CN1774504A - 蛋白酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肽酶家族S2A或S1E的丝氨酸蛋白酶新种类，其在存在铜(Cu2+)时是稳定的，和/或只被铜抑制到有限的程度。也公开了针对这种影响的潜在的相关结构特性。这个种类的蛋白酶包括来源于Brachysporiella gayana、达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种、Nocardiopsis prasina、和Nocardiopsis alba的蛋白酶，但是排除来源于金龟子绿僵菌和拟诺卡氏菌种NRRL 18262的已知蛋白酶。本发明也涉及编码这种蛋白酶的DNA，其在包括动植物细胞的宿主细胞中的表达，及其在例如动物饲料和清洁剂中的用途。特别地，本发明涉及动物饲料和动物饲料添加剂，例如预混合料，将这些蛋白酶与1－500ppm的Cu(饲料中的浓度)一起掺入。

Description

蛋白酶
发明领域
本发明涉及稳定的和/或相对不受铜影响的某些种类的丝氨酸蛋白酶，以及涉及编码这些蛋白酶的DNA、其重组生产，及其在动物饲料和清洁剂(detergent)中的用途。
发明背景
Steven E.Screen和Raymond J.St.Leger在The Journal of BiologicalChemistry，Vol.275，No.9，2000，第6689-6694页中公开了来源于金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)的蛋白酶的克隆和表达。序列表中SEQ ID NO：3显示了其核苷酸序列chyl，SEQ ID NO：4(TREMBL：Q9Y843)显示了推导的氨基酸序列CHY1。
在WO 88/03947中描述了来源于拟诺卡氏菌种NRRL 18262和达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)NRRL 18133的蛋白酶。在丹麦专利申请号1996 00013中显示了来源于拟诺卡氏菌NRRL 18262的蛋白酶的DNA和氨基酸序列。WO 01/58276描述了与来源于拟诺卡氏菌NRRL no.18262的蛋白酶相关的酸稳定蛋白酶在动物饲料中的用途。JP 2255081A描述了从拟诺卡氏菌FERM P-1-508纯化的蛋白酶。德国专利号DD 2,004,328公开了来源于达松维尔拟诺卡氏菌ZIMET 43647的蛋白酶。
本发明的目的是提供用于各种工业用途，例如用于动物饲料和/或清洁剂中的备选蛋白酶。
发明概述
本发明涉及肽酶家族S2A或S1E的蛋白酶，其i)在pH7和25℃，在补充有0.1％K-Sorbate的分析缓冲液中，并且在存在1mM的Cu2+时培养164小时后，测量的残余活性相对于培养0小时后的活性，具有至少0.80的残余活性；和/或ii)相对于没有Cu2+的对照，在存在1mM的Cu2+时，具有至少0.66的相对活性；其中i)和ii)的活性测量是在pH7.0和25℃，在分析缓冲液中，在底物Suc-AAPF-pNA上测量的；并且其中对于i)的测量值，蛋白酶具有经SDS-PAGE确定的至少90％的纯度。
本发明也涉及编码这种蛋白酶的分离核酸序列和包括该核酸序列的核酸构建体、载体、和宿主细胞，以及生产和利用该蛋白酶的方法。
附图简述
图1是来源于拟诺卡氏菌NRRL 18262(蛋白酶10，SEQ ID NO：2的第1-188位氨基酸)、金龟子绿僵菌(绿僵菌蛋白酶、SEQ ID NO：4的第1-188位氨基酸)、Nocardiopsis prasina DSM 15648(蛋白酶11，SEQ ID NO：6的第1-188位氨基酸)、Nocardiopsis prasina DSM 15649(蛋白酶35，SEQ ID NO：8的第1-188位氨基酸)、Nocardiopsis alba DSM 15647(蛋白酶08，SEQ IDNO：12的第1-188位氨基酸)、和Brachysporiella gayana CGMCC 0865(Brachysporiella蛋白酶，SEQ ID NO：14的第1-186位氨基酸)的蛋白酶的成熟肽部分的多个序列对比。
发明详述
在标题为″具有蛋白酶活性的多肽″中包括了肽酶家族S2A和S1E的丝氨酸蛋白酶的说明。
存在铜时的稳定性和抑制
本发明涉及i)在存在Cu2+时相对稳定的蛋白酶，和/或ii)被Cu2+抑制到相对低程度的蛋白酶。
确定特性i)为在pH7和25℃，在补充有0.1％K-山梨酸(Sorbate)(为了保存目的)的分析缓冲液中，和在存在1mM Cu2+时已经孵育164小时后的残余(＝静止，或剩余)酶活性。相对于孵育0小时后的活性测量残余活性。对于本发明的蛋白酶，残余活性是至少0.80(＝80％)。
利用底物Suc-AAPF-pNA，在pH7.0和25℃，在分析缓冲液中测量蛋白酶活性。为了更详细地说明，请参阅在实施例4中描述的pNA分析，其也详细描述了i)和ii)所述的测定。
目前预期测试蛋白酶的纯度可能影响这些稳定性结果，因此当分析i)所述的稳定性时，优选蛋白酶经SDS-PAGE测量是至少90％纯的。在实施例2中公开了经SDS-PAGE确定纯度的方法。在特定的实施方案中，SDS-PAGE纯度是至少91％、92％、93％、94％或至少95％。在可选的实施方案中，特别是为了测试i)的目的，吸光率纯度(参见实施例3)，相应于A280/A260比率至少为1.40、或至少1.42、1.44、1.46、1.48、1.50、1.60、或至少1.70。
确定特性ii)为在存在1mM Cu2+时，相对于在除了存在Cu2+以外的相同条件下相同酶的活性的酶活性。对于本发明的蛋白酶，这个相对活性是至少0.66(＝66％)。为了特性ii)的目的)，如上所述测量酶(蛋白酶)活性。
在本发明蛋白酶的特定实施方案中，i)所述的残余活性是至少0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、或至少0.97。
在可选的实施方案中，i)所述的残余活性是至少0.76、0.77、0.78、或0.79。在其它可选的实施方案中，在孵育116小时后确定i)所述的残余活性，而在这种情况下本发明蛋白酶的残余活性是至少0.84，具有如上列的相同优选范围(至少0.85或以上)。在更进一步的备选实施方案中，在孵育188.6小时后确定i)所述的残余活性，而在这种情况下本发明蛋白酶的残余活性是至少0.73，具有如上列的相同优选范围(至少0.76以上，加下列：或至少0.74，或至少0.75以上)。
在本发明蛋白酶的另一组特定的实施方案中，ii)所述的相对活性是至少0.67、0.68、0.69、0.70、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.80、0.81、或至少0.82。
在可选的实施方案中，使用底物Boc-VLGR-pNA代替Suc-AAPF-pNa用于i)和/或ii)所述的活性测量。
特性i)和ii)所述稳定性和抑制的研究结果分别显示在实施例4的表2和1中。从这些表格看出，显然标明为蛋白酶18和Brachysporiella蛋白酶的蛋白酶，是唯一满足特性i)的测试蛋白酶，而所有的测试蛋白酶都满足特性ii)，除了已知的标明为蛋白酶10和绿僵菌蛋白酶的蛋白酶。
对表1的更近观察显示蛋白酶18和蛋白酶08形成在存在铜时具有明显更高的相对活性的极有趣的亚群(两者的相对活性都超过0.80)。然而，Brachysporiella蛋白酶也很好(接近0.70的相对活性)。这意味着2个测试i)和ii)鉴定出这3种蛋白酶是特别有兴趣的。
在转而考虑可解释所观察到的影响的潜在结构成分前，在此首先考虑计算多种测试蛋白酶中氨基酸残基数目的一些原则，和如何推断多种骨架中相应氨基酸残基的指导。
氨基酸残基编号
在本文中，为了鉴定多种蛋白酶中相应氨基酸残基的目的，必须参考SEQ ID NO：2，蛋白酶10从A1开始到T188结束的成熟部分(第1-188位氨基酸)氨基酸残基的编号。图1显示在10个残基的序列对比串中，即在序列对比的上面行中，每个这种串的最后氨基酸残基的编号。例如，编号″10″是指在这第一串的10个残基中，蛋白酶10的最后氨基酸残基，″T″是成熟蛋白酶10氨基酸序列中编号10的氨基酸残基。作为另一个实例，编号″145″是指在图1序列对比第三行残基的这最后串中，蛋白酶10的最后氨基酸残基，其为″G″，是成熟蛋白酶10氨基酸序列中编号145的残基。这个编号与SEQ ID NO：2的数目相同，然而不一定与SEQID NOs：4、6、8、10、12和14的数目相同，原因是为了鉴定多种蛋白酶中相应氨基酸残基的目的，根据蛋白酶10使用统一的编号。如下进一步描述指定统一编号的方法。
对于蛋白酶10的每一氨基酸残基，可在图1显示的其它6种蛋白酶的每一个中鉴定″相应″的残基，因为″相应″的残基只不过是在图1的序列对比中置于另一个上面，或相互可放置在另一个上(on top of each other)的残基。例如，蛋白酶10的第10个氨基酸残基T(SEQ ID NO：2的T10)相应于SEQ IDNOs：4和12的Y10；相应于SEQ ID NOs：6、8和10的T10；以及SEQ ID NO：14的V8。然而在本文中，除了为了序列表的目的外，全部指定这些残基为相同的编号，因为限定它们为″相应的残基″，并且指定的编号是蛋白酶10中相应残基的编号，即残基编号10。因此，蛋白酶10的T10分别相应于绿僵菌蛋白酶、蛋白酶11，蛋白酶35、蛋白酶08、蛋白酶18、和Brachysporiella蛋白酶的Y10、T10、T10、T10、Y10和V10。当无另外说明时，在下文中使用这个编号。
图1的多重序列对比，在某些行中，在某些位置，包括缺口，其可被认为是氨基酸残基的缺失。在本文中，通过按字母顺序指定每个缺口为小写字母来编号缺口或缺失的氨基酸残基，即a、b、c、d-----t、u、v、x、y，z。将需要25个以上的这种标示，编号将继续为aa、bb、cc等。例如，蛋白酶10的G12和G13之间的缺口相应于在位置12a和12b的2个氨基酸残基的缺失。因此，指定图1的第二行中显示的绿僵菌蛋白酶(SEQ ID NO：4)中的相应残基为R12a和S12b。以此类推，相应于蛋白酶10的第57-60位中FPGN的绿僵菌蛋白酶中的FPGSA连续氨基酸残基编号如下：F57、P58、G59、S59a和A60；位置59a相当于在蛋白酶10中缺失1个氨基酸。
图1的序列对比中包括的2种蛋白酶，即绿僵菌蛋白酶和Brachysporiella蛋白酶，与蛋白酶10相比包括C-末端延伸。这种延伸的氨基酸通常在本领域中编号为从号码188延伸，即189、190、191等。例如，绿僵菌蛋白酶的最后氨基酸指定为A189。
可向图1的序列对比加入的另一个具有SEQ ID NO：X成熟肽部分的氨基酸序列的蛋白酶如下：
如下所述利用″Align″程序确定SEQ ID NO：X与图1的7种蛋白酶(每一个SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12和14的成熟肽部分)的同一性的百分比。由此产生7个成对的序列对比。选择与SEQ ID NO：X具有最高程度同一性的序列作为模型蛋白酶。如果存在更多候选的模型蛋白酶，选择在图1序列对比中列在第一的蛋白酶。如果，例如，SEQ ID NO：X与SEQ ID NOs：2、4，6、8、10、12、和14分别具有下列百分比的同一性：45％、55％、50％、65％、65％、45％和40％，则应选择SEQ ID NO：8作为模型蛋白酶。下一步是利用SEQ ID NO：X与SEQ ID NO：8的成对序列对比，将SEQ ID NO：X粘贴(或可简单地写入)到图1的序列对比上作为底端行，确保相应的氨基酸残基(在此″相应的″是指SEQ ID NO：X和SEQ ID NO：8的成对序列对比)放置在彼此上下。
当图1的序列对比保持不受加入新序列的这个步骤的影响时，与图1的蛋白酶10相比，所述的方法可能在SEQ ID NO：X中产生缺口；在SEQ ID NO：X中产生″环″，和/或产生SEQ ID NO：X的N-或C-末端延伸。
关于这种位置的编号，为了鉴定SEQ ID NO：X中相应的氨基酸残基，如上所述处理缺口和C-末端延伸。如果有N-末端延伸，通常在本领域中编号为，-1、-2、-3等(″-″意味着″负的″)。例如，当加入图1的序列对比时，如果SEQ ID NO：X是从位于蛋白酶10N-末端氨基酸A1之前的ALI序列开始的，这些可分别编号为A-3、L-2和I-1。如果有环，这相当于SEQ IDNO：X具有″多余的″氨基酸残基，其使得图1的序列对比不能留出空间。印刷上地，将这些多余的残基转移到下一行上，但是当然认为它们包括在多重序列对比中，并且以此类推其编号为如上所述的用于缺口染色的编号(利用标示a、b、c等)。例如，SEQ ID NO：X和SEQ ID NO：8的成对序列对比可包括下列部分：
(SEQ ID NO：8的部分)FAAT-----NAAGQP
(SEQ ID NO：X的部分)YAVSCRTAKNAACQP，
蛋白酶08(SEQ ID NO：8)的氨基酸残基FAATNAAGQP具有序列对比编号19至28，而在成对序列对比中这些可相应地转为SEQ ID NO：X的下列氨基酸残基：YAVSCRTAKNAACQP。为此目的，SEQ ID NO：X的氨基酸残基将如下编号：Y19、A20，V21、S22、C22a、R22b、T22c、A22d、K22e、N23A24、A25、C26、Q27、和P28。
在图1的序列对比中，这可书写如下：
(SEQ ID NO：8的部分)FAATNAAGQP
(SEQ ID NO：X的部分)YAVSNAACQP，
                         CRTAK  22e
在特定的备选实施方案中，利用SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12和14的完全CDS部分(包括向成熟肽部分加入任何信号肽部分，和/或前肽部分)产生相当于上述的成对序列对比。
下列是在此用于表征蛋白酶的注明的实施例：表示如下：
″包括氨基酸序列的蛋白酶，当根据图1排列时，该氨基酸序列包括V166，其中氨基酸残基的编号相应于蛋白酶10(SEQ ID NO：2的第1-188位氨基酸)的编号″
意味着当加入到如上所述的图1的多重序列对比时，该蛋白酶的氨基酸序列在编号166的位置(是指如上所述推断的序列对比编号)具有V。
使用类似″至少一个的(L114或Y114)；(S121或D121)；(Q130或M130)；(N162或T162或S162)；(S163或R163)；E174；和/或(S177或E177)″的表示，通过分号(；)分开，说明蛋白酶满足任何一个(至少一个)的标准。这个情况是例如，用于具有Y114、或S121、或M130、或E174的蛋白酶，并且也用于具有L114和D121的蛋白酶。
使用类似：
″一种蛋白酶，包括下列至少一个：
a)(T120+R122+T127+Y129)、(T120+N122+P127+F129)、或(T120+S122+T127+Q129)；和/或
b)(T91+T176+1179+N180)、(S91+N176+L179+E180)、或(S91+N176+L179+S180)″的表示，通过6个括号的至少一个内的加号(+)分开，说明满足所有标准的蛋白酶。这个情况是例如，用于具有T120、R122、T127和Y129的蛋白酶18((a)中的第一个括号)。这个蛋白酶，同时也包括T91、T176、I179和N180((b)中的第一括号)。
使用类似″(H35+D61+S143)″的表示说明包括H35、D61和S143(活性位点氨基酸残基)的蛋白酶。
关于Cu的结构性因素
本发明关于铜对多种测试酶的不同影响的惊奇发现已经引起了关于确定可能解释所观察到的差异结构成分的一些研究。鉴定了2个潜在的铜结合位点(如下列表格所示的位点号I和II)，其中预期位点号I是最重要的位点：
  位点号I   位点号II
  蛋白酶/残基号  120   122   127   129   91   176   179   180   SEQ ID NO：的部分
  蛋白酶18  T   R   T   Y   T   T   I   N   12
  Brachysporiella  T   N   P   F   S   N   L   E   14
  蛋白酶08  T   S   T   Q   S   N   L   S   10
  蛋白酶35  S   S   T   T   H   T   V   N   8
  蛋白酶11  S   S   T   T   H   T   V   N   6
  蛋白酶10  S   S   T   T   H   T   V   N   2
  绿僵菌  T   N   A   S   S   N   L   Q   4
上述表格中，将双线(＝)放置在那些相对不受铜影响的蛋白酶，和受到铜的更多负影响的蛋白酶之间(分别在双线上下的蛋白酶)。
从这个表格显示似乎下列组合的位点号I的残基对于通过铜达到的高稳定性和/或低抑制是不利的：a)(T120+N122+A127+S129)，和b)(S120+S122+T127+T129)。
以此类推，位点号II的残基的下列组合也可能是不利的：a)(S91+N176+L179+Q180)，和b)(H91+T176+V179+N180)。
另一方面，位点号I和II的残基的下列组合似乎是有利的：
a)(T120+R122+T127+Y129)、(T120+N122+P127+F129)、或(T120+S122+T127+Q129)；和/或
b)(T91+T176+1179+N180)、(S91+N176+L179+E180)、或(S91+N176+L179+S180)。
可能促进解释所观察到的差异结构性的其它残基是在第51、54、86、89、99、125、130、131、135、165和166位的残基。因此，在特定的实施方案中，本发明的蛋白酶不包括下列残基的任何组合：a)(V51+Q54+A86+A89+S99+E125+N130+M131+T135+R165+T166)，也不包括b)(T51+G54+P86+S89+S99+Q125+S130+L131+S135+S165+R166)。另一方面，在附加的特定实施方案中，本发明的蛋白酶包括下列的至少一个：T51；N54或G54；Q86或P86；T89或F89；A99或G99；Q125或V125；S130或G130；L131；N135或S135；S165或T165；V166或S166。措词″至少一个″意味着1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，或所有的这11个残基的组合。为了本发明的目的，″至少一个″的定义一般是以此类推可适用的。
在可选的实施方案中，本发明明确地涉及在这个小节中所限定的蛋白酶，其没有如权利要求1提出的功能性特征i)和ii)，优选为肽酶家族S2A或S1E的蛋白酶。
具有蛋白酶活性的多肽
具有蛋白酶活性的多肽，或蛋白酶，有时也指明为肽酶、蛋白酶、肽水解酶、或蛋白水解酶。蛋白酶可能具有起始于其末端的水解肽的外型，或在多肽链中内部起作用的内型(内肽酶)。内肽酶显示在N-和C-末端上阻断与所述的蛋白酶特异性相关的肽底物的活性。
在此限定术语″蛋白酶″作为水解肽键的酶。它包括属于EC 3.4酶小组的任何酶(包括其13个亚类的每一类)。EC号码是指来自NC-IUBMB，Academic Press，San Diego，加利福尼亚的酶命名法1992，包括分别刊登于Eur.J.Biochem.1994，223，1-5；Eur.J.Biochem.1995，232，1-6；Eur.J.Biochem.1996，237，1-5；Eur.J.Biochem.1997，250，1-6；和Eur.J.Biochem.1999，264，610-650的附录1-5。有规律地补充和更新该命名法；参见例如万维网(WWW)http：//www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html)。
根据其催化机理将蛋白酶分为下列小组：丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)、以及未知的或至今未分类的蛋白酶(U)、参见Handbook of Proteolytic Enzymes，A.J.Barrett，N.D.Rawlings，J.F.Woessner(编辑)，Academic Press(1998)，特别是综合导言部分。
本发明的蛋白酶选自：
(a)上述手册所述的肽酶家族S2A的丝氨酸蛋白酶；和
(b)肽酶家族S1E的丝氨酸蛋白酶，其在Biochem.J.290：205-218(1993)和2003年3月24日的MEROPS蛋白酶数据库，版本(release)6.20(www.merops.ac.uk)中有描述。该数据库在Rawlings，N.D.，O′Brien，E.A.& Barrett，A.J.(2002)MEROPS：the protease database.Nucleic Acids Res.30，343-346中有描述。
肽酶家族S2A代表分类蛋白酶的传统方式。现在，经常将传统上分类为S2A蛋白酶的蛋白酶根据MEROPS分类法在肽酶家族S1E中进行分类。
在特定的实施方案中，蛋白酶属于肽酶家族S2A。在另一个特定的实施方案中，蛋白酶属于肽酶家族S1E。
在可选的实施方案中，本发明的蛋白酶选自：
(c)属于EC 3.4.-.-酶小组的蛋白酶；和
(d)属于上述手册S组的丝氨酸蛋白酶；
为了确定给出的蛋白酶是否是丝氨酸蛋白酶、S2A蛋白酶家族、和/或S1E蛋白酶家族，参考上述参考文献和其中表明的原则。可对所有类型的蛋白酶、天然存在或野生型的蛋白酶、或遗传工程化或合成的蛋白酶进行这种确定。
可利用任何分析测量蛋白酶活性，其中使用底物，包括与所述蛋白酶的特异性相关的肽键。pH-分析和温度-分析同样适于所述的蛋白酶。分析-pH-值的实例是pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。分析-温度的实例是20、25、30、35、37、40、45、50、55、60、65、70或80℃。
蛋白酶底物的实例是酪蛋白，例如天青精-交联(Azurine-crosslinked)的酪蛋白(AZCL-酪蛋白)。为了本发明的目的，所谓的pNA分析是优选的分析，并且优选的底物是Suc-AAPF-pNA。
对于本发明的蛋白酶的起源没有限制。因此，术语蛋白酶不仅包括获得自任何种属微生物的天然或野生型的蛋白酶，并且包括显示蛋白酶活性的其任何突变体、变体、片段等，以及合成的蛋白酶，例如改组的蛋白酶和共序列(consensus)蛋白酶。可根据本领域普遍已知的，例如通过定点诱变、通过PCR(利用包含所需突变的PCR片段作为PCR反应中的引物)、通过改组、或通过随机诱变制备这种遗传工程化的蛋白酶。共有序列蛋白质的制剂在例如EP 897985中有描述。如在此使用的与给定来源有关的术语″获得自″是指由核酸序列编码的多肽是由来源或由其中存在来自该来源的核酸序列的细胞产生的。在优选的实施方案中，多肽是细胞外分泌的。
在特异的实施方案中，蛋白酶是低-过敏原的变体，设计成当暴露于动物，包括人时，能产生减小的免疫反应。术语免疫反应可理解为经暴露于蛋白酶的动物的免疫系统产生的任何反应。免疫反应的一个类型是在接触的动物中导致IgE水平增加的变态反应。可利用本领域已知的技术制备低-过敏原的变体。例如蛋白酶可与保护部分的聚合体部分或涉及免疫应答的蛋白酶表位结合。与聚合体的结合作用可能涉及聚合体与蛋白酶的体外化学偶联，例如在WO 96/17929、WO 98/30682、WO 98/35026和/或WO 99/00489所描述的。此外或备选地，结合作用可能另外涉及聚合体与蛋白酶的体内偶联。可通过编码蛋白酶的核苷酸序列的遗传工程，在蛋白酶中插入编码附加糖基化位点的共有序列，并且在能够糖基化蛋白酶的宿主中表达蛋白酶而获得这种结合作用，参见例如WO 00/26354。提供低过敏原变体的另一个方法是遗传工程化编码蛋白酶的核苷酸序列以导致蛋白酶自我寡聚化，影响可能遮蔽其它蛋白酶单体表位的蛋白酶单体，并且由此降低低聚物的抗原性。这种产物及其制剂在例如WO 96/16177中有描述。可通过多种方法鉴定涉及免疫应答的表位，例如在WO 00/26230和WO 01/83559中描述的噬菌体显示方法，或在EP 561907中描述的随机法。一旦已经鉴定出表位，可改变其氨基酸序列以通过已知的基因操作技术，例如定点诱变来产生免疫特性改变的蛋白酶(参见例如WO 00/26230、WO 00/26354和/或WO 00/22103)，和/或可以以足够的接近度使聚合体与表位进行聚合体的结合作用而保护表位。
在特定的实施方案中，本发明的多肽包括具有蛋白酶活性并且与SEQID NO：14的第1至186位氨基酸和/或(SEQ ID NOs：12、10、8、6、4或2)氨基酸序列的第1-188位氨基酸至少40％同一性程度的氨基酸序列(下文中的″同源的多肽″)。在进一步的特定实施方案中，同一性程度是至少大约42％、44％、46％、48％、50％、52％、54％、56％、58％、60％、62％、63％、64％、66％、68％、70％、72％、75％、77％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、或至少大约97％。在另一个可选的实施方案中，上述任何同一性程度与SEQ ID NOs：14、12、10、8、6、4或2，例如SEQ ID NO：2的第-189至186位氨基酸的任何完全的CDS部分相关。在特定的实施方案中，本发明的多肽i)具有；或ii)由具有如上所述任何同一性程度的氨基酸序列组成。
为了本发明的目的，通过Needleman-Wunsch序列对比的程序″align″(即总的序列对比)确定2个氨基酸序列之间的同一性程度，以及2个核苷酸序列之间的同一性程度。该程序用于多肽以及核苷酸序列的序列对比。使用默认积分矩阵BLOSUM50用于多肽序列对比，而默认单位矩阵用于核苷酸序列对比。对于多肽，缺口的第一个残基的罚分是-12，而对于核苷酸是-16。对于多肽，缺口的进一步残基的罚分是-2，对于核苷酸是-4。
″Align″属于FASTA程序包版本v20u6(参见W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools for Biological Sequence Analysis″，PNAS 85：2444-2448，和W.R.Pearson (1990)″Rapid and Sensitive Sequence Comparison withFASTP and FASTA，″Methods in Enzymology 183：63-98)。FASTA蛋白质序列对比使用Smith-Waterman算法而不限制缺口大小(参见″Smith-Waterman algorithm″，T.F.Smith和M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147：195-197)。
在特定的实施方案中，将2个氨基酸序列的成熟肽部分，或预测或预期的成熟肽部分用于序列对比。
可选的，可通过Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5：151-153)，利用具有同一性表格及其后的多重序列对比参数的LASERGENET TMMEGALIGNTM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)确定2个氨基酸序列之间的同一性程度：缺口罚分为10，以及缺口长度罚分为10。成对序列对比的参数是Ktuple＝1，缺口罚分＝3，windows＝5，以及对角线＝5。可利用如上所述的相同算法和软件包确定2个核苷酸序列之间的同一性程度，其具有下列设置：缺口罚分(gap penalty)为10，以及缺口长度罚分(gap lengthpenalty)为10。成对序列对比的参数是Ktuple＝1，缺口罚分＝3，和windows＝20。
在特定的实施方案中，同源性多肽具有10、或9、或8、或7、或6、或5个氨基酸差异的氨基酸序列。在另一个特定的实施方案中，同源性多肽与SEQ ID NO：14的第1至186位氨基酸，或(SEQ ID NOs：12、10、8、6、4或2的)第1-188位氨基酸相差4、或3、或2个氨基酸、或1个氨基酸。在可选的实施方案中，同源性多肽具有与SEQ ID NO：14的第1至186位氨基酸、或(SEQ ID NOs：12、10、8、6、4或2的)第1-188位氨基酸相差40、35、30、25、20、或15个氨基酸的氨基酸序列。
在特定的实施方案中，本发明的多肽包括SEQ ID NO：14的第1至186位氨基酸、或(SEQ ID NOs：12、10、8、6、4或2的)第1-188位氨基酸的氨基酸序列，或其等位变体；或具有蛋白酶活性的其片段。
在另一个优选的实施方案中，本发明的多肽由SEQ ID NO：14的第1至186位氨基酸、或(SEQ ID NOs：12、10、8、6、4或2的)第1-188位氨基酸，或其等位变体；或具有蛋白酶活性的其片段组成。
片段是从这些氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一个实施方案中，片段包含至少75个氨基酸残基，或至少100个氨基酸残基，或至少125个氨基酸残基，或至少150个氨基酸残基，或至少160个氨基酸残基，或至少165个氨基酸残基，或至少170个氨基酸残基，或至少175个氨基酸残基。
等位变体表示占据相同染色体位点的基因的任何两个或多个备选形式。等位变体通过突变天然产生，并且可在群体内导致多态性。基因突变可能是沉默的(在编码多肽中无变化)或可能编码改变氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
本发明也涉及具有蛋白酶活性的分离多肽，并且其是由在极低、或低、或中等、或中等-高、或高、或极高的严谨条件下与核酸探针杂交的核酸序列编码的，其中该核酸探针在相同条件下与(a)SEQ ID NO：13的第726-1283位核苷酸、SEQ ID NO：11的第499-1062位核苷酸、SEQ ID NO：9的第502-1065位核苷酸、SEQ ID NO：7的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO：5的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO：3的第559-1122位核苷酸、和/或SEQID NO：1的第900-1466位核苷酸；(b)(a)的亚序列，或(c)(a)、或(b)的互补链杂交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，MolecularCloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，纽约)。在特定的实施方案中，核酸探针选自上述的(a)、(b)、或(c)的核酸序列之中。相应于各个成熟肽部分的SEQ ID NO：13的第726-1283位核苷酸、SEQID NO 11：的第499-1062位核苷酸、SEQ ID NO：9的第502-1065位核苷酸、SEQ ID NO：7的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO 5：的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO：3的第559-1122位核苷酸、和/或SEQ ID NO 1：的第900-1466位核苷酸是优选的探针。
亚序列可以是至少100个核苷酸，或在另一个实施方案中是至少200个核苷酸。此外，亚序列可编码具有蛋白酶活性的多肽片段。
在上述(a)或(b)下列出的核酸序列，以及相应的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针以从不同属或种的菌株，根据本领域公知的方法鉴定和克隆编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。特别地，这种探针可用于与基因组DNA或令人感兴趣的属或种的cDNA，按照标准的Southern印迹步骤杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。这种探针比起全部序列来可以是相当短的，但应该是至少15，优选至少25，以及更优选是至少35个核苷酸长度。也可使用更长的探针。可使用DNA和RNA探针。一般标记探针用于检测相应基因(例如，使用32p、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白)。本发明包括这种探针。
因此，可从这种其它生物体制备的基因组DNA或cDNA文库筛选与上述的探针杂交，并且编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其它分离技术分离来自这种其它生物体的基因组或其它的DNA。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移并固定到硝化纤维素或其它合适的载体材料上。为了鉴定同源的克隆或同源的DNA，在Southern印迹中使用载体材料。为了本发明的目的，杂交表明该核酸序列与相应于所选择核酸序列、其互补链、或其亚序列的标记核酸探针在极低至极高的严谨条件下杂交。可利用X光胶片检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
在特定的实施方案中，核酸探针是SEQ ID NO：13的第726-1283位核苷酸、SEQ ID NO：11的第499-1062位核苷酸、SEQ ID NO：9的第502-1065位核苷酸、SEQ ID NO：7的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO：5的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO：3的第559-1122位核苷酸、和/或SEQ ID NO：1的第900-1466位核苷酸。在另一个实施方案中，核酸探针是编码相应于任何或上述所列的核酸序列的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，核酸探针是包含于质粒中的核酸序列，或优选其成熟多肽编码区，该质粒包含于大肠杆菌DSM 15509中，其中核酸序列编码具有蛋白酶活性的多肽。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针，定义极低至极高的严谨条件为在42℃，在5×SSPE，0.3％SDS，200μg/ml剪切和变性的鲑鱼精DNA，以及对于极低和低严谨为25％甲酰胺、对于中等和中等-高严谨为35％甲酰胺、或对于高和极高严谨为50％甲酰胺中，按照标准的Southern印迹方法进行预杂交和杂交。
对于至少100个核苷酸长度的长探针，最后利用2×SSC，0.2％SDS洗涤载体材料3次，每次15分钟，优选在45℃(极低严谨)、更优选至少在50℃(低严谨)、更优选至少在55℃(中等严谨)、更优选至少在60℃(中等-高严谨)、更优选至少在65℃(高严谨)、以及最优选至少在70℃(极高严谨)下进行洗涤。
对于大约15个核苷酸至大约70个核苷酸长度的短探针，严谨条件定义为在比利用根据Bolton和McCarthy(1962，Proceedings of the NaionalAcademy of Sciences USA 48：1390)的计算法计算的Tm低5℃至10℃，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH 7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1×Denhardt′s溶液，1mM焦磷酸钠，1mM一元磷酸钠，0.1mM ATP，和每ml 0.2mg酵母RNA中，按照标准的Southern印迹方法进行预杂交、杂交、和洗涤后-杂交。
对于大约15个核苷酸至大约70个核苷酸长度的下列短探针，在6×SSC加0.1％SDS中洗涤载体材料15分钟一次，利用6×SSC在低于计算的Tm 5℃至10℃下洗涤两次，每次15分钟。
本发明也涉及具有包括SEQ ID NO：14的第1至186位氨基酸、和/或(SEQ ID NOs：12、10、8、6、4或2)的第1-188位氨基酸的取代、缺失、和/或插入一个或多个氨基酸的多肽变体。
变体多肽的氨基酸序列可不同于SEQ ID NO：14的第1至186、-170至186、或-189至186位氨基酸的氨基酸序列，或通过插入或缺失一个或多个氨基酸残基和/或通过不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基而不同于SEQ ID NOs：12、10、8、6、4或2的任何一项的相应部分。优选地，氨基酸变化具有次要的特性，也就是说保守的氨基酸取代不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；小的缺失，一般为1个至大约30个氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；达到大约20-25个残基的小的接头肽；或通过改变净电荷或另一个功能，例如聚组氨酸区、抗原性的表位或结合结构域而便于纯化的小的延伸。
保守取代的实例是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天门冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)的组的范围之内。一般不改变特异活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且在例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，The Proteins，Academic Press，纽约中有描述。最通常发生的交换是Ala/Ser、Val/lle、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly及其相反。
在特定的实施方案中，本发明的多肽以及本发明所述的用途是酸-稳定的。为了本目的，术语酸-稳定的是指在pH 3.0和37℃孵育2小时后的残余活性，与在pH 9.0和5℃孵育2小时的相应样品的残余活性相比是至少20％。在特定的实施方案中，残余活性是至少22％、24％、25％或至少26％。可选的，酸稳定性定义是指当在pH 3.5和37℃测量时，与在pH 9.0和5℃孵育2小时的相应样品的残余活性相比为至少50％、或60％、或70％的残余活性。在WO 01/58276的实施例2C中公开了用于确定耐酸性的合适分析。
在另一个特定的实施方案中，本发明的多肽和本发明所述的用途在pH7.0具有至少0.2、0.3、0.4、或至少0.5的相对活性。WO 01/58276的实施例2B的pH-图谱测试是合适的分析。
本发明的多肽和根据本发明所使用的多肽是细菌或真菌的多肽。真菌的多肽可能来源于丝状真菌或来自酵母。
在特定的实施方案中，本发明的多肽是i)真菌的蛋白酶；ii)来源于子囊菌门(Ascomycota)的蛋白酶；iii)盘菌亚门(Pezizomycotina)；iv)粪科菌纲(Sordariomycetes)；v)粪壳目(Sordariales)；vi)Annulatascaceae科；vii)Ascotaiwania和/或Brachysporiella属(Brachysporiella是该真菌的无性型(无性的)状态，而Ascotaiwania是有性型或有性状态)；和/或viii)来源于Ascotaiwania和/或Brachysporiella菌株的蛋白酶，例如Ascotaiwaniamitriformis、Ascotaiwania sawada、Brachysporiella gayana、和Brachysporiellasp.，例如Brachysporiella gayana CGMCC 0865，例如具有SEQ ID NO：14的第1至186、-170至186、或-189至186位氨基酸的氨基酸序列的多肽。
可以理解对于上述的种属，本发明包括完全的和不完全的状态、和其他分类学的等同物，例如无性型，而不考虑其已知的种属名称。本领域的技术人员将容易地识别适当等同物的同一性。
上述分类学主要是根据Ranghoo，V.M.，Goh，T.K.& Hyde，K.D.1999.New observations on Monotosporella rhizoidea.Mycosciences 40：377-382；和Sivichai，S.，Hywel-Jones，N.& J.E.B.G.1998，Liginicolous freshwaterAscomycota from Thailand：I.Ascotaiwania sawada and its anamorph stateMonotosporella.Mycosciense 39：307-311。
在另一个特定的实施方案中，本发明的多肽是i)细菌蛋白酶；ii)来源于放线菌门(Actinomycetales)的蛋白酶；iii)放线菌纲(the class Actinobacteria)；iv)放线菌目(Actinomycetales)；v)拟诺卡氏菌科(Nocardiopsaceae)；vi)拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)；和/或来源于vii)拟诺卡氏菌种的蛋白酶，例如Nocardiopsis alba、南极洲拟诺卡氏菌(Nocardiopsis antarctica)、Nocardiopsis prasina、Nocardiopsis composta、Nocardiopsis exhalans、嗜盐拟诺卡氏菌(Nocardiopsis halophila)、Nocardiopsis halotolerans、Nocardiopsis kunsanensis、李斯特拟诺卡氏菌(Nocardiopsis listeri)、卢森坦类拟诺卡氏菌(Nocardiopsis lucentensis)、Nocardiopsis metallicus、Nocardiopsis synnemataformans、海藻糖拟诺卡氏菌(Nocardiopsis trehalosi)、Nocardiopsis tropica、Nocardiopsis umidischolae、Nocardiopsis xinjiangensis、或达松维尔拟诺卡氏菌、例如：
达松维尔拟诺卡氏菌DSM 43235，例如蛋白酶18，具有SEQ ID NO：12的第1至188、或-166至188位氨基酸的氨基酸序列的多肽；
Nocardiopsis alba DSM 15647，例如蛋白酶08，具有SEQ ID NO：10的第1至188、或-167至188位氨基酸的氨基酸序列的多肽；
Nocardiopsis prasina DSM 15649，例如蛋白酶35，具有SEQ ID NO：8的第1至188、或-165至188位氨基酸的氨基酸序列的多肽；
Nocardiopsis prasina DSM 15648，例如蛋白酶11，具有SEQ ID NO：6的第1至188、或-165至188位氨基酸的氨基酸序列的多肽。
这4种蛋白酶，和来自Brachysporiella gayana CGMCC 0865的蛋白酶，例如具有SEQ ID NO：14的第1至186、-170至186、或-189至186位氨基酸的氨基酸序列多肽的Brachysporiella蛋白酶一起形成本发明的特定实施方案。由蛋白酶18、蛋白酶08、和Brachysporiella蛋白酶组成的亚组是本发明的另一个特定的实施方案，而由Brachysporiella蛋白酶和蛋白酶18组成的亚组是本发明的更进一步的特定实施方案。
上述分类学是根据G.M.Garrity & J.G.Holt的Bergey′s Manual ofSystematic Bacteriology，2001，第二版，卷号1，David R.Bone，Richard W.Castenholz中的chapter：The road map to the Manual。这些种属的菌株是公众可在许多菌种保藏机构容易地获得的，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSM)、真菌菌种保藏中心(CBS)、和农业研究机构保藏中心(NRRL)。
此外，可鉴定并从其它来源，包括从自然界分离的微生物(例如，土壤、堆肥、水等)利用上述探针获得这种多肽。用于从天然生境分离微生物的技术是本领域已知的。然后可通过类似地筛选另一个微生物的基因组DNA或cDNA文库衍生出核酸序列。一旦已经用探针检测到编码多肽的核酸序列，可利用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆序列(参见例如，Sambrook等人，1989，上文)。
可通过在适当的筛选培养基中掺入所需水平的Cu2+和/或Cu+并且选择最有效的蛋白酶生产者来进行不受铜或相对不受铜影响的蛋白酶筛选。措词″有效的″(potent)当然是指蛋白酶活性，可利用任何合适的蛋白酶筛选方法，例如根据包含脱脂乳的固体培养基中澄清带的大小来进行评估。所需水平的铜的实例是达到200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、或达到10000ppm的Cu。Cu的含量应是至少0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2、3、4、5、6、7、8、9或至少10ppm。措词ppm是指百万分之(w/w)，例如mg/kg，并且可利用其原子量(近似63.5)转化为Cu的摩尔浓度，如本领域已知的，例如1mM Cu相当于63.5ppm Cu。
在特定的实施方案中，本发明的蛋白酶是分离和/或纯化的。如在此所限定的，″分离″的多肽是基本上没有其它多肽的多肽，例如通过SDS-PAGE所确定的，至少大约20％纯、优选至少大约40％纯、更优选大约60％纯，更优选大约80％纯、最优选大约90％纯、以及最优选大约95％纯。
由本发明的核酸序列编码的多肽也包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽是在多肽或其片段的N-末端或C-末端融合的。融合多肽是通过将编码另一个多肽的核酸序列(或其部分)与本发明的核酸序列(或其部分)融合而产生的。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列以使得它们在读框内，并且融合多肽的表达是在相同启动子和终止子的调控之下。
在特定的实施方案中，本发明的多肽不包括(即，排除)：a)SEQ ID NO：4的第-186至188，-167至188、或1-188位氨基酸；b)SEQ ID NO：2的第1-188位氨基酸；c)来自达松维尔拟诺卡氏菌NRRL 18133的蛋白酶，其在WO 88/03947中有描述，优选其具有经SDS-PAGE确定为20,500道尔顿的分子量(MW)和pI为9.15和8.2的等电点；d)来自拟诺卡氏菌种的蛋白酶，其在JP 2255081A中有描述，优选其具有经SDS电泳确定为21,000Da的MW和10-12的最适pH；和/或e)来源于由德国专利号DD 2,004,328所描述的达松维尔拟诺卡氏菌种的菌株zIMET 43647的蛋白酶。
核酸序列
本发明也涉及编码本发明多肽的分离核酸序列。本发明的特定核酸序列是SEQ ID NO：13的第726-1283位核苷酸、SEQ ID NO：11的第499-1062位核苷酸、SEQ ID NO：9的第502-1065位核苷酸、SEQ ID NO：7的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO：5的第496-1059位核苷酸。本发明的另一个特定核酸序列是包含于质粒中的序列，优选其成熟多肽的编码区，其中该质粒包含于保藏的微生物大肠杆菌DSM 15509中。本发明也包括编码具有SEQID NO：14的第1至186位氨基酸，和/或(SEQ ID NOs：12、10、8、6、4或2)的第1-188位氨基酸的氨基酸序列多肽的核酸序列，其由于遗传密码的简并性而不同于相应的核苷酸序列。本发明也涉及编码具有蛋白酶活性的上述氨基酸序列的编码片段的上述核苷酸序列的亚序列。
在亚序列中已经从5′和/或3′末端缺失掉一个或多个核苷酸。优选地，亚序列包含至少150、190或至少225个核苷酸，更优选至少300个核苷酸，更优选至少375、450、500、531、600、700、800、900、1000、或1100个核苷酸。
本发明也涉及编码在存在铜时更稳定，和/或较少受到铜抑制的蛋白酶的核苷酸序列，其与SEQ ID NO：13的第726-1283位核苷酸、SEQ ID NO：11的第499-1062位核苷酸、SEQ ID NO：9的第502-1065位核苷酸、SEQ IDNO：7的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO：5的第496-1059位核苷酸、SEQID NO：3的第559-1122位核苷酸、和/或SEQ ID NO：1的第900-1466位核苷酸具有至少40％的同一性程度。在特定的实施方案中，同一性程度是至少42％、45％、47％、50％、52％、55％、57％、60％、62％、64％、65％、67％、70％、72％、75，77％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％，或至少97％。
本发明也涉及在上述任何核苷酸序列中包括至少一个突变的突变核酸序列，其中突变的核酸序列编码多肽(i)由任何相应的氨基酸序列组成，或(ii)是(i)的任何序列的变体，其中该变体包括取代、缺失、和/或插入一个或多个，或(iii)是(i)的任何序列的等位变体，或(iv)是(i)的任何序列的片段。
用于分离或克隆编码多肽的核酸序列的技术是本领域已知的，并且包括从基因组DNA分离，从cDNA或其组合制备。从这种基因组DNA克隆本发明的核酸序列可能受到，例如利用公知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选以检测克隆到的具有共同结构特性的DNA片段的影响。参见例如，Innis等人，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，AcademicPress，纽约。可使用其它的核酸扩增方法，例如连接酶链式反应(LCR)、连接活化的转录(LAT)和依赖于核酸序列的扩增(NASBA)。可从Brachysporiella(Ascotaiwania)的菌株、或拟诺卡氏菌的菌株、或从其它或相关的生物体克隆核酸序列，因此例如可以是核酸序列的多肽编码区的等位基因或种属变体。
如在此所使用的，术语″分离的核酸序列″是指基本上没有其它核酸序列的核酸序列，例如通过琼脂糖电泳所确定的，至少大约20％纯、优选至少大约40％纯、更优选至少大约60％纯，更优选至少大约80％纯、以及最优选至少大约90％纯。例如，可通过用于遗传工程以从其天然位置重新定位核酸序列至其可再生的不同位点的标准克隆方法来获得分离的核酸序列。该克隆方法可包括切割和分离包括编码多肽的核酸序列的所需核酸片段，将该片段插入到载体分子中，以及将重组载体整合到宿主细胞中，其中可复制该核酸序列的多个拷贝或克隆。该核酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成的、合成的起源、或其任何组合。
编码本发明多肽的核酸序列的修饰可能是为合成与该多肽基本相似的多肽所必需的。术语与多肽″基本上相似的″是指该多肽的非天然存在形式。这些多肽可能在从其天然来源分离多肽的一些工程化方法中有差异，例如在特异活性、热稳定性、最适pH、变应原性等中有差异的变体。可根据作为SEQ ID NO：1、3，5、7、9、11或13的多肽编码部分而提供的核酸序列，例如其亚序列来构建变体序列，和/或通过导入不产生由该核酸序列编码的另一个氨基酸序列多肽、但是其相应于宿主生物体的密码子使用率而用于产生该蛋白酶的核苷酸取代，或通过导入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建变体序列。对于核苷酸取代的一般说明，参见例如Ford等人，1991，Protein Expression and Purification 2：95-107。可例如，如上所述制备低-过敏原的多肽。
对本领域技术人员来说显而易见的是可在对分子功能至关重要的区域外部进行这种取代而仍然产生活性多肽。可根据本领域已知的方法鉴定对由本发明的分离核酸序列编码的多肽活性必需，因此优选不被取代的氨基酸残基，例如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变(参见，例如Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)。在后者的技术中，在分子中的每个带正电荷的残基导入突变，测试所得到的突变体分子的蛋白酶活性以鉴定对分子活性至关重要的氨基酸残基。也可通过由例如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记所确定的三维结构分析来确定底物-蛋白酶的相互作用位点(参见，例如de Vos等人，1992，Science 255：306-312；Smith等人，1992，Journalof Molecular Biology 224：899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Letters 309：59-64)。
本发明也涉及编码本发明多肽的分离核酸序列，其在极低严谨条件、优选低严谨条件、更优选中等严谨条件、更优选中等-高严谨条件、更优选高严谨条件、以及最优选极高严谨条件下与核酸探针杂交，其中该核酸探针在相同条件下与在此所限定的SEQ ID NO：13的第726-1283位核苷酸、SEQ ID NO：11的第499-1062位核苷酸、SEQ ID NO：9的第502-1065位核苷酸、SEQ ID NO：7的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO：5的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO：3的第559-1122位核苷酸、和/或SEQ ID NO：1的第900-1466位核苷酸；或其互补链；或等位变体及其亚序列(Sambrook等人，1989，上文)杂交。
本发明也涉及由(a)在极低、低、中等、中等-高、高、或极高的严谨条件下与(i)SEQ ID NO：13的第726-1283位核苷酸、SEQ ID NO：11的第499-1062位核苷酸、SEQ ID NO：9的第502-1065位核苷酸、SEQ ID NO：7的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO：5的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO：3的第559-1122位核苷酸、和/或SEQ ID NO：1的第900-1466位核苷酸；(ii)(i)的亚序列，或(iii)(i)、或(ii)的互补链杂交的DNA；以及(b)分离核酸序列而产生分离的核酸序列。亚序列优选是至少100个核苷酸的序列，例如编码具有蛋白酶活性的多肽片段的序列。
在特定的实施方案中，本发明的核酸序列不包括(即排除)：a)SEQ IDNO 3的第1-1122和/或559-1122位核苷酸；和/或b)SEQ ID NO：1的第1-1596和/或900-1466位核苷酸。
用于产生突变核酸序列的方法
本发明进一步涉及用于产生突变核酸序列的方法，包括在SEQ ID NO：13的第726-1283位核苷酸、SEQ ID NO：11的第499-1062位核苷酸、SEQ IDNO：9的第502-1065位核苷酸、SEQ ID NO：7的第496-1059位核苷酸、SEQID NO：5的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO：3的第559-1122位核苷酸、和/或SEQ ID NO：1的第900-1466位核苷酸，或其亚序列的成熟多肽编码序列中导入至少一个突变，其中突变的核酸序列编码由相应的氨基酸序列组成的多肽；或具有蛋白酶活性的其片段。
将突变导入到核酸序列中以使一个核苷酸变换为另一个核苷酸可能伴随有利用本领域中已知的任何方法的定点诱变。特别有用的是利用超螺旋的，具有令人感兴趣的插入的双链DNA载体和包含所需要突变的2个合成引物的方法。各自互补于载体相反链的寡核苷酸引物，借助于Pfu DNA聚合酶在温度循环期间延伸。在引物的整合上，产生了包含交错缺口的突变质粒。温度循环后，用特异于甲基化和半甲基化DNA的DpnI处理产物以消化亲本DNA模板并且选择包含突变的合成DNA。也可使用本领域已知的其它方法。
核酸构建体
本发明也涉及包括本发明核酸序列的核酸构建体，其中核酸序列与一个或多个指导编码序列在合适的宿主细胞中在与调控序列相适合的条件下表达的调控序列进行可操作地连接。可理解表达包括涉及产生多肽的步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
在此限定″核酸构建体″为单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因或已经对其进行改进而包含以不会另外存在于自然界的方式组合和毗邻的(juxtaposed)核酸节段。当核酸构建体包含所有为表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语表达盒同义。术语″编码序列″在此限定为直接指定为其蛋白质产物的氨基酸序列的核酸序列。一般通过核糖体结合位点(原核生物)或刚好位于mRNA5′末端开放阅读框上游的ATG起始密码子(真核生物)和刚好位于mRNA3′末端开放阅读框下游的转录终止子序列确定编码序列的边界。编码序列可包括但不限于，DNA、cDNA和重组的核酸序列。
可以多种方式操作编码本发明多肽的分离核酸序列以保证多肽表达。在将核酸序列插入到载体中之前，根据表达载体其操作可以是合乎需要的或必须的。利用重组DNA方法来改进核酸序列的技术是本领域公知的。
术语″调控序列″在此限定为包括对于本发明多肽的表达必须或有利的所有成分。各个调控序列可以是天然的或与编码多肽的核酸序列是外源的。这种调控序列包括但不限于，前导、多聚腺苷酸序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少调控序列包括启动子和转录及翻译终止信号。对调控序列可提供接头以便导入便于连接调控序列和编码多肽的核酸序列编码区的特异限制酶切位点。术语″可操作地连接″在此限定为其中将调控序列适当地置于相对于DNA序列的编码序列的位置以使得该调控序列指导多肽表达的构型。
调控序列可以是适当的启动子序列，由用于表达核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列包含介导多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可从编码胞外或胞内多肽的、与宿主细胞同源或异源的基因获得。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、和尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)基因获得的启动子，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的混合启动子)、其突变的、截短的、和混合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子是从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因获得的。其他用于酵母宿主细胞的的有用启动子在Romanos等人，1992，Yeast 8：423-488中有描述。
用于指导本发明的核酸构建体特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从大肠杆菌乳糖操纵子(lac)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂水解酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、和原核的β-内酰胺酶(Villa-Kamaroff et al.，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：3727-3731)基因获得的启动子，以及tac启动子(DeBoer等人，1983，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 80：21-25)。进一步的启动子在″Usefulproteins from recombinant bacteria″in Scientific American，1980，242：74-94；和Sambrook等人，1989，同上文中有描述。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。将终止子序列可操作地与编码多肽的核酸序列的3′末端连接。任何在所选择的宿主细胞中是功能性的终止子都可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶基因获得的。
用于酵母宿主细胞的优选终止子是从酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因获得的。其它用于酵母宿主细胞的有用终止子在Romanos等人，1992，同上文中有描述。
用于细菌宿主细胞，例如芽胞杆菌宿主细胞的优选终止子是来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、或解淀粉芽胞杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的终止子。
调控序列也可以是合适的前导序列，mRNA的非翻译区，其对于宿主细胞的翻译是很重要的。将前导序列与编码多肽的核酸序列的5′末端可操作地连接。任何在所选择的宿主细胞中有功能的前导序列都可用于本发明。
用于丝状真菌的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶基因获得的。
用于酵母宿主细胞的合适前导序列是从酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子、和酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)基因获得的。
调控序列也可以是多聚腺苷酸序列，是可操作地与核酸序列的3′末端连接的序列，并且当其转录时，受到宿主细胞识别作为向转录的mRNA加入多聚腺苷残基的信号。任何在所选择的宿主细胞中有功能的多聚腺苷酸序列都可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选多聚腺苷酸序列是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉氨基苯甲酸合酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶基因获得的。
用于酵母宿主细胞的有用多聚腺苷酸序列在Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990中有描述。
调控序列也可以是编码与多肽氨基末端连接并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径的氨基酸序列的信号肽编码区。核酸序列的编码序列的5′末端可固有地包含在翻译阅读框中与编码分泌多肽的编码区节段天然连接的信号肽编码区中。备选地，编码序列的5′末端可包含与编码序列外源的信号肽编码区。外源的信号肽编码区可能是当编码序列不天然地包含信号肽编码区时所必需的。备选地，外来的信号肽编码区可简单地替代天然的信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，任何指导表达多肽进入所选择的宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可用于本发明。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码区是从芽孢杆菌NCIB 11837生麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽胞杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)基因和枯草芽孢杆菌prsA获得的信号肽编码区。进一步的信号肽在Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137中有描述。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码区是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶、和Humicola lanuginosa脂肪酶基因获得的信号肽区。
用于酵母宿主细胞的有用信号肽是从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶基因获得的。其它的有用信号肽编码区在Romanos等人，1992，同上文中有描述。
在优选的实施方案中，信号肽编码区选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11或13的信号肽编码区。
调控序列也可以是编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽编码区。所得到的多肽称为前酶或前多肽(或有时称为酶原)。前多肽一般是非活化的并且可通过前肽的催化或自催化切割而从前多肽转化为成熟的活性多肽。前肽编码区可从例如枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO 95/33836)基因获得。
在优选的实施方案中，前肽编码区选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11和13的前肽编码区。
其中信号肽和前肽区存在于多肽的氨基末端，前肽区紧接位于多肽的氨基末端而信号肽区紧接位于前肽区域的氨基末端。
表达载体
本发明也涉及包括本发明的核酸序列、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体。可将如上所述的包括多种核酸和调控序列连接在一起以产生重组表达载体，其可包括一个或多个便利的限制酶切位点以容许在这些位点插入或取代编码多肽的核酸序列。备选地，可通过插入核酸序列或包括进入适当表达载体的序列的核酸构建体表达本发明的核酸序列。在表达载体的产生中，编码序列位于载体中以便编码序列与用于表达的适当调控序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其可便利地经受重组DNA方法并且可实现核酸序列的表达。载体的选择一般取决于载体与其中将导入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性的或封闭的环状质粒。
载体可以是自我复制载体，即以染色体外的实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如质粒，染色体外的元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含任何用于确保自我复制的方式。备选地，载体可以是当被导入宿主细胞时，整合到基因组中并与其已经整合进入的染色体一起复制的载体。此外，可使用单个载体或质粒，或一起包含总DNA的两个或多个载体或质粒以导入宿主细胞的基因组或者可以使用转座子。
本发明的载体优选包含容许容易的选择转化细胞的一个或多个可选择的标记物。可选择的标记物是提供抗微生物性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等的基因产物。细菌的可选择标记物的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因。用于酵母宿主细胞的合适标记物是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的可选择标记物包括但不限于，amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素转乙酰酶(phosphinothricia acetyltransferase))、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸酯脱羧酶)、sC(硫酸腺嘌呤转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，及其等同物。优选用于曲霉细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本发明的载体优选包含容许载体稳定整合到宿主细胞基因组中或容许载体在细胞中不依赖于基因组而自发复制的元件。
对于整合到宿主细胞基因组中，载体可能依赖于编码多肽的核酸序列或通过同源或非同源重组将载体稳定整合到基因组中的其它任何元件。备选地，载体可包含对于通过同源重组到宿主细胞基因组中而指导整合的附加核酸序列。附加的核酸序列能够使载体在染色体的准确位置整合到宿主细胞基因组中。为了增加在准确位置整合的可能性，整合元件优选应包含足够数目的核酸，例如100至1,500个碱基对，优选400至1,500个碱基对，以及最优选800至1,500个碱基对，其与相应的靶序列是高度同源的以增强同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的核酸序列。另一方面，载体可通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自我复制，载体可进一步包括能够使载体在所述的宿主细胞中自主复制的复制原点。细菌复制原点的实例是容许在大肠杆菌中复制的pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184，以及容许在芽胞杆菌中复制的pUB110、pE194、pTAl060、和pAMβ1的质粒复制原点。用于酵母宿主细胞的复制原点的实例是2微粒复制原点(micron origin of replication)、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。复制原点可以是具有突变的原点，其在宿主细胞中产生功能性温度灵敏性(参见，例如Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1433)。
可将本发明的核酸序列的一个以上拷贝插入到宿主细胞中以增加基因产物的生产。可通过将序列的至少一个附加拷贝整合到宿主细胞基因组中，或通过包括扩增伴随核酸序列的可选择标记基因来获得增加拷贝数的核酸序列，其中细胞包含扩增拷贝的可选择标记基因，由此可通过在存在适当的可选择试剂时培养细胞而选择附加拷贝的核酸序列。
用于连接如上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员已知的(参见，例如Sambrook等人，1989，上文)。
蛋白酶也可以与至少一种令人感兴趣的动物饲料的其他酶一起共表达，例如肌醇六磷酸酶(phytase)(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4.-.-)，磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)。
酶可以是从不同的载体、从1个载体，或利用两种方法的混合而共表达的。当利用不同的载体时，载体可能具有不同的可选择标记物和不同的复制原点。当只利用1个载体时，可从一个或多个启动子表达基因。如果在1个启动子(二-或多-顺反子)的调控下克隆，其中克隆基因的顺序可能影响蛋白质的表达水平。蛋白酶也可表达为融合蛋白质，即编码蛋白酶的编码已经与编码另一个蛋白质的基因在框内融合。该蛋白质可以是另一个酶或来自另一个酶的功能域。
宿主细胞
本发明也涉及包括本发明核酸序列的重组宿主细胞，其可有利地用于多肽的重组生产。将包括本发明核酸序列的载体导入宿主细胞以使得该载体保持作为染色体的整合部分或如早先所描述的作为染色体外自我复制的载体。术语″宿主细胞″包括由于复制期间发生突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞的后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是单细胞的微生物，例如原核生物或非单细胞微生物，例如真核生物。
有用的单细胞是例如革兰氏阳性细菌的细菌细胞，包括但不限于，芽胞杆菌属细胞、或链霉菌属细胞、或乳酸菌属的细胞；或革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌和假单胞菌种属，乳酸菌包括但不限于乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptcoccus)、小球菌属(Pediococcus)和肠球菌属(Enterococcus)的种类。
载体进入细菌宿主细胞的导入可例如受到原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)、利用感受态细胞(参见，Young and Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)、或结合作用(参见例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology169：5771-5278)的影响。
宿主细胞可以是真核生物，例如非人动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、或真菌细胞。
在特定的实施方案中，宿主细胞是真菌细胞。在此使用的″真菌″包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(正如Hawksworth等人，In，Ainsworth和Bisby′s Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press，剑桥，UK所限定的)，以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等人，1995，上文，第171页所引用的)，和所有的有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，上文)。
在另一个特定的实施方案中，真菌宿主细胞是酵母细胞。如在此使用的″酵母″包括产子囊孢子酵母(内孢霉目(Endomycetales))、产担子孢子酵母(basidiosporogenous)、和属于不完全真菌类(Fungi Imperfecti)的酵母(芽生菌目(Blastomycetes))。因为将来酵母的分类法可能有变化，为了本发明的目的，应如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，and Davenport，R.R.eds，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)所描述的限定酵母。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊氏酵母属(Hansenula)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或Yarrowia细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。″丝状真菌″包括真菌门和卵菌门亚门的所有丝状体(正如Hawksworth等人，1995，上文所定义的)。丝状真菌的特点在于菌丝体的壁由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、和其他复合多糖组成。营养生长是通过菌丝的伸长而碳代谢是专性需氧的。相比之下，例如酿酒酵母的酵母营养生长是通过单细胞原植体(thallus)的出芽而碳代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞的实例是下列种属的细胞，但不限于枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、腐殖菌属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、草根霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉属(Trichoderma)。
可通过包括原生质体形成、原生质体转化和本身已知方式的细胞壁再生的方法转化真菌细胞。用于转化曲霉宿主细胞的合适方法在EP 238 023和Yelton等人，1984，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81：1470-1474中有描述。用于转化镰刀菌属种属的合适方法在Malardier等人，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787中有描述。可利用Becker和Guarente，In Abelson，J.N.和Simon，M.I.，编辑，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology，Methods in Enzymology，第194卷，第182-187页，AcademicPress，Inc.，纽约；Ito等人，1983，Journal of Bacteriology 153：163；和Hinnen等人，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1920描述的方法转化酵母。
生产方法
本发明也涉及生产本发明的多肽的方法包括(a)培养其野生型能够产生多肽的菌株；以及(b)回收多肽。优选地，菌株属于Brachysporiella属，例如Brachysporiella gayana、或属于拟诺卡氏菌属，例如达松维尔拟诺卡氏菌或Nocardiopsis alba。最优选的野生型菌株是：达松维尔拟诺卡氏菌DSM43235、Nocardiopsis alba DSM 15647、Nocardiopsis prasina DSM 15649、Nocardiopsis prasinaDSM 15648、和Brachysporiella gayana CGMCC 0865。本发明也涉及用于产生本发明多肽的方法，包括(a)在有利于产生多肽的条件下培养宿主细胞；以及(b)回收多肽。
本发明也涉及用于产生本发明多肽的方法，包括(a)在有利于产生多肽的条件下培养宿主细胞，其中宿主细胞包括在SEQ ID NO：13的第726-1283位核苷酸、SEQ ID NO：11的第499-1062位核苷酸、SEQ ID NO：9的第502-1065位核苷酸、SEQ ID NO：7的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO：5的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO：3的第559-1122位核苷酸、和/或SEQID NO：1的第900-1466位核苷酸中包括至少一个突变的突变核酸序列，其中突变的核酸序列编码相应的多肽，其(i)由SEQ ID NO：14的第1至186位氨基酸、或(SEQ ID NOs：12、10、8、6、4或2)中任何一项的第1-188位氨基酸组成，或(ii)是(i)的任何序列的变体，其中变体包括取代、缺失、和/或插入一个或多个氨基酸，或(iii)是(i)的任何序列的等位变体，或(iv)是(i)的任何序列的片段。
在本发明的生产方法中，在适于产生多肽的营养培养基中利用本领域已知的方法培养细胞。例如，可通过摇瓶培养、在实验室或工业发酵罐中、在合适的培养基和在容许多肽表达和/或分离的条件下进行小规模的或大规模的发酵(包括连续、分批、分批饲养、或固态发酵)而培养细胞。在包括碳和氮源和无机盐的合适营养培养基中利用本领域已知的方法进行培养。可从供应商获得合适的培养基或可根据公开的组合物(例如，美国典型培养物保藏中心的目录)制备合适的培养基。如果多肽分泌到营养培养基中，可直接从培养基回收多肽。如果多肽不分泌，可从细胞裂解物回收多肽。
可利用本领域已知的特异于该多肽的方法检测多肽。检测方法可包括特异抗体的使用、产物的形成、或底物的消失。例如，可使用蛋白酶分析确定在此所描述的多肽的活性。
可通过本领域已知的方法回收所得到的多肽。例如，可通过传统方法从营养培养基回收多肽，包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
可通过本领域已知的多种方法纯化本发明的多肽，包括但不限于色谱法(例如，离子交换、亲合、疏水性的、色谱聚焦、和大小排阻)、电泳方法(例如预备性的等电聚焦)、差异溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden，编辑，VCHPublishers，纽约，1989)。
植物
本发明也涉及转基因植物、植物部分、或植物细胞，其已经用编码具有本发明的蛋白酶活性的多肽的核酸序列转化以使得表达和产生可收回数量的多肽。可从植物或植物部分回收多肽。备选地，包含重组多肽的植物或植物部分可用作改善食品或饲料的品质，例如改善营养价值、可口性(palatability)、和流变性，或破坏抗营养因子。
在特定的实施方案中，该多肽指向种子中的胚乳贮存液泡。这可通过合成具有合适信号肽的前体而获得，参见Horvath等人in PNAS，2000年2月15日，第97卷，no.4，第1914-1919页。
转基因的植物可以是双子叶(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)或其改造的变体。单子叶植物的实例是草，例如草地早熟禾(meadow grass)(blue grass，早熟禾属(Poa))、饲用牧草，例如羊矛属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)、寒地型牧草(temperature grass)，例如剪股颖属(Agrostis)，以及谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高粱和王蜀黍(玉米)。双子叶植物的实例是烟草、豆类，例如羽扇豆(lupin)、马铃薯、甜菜、豌豆、菜豆和大豆，以及十字花科植物(Cruciferous)(十字花科(Brassicaceae))，例如花椰菜、油菜籽，以及紧密相关的模式生物体拟南芥(Arabidopsisthaliana)。如例如在美国专利号5,689,054和美国专利号6,111,168中所描述的低-肌醇六磷酸植物是工程化植物的实例。
植物部分的实例是茎干、愈伤组织、叶片、根、果实、种子和球根，以及包括这些部分的个别组织，例如表皮、叶肉、薄壁组织、维管组织、分生组织。也认为特异的植物细胞隔室，例如叶绿体、非原质体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和细胞质是植物部分。此外，任何植物细胞，无论何种组织起源，都被认为是植物部分。同样地，也认为例如有助于本发明应用的分离的特异组织和细胞是植物部分，例如胚芽、胚乳、糊粉粒和种皮。
这些植物、植物部分和植物细胞的后代也包括在本发明的范围内。
可根据本领域已知的方法构建表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞。简而言之，通过将编码本发明多肽的一个或多个表达构建体整合到植物宿主基因组中构建植物或植物细胞，并繁殖所得到的修饰植物或植物细胞成为转基因植物或植物细胞。
便利地，表达构建体是核酸构建体，其包括与在选择的植物或植物部分中为表达核酸序列所需要的适当调控序列可操作连接的编码本发明多肽的核酸序列。此外，表达构建体可包括用于鉴定其中已经整合入表达构建体宿主细胞和为将构建体导入所述植物必需的DNA序列的可选择标记物(后者取决于所使用的DNA导入方法)。
根据需要多肽在何时，何处以及如何表达来确定调控序列的选择，例如启动子和终止子序列以及任选的信号或转运序列。例如，编码本发明多肽的基因表达可以是组成性或可诱导的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可定向至例如种子或叶片的特异组织或植物部分。调控序列是例如Tague等人，1988，Plant Physiology 86：506所描述的。
对于组成性的表达，可使用下列：可使用35S-CaMV启动子(Franck等人，1980，Cell 21：285-294)、玉米泛素(Christensen AH，Sharrock RA和Quail 1992.Maize polyubiquitin genes：structure，thermal perturbation ofexpression and transcript splicing，and promoter activity following transfer toprotoplasts by electroporation)、或水稻肌动蛋白1启动子(Plant Mo.Biol.18，675-689.；Zhang W，McElroy D.和Wu R 1991，Analysis of rice Actl 5aregion activity in transgenic rice plants.Plant Cell 3，1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如，来自例如种子、马铃薯块茎和果实的贮存库(sink)组织的启动子(Edwards & Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)、或来自例如分生组织的代谢贮源组织的启动子(Ito等人，1994，Plant Mol.Biol.24：863-878)，种子特异的启动子，例如谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白、或来自水稻的白蛋白启动子(Wu等人，1998，Plant and Cell Physiology39：885-889)、来自豆球蛋白B4的蚕豆(Vicia faba)启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白质基因(Conrad等人，1998，Journal of Plant Physiology 152：708-711)、来自植物油体蛋白质的启动子(Chen等人，1998，Plant and CellPhysiology 39：935-941)、来自芸苔(Brassica napus)的贮存蛋白质napA启动子、或本领域已知的任何其它种子特异的启动子，例如在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可以是叶片特异的启动子，例如来自水稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等人，1993，Plant Physiology 102：991-1000，小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins，1994，Plant MolecularBiology 26：85-93)、或来自水稻的aldP基因启动子(Kagaya等人，1995，Molecular and General Genetics 248：668-674)、或创伤可诱导的启动子，例如马铃薯pin2启动子(Xu等人，1993，Plant Molecular Biology 22：573-588)。同样，启动子可以是通过非生物的处理，例如温度、干旱或盐碱度改变而可诱导的，或通过外部施用活化启动子的物质，例如乙醇、雌激素、植物激素，如乙烯、脱落酸、赤霉酸和/或重金属而进行诱导。
也可使用启动子增强子元件而在植物中获得更高表达的蛋白酶。例如，启动子增强子元件可以是置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间的内含子。例如，Xu等人，1993，上文公开了利用水稻肌动蛋白1基因的第一个内含子以增强表达。
更进一步地，可针对所述需要改善表达的植物品种优化密码子使用率(参见Horvath等人参考上文)。
可在本领域中选择可利用的选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分。
根据本领域已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，包括土壤杆菌-介导的转化、病毒-介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等人，1990，Science 244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto等人，1989，Nature 338：274)。
目前，根瘤土壤杆菌-介导的基因转移是选择用于产生转基因双子叶植物的方法(关于综述，参见Hooykas和Schilperoort，1992，Plant MolecularBiology 19：15-38)，并且它也可用于转化单子叶植物，尽管对于这些植物其它的转化方法一般是优选的。目前，选择用于产生转基因单子叶植物的方法，补充土壤杆菌方法的是粒子轰击(包被有转化DNA的显微黄金或钨颗粒)胚愈伤组织或发育的胚芽(Christou，1992，Plant Journal 2：275-281；Shimamoto，1994，Current Opinion Biotechnology5：158-162；Vasil等人，1992，Bio/Technology 10：667-674)。用于转化单子叶植物的备选方法是基于如Omirulleh等人，1993，Plant Molecular Biology 21：415-428所描述的原生质体转化。
转化后，选择其中已经整合入表达构建体的转化体，并且根据本领域众所周知的方法使其再生成为完全的植株。
本发明也涉及用于产生本发明多肽的方法，包括(a)在有利于产生多肽的条件下培养包括编码具有本发明蛋白酶活性的多肽德核酸序列的转基因植物或植物细胞；以及(b)回收该多肽。
动物
本发明也涉及转基因的非人动物和其产物或元件，其实例是例如乳汁和血液的体液、器官、肌肉和动物细胞。用于在例如哺乳动物细胞中表达蛋白质的技术是本领域已知的，参见例如手册Protein Expression：A PracticalApproach，Higgins and Hames(编辑)，Oxford University Press(1999)，和其它3本该系列关于基因转录、RNA加工和翻译后过程的手册。一般说来，为了制备转基因的动物，所选择动物的选择细胞是用编码具有本发明蛋白酶活性的多肽的核酸序列转化以便表达和产生该多肽。可从动物，例如雌性动物的乳汁回收多肽，或表达该多肽可能对动物本身有益，例如有助于该动物的消化。下文在标题为动物饲料的小节提及动物的实例。
考虑到从动物的乳汁回收蛋白酶，为了产生转基因的动物，可将编码蛋白酶的基因插入到所述动物的受精卵中，例如使用包括合适的乳蛋白启动子和编码蛋白酶的基因的转基因表达载体。将转基因表达载体微注射到受精卵中，并且优选永久地整合到染色体中。一旦卵开始生长和分裂，将潜能胚胎植入到代孕母体中，并且鉴定携带转基因的动物。因此可通过传统的育种繁殖所得到的动物。可从动物的乳汁纯化多肽，参见例如Meade，H.M.等人(1999)：Expression of recombinant proteins in the milk of transgenicanimals，Gene expression systems：Using nature for the art of expression.J.M.Fernandez and J.P.Hoeffler(编辑)，Academic Press。
可选的，为了产生在其体和/或生殖细胞的基因组中携带核酸序列，包括包含编码蛋白酶的转基因的异种转基因构建体的转基因非人动物，可如在WO 2000064247中所公开的，将转基因与用于蛋白酶的唾液腺特异性表达的第一调控序列可操作地连接。
组合物
在更进一步的方面，本发明涉及包括本发明多肽的组合物。
可根据本领域已知的方法制备多肽组合物并且其可以是液体或干燥组合物的形式。例如，多肽组合物可以是颗粒化或微粒化的形式。可根据本领域已知的方法稳定被包括在组合物中的多肽。
如下给出优选使用本发明的多肽或多肽组合物的实例。
动物饲料
本发明也涉及在动物饲料中利用本发明蛋白酶的方法，以及包括这些多肽的饲料组合物和饲料添加剂。
术语动物包括所有的动物，包括人类。动物的实例是非反刍动物、和反刍动物，例如绵羊、山羊、马和牛，例如肉用牛(bef cattle)、奶牛和仔牛犊。在特定的实施方案中，动物是非反刍动物动物。非反刍动物动物包括单胃动物，例如猪或家猪(swine)(包括但不限于，仔猪、生长猪和大母猪)；家禽，例如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉用小鸡(broiler chicks)、产蛋鸡(layer))；仔牛犊；和鱼(包括但不限于鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼)；以及甲壳类(包括但不限于虾和对虾)。
术语饲料或饲料组合物是指适于或旨在用于动物摄取的任何化合物、制剂、混合物、或组合物。
根据本发明的用途，可将蛋白酶在日常饮食之前、之后或同时喂给动物。后者是优选的。
在特定的实施方案中，明确限定蛋白酶加入饲料的形式或何时包括在饲料添加剂中。明确限定是指通过大小排阻色谱法确定蛋白酶制剂是至少50％纯的(参见WO 01/58275的实施例12)。在其它特定的实施方案中，通过这个方法确定的蛋白酶制剂是至少60、70、80、85、88、90、92、94或至少95％纯的。
明确限定的蛋白酶制剂是有利的。例如，对于饲料使用基本上没有其它蛋白酶干扰或污染的蛋白酶更容易正确用量。术语正确用量特别是指为了获得一致和恒定结果的目的，以及根据预期效果优化剂量的能力。
然而关于动物饲料中的使用，蛋白酶不必是很纯的；它可例如包括其它的酶，而在这种情况下它可限定为蛋白酶制剂。
蛋白酶制剂可以是(a)直接加入饲料(或在植物蛋白的处理过程中直接使用)，或(b)可用于一个或多个中间组合物，例如饲料添加剂或预混合料的生产，随后将其加入饲料(用于处理过程)。如上所述的纯度是指原始蛋白酶制剂的纯度，不管是用于上述的(a)或(b)。
利用重组的生产方法可特别地获得具有这个数量级纯度的蛋白酶制剂，然而不是可轻易地获得它们，并且当通过传统发酵方法生产蛋白酶时，会有更多的批间差异。
当然这种蛋白酶制剂可与其它酶混合。
在特定的实施方案中，本发明所述的蛋白酶能够溶解植物蛋白。在WO01/58276的实施例4中公开了用于确定溶解蛋白质的合适分析。
如在此所使用的术语植物蛋白是指包括至少一种衍生自或起源于植物的蛋白质，包括修饰的蛋白质和蛋白质-衍生物的任何化合物、组合物、制剂或混合物。在特定的实施方案中，植物蛋白的蛋白质含量是至少10、20、30、40、50、或60％(w/w)。
植物蛋白可衍生自植物蛋白来源，例如豆类和谷类，例如来自豆科(Leguminosae)、十字花科、藜科(Chenopodiaceae)、和禾本科(Poaceae)植物的材料，例如大豆粗粉、羽扇豆粗粉和油菜籽粉。
在特定的实施方案中，植物蛋白来源是来自一种或多种豆科植物，例如大豆、羽扇豆、豌豆或菜豆的材料。
在另一个特定的实施方案中，植物蛋白来源是来自一种或多种藜科植物，例如甜菜、制糖甜菜(sugar beet)、菠菜或奎藜籽(quinoa)的材料。
植物蛋白来源的其它实例是油菜籽和卷心菜。
大豆是优选的植物蛋白来源。
植物蛋白来源的其它实例是谷类，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、王蜀黍(玉米)、水稻和高粱。
用本发明的至少一种蛋白酶处理本发明所述的植物蛋白导致增加植物蛋白的溶解作用。
术语蛋白质的溶解作用主要是指使蛋白质成为溶液。这种溶解作用可能是由于蛋白酶介导从通常复合的天然组合物，例如饲料的其它成分释放蛋白质。可根据参照没有蛋白酶处理的空白样品，可溶蛋白质数量的增加来测量溶解作用。
在本发明(预)处理过程的的特定实施方案中，所述的蛋白酶影响(或作用于，或施加其溶解影响于)植物蛋白或蛋白质来源。为了获得这些，一般将植物蛋白或蛋白质来源悬浮在例如水溶剂的溶剂中，例如水，并且调节pH和温度值，尤其考虑到所述酶的特性。例如，可在实际蛋白酶的活性至少相同的pH-值下进行处理，例如可在实际蛋白酶的活性至少40％、50％、60％、70％、80％或至少90％的温度下进行处理。上述百分比活性表示相对的最大活性。继续酶促反应直到获得所需要的结果，其后可以或未必通过使酶失活，例如通过热处理步骤而加以终止。
在本发明处理过程的另一个特定实施方案中，持续蛋白酶作用，意味着例如向植物蛋白或蛋白质来源加入蛋白酶，但其溶解影响可能没有启动直到稍晚，当需要时，一旦建立合适的溶解条件，或一旦任何酶抑制剂失活，或诸如此类的其它方式可用于推迟酶的作用。
在一个实施方案中，处理是动物饲料或植物蛋白的预处理而用于动物饲料。
术语改善动物饲料的营养价值是指改善蛋白质的可利用性，由此导致增加蛋白质的提取、更高的蛋白产率、和/或改善的蛋白质利用。因此增加饲料的营养价值，改善动物的生长速率和/或增重和/或饲料转化(即相对于体重增加的可摄取饲料的重量)。
可以任何形式向饲料加入蛋白酶，可以是相对纯的蛋白酶，或与旨在加入动物饲料的其它成分混合，即以动物饲料添加剂的形式，例如所谓用于动物饲料的预混合物。
在进一步的方面，本发明涉及用于动物饲料的组合物，例如动物饲料，和动物饲料添加剂，例如预混合料。
除本发明的蛋白酶外，本发明的动物饲料添加剂包含至少一种脂溶性的维生素，和/或至少一种水溶性的维生素，和/或至少一种微量矿物质。饲料添加剂也可包含至少一种大量矿物。
进一步任选的，饲料-添加剂是着色剂、芳香族化合物、稳定剂、抗菌的肽，包括抗真菌的多肽，和/或至少一种选自下列的其它酶：肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4.-.-)、磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)。
在特定的实施方案中，这些其它酶是明确限定的(如上述用于蛋白酶制剂所限定)。
抗菌肽(AMP′s)的实例是CAP18、Leucocin A、Tritrpticin、内源性抗微生物多肽-1、Thanatin、防卫素(Defensin)、乳铁传递蛋白、乳铁结合蛋白和Ovispirin，例如Novispirin(Robert Lehrer，2000)、Plectasins、和抑制素，包括在WO 03/044049和WO 03/048148中公开的化合物和多肽，以及上述保持抗菌活性的肽的变体或片段。
抗真菌多肽(AFP′s)的实例是巨曲霉(Aspergillus giganteus)，和黑曲霉肽，以及保持抗真菌活性的其变体和片段，如在WO 94/01459和WO02/090384中所公开的。多聚不饱和脂肪酸的实例是C18、C20和C22多聚不饱和脂肪酸，例如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和γ-亚油酸。产生活性氧种类的实例是例如过硼酸盐、过硫酸盐、或过碳酸盐的化学试剂；和例如氧化酶、氧合酶或合成酶。
通常脂溶或水溶性的维生素，以及微量矿物质形成将加入饲料的所谓预混合料的部分，而通常将大量矿物质单独加入饲料。富集本发明蛋白酶的预混合料是本发明的动物饲料添加剂的实例。
在特定的实施方案中，本发明的动物饲料添加剂预期包括(或如必须包括时规定)在动物的日常饮食中，或以0.01至10.0％；更特别为0.05至5.0％；或0.2至1.0％的水平喂饲(％是指每100g饲料的g添加剂)。这特别地用于预混合料。
下列是这些成分实例的非排他性列表：
脂溶性维生素的实例是维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K，例如维生素K3。
水溶性维生素的实例是维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸(panthothenate)、例如Ca-D-泛酸。
微量矿物质的实例是锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。
大量矿物质的实例是钙、磷和钠。
这些成分的营养需要量(以家禽和仔猪/猪例证)如WO 01/58275的表A所列。营养需要量是指在日常饮食中应以指明的浓度提供这些成分。
可选的，本发明的动物饲料添加剂包括WO01/58275的表A中列举的至少一种单独成分。在本文中，至少一种意味着任何一种、一种或多种、一种或2、或3、或4种等直到所有的13种、或直到所有的15种单独成分。更具体地说，这个至少一种单一成分包括在本发明的添加剂中，其在饲料浓度中呈现的数量是在表A的第4栏、第5栏、或第6栏指明的范围内。
同时上述″至少一个″的定义一般有效的遍及本专利申请--当然在以此类推的基础上，是指该定义的上限，在上述的实例15种中，当然应反映为在各个特定情况中给出选择的最大数目。
本发明也涉及动物饲料组合物。动物饲料组合物或日常饮食具有相对高含量的蛋白质。可如WO 01/58275的表B中第2-3栏所指明的表征家禽和猪的调养饲料。可如该表B的第4栏中所指明的表征鱼调养饲料。此外这种鱼调养饲料通常具有200-310g/kg含量的粗脂肪。
本发明所述的动物饲料组合物具有50-800g/kg含量的粗蛋白，此外包括至少一种在此所要求保护的蛋白酶。
此外，或可选的(关于如上所述的粗蛋白含量)，本发明的动物饲料组合物具有10-30MJ/kg的可代谢能量含量；和/或0.1-200g/kg的钙含量；和/或0.1-200g/kg的有效磷含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。
在特定的实施方案中，代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸、和/或赖氨酸的含量是在WO 01/58275表B中第2、3、4或5中任何一项的范围内(R.2-5)。
通过将氮(N)乘以因子6.25来计算粗蛋白，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。通过Kjeldahl定氮法(A.O.A.C.，1984，Official Methods ofAnalysis第14版，Association of Official Analytical Chemists，Washington DC)确定含氮量。
可根据NRC出版物Nutrient requirements in swine，第9修订版，1988，subcommittee on swine nutrition，committee on animal nutrition，board ofagriculture，national research council.National Academy Press，华盛顿，D.C.，第2-6页，和用于家禽饲料-原料的能量值欧洲表，Spelderholt centre forpoultry research and extension，7361 DA Beekbergen，荷兰，Grafisch bedrijfPonsen & looijen bv，Wageningen.ISBN 90-71463-12-5来计算可代谢能量。
根据例如Veevoedertabel 1997，gegevens over chemische samenstelling，verteerbaarheid en voederwaarde vanvoedermiddelen，Central Veevoederbureau，Runderweg 6，8219 pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7的饲料表来计算完全的动物调养饲料中的饮食性钙、有效磷和氨基酸含量。
在特定的实施方案中，本发明的动物饲料组合物包含至少一种如上所限定的植物蛋白或蛋白质来源。
在更进一步的特定实施方案中，本发明的动物饲料组合物包含0-80％的玉米；和/或0-80％的高粱；和/或0-70％的小麦；和/或0-70％的大麦；和/或0-30％的燕麦；和/或0-40％的大豆粉；和/或0-10％的鱼粉；和/或0-20％的乳清。
可将动物调养饲料制备成例如粉料(非颗粒)或颗粒饲料。一般地，混合碾磨的饲料-原料并且根据所述种属的规格加入足够数量的必需维生素和矿物质。可加入固体的酶或液体酶制剂。例如，一般在混合步骤前或在混合期间加入固体酶制剂；而一般在压丸(pelleting)步骤后加入液体酶制剂。也可将酶掺入到饲料添加剂或预混合料中。
调养饲料中的最终酶浓度是在每kg调养饲料0.01-200mg酶蛋白的范围内，例如在每kg动物调养饲料0.5-25，或5-30的范围内。
当然应该以有效量施加蛋白酶，即足够用于改善溶解作用和/或增加饲料的营养价值的数量。目前预期施用酶的一种或多种数量如下(剂量范围)：0.01-200；0.01-100；0.05-100；0.5-100；1-100；5-100；10-100；0.05-50；1-50；或0.10-10，所有这些范围是每kg饲料的mg蛋白酶的酶蛋白质(ppm)。
为了确定每kg饲料的mg酶蛋白，从饲料组合物纯化蛋白酶，利用相应的分析确定纯化蛋白酶的特异活性(见至活性，底物和分析)。利用相同的分析也因而确定饲料组合物的蛋白酶活性，并且根据这2个测定，计算每kg饲料的mg酶蛋白方式的剂量。
将相同的原则用于确定饲料添加剂中的mg酶蛋白。当然，如果可得到用于制备饲料添加剂或饲料的蛋白酶的样品，由此样品确定特异活性(不必从饲料组合物或添加剂纯化蛋白酶)。
在特定的实施方案中，本发明的动物饲料添加剂是预混合料。通常旨在将预混合料加入(夹杂至)动物饲料中。饲料中预混合料的一般包含率是0.01-10.0％，更特别为0.05-5.0％，或0.2-1.0％，一般为0.5-1.0％。当动物饲料中预混合料的包含率改变时，在预定、或指定多种成分的饲料中浓度方面描述这种预混合料是很有意义的。
本发明的预混合料包含本发明的蛋白酶，此外包含至少一种脂溶性-和/或水溶性维生素，和/或至少一种微量矿物质。
在特定的实施方案中，预混合料包括、包含或含有微量矿物质铜，通常为铜盐或铜离子的形式，即在其特定的无机盐中分别为Cu2+或Cu+。在本发明的预混合料的特定实施方案中预混合料包含的铜(Cu)的数量为，当以规定的包含率包括在饲料中时，饲料中的浓度(″在饲料中-浓度″)为1-500ppm的铜(ppm意味着例如mg/kg饲料)。
在进一步的特定实施方案中，铜的饲料中浓度低于或等于5、10、20、25、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、300，或低于或等于400ppm。另一方面，Cu的饲料中浓度应为至少Cu0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0，或至少5.0ppm。在此具体地包括利用上述指明的上下限中任何组的饲料中浓度的任何范围。其非限制性的实例是0.2-100、0.4-100、0.6-200、0.8-100、1-25、1-50、1-100、1-140、1-150、2-100、3-100、4-100、5-100、3-200、4-200、5-200、3-300、4-300和5-300ppm Cu。
因而预混合料中Cu的浓度当然比预定的饲料中浓度高，一般为饲料中浓度的100-200倍(分别以1％和0.5％的包含率为基础)。因此，预混合料可能含有、包含或包括浓度达到100,000ppm(500ppm饲料中浓度的200倍)的Cu，甚至更高。下列是预混合料中Cu浓度最大量的非限制性实例：1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000ppm Cu。下列是预混合料中Cu浓度最小量的非限制性实例：100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900，或2000ppm Cu。在此具体地包括利用上述指明的上下限中任何组的预混合料中浓度的任何范围。其非限制性的实例是100-100,000；200-90，000；300-80,000；400-70,000；500-50,000；100-10,000；100-5,000；和100-2000ppmCu。
下列是本发明的预混合料组合物的具体实例，所有的另外包括本发明的蛋白酶，其饲料中浓度为1-50mg/kg。多种其它预混合料成分下标明的浓度也是是饲料中浓度(每kg的饲料)。
用于仔猪调养饲料的预混合料(完全的配合饲料)：135ppm Cu、100ppmZn、90ppm Fe、50mg Mn、1.24ppm I、0.3ppm Se、0.10ppm Co、10000IE/kgvit.A、2000IE/kg vit.D3、90mg/kg vit.E、2.25ppm vit.B1、3.75ppm vit.B2、10.50ppm vit.B3、7.5ppm vit.B6、0.03ppm vit.B12、0.75ppm vit.K、0.06ppm vit.H、0.9ppm叶酸、16.5ppm烟酸。
另一种仔猪调养饲料的预混合料：14400IE vit.A、120000IE vit.D3、1440mg vit.E、2.4mg vit.B1、7.2mg vit.B2、30mg烟酸、4.8mg vit.B6、48μg vit.B12、240μg生物素、21.6mg泛酸、600mg氯化胆碱(Cholinchloride)、120mgZn、90mg Fe、90mg Mn、24mg Cu、1.8mg I、0.84mgCo、0，48mgSe、600mgMg。
第三种仔猪调养饲料的预混合料：210mg Zn、246mg Fe、84mg Mn、24mg Cu，和4mg I。
用于肉用仔鸡调养饲料的预混合料：视黄醇4.05；胆钙化醇0.05；生育酚13.5；甲萘醌2.25；硫胺素1；胆碱375；核黄素5.4；泛酸(panthothenicacid)13.5；吡哆醇1.1；氰钴胺素0.01；烟酸(nicotonic)40；生物素0.15；I 2.1；Co 1.4；Se 0.43；Cu 7.2；Mn 86；Zn 57；Fe 65；Mg 110。
用于其它肉用仔鸡调养饲料的预混合料包含8或10mg Cu/kg调养饲料。
清洁剂组合物
本发明的蛋白酶可加入清洁剂组合物并且因此成为清洁剂组合物的组分。
可将本发明的清洁剂组合物例如配制成为手洗或机洗清洁剂组合物，其包括适于预处理染色织物和漂洗加入的织物软化剂组合物的洗涤添加剂组合物，或配制成为供普通家庭的硬表面清洗操作之用的清洁剂组合物，配制用于手工或机械洗涤的操作。
在特定的方面，本发明提供包括本发明蛋白酶的去污添加剂。去垢添加剂以及清洁剂组合物可包括一种或多种其它的酶，例如脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。
总的来说，所选择的酶的特性应与所选择的清洁剂相适合，(即最适pH，与其它酶促或非酶促成分的相容性等)，并且该酶应以有效量存在。
合适的脂肪酶包括细菌或真菌起源的脂肪酶。包括化学上改进或蛋白质工程化的突变体。有用脂肪酶的实例包括来自腐殖菌属(同义语Thermomyces)的脂肪酶，例如来自如EP 258068和EP 305216中所描述的H.lanuginosa(T.lanuginosus)的脂肪酶，或来自如WO 96/13580中所描述的H.insolens的脂肪酶，假单胞菌(pseudomonas)脂肪酶，例如来自产碱杆菌假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱杆菌假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、施氏假单胞菌(P.Stutzeri)(GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.Fluorescens)、假单胞菌种菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)的脂肪酶，芽胞杆菌脂肪酶，例如来自枯草芽胞杆菌(Dartois等人(1993)，Biochemica et biophysica Acta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP64/744992)或短小芽胞杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)的脂肪酶。其它的实例是，例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260105、WO 95/35381、WO96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO97/04079和WO 97/07202中所描述的脂肪酶变体。优选的可商业购买的脂肪酶包括LipolaseTM和Lipolase UltraTM(Novozymes A/S)。
合适的淀粉酶(α-和/或β-)包括细菌或真菌起源的淀粉酶。包括化学上改进或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如，从芽胞杆菌，例如地衣芽孢杆菌的特殊菌株获得的α-淀粉酶，其在GB 1,296,839中有详细描述。有用淀粉酶的实例是在WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873、和WO97/43424中描述的变体，特别是在下列一个或多个位置中有取代：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。可商业购买的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BAN TM(Novozymes A/S)、RapidaseTM和PurastarTM(来自Genencor International Inc.)。
合适的纤维素酶包括细菌或真菌起源的纤维素酶。包括化学上改进或蛋白质工程化的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽胞杆菌属、假单胞菌属、腐殖菌属、镰刀菌属、草根霉属、枝顶孢属的纤维素酶，例如由US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178，US 5,776,757和WO89/09259中公开的Humicola insolens、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢产生的真菌纤维素酶。特别合适的纤维素酶是具有注意颜色好处(color care benefit)的碱性或中性的纤维素酶。这种纤维素酶的实例是在EP 0495257、EP 531372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其它的实例是例如在WO94/07998、EP 0531315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO95/24471、WO98/12307和WO 99/01544中描述的纤维素酶变体。可商业购买的纤维素酶包括CelluzymeTM、和CarezymeTM(Novozymes A/S)、ClazinaseTM、和Puradax HATM(Genencor International Inc.)、和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌起源的酶。包括化学上改进或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞菌(Coprinus)，例如灰盖鬼伞(C.cinereus)的过氧化物酶，以及在WO93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中描述的其变体。可商业购买的过氧化物酶包括Guardzyme TM(Novozymes)。
可通过加入包含一种或多种酶的单独添加剂，或通过加入包括所有这些酶的组合添加剂使清洁剂酶包括在清洁剂组合物中。可以颗粒、液体、匀浆等的形式配制本发明的去垢添加剂，即单独的添加剂或组合添加剂。优选的去垢添加剂制剂是颗粒，特别是无粉尘的颗粒、液体，特别是稳定的液体、或匀浆。
可如在US 4,106,991和4,661,452中公开的生产无粉尘的颗粒，并且可通过本领域已知的方法任选进行涂层。蜡状涂层材料的实例是平均摩尔量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基壬基酚；其中包含12至20个碳原子并且存在15至80个环氧乙烷单位的乙氧基脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单和双和三酸甘油酯。在GB 1483591中给出了适于通过流化床技术应用的成膜涂层材料的实例。可根据已建立的方法，通过加入多元醇，例如丙二醇，糖或糖醇、乳酸或硼酸稳定液体酶制剂。可根据EP 238216中公开的方法制备保护酶。
本发明的清洁剂组合物可以是任何便利的形式，例如棒状、片剂、粉剂、颗粒、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是含水的，一般包含达到70％的水和0-30％的有机溶剂，或是无水的。
清洁剂组合物包括一种或多种表面活性剂，其可以是非离子的，包括半极性的和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子的。表面活性剂一般以按重量计0.1％至60％的水平存在。
当包括在其中时，清洁剂通常包含大约1％至大约40％的阴离子表面活性剂，例如直链烷基苯磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸酯)、脂肪醇乙氧基硫酸酯、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基丁二酸或肥皂。
当包括在其中时，清洁剂通常包含大约0.2％至大约40％的非离子型表面活性剂，例如脂肪醇乙氧基化合物、羟乙基壬基酚酯、烷基聚糖苷、烷基二甲基胺氧化物、羟乙基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、聚羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(″葡糖酰胺″)。
清洁剂可能包含0-65％的清洁剂增效助剂或络合剂，例如沸石、二磷酸、三磷酸、膦酸酯、碳酸酯、柠檬酸酯、次氮基三乙酸(氨三乙酸)、乙二胺四乙酸、二乙撑三胺五乙酸、烷基或烯基丁二酸、可溶性硅酸盐或分层的硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。
清洁剂可包括一种或多种聚合物。实例是羧甲基纤维素、聚(乙烯替吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡淀-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯，例如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸酯共聚合物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸酯共聚合物。
清洁剂可能包含包括H2O2来源的漂白系统，例如可与过酸形式的漂白活化剂，例如四乙酰基乙二胺或壬酰基苯酚磺酸盐结合的过硼酸盐或过碳酸盐。备选地，漂白系统可包括例如酰胺、二酰亚胺、或砜类型的过氧酸。
可利用传统的稳定剂，例如多元醇，例如丙二醇或甘油，糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物，例如芳族的硼酸酯、或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰基苯基硼酸来稳定本发明的清洁剂组合物的酶，并且可如例如WO92/19709和WO 92/19708中所述的配制组合物。
清洁剂也可包含其它的传统清洁剂成分，例如织物调节剂，包括粘土、发泡剂、抑泡剂、防腐剂、污垢悬浮剂、抗污垢再沉积试剂、染料、杀菌剂、荧光增白剂、水溶增溶剂、晦暗抑制剂或芳香剂。
目前预期在清洁剂组合物中，可加入相当于每升洗涤溶液0.01-100mg酶蛋白的数量的任何酶，特别是本发明的酶，优选每升洗涤溶液0.05-5mg的酶蛋白，特别是每升洗涤溶液0.1-1mg的酶蛋白。
可将本发明的酶另外掺入在WO 97/07202中公开的清洁剂制剂。
生物材料的保藏
下列生物材料已经按照布达佩斯条约的条款分别保藏在NRRL(农业研究机构保藏中心)、DSM(德意志微生物和细胞培养物保藏中心，MascheroderWeg 1b，38124Braunschweig，德国)，和CGMCC(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京100080，中国)，并给出下列保藏号：
  保藏   保藏号   保藏日期
  拟诺卡氏菌(Nocardiopsis sp.)Nocardiopsis prasinaNocardiopsis prasinaNocardiopsis albaBrachysporiella sp.大肠杆菌(Escherichia coli)   NRRL 18262DSM 15648DSM 15649DSM 15647CGMCC 0865DSM 15509   1987年11月10日2003年5月30日2003年5月30日2003年5月30日2002年12月19日2003年3月18日
菌株达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种DSM 43235可从DSM公开获得。这个菌株也保藏在其它的下列保藏机构：ATCC 23219、IMRU 1250、NCTC 10489。菌株拟诺卡氏菌NRRL 18262与另一个专利申请的提交相关而进行了保藏。
在37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122下，在专利与商标官员确定本专利申请悬而未决至授权期间，将可获得已经在保证获得培养物的条件下保藏的菌株。保藏物表示保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交相关主题申请的副本或其后续申请的国家中，根据国外专利法律的要求，该保藏物是可利用的。然而，应该理解保藏物的可利用性不构成在通过政府作用所授予专利权的损抑中实施相关主题发明的许可。
Brachysporiella菌株CGMCC 0865是在中国于1998年10月从未鉴定植物的死亡分支(branches)中分离的。菌株Nocardiopsis prasina DSM 15648、Nocardiopsis prasinaDSM 15649和Nocardiopsis alba DSM 15647是在丹麦于2001年从土壤样品中分离的。
在此所描述和要求保护的本发明不限于在此所公开的特定实施方案所限制的范围，因为这些实施方案旨在例证说明本发明的几个方面。任何等同的实施方案都是在本发明的范围内的。实际上，除在此所显示和描述的实施方案外，从上述说明书看来，本发明的各种改变对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这种改变也是属于所附的权利要求的范围内的。就分岐来说，包括定义的本公开的内容将进行控制。
在此引用多种参考文献，其公开的内容全部引入作为参考。
实施例
实施例1：蛋白酶
利用常规方法从各个野生型菌株或重组宿主细胞的发酵物纯化下列蛋白酶：
蛋白酶10(SEQ ID NO：2的第1-188位氨基酸)、蛋白酶18(SEQ ID NO：12的第1-188位氨基酸)、Brachysporiella蛋白酶(SEQ ID NO：14的第1-186位氨基酸)、绿僵菌(Metarhizium)蛋白酶(SEQ ID NO：4的第1-188位氨基酸)、蛋白酶08(SEQ ID NO：10的第1-188位氨基酸)、蛋白酶11(SEQID NO：6的第1-188位氨基酸、和蛋白酶35(SEQ ID NO：8的第1-188位氨基酸)。
经SDS-PAGE确定的蛋白酶制剂的纯度(参见实施例2)在95％以上，并且吸光率纯度(A280/A260比率；参见实施例3)在1.40以上。
实施例2：通过SDS-PAGE确定纯度
实施例1中提及的蛋白酶纯度是通过SDS-PAGE利用下列步骤确定的：
将40μl(微升)蛋白酶溶液(A280浓度＝0.025)与40μl 0.1M的PMSF在置于冰上的Eppendorf试管中混合并静置半小时。然后向Eppendorf管加入20μl 50％(w/v)的TCA(三氯乙酸)。在冰上又放置半小时后，离心试管(5分钟，0℃，14.000×g)并小心地除去上清液。向沉淀加入20μl SDS-PAGE样品缓冲液(200μl Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液(2×)(125mM Tris/HCl，pH6.8，4％(w/v)SDS，50ppm溴酚蓝，20％(v/v)甘油，LC2676，来自InvitrogenTM)+160μl蒸镏水+20μl β-巯基乙醇+20μl 3M未缓冲的Tris Base(Sigma T-1503)并煮沸试管3分钟。短暂离心试管并且将10μl样品加入来自InvitrogenTM的4-20％梯度的Tris-甘氨酸预浇制的凝胶(基于Laemmli的化学，但在凝胶中没有SDS(Laemmli，英国，(1970)Nature，vol.227，pp.680-685)，EC60255)的聚丙烯酰胺梯度凝胶)。用Tris-甘氨酸电泳缓冲液(2.9gTris Base，14.4g甘氨酸，1.0g SDS，加蒸馏水至1L)在缓冲槽(reservoirs)中以150V的恒定电压进行电泳，直到溴酚蓝示踪染料到达凝胶的底部。电泳后，用100ml蒸馏水通过轻柔的晃动漂洗凝胶3次，每次5分钟。然后用Gelcode蓝染试剂(来自PIERCE的胶体考马斯G-250产品，PIERCE目录号24592)轻柔晃动凝胶1小时，并通过用蒸馏水轻柔晃动洗涤8至16小时，其中几次更换蒸馏水。最后，在两片玻璃纸之间干燥凝胶。用来自AGFA的装备有Fotolook 95v2.08软件的Arcus II扫描仪扫描，并且通过File/Acquire命令输入Windows的图像评估软件CREAMTM(目录号990001和990005，Kem-En-Tec，丹麦)，其设置如下(Fotolook 95 v2.08的)：起始＝反射，模式＝彩色RGB，扫描分别率＝240ppi，输出分辨率＝1201pi，比例系数＝100％，范围＝整体选择的直方图，以及Min＝0和Max＝215，弹性曲线＝无，尖锐度＝无，Descreen＝无和Flavor＝无，由此产生SDS-PAGE凝胶的*.img图片文件，其可用于在CREAMTM中进行评估。用菜单命令分析/1-D评估该*.img图片文件。用泳道放置工具在*.img图片文件上放置两条扫描线：样品扫描线和背景扫描线。从上样点刚好以下至溴酚蓝示踪染料刚好以上的位置将样品扫描线放在样品(具有待检测的蛋白酶)泳道的中间。将背景扫描线与样品扫描线平行放置，但是其放置在成像的SDS-PAGE凝胶中没有加入样品的位置，背景扫描线的起点和终点垂直于样品扫描线的起点和终点。背景扫描线代表凝胶的真实背景。没有调整扫描线的宽度和形状。现在用中敏感度的1-D/扫描菜单命令记录沿着扫描线的强度。利用1-D/编辑菜单命令，从样品扫描减去背景扫描。然后选择1-D/结果菜单命令，并通过CREAMTM软件计算蛋白酶峰的面积％，使用其作为蛋白酶的SDS-PAGE纯度。
所有蛋白酶样品的SDS-PAGE纯度为95％以上。
实施例3：吸光度纯度的确定
纯化的蛋白酶样品的A280/A260比率确定如下。
A260是指蛋白酶样品相对于空白缓冲液在1cm路径长度的比色杯中在260nm处的吸光度。A280是指相同蛋白酶样品相对于空白缓冲液在1cm路径长度的比色杯中在280nm处的吸光度。
将来自实施例1的纯化的蛋白酶样品在缓冲液中稀释直到分光光度计的A280读数在其反应曲线的线性部分内。从读数确定A280/A260比率。获得下列结果：蛋白酶10∶1.94、蛋白酶18∶1.96、Brachysporiella蛋白酶∶1.48、绿僵菌蛋白酶∶1.95、蛋白酶08∶1.86、蛋白酶11∶1.95、蛋白酶35∶1.94。
实施例4：蛋白酶测定-和多种抑制剂对所选择蛋白酶的稳定性和活性的影响
如下所述测试多种潜在抑制剂对实施例1的蛋白酶的活性和稳定性的影响。
分析缓冲液
100mM丁二酸(Merck 1.00682)、100mM HEPES(Sigma H-3375)、100mM CHES(Sigma C-2885)、100mM CABS(Sigma C-5580)、1mMCaCl2、150mM KCl、0.01％ Triton X-100(Sigma T-9284)，用NaOH调节至pH 7.0。
抑制剂
Fe(II)SO4·7H2O，Sigma F-7002
Cu(II)SO4·5H2O，Merck 2790
Zn(II)Ac2·2H2O，Merck 8802
Mg(II)Cl2·6H2O，Merck 105832
Mn(II)Cl2·H2O，Merck 5934
氯化胆碱，Aldrich C7，970-0
pNA分析
pNA底物：Suc-AAPF-pNA(Bachem L-1400)或Boc-VLGR-pNA(Bachem L-1205)。
温度：25℃。
将20μl(微升)蛋白酶(在0.01％Triton X-100中稀释)置于微滴定平板的孔中。通过加入200μl pNA底物(将50mg溶解在1.0ml DMSO并进一步用分析缓冲液稀释100×)开始分析。监测OD405的增加而测量蛋白酶的活性。
利用有和没有各种抑制剂的多种蛋白酶的pNA分析确定剂量/反应关系(OD405/min对(mg酶)/l))。剂量反应曲线在足够广泛的酶浓度范围内是线性的。观察到不同程度的抑制：为了比较的目的而包括的一些蛋白酶，即猪胰蛋白酶和SAVINASETM蛋白酶(来源于幽闭芽孢杆菌(Bacillus clausii)的枯草杆菌蛋白酶，可从Novozymes A/S，Krogshoejvej 36，DK-2880Bagsvaerd，丹麦商业购买)未受到抑制，而其它的蛋白酶受到抑制。加入抑制剂而已经发展为黄色的p-硝基苯胺颜色证明没有影响。因此推断pNA分析实际上适于抑制测量。
稳定性分析
将蛋白酶在具有0.1％(w/v)K-山梨酸(山梨酸的钾盐)和1mM抑制剂的分析缓冲液中稀释到近似为1mg/ml(见下文)。使混合物在25℃孵育)。每隔一段时间，从孵育物(充分混合后)取出样品并冷冻。在分析缓冲液中稀释后，利用pNA分析测量残余活性。为了加入1mM抑制剂，在具有5mM EDTA的分析缓冲液中稀释孵育物以便看到单纯的稳定性影响。
从理论的摩尔消光系数评估蛋白酶浓度，E280(1M)，其可利用公式从氨基酸组成计算出来：E280(1M)＝5690*NTrp+1280*NTyr+120Ncys，其中NTrp、NTyr和Ncys是蛋白酶中Trp、Tyr和Cys氨基酸残基的数目(Gill，S.C.，vonHippel，P.H.，Analytical Biochemistry 182，319-326，(1989))，并从氨基酸序列计算蛋白酶的分子量Mw。从纯的(实施例2所述的95％纯度以上)蛋白酶样品的A280测量值计算蛋白酶浓度：浓度(mg/ml)＝(A280 *Mw)/E280(1M))。
抑制结果
剂量/反应曲线(OD405/min对(mg酶)/l)显示任何蛋白酶都没有受到Fe2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+或氯化胆碱(加入分析缓冲液的浓度为1mM)的抑制。然而Cu2+，抑制所有测试的蛋白酶(至不同的程度，如下列表1所显示)。
首先，用1mg/l的酶剂量测试多种Cu2+浓度的影响。至少在0至1mM Cu2+的范围内，似乎在抑制和Cu2+的浓度之间有线性关系，抑制显示随着Cu2+浓度增加其本身使酶活性降低(从剂量/反应曲线的线性部分测量酶活性为平均的OD405增加/时间)。
表1：显示测试的多种蛋白酶相对于对照实验的活性(酶浓度为1mg/l，利用1mM浓度的Cu2+，并且利用Suc-AAPF-pNA作为底物，在pH7和25℃)，对照实验除没有加入Cu2+外是完全相同的。
表1
  酶活性/mOD405/min
  酶   对照(没有Cu2+)  +1mM Cu2+   相对活性
  蛋白酶10   122.2   80.3   0.657
  蛋白酶18   193.1   158.0   0.818
  Brachysporiella蛋白酶   72.6   50.5   0.695
  绿僵菌蛋白酶   118.2   72.4   0.612
  蛋白酶08   216.0   174.5   0.808
  蛋白酶11   133.6   92.3   0.691
  蛋白酶35   109.2   75.0   0.687
稳定性结果
在存在浓度为1mM的多种抑制剂时，如上所述测试多种蛋白酶的稳定性。对一些蛋白酶的稳定性有影响的唯一抑制剂是Cu2+。然而，这个抑制剂对所有蛋白酶的影响是不相同的：参见下列表2中的结果，显示在存在1mMCu2+时，蛋白酶18和Brachysporiella蛋白酶实际上是稳定的，而其他的蛋白酶不是。
表2
  残余酶活性
  酶/孵育时间/小时   0   3.1   18.6   44.0   116.0   164.0   188.6
  蛋白酶10   1.000   0.952   0.868   0.874   0.837   0.752   0.723
  蛋白酶18   1.000   0.985   1.008   1.003   0.982   1.030   0.993
  Brachysporiella蛋白酶   1.000   1.022   1.073   1.057   1.029   1.053   0.984
  绿僵菌蛋白酶   1.000   0.979   0.939   0.891   0.760   0.651   0.627
  蛋白酶08   1.000   0.936   0.867   0.842   0.767   0.721   0.703
  蛋白酶11   1.000   0.930   1.032   0.930   0.737   0.616   0.581
  蛋白酶35   1.000   0.960   0.918   0.852   0.807   0.745   0.733
                              序列表
<110>诺维信公司(Novozymes A/S)
Oestergaard，Peter Rahbek
De Maria，Leonardo
<120>蛋白酶
<130>10604.504-WO
<160>14
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1596
<212>DNA
<213>拟诺卡氏菌属NRRL 18262(Nocardiopsis sp.NRRL 18262)
<220>
<221>CDS
<222>(900)..(1466)
<400>1
acgtttggta cgggtaccgg tgtccgcatg tggccagaat gcccccttgc gacagggaac     60
ggattcggtc ggtagcgcat cgactccgac aaccgcgagg tggccgttcg cgtcgccacg    120
ttctgcgacc gtcatgcgac ccatcatcgg gtgaccccac cgagctctga atggtccacc    180
gttctgacgg tctttccctc accaaaacgt gcacctatgg ttaggacgtt gtttaccgaa    240
tgtctcggtg aacgacaggg gccggacggt attcggcccc gatcccccgt tgatcccccc    300
aggagagtag ggaccccatg cgaccctccc ccgttgtctc cgccatcggt acgggagcgc    360
tggccttcgg tctggcgctg tccggtaccc cgggtgccct cgcggccacc ggagcgctcc    420
cccagtcacc caccccggag gccgacgcgg tctccatgca ggaggcgctc cagcgcgacc    480
tcgacctgac ctccgccgag gccgaggagc tgctggccgc ccaggacacc gccttcgagg    540
tcgacgaggc cgcggccgag gccgccgggg acgcctacgg cggctccgtc ttcgacaccg    600
agagcctgga actgaccgtc ctggtcaccg atgccgccgc ggtcgaggcc gtggaggcca    660
ccggcgccgg gaccgagctg gtctcctacg gcatcgacgg tctcgacgag atcgtccagg    720
agctcaacgc cgccgacgcc gttcccggtg tggtcggctg gtacccggac gtggcgggtg    780
acaccgtcgt cctggaggtc ctggagggtt ccggagccga cgtcagcggc ctgctcgcgg    840
acgccggcgt ggacgcctcg gccgtcgagg tgaccacgag cgaccagccc gagctctac     899
gcc gac atc atc ggt ggt ctg gcc tac acc atg ggc ggc cgc tgt tcg      947
Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser
1               5                   10                  15
gtc ggc ttc gcg gcc acc aac gcc gcc ggt cag ccc ggg ttc gtc acc      995
Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr
            20                  25                  30
gcc ggt cac tgc ggc cgc gtg ggc acc cag gtg acc atc ggc aac ggc     1043
Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly
        35                  40                  45
agg ggc gtc ttc gag cag tcc gtc ttc ccc ggc aac gac gcg gcc ttc     1091
Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe
    50                  55                  60
gtc cgc ggt acg tcc aac ttc acg ctg acc aac ctg gtc agc cgc tac      1139
Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr
65                  70                  75                  80
aac acc ggc ggg tac gcc acg gtc gcc ggt cac aac cag gcc ccc atc      1187
Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile
                85                  90                  95
ggc tcc tcc gtc tgc cgc tcc ggc tcc acc acc ggt tgg cac tgc ggc      1235
Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly
            100                 105                 110
acc atc cag gcc cgc ggc cag tcg gtg agc tac ccc gag ggc acc gtc      1283
Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val
        115                 120                 125
acc aac atg acc cgg acc acc gtg tgc gcc gag ccc ggc gac tcc ggc      1331
Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly
    130                 135                 140
ggc tcc tac atc tcc ggc acc cag gcc cag ggc gtg acc tcc ggc ggc      1379
Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
tcc ggc aac tgc cgc acc ggc ggg acc acc ttc tac cag gag gtc acc      1427
Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr
                165                 170                 175
ccc atg gtg aac tcc tgg ggc gtc cgt ctc cgg acc tga tccccgcggt       1476
Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr
            180                 185
tccaggcgga ccgacggtcg tgacctgagt accaggcgtc cccgccgctt ccagcggcgt    1536
ccgcaccggg gtgggaccgg gcgtggccac ggccccaccc gtgaccggac cgcccggcta    1596
<210>2
<211>188
<212>PRT
<213>拟诺卡氏菌属NRRL 18262(Nocardiopsis sp.NRRL 18262)
<400>2
Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr
            20                  25                  30
Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly
        35                  40                  45
Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe
    50                  55                  60
Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr
65                  70                  75                  80
Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile
                85                  90                  95
Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly
            100                 105                 110
Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val
        115                 120                 125
Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly
    130                 135                 140
Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr
                165                 170                 175
Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr
            180                 185
<210>3
<211>1125
<212>DNA
<213>金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1122)
<220>
<221>sig_peptide
<222>(1)..(54)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(559)..(1122)
<400>3
atg gag ctt acc aaa ttt ctt gcc tta ctg gca gtt atc ctg ccc          45
Met Glu Leu Thr Lys Phe Leu Ala Leu Leu Ala Val Ile Leu Pro
    -185                -180                -175
gtc gcc tac ggt gca cca acg cag gcg gca agc ctg cac ccc cag          90
Val Ala Tyr Gly Ala Pro Thr Gln Ala Ala Ser Leu His Pro Gln
    -170                -165                -160
att ttg gag gcc atg aag cgc  gac ttg ggg ctg aac gcc gag cag        135
Ile Leu Glu Ala Met Lys Arg  Asp Leu Gly Leu Asn Ala Glu Gln
    -155                -150                -145
gcc act gtt cgt gtg gcg cgg gag atc cat gcc acc gat gtt att         180
Ala Thr Val Arg Val Ala Arg Glu Ile His Ala Thr Asp Val Ile
    -140                -135                -130
gag cag ctg cgc agc tca gta gcg ttc gct ggt gct tgg att gac         225
Glu Gln Leu Arg Ser Ser Val Ala Phe Ala Gly Ala Trp Ile Asp
    -125                -120                -115
gcg gac gtg cta tac atc ggc att act gac caa gcc ttg gcc gat         270
Ala Asp Val Leu Tyr Ile Gly Ile Thr Asp Gln Ala Leu Ala Asp
    -110                -105                -100
gag gtc act gct gcc ggc gcc acg ccg att gtc atg acc aac agc ctg      318
Glu Val Thr Ala Ala Gly Ala Thr Pro Ile Val Met Thr Asn Ser Leu
    -95                 -90                 -85
tcc aag ctg gaa aag gcc aag gag gat ctc gat aag ata ttc atc ggc      366
Ser Lys Leu Glu Lys Ala Lys Glu Asp Leu Asp Lys Ile Phe Ile Gly
-80                 -75                 -70                 -65
cga gcc aac acc ctg gaa aca tct tcg gac act agc tct ggc att gca      414
Arg Ala Asn Thr Leu Glu Thr Ser Ser Asp Thr Ser Ser Gly Ile Ala
                -60                 -55                 -50
tcg tat ttc gtt gat gtc gcc gcc aac aag ctc gtt ata gag gct ctc      462
Ser Tyr Phe Val Asp Val Ala Ala Asn Lys Leu Val Ile Glu Ala Leu
            -45                 -40                 -35
gcc gac agt cac ggc cat gct gag caa cta gcc gcg cag gtt ggg ctt      510
Ala Asp Ser His Gly His Ala Glu Gln Leu Ala Ala Gln Val Gly Leu
        -30                 -25                 -20
aca tcc gaa ttc gag gtg cgg act gtt gag acg atg ccg act acc atg      558
Thr Ser Glu Phe Glu Val Arg Thr Val Glu Thr Met Pro Thr Thr Met
    -15                 -10                 -5              -1
gcc acg gtt cag ggt ggt gat gtc tat tat att aat aga agc tcc cgc      606
Ala Thr Val Gln Gly Gly Asp Val Tyr Tyr Ile Asn Arg Ser Ser Arg
1               5                   10                  15
tgc tct atc ggt ttc gca gta acc aca ggt ttc gtg tcc gct gga cac      654
Cys Ser Ile Gly Phe Ala Val Thr Thr Gly Phe Val Ser Ala Gly His
            20                  25                  30
tgt gga gga tca gga gct tca gct aca aca agt agt ggt gag gcc cta      702
Cys Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Thr Thr Ser Ser Gly Glu Ala Leu
        35                  40                  45
gga acc ttt tcg ggc tcc gtc ttc cct ggc agt gcc gac atg gcc tac      750
Gly Thr Phe Ser Gly Ser Val Phe Pro Gly Ser Ala Asp Met Ala Tyr
    50                  55                  60
gtc cgc act gta agt gga aca gtc ctt aga ggc tac atc aac ggc tac      798
Val Arg Thr Val Ser Gly Thr Val Leu Arg Gly Tyr Ile Asn Gly Tyr
65                  70                  75                  80
ggc caa ggg agc ttt ccc gtc tca gga agc tcc gag gct gcc gtt gga      846
Gly Gln Gly Ser Phe Pro Val Ser Gly Ser Ser Glu Ala Ala Val Gly
                85                  90                  95
gct agc atc tgc cgc tcc ggc tca acc act caa gtc cac tgc ggc acg      894
Ala Ser Ile Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gln Val His Cys Gly Thr
            100                 105                 110
att ggt gcc aag ggc gcc acg gtt aac tac cct caa gga gct gtt tcg      942
Ile Gly Ala Lys Gly Ala Thr Val Asn Tyr Pro Gln Gly Ala Val Ser
        115                 120                 125
ggc ctc act cgg act agc gtc tgc gcc gag ccc ggc gac tca ggc ggt      990
Gly Leu Thr Arg Thr Ser Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly
    130                 135                 140
tct ttc tac tcc ggc tcc cag gcg cag ggt gtc acc tcg gga ggc agc     1038
Ser Phe Tyr Ser Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser
145                 150                 155                 160
ggc gac tgc agc cgt gga ggc acg acc tat ttc cag cct gtt aat agg     1086
Gly Asp Cys Ser Arg Gly Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Pro Val Asn Arg
                165                 170                 175
atc ctc cag aca tat ggc ctt acc ttg gtc acg gcg tag                 1125
Ile Leu Gln Thr Tyr Gly Leu Thr Leu Val Thr Ala
            180                 185
<210>4
<211>374
<212>PRT
<213>金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)
<400>4
Met Glu Leu Thr Lys Phe Leu Ala Leu Leu Ala Val Ile Leu Pro
    -185                -180                -175
Val Ala Tyr Gly Ala Pro Thr Gln Ala Ala Ser Leu His Pro Gln
    -170                -165                -160
Ile Leu Glu Ala Met Lys Arg Asp Leu Gly Leu Asn Ala Glu Gln
    -155                -150                -145
Ala Thr Val Arg Val Ala Arg Glu Ile His Ala Thr Asp Val Ile
    -140                -135                -130
Glu Gln Leu Arg Ser Ser Val Ala Phe Ala Gly Ala Trp Ile Asp
    -125                -120                -115
Ala Asp Val Leu Tyr Ile Gly Ile Thr Asp Gln Ala Leu Ala Asp
    -110                -105                -100
Glu Val Thr Ala Ala Gly Ala Thr Pro Ile Val Met Thr Asn Ser Leu
    -95                 -90                 -85
Ser Lys Leu Glu Lys Ala Lys Glu Asp Leu Asp Lys Ile Phe Ile Gly
-80                 -75                 -70                 -65
Arg Ala Asn Thr Leu Glu Thr Ser Ser Asp Thr Ser Ser Gly Ile Ala
                -60                 -55                 -50
Ser Tyr Phe Val Asp Val Ala Ala Asn Lys Leu Val Ile Glu Ala Leu
            -45                 -40                 -35
Ala Asp Ser His Gly His Ala Glu Gln Leu Ala Ala Gln Val Gly Leu
        -30                 -25                 -20
Thr Ser Glu Phe Glu Val Arg Thr Val Glu Thr Met Pro Thr Thr Met
    -15                 -10                 -5              -1
Ala Thr Val Gln Gly Gly Asp Val Tyr Tyr Ile Asn Arg Ser Ser Arg
1               5                   10                  15
Cys Ser Ile Gly Phe Ala Val Thr Thr Gly Phe Val Ser Ala Gly His
            20                 25                 30
Cys Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Thr Thr Ser Ser Gly Glu Ala Leu
        35                  40                  45
Gly Thr Phe Ser Gly Ser Val Phe Pro Gly Ser Ala Asp Met Ala Tyr
    50                  55                  60
Val Arg Thr Val Ser Gly Thr Val Leu Arg Gly Tyr Ile Asn Gly Tyr
65                  70                  75                  80
Gly Gln Gly Ser Phe Pro Val Ser Gly Ser Ser Glu Ala Ala Val Gly
                85                  90                  95
Ala Ser Ile Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gln Val His Cys Gly Thr
            100                 105                 110
Ile Gly Ala Lys Gly Ala Thr Val Asn Tyr Pro Gln Gly Ala Val Ser
        115                 120                 125
Gly Leu Thr Arg Thr Ser Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly
    130                 135                 140
Ser Phe Tyr Ser Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser
145                 150                 155                 160
Gly Asp Cys Ser Arg Gly Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Pro Val Asn Arg
                165                 170                 175
Ile Leu Gln Thr Tyr Gly Leu Thr Leu Val Thr Ala
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<212>DNA
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Ala Thr Gly Pro Leu Pro Gln Ser Pro Thr Pro Glu Ala Asp Ala
-165                -160                -155
gtc tcc atg cag gag gcg ctc cag cgc gac ctc ggc ctg acc ccg          90
Val Ser Met Gln Glu Ala Leu Gln Arg Asp Leu Gly Leu Thr Pro
-150                -145                -140
ctt gag gcc gat gaa ctg ctg gcc gcc cag gac acc gcc ttc gag         135
Leu Glu Ala Asp Glu Leu Leu Ala Ala Gln Asp Thr Ala Phe Glu
-135                -130                -125
gtc gac gag gcc gcg gcc gcg gcc gcc ggg gac gcc tac ggc ggc         180
Val Asp Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Asp Ala Tyr Gly Gly
-120                -115                -110
tcc gtc ttc gac acc gag acc ctg gaa ctg acc gtc ctg gtc acc gac      228
Ser Val Phe Asp Thr Glu Thr Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp
-105                -100                -95                -90
gcc gcc tcg gtc gag gct gtg gag gcc acc ggc gcg ggt acc gaa ctc      276
Ala Ala Ser Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Gly Thr Glu Leu
                -85                 -80                 -75
gtc tcc tac ggc atc gag ggc ctc gac gag atc atc cag gat ctc aac      324
Val Ser Tyr Gly Ile Glu Gly Leu Asp Glu Ile Ile Gln Asp Leu Asn
            -70                 -65                 -60
gcc gcc gac gcc gtc ccc ggc gtg gtc ggc tgg tac ccg gac gtg gcg      372
Ala Ala Asp Ala Val Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Ala
        -55                 -50                 -45
ggt gac acc gtc gtc ctg gag gtc ctg gag ggt tcc gga gcc gac gtg      420
Gly Asp Thr Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp Val
    -40                 -35                 -30
agc ggc ctg ctc gcc gac gcc ggc gtg gac gcc tcg gcc gtc gag gtg      468
Ser Gly Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala Val Glu Val
-25                 -20                 -15                 -10
acc agc agt gcg cag ccc gag ctc tac gcc gac atc atc ggc ggt ctg      516
Thr Ser Ser Ala Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu
                -5              -1  1                5
gcc tac acc atg ggc ggc cgc tgt tcg gtc gga ttc gcg gcc acc aac      564
Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser ValGly Phe Ala Ala Thr Asn
        10                  15                 20
gcc gcc ggt cag ccc gga ttc gtc acc gcc ggt cac tgt ggc cgc gtg      612
Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Arg Val
    25                  30                  35
ggc acc cag gtg agc atc ggc aac ggc cag ggc gtc ttc gag cag tcc      660
Gly Thr Gln Val Ser Ile Gly Asn Gly Gln Gly Val Phe Glu Gln Ser
40                  45                  50                  55
atc ttc ccg ggc aac gac gcc gcc ttc gtc cgc ggc acg tcc aac ttc      708
Ile Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe
                60                  65                  70
acg ctg acc aac ctg gtc agc cgc tac aac acc ggc ggt tac gcc acc      756
Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr
            75                  80                  85
gtc gcc ggc cac aac cag gcg ccc atc ggc tcc tcc gtc tgc cgc tcc      804
Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser
        90                  95                  100
ggc tcc acc acc ggc tgg cac tgc ggc acc atc cag gcc cgc ggc cag      852
Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln
    105                 110                 115
tcg gtg agc tac ccc gag ggc acc gtc acc aac atg acc cgg acc acc      900
Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr
120                 125                 130                 135
gtg tgc gcc gag ccc ggc gac tcc ggc ggc tcc tac atc tcc ggc aac      948
Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Asn
                140                 145                 150
cag gcc cag ggc gtc acc tcc ggc ggc tcc ggc aac tgc cgc acc ggc      996
Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly
            155                 160                 165
ggg acc acc ttc tac cag gag gtc acc ccc atg gtg aac tcc tgg ggc     1044
Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr Pro Met Val Asn Ser Trp Gly
        170                 175                 180
gtc cgt ctc cgg acc taa                                           1062
Val Arg Leu Arg Thr
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<211>353
<212>PRT
<213>Nocardiopsis prasina DSM 15648
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Ala Thr Gly Pro Leu Pro Gln Ser Pro Thr Pro Glu Ala Asp Ala
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Val Ser Met Gln Glu Ala Leu Gln Arg Asp Leu Gly Leu Thr Pro
-150                -145                -140
Leu Glu Ala Asp Glu Leu Leu Ala Ala Gln Asp Thr Ala Phe Glu
-135                -130                -125
Val Asp Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Asp Ala Tyr Gly Gly
-120                -115                -110
Ser Val Phe Asp Thr Glu Thr Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp
-105                -100                -95                 -90
Ala Ala Ser Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Gly Thr Glu Leu
                -85                 -80                 -75
Val Ser Tyr Gly Ile Glu Gly Leu Asp Glu Ile Ile Gln Asp Leu Asn
            -70                 -65                 -60
Ala Ala Asp Ala Val Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Ala
        -55                 -50                 -45
Gly Asp Thr Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp Val
    -40                 -35                 -30
Ser Gly Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala Val Glu Val
-25                 -20                 -15                 -10
Thr Ser Ser Ala Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu
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Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn
        10                  15                  20
Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Arg Val
    25                  30                  35
Gly Thr Gln Val Ser Ile Gly Asn Gly Gln Gly Val Phe Glu Gln Ser
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Ile Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe
                60                  65                  70
Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr
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Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser
        90                  95                  100
Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln
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Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr
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Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Asn
                140                 145                 150
Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly
            155                 160                 165
Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr Pro Met Val Asn Ser Trp Gly
        170                 175                 180
Val Arg Leu Arg Thr
   185
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<213>Nocardiopsis prasina DSM 15649
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<222>(1)..(1059)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(496)..(1059)
<400>7
gcc acc gga cca ctc ccc cag tca ccc acc ccg gag gcc gac gcc          45
Ala Thr Gly Pro Leu Pro Gln Ser Pro Thr Pro Glu Ala Asp Ala
-165                -160                -155
gtc tcc atg cag gag gcg ctc cag cgc gac ctc ggc ctg acc ccg          90
Val Ser Met Gln Glu Ala Leu Gln Arg Asp Leu Gly Leu Thr Pro
-150                -145                -140
ctt gag gcc gat gaa ctg ctg gcc gcc cag gac acc gcc ttc gag         135
Leu Glu Ala Asp Glu Leu Leu Ala Ala Gln Asp Thr Ala Phe Glu
-135                -130                -125
gtc gac gag gcc gcg gcc gag gcc gcc ggt gac gcc tac ggc ggc         180
Val Asp Glu Ala Ala Ala Glu Ala Ala Gly Asp Ala Tyr Gly Gly
-120                -115                -110
tcc gtc ttc gac acc gag acc ctg gaa ctg acc gtc ctg gtc acc gac      228
Ser Val Phe Asp Thr Glu Thr Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp
-105                -100                -95                 -90
tcc gcc gcg gtc gag gcg gtg gag gcc acc ggc gcc ggg acc gaa ctg      276
Ser Ala Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Gly Thr Glu Leu
                -85                 -80                 -75
gtc tcc tac ggc atc acg ggc ctc gac gag atc gtc gag gag ctc aac      324
Val Ser Tyr Gly Ile Thr Gly Leu Asp Glu Ile Val Glu Glu Leu Asn
            -70                 -65                 -60
gcc gcc gac gcc gtt ccc ggc gtg gtc ggc tgg tac ccg gac gtc gcg      372
Ala Ala Asp Ala Val Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Ala
        -55                 -50                 -45
ggt gac acc gtc gtg ctg gag gtc ctg gag ggt tcc ggc gcc gac gtg      420
Gly Asp Thr Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp Val
    -40                 -35                 -30
ggc ggc ctg ctc gcc gac gcc ggc gtg gac gcc tcg gcg gtc gag gtg      468
Gly Gly Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala Val Glu Val
-25                 -20                 -15                 -10
acc acc acc gag cag ccc gag ctg tac gcc gac atc atc ggc ggt ctg      516
Thr Thr Thr Glu Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu
            -5                  -1  1               5
gcc tac acc atg ggc ggc cgc tgt tcg gtc ggc ttc gcg gcc acc aac      564
Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn
        10                  15                  20
gcc gcc ggt cag ccc ggg ttc gtc acc gcc ggt cac tgt ggc cgc gtg      612
Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Arg Val
    25                  30                  35
ggc acc cag gtg acc atc ggc aac ggc cgg ggc gtc ttc gag cag tcc      660
Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser
40                  45                  50                  55
atc ttc ccg ggc aac gac gcc gcc ttc gtc cgc gga acg tcc aac ttc      708
Ile Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe
                60                  65                  70
acg ctg acc aac ctg gtc agc cgc tac aac acc ggc ggc tac gcc acc      756
Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr
            75                  80                  85
gtc gcc ggt cac aac cag gcg ccc atc ggc tcc tcc gtc tgc cgc tcc      804
Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser
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Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln
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Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr
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Gly Gly Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala Val Glu Val
-25                 -20                 -15                 -10
Thr Thr Thr Glu Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu
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    185
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<212>DNA
<213>Nocardiopsis alba
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<222>(1)..(1065)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(502)..(1065)
<400>9
gcg acc ggc ccc ctc ccc cag tcc ccc acc ccg gat gaa gcc gag          45
Ala Thr Gly Pro Leu Pro Gln Ser Pro Thr Pro Asp Glu Ala Glu
        -165                -160                -155
gcc acc acc atg gtc gag gcc ctc cag cgc gac ctc ggc ctg tcc        90
Ala Thr Thr Met Val Glu Ala Leu Gln Arg Asp Leu Gly Leu Ser
        -150                -145                -140
ccc tct cag gcc gac gag ctc ctc gag gcg cag gcc gag tcc ttc       135
Pro Ser Gln Ala Asp Glu Leu Leu Glu Ala Gln Ala Glu Ser Phe
        -135                -130                -125
gag atc gac gag gcc gcc acc gcg gcc gca gcc gac tcc tac ggc       180
Glu Ile Asp Glu Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Asp Ser Tyr Gly
        -120                -115                -110
ggc tcc atc ttc gac acc gac agc ctc acc ctg acc gtc ctg gtc acc      228
Gly Ser Ile Phe Asp Thr Asp Ser Leu Thr Leu Thr Val Leu Val Thr
        -105                -100                -95
gac gcc tcc gcc gtc gag gcg gtc gag gcc gcc ggc gcc gag gcc aag      276
Asp Ala Ser Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Ala Gly Ala Glu Ala Lys
    -90                 -85                 -80
gtg gtc tcg cac ggc atg gag ggc ctg gag gag atc gtc gcc gac ctg      324
Val Val Ser His Gly Met Glu Gly Leu Glu Glu Ile Val Ala Asp Leu
-75                 -70                 -65                 -60
aac gcg gcc gac gct cag ccc ggc gtc gtg ggc tgg tac ccc gac atc      372
Asn Ala Ala Asp Ala Gln Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Ile
                -55                 -50                 -45
cac tcc gac acg gtc gtc ctc gag gtc ctc gag ggc tcc ggt gcc gac      420
His Ser Asp Thr Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp
            -40                 -35                 -30
gtg gac tcc ctg ctc gcc gac gcc ggt gtg gac acc gcc gac gtc aag     468
Val Asp Ser Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Thr Ala Asp Val Lys
        -25                 -20                 -15
gtg gag agc acc acc gag cag ccc gag ctg tac gcc gac atc atc ggc      516
Val Glu Ser Thr Thr Glu Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly
    -10                 -5              -1  1               5
ggt ctc gcc tac acc atg ggt ggg cgc tgc tcg gtc ggc ttc gcg gcc      564
Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala
                10                  15                  20
acc aac gcc tcc ggc cag ccc ggg ttc gtc acc gcc ggc cac tgc ggc      612
Thr Asn Ala Ser Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly
            25                  30                  35
acc gtc ggc acc ccg gtc agc atc ggc aac ggc cag ggc gtc ttc gag      660
Thr Val Gly Thr Pro Val Ser Ile Gly Asn Gly Gln Gly Val Phe Glu
        40                  45                  50
cgt tcc gtc ttc ccc ggc aac gac tcc gcc ttc gtc cgc ggc acc tcg      708
Arg Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ser Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser
    55                  60                  65
aac ttc acc ctg acc aac ctg gtc agc cgc tac aac acc ggt ggt tac      756
Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Thr Gly Gly Tyr
70                  75                  80                  85
gcg acc gtc tcc ggc tcc tcg cag gcg gcg atc ggc tcg cag atc tgc      804
Ala Thr Val Ser Gly Ser Ser Gln Ala Ala Ile Gly Ser Gln Ile Cys
                 90                  95                 100
cgt tcc ggc tcc acc acc ggc tgg cac tgc ggc acc gtc cag gcc cgc      852
Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Val Gln Ala Arg
            105                 110                 115
ggc cag acg gtg agc tac ccc cag ggc acc gtg cag aac ctg acc cgc      900
Gly Gln Thr Val Ser Tyr Pro Gln Gly Thr Val Gln Asn Leu Thr Arg
        120                 125                 130
acc aac gtc tgc gcc gag ccc ggt gac tcc ggc ggc tcc ttc atc tcc      948
Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser
    135                 140                 145
ggc agc cag gcc cag ggc gtc acc tcc ggt ggc tcc ggc aac tgc tcc      996
Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser
150                 155                 160                 165
ttc ggt ggc acc acc tac tac cag gag gtc aac ccg atg ctg agc agc     1044
Phe Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Asn Pro Met Leu Ser Ser
                170                 175                 180
tgg ggt ctg acc ctg cgc acc tga                                     1068
Trp Gly Leu Thr Leu Arg Thr
            185
<210>10
<211>355
<212>PRT
<213>Nocardiopsis alba
<400>10
Ala Thr Gly Pro Leu Pro Gln Ser Pro Thr Pro Asp Glu Ala Glu
        -165                -160                -155
Ala Thr Thr Met Val Glu Ala Leu Gln Arg Asp Leu Gly Leu Ser
        -150                -145                -140
Pro Ser Gln Ala Asp Glu Leu Leu Glu Ala Gln Ala Glu Ser Phe
        -135                -130                -125
Glu Ile Asp Glu Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Asp Ser Tyr Gly
        -120                -115                -110
Gly Ser Ile Phe Asp Thr Asp Ser Leu Thr Leu Thr Val Leu Val Thr
        -105                -100                -95
Asp Ala Ser Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Ala Gly Ala Glu Ala Lys
    -90                 -85                 -80
Val Val Ser His Gly Met Glu Gly Leu Glu Glu Ile Val Ala Asp Leu
-75                 -70                 -65                 -60
Asn Ala Ala Asp Ala Gln Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Ile
                -55                 -50                 -45
His Ser Asp Thr Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp
            -40                 -35                 -30
Val Asp Ser Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Thr Ala Asp Val Lys
        -25                 -20                 -15
Val Glu Ser Thr Thr Glu Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly
    -10                 -5              -1  1               5
Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala
                10                  15                  20
Thr Asn Ala Ser Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly
            25                  30                  35
Thr Val Gly Thr Pro Val Ser Ile Gly Asn Gly Gln Gly Val Phe Glu
        40                  45                  50
Arg Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ser Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser
    55                  60                  65
Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Thr Gly Gly Tyr
70                  75                  80                  85
Ala Thr Val Ser Gly Ser Ser Gln Ala Ala Ile Gly Ser Gln Ile Cys
                90                  95                  100
Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Val Gln Ala Arg
            105                 110                 115
Gly Gln Thr Val Ser Tyr Pro Gln Gly Thr Val Gln Asn Leu Thr Arg
        120                 125                 130
Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser
    135                 140                 145
Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser
150                 155                 160                 165
Phe Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Asn Pro Met Leu Ser Ser
                170                 175                 180
Trp Gly Leu Thr Leu Arg Thr
            185
<210>11
<211>1065
<212>DNA
<213>达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种(Nocardiopsis dassonvillei subspeciesdassonvillei)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1062)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(499)..(1062)
<400>11
gct ccg gcc ccc gtc ccc cag acc ccc gtc gcc gac gac agc gcc        45
Ala Pro Ala Pro Val Pro Gln Thr Pro Val Ala Asp Asp Ser Ala
    -165                -160                -155
gcc agc atg acc gag gcg ctc aag cgc gac ctc gac ctc acc tcg        90
Ala Ser Met Thr Glu Ala Leu Lys Arg Asp Leu Asp Leu Thr Ser
    -150                -145                -140
gcc gag gcc gag gag ctt ctc tcg gcg cag gaa gcc gcc atc gag        135
Ala Glu Ala Glu Glu Leu Leu Ser Ala Gln Glu Ala Ala Ile Glu
    -135                -130                -125
acc gac gcc gag gcc acc gag gcc gcg ggc gag gcc tac ggc ggc        180
Thr Asp Ala Glu Ala Thr Glu Ala Ala Gly Glu Ala Tyr Gly Gly
    -120                -115                -110
tca ctg ttc gac acc gag acc ctc gaa ctc acc gtg ctg gtc acc gac      228
Ser Leu Phe Asp Thr Glu Thr Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp
    -105                -100                -95
gcc tcc gcc gtc gag gcg gtc gag gcc acc gga gcc cag gcc acc gtc      276
Ala Ser Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Gln Ala Thr Val
-90                 -85                 -80                 -75
gtc tcc cac ggc acc gag ggc ctg acc gag gtc gtg gag gac ctc aac      324
Val Ser His Gly Thr Glu Gly Leu Thr Glu Val Val Glu Asp Leu Asn
                -70                 -65                 -60
ggc gcc gag gtt ccc gag agc gtc ctc ggc tgg tac ccg gac gtg gag      372
Gly Ala Glu Val Pro Glu Ser Val Leu Gly Trp Tyr Pro Asp Val Glu
            -55                 -50                 -45
agc gac acc gtc gtg gtc gag gtg ctg gag ggc tcc gac gcc gac gtc      420
Ser Asp Thr Val Val Val Glu Val Leu Glu Gly Ser Asp Ala Asp Val
        -40                 -35                 -30
gcc gcc ctg ctc gcc gac gcc ggt gtg gac tcc tcc tcg gtc cgg gtg      468
Ala Ala Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ser Ser Ser Val Arg Val
    -25                 -20                 -15
gag gag gcc gag gag gcc ccg cag gtc tac gcc gac atc atc ggc ggc      516
Glu Glu Ala Glu Glu Ala Pro Gln Val Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly
-10                 -5              -1  1               5
ctg gcc tac tac atg ggc ggc cgc tgc tcc gtc ggc ttc gcc gcg acc      564
Leu Ala Tyr Tyr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr
            10                  15                  20
aac agc gcc ggt cag ccc ggt ttc gtc acc gcc ggc cac tgc ggc acc      612
Asn Ser Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr
        25                  30                  35
gtc ggc acc ggc gtg acc atc ggc aac ggc acc ggc acc ttc cag aac      660
Val Gly Thr Gly Val Thr Ile Gly Asn Gly Thr Gly Thr Phe Gln Asn
    40                  45                  50
tcg gtc ttc ccc ggc aac gac gcc gcc ttc gtc cgc ggc acc tcc aac      708
Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn
55                  60                  65                  70
ttc acc ctg acc aac ctg gtc tcg cgc tac aac tcc ggc ggc tac cag      756
Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly Tyr Gln
                75                  80                  85
tcg gtg acc ggt acc agc cag gcc ccg gcc ggc tcg gcc gtg tgc cgc      804
Ser Val Thr Gly Thr Ser Gln Ala Pro Ala Gly Ser Ala Val Cys Arg
            90                  95                  100
tcc ggc tcc acc acc ggc tgg cac tgc ggc acc atc cag gcc cgc aac      852
Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn
        105                 110                 115
cag acc gtg cgc tac ccg cag ggc acc gtc tac tcg ctc acc cgc acc      900
Gln Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val Tyr Ser Leu Thr Arg Thr
    120                 125                 130
aac gtg tgc gcc gag ccc ggc gac tcc ggc ggt tcg ttc atc tcc ggc      948
Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly
135                 140                 145                 150
tcg cag gcc cag ggc gtc acc tcc ggc ggc tcc ggc aac tgc tcc gtc      996
Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Val
                155                 160                 165
ggc ggc acg acc tac tac cag gag gtc acc ccg atg atc aac tcc tgg     1044
Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Thr Pro Met Ile Asn Ser Trp
            170                 175                 180
ggt gtc agg atc cgg acc taa                                         1065
Gly Val Arg Ile Arg Thr
        185
<210>12
<211>354
<212>PRT
<213>达松维尔拟诺卡氏菌达松维尔亚种(Nocardiopsis dassonvillei subspeciesdassonvillei)
<400>12
Ala Pro Ala Pro Val Pro Gln Thr Pro Val Ala Asp Asp Ser Ala
    -165                -160                -155
Ala Ser Met Thr Glu Ala Leu Lys Arg Asp Leu Asp Leu Thr Ser
    -150                -145                -140
Ala Glu Ala Glu Glu Leu Leu Ser Ala Gln Glu Ala Ala Ile Glu
    -135                -130                -125
Thr Asp Ala Glu Ala Thr Glu Ala Ala Gly Glu Ala Tyr Gly Gly
    -120                -115                -110
Ser Leu Phe Asp Thr Glu Thr Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp
    -105                -100                -95
Ala Ser Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Gln Ala Thr Val
-90                 -85                 -80                 -75
Val Ser His Gly Thr Glu Gly Leu Thr Glu Val Val Glu Asp Leu Asn
                -70                 -65                 -60
Gly Ala Glu Val Pro Glu Ser Val Leu Gly Trp Tyr Pro Asp Val Glu
            -55                 -50                 -45
Ser Asp Thr Val Val Val Glu Val Leu Glu Gly Ser Asp Ala Asp Val
        -40                 -35                 -30
Ala Ala Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ser Ser Ser Val Arg Val
    -25                 -20                 -15
Glu Glu Ala Glu Glu Ala Pro Gln Val Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly
-10                 -5              -1  1               5
Leu Ala Tyr Tyr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr
            10                  15                  20
Asn Ser Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr
        25                  30                  35
Val Gly Thr Gly Val Thr Ile Gly Asn Gly Thr Gly Thr Phe Gln Asn
    40                  45                  50
Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn
55                  60                  65                  70
Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly Tyr Gln
                75                  80                  85
Ser Val Thr Gly Thr Ser Gln Ala Pro Ala Gly Ser Ala Val Cys Arg
             90                  95                  100
Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn
        105                 110                 115
Gln Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val Tyr Ser Leu Thr Arg Thr
    120                 125                 130
Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly
135                 140                 145                 150
Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Val
                155                 160                 165
Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Thr Pro Met Ile Asn Ser Trp
            170                 175                 180
Gly Val Arg Ile Arg Thr
        185
<210>13
<211>1400
<212>DNA
<213>Brachysporiella gayana
<220>
<221>CDS
<222>(159)..(1283)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(726)..(1283)
<400>13
gtaggagctg tagaatcagc acatgaggca agtataaaag aaccagcatg ggatgatcaa     60
agtctgccaa ttcaaaggag caccatcaag ccgtcttgtc tagaactcct tgaacaccct    120
gtctactcca gtactcttgt cacagaacac atctagat atg gag ctc aca agc        173
                                          Met Glu Leu Thr Ser
                                                          -185
ctc atc gcc gca ctc gca gtt att ctg cct att gcc tac ggt gtt          218
Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Pro Ile Ala Tyr Gly Val
                -180                -175                -170
ccc atg gat gcc acc acc aac ctt tct ccc aag gtc ctg gcc gct          263
Pro Met Asp Ala Thr Thr Asn Leu Ser Pro Lys Val Leu Ala Ala
                -165                -160                -155
atg aag cgc gac ctg gga ctt gac gcc agg gag gcc act gcc cgt          308
Met Lys Arg Asp Leu Gly Leu Asp Ala Arg Glu Ala Thr Ala Arg
                -150                -145                -140
gtc acc ttc gaa cgt cgt gct ggc gat gtc atc gag gag ctg cgc          353
Val Thr Phe Glu Arg Arg Ala Gly Asp Val Ile Glu Glu Leu Arg
                -135                -130                -125
agc tcc ctg gga gat tcg ttc gcc ggt gct tgg gtt acg gat ggc          398
Ser Ser Leu Gly Asp Ser Phe Ala Gly Ala Trp Val Thr Asp Gly
                -120                -115                -110
aag gtc atc aac att ggt gtc act gat caa gct ttg gtc tcc aag gtt      446
Lys Val Ile Asn Ile Gly Val Thr Asp Gln Ala Leu Val Ser Lys Val
                -105                -100                -95
aag gaa gct ggc gct gaa ccg atg gtt atg aag aac agc ctc ggg aag      494
Lys Glu Ala Gly Ala Glu Pro Met Val Met Lys Asn Ser Leu Gly Lys
            -90                 -85                 -80
ctt caa gag gca aag aag aag ctt gat cag atc atc aag gag aag ccg      542
Leu Gln Glu Ala Lys Lys Lys Leu Asp Gln Ile Ile Lys Glu Lys Pro
        -75                 -70                 -65
aag acc ctc agc acc tca ggc aag ccc ggc att gca aca tac tac gtt      590
Lys Thr Leu Ser Thr Ser Gly Lys Pro Gly Ile Ala Thr Tyr Tyr Val
    -60                 -55                 -50
gac att gag acc aac aag ctc atc atc acg gca ctc tcc acc agt atc      638
Asp Ile Glu Thr Asn Lys Leu Ile Ile Thr Ala Leu Ser Thr Ser Ile
-45                 -40                 -35                 -30
act caa gct gaa gat ctg gct aag gag gtt ggc ctt tct gag tct gag      686
Thr Gln Ala Glu Asp Leu Ala Lys Glu Val Gly Leu Ser Glu Ser Glu
                -25                 -20                 -15
ttc gag gtg cgc aag act gag aag atg cca tcc cct ttc atc ctc ggc      734
Phe Glu Val Arg Lys Thr Glu Lys Met Pro Ser Pro Phe Ile Leu Gly
            -10                 -5              -1  1
gga gac ccc ttt gtc atc aac aac agt gcc gtg tgc tct gtc ggc ttc      782
Gly Asp Pro Phe Val Ile Asn Asn Ser Ala Val Cys Ser Val Gly Phe
    5                   10                  15
gcc gtc tct ggc ggg ttt gtc tca gct ggc cac tgt ggc ggt caa ggc      830
Ala Val Ser Gly Gly Phe Val Ser Ala Gly His Cys Gly Gly Gln Gly
20                  25                  30                  35
agc cct gtc acc tat atc gac ggt ggc gca ctt gga acg atc gaa gga      878
Ser Pro Val Thr Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Leu Gly Thr Ile Glu Gly
                40                  45                  50
tct gtc ttc ccc ggt gat gca gat atg tcc ttc atc cgt gcc gtt gac      926
Ser Val Phe Pro Gly Asp Ala Asp Met Ser Phe Ile Arg Ala Val Asp
            55                  60                  65
ggc act gac ctc cct ggc atc gtt ggt acc tat ggc aac ggt gat cag      974
Gly Thr Asp Leu Pro Gly Ile Val Gly Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Gln
        70                  75                  80
ccc atc ttt ggc agc aat gtc gca ccc atc ggc tct ggt gtc tgc cgc     1022
Pro Ile Phe Gly Ser Asn Val Ala Pro Ile Gly Ser Gly Val Cys Arg
    85                  90                  95
tca gga aca act acc ggc tat cac tgc ggc cag ctt gat gcc tac gac     1070
Ser Gly Thr Thr Thr Gly Tyr His Cys Gly Gln Leu Asp Ala Tyr Asp
100                 105                 110                 115
gtc act gtc aac tac gac gtg gga cct gtg ttc ggt ctt acc atg acc     1118
Val Thr Val Asn Tyr Asp Val Gly Pro Val Phe Gly Leu Thr Met Thr
                120                 125                 130
tct gct tgc gct gag cct gga gac tct ggc ggc tcc ttc ttt gcc ggt     1166
Ser Ala Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Phe Ala Gly
            135                 140                 145
gac cag gct cag ggc gtc acc tcg gga ggt tct ggt gat tgc acc agc     1214
Asp Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asp Cys Thr Ser
        150                 155                 160
ggt ggt cag acc ttc ttc cag ccc gtg aac gag att ctg gag acc tat     1262
Gly Gly Gln Thr Phe Phe Gln Pro Val Asn Glu Ile Leu Glu Thr Tyr
    165                 170                 175
ggt ctc tcg ctc acc acg gcc taattggatg aggctttgga cagccaagag        1313
Gly Leu Ser Leu Thr Thr Ala
180                 185
cctcaacttt tcatctgtat atagcaatta ttttcgtatc tcaagtactt agatcgtcac   1373
gatcaataca tatggacttc gcttggc                                       1400
<210>14
<211>375
<212>PRT
<213>Brachysporiella gayana
<400>14
Met Glu Leu Thr Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Ile Leu Pro
                -185                -180                -175
Ile Ala Tyr Gly Val Pro Met Asp Ala Thr Thr Asn Leu Ser Pro
                -170                -165                -160
Lys Val Leu Ala Ala Met Lys Arg Asp Leu Gly Leu Asp Ala Arg
                -155                -150                -145
Glu Ala Thr Ala Arg Val Thr Phe Glu Arg Arg Ala Gly Asp Val
                -140                -135                -130
Ile Glu Glu Leu Arg Ser Ser Leu Gly Asp Ser Phe Ala Gly Ala
                -125                -120                -115
Trp Val Thr Asp Gly Lys Val Ile Asn Ile Gly Val Thr Asp Gln
                -110                -105                -100
Ala Leu Val Ser Lys Val Lys Glu Ala Gly Ala Glu Pro Met Val Met
                -95                 -90                 -85
Lys Asn Ser Leu Gly Lys Leu Gln Glu Ala Lys Lys Lys Leu Asp Gln
            -80                 -75                 -70
Ile Ile Lys Glu Lys Pro Lys Thr Leu Ser Thr Ser Gly Lys Pro Gly
        -65                 -60                 -55
Ile Ala Thr Tyr Tyr Val Asp Ile Glu Thr Asn Lys Leu Ile Ile Thr
    -50                 -45                 -40
Ala Leu Ser Thr Ser Ile Thr Gln Ala Glu Asp Leu Ala Lys Glu Val
-35                 -30                 -25                 -20
Gly Leu Ser Glu Ser Glu Phe Glu Val Arg Lys Thr Glu Lys Met Pro
                -15                 -10                 -5
Ser Pro Phe Ile Leu Gly Gly Asp Pro Phe Val Ile Asn Asn Ser Ala
        -1  1               5                   10
Val Cys Ser Val Gly Phe Ala Val Ser Gly Gly Phe Val Ser Ala Gly
    15                  20                  25
His Cys Gly Gly Gln Gly Ser Pro Val Thr Tyr Ile Asp Gly Gly Ala
30                  35                  40                  45
Leu Gly Thr Ile Glu Gly Ser Val Phe Pro Gly Asp Ala Asp Met Ser
                50                  55                  60
Phe Ile Arg Ala Val Asp Gly Thr Asp Leu Pro Gly Ile Val Gly Thr
            65                  70                  75
Tyr Gly Asn Gly Asp Gln Pro Ile Phe Gly Ser Asn Val Ala Pro Ile
        80                  85                  90
Gly Ser Gly Val Cys Arg Ser Gly Thr Thr Thr Gly Tyr His Cys Gly
    95                  100                 105
Gln Leu Asp Ala Tyr Asp Val Thr Val Asn Tyr Asp Val Gly Pro Val
110                 115                 120                 125
Phe Gly Leu Thr Met Thr Ser Ala Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly
                130                 135                 140
Gly Ser Phe Phe Ala Gly Asp Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly
            145                 150                 155
Ser Gly Asp Cys Thr Ser Gly Gly Gln Thr Phe Phe Gln Pro Val Asn
        160                 165                 170
Glu Ile Leu Glu Thr Tyr Gly Leu Ser Leu Thr Thr Ala
    175                 180                 185

Claims (24)

1.一种肽酶家族S2A和/或肽酶家族S1E的蛋白酶，其
i)在pH7和25℃下，在补充有0.1％K-Sorbate的分析缓冲液中，并且在存在1mM的Cu2+时培养164小时后，测量的残余活性相对于培养0小时后的活性，具有至少0.80的残余活性；和/或
ii)相对于没有Cu2+的对照，在存在1mM的Cu2+时，具有至少0.66的相对活性；
其中i)和ii)的活性测量是在pH7.0和25℃，在分析缓冲液中，在底物Suc-AAPF-pNA上测量的；并且
其中对于i)的测量值，蛋白酶具有经SDS-PAGE确定的至少90％的纯度。
2.权利要求1的蛋白酶，包括氨基酸序列，当根据图1排列时，该氨基酸序列不包括下列任何序列：
a)(T120+N122+A127+S129)，并且不包括
b)(S120+S122+T127+T129)；
其中每个氨基酸残基的编号相应于蛋白酶10(SEQ ID NO：2的第1-188位氨基酸)的编号。
3.包括氨基酸序列的上述权利要求中任何一项的蛋白酶，当根据图1排列时，该氨基酸序列不包括下列任何序列：
a)(S91+N176+L179+Q180)，并且不包括
b)(H91+T176+V179+N180)；
其中每个氨基酸残基的编号相应于蛋白酶10(SEQ ID NO：2的第1-188位氨基酸)的编号。
4.包括氨基酸序列的上述权利要求中任何一项的蛋白酶，当根据图1排列时，该氨基酸序列包括下列至少一个序列：
a)(T120+R122+T127+Y129)、(T120+N122+P127+F129)、或(T120+S122+T127+Q129)；和/或
b)(T91+T176+I179+N180)、(S91+N176+L179+E180)、或(S91+N176+L179+S180)，
其中每个氨基酸残基的编号相应于蛋白酶10(SEQ ID NO：2的第1-188位氨基酸)的编号。
5.包括氨基酸序列的上述权利要求中任何一项的蛋白酶，当根据图1排列时，该氨基酸序列不包括下列任何序列：
a)(V51+Q54+A86+A89+H91+S99+S120+S122+E125+T127+T129+N130+M131+T135+R165+T166+T176+V179+N180)，并且不包括
b)(T51+G54+P86+S89+S91+S99+T120+N122+Q125+A127+S129+S130+L131+S135+S165+R166+N176+L179+Q180)；
其中每个氨基酸残基的编号相应于蛋白酶10(SEQ ID NO：2的第1-188位氨基酸)的编号。
6.包括氨基酸序列的上述权利要求中任何一项的蛋白酶，当根据图1排列时，该氨基酸序列包括下列至少一个序列：
T51、N54或G54、Q86或P86、T89或F89、T91或S91、A99或G99、T120、R122或N122、Q125或V125、T127或P127、Y129或F129、S130或G130、L131、N135或S135、S165或T165、V166或S166、T176或N176、I179或L179、N180或E180，
其中每个氨基酸残基的编号相应于蛋白酶10(SEQ ID NO：2的第1-188位氨基酸)的编号。
7.包括氨基酸序列的上述权利要求中任何一项的蛋白酶，当根据图1排列时，该氨基酸序列包括：
a)(T51+N54+Q86+T89+T91+A99+T120+R122+Q125+T127+Y129+S130+L131+N135+S165+V166+T176+I179+N180)，或
b)(T51+G54+P86+F89+S91+G99+T120+N122+V125+P127+F129+G130+L131+S135+T165+S166+N176+L179+E180)；
其中每个氨基酸残基的编号相应于蛋白酶10(SEQ ID NO：2的第1-188位氨基酸)的编号。
8.包括氨基酸序列的上述权利要求中任何一项的蛋白酶，当根据图1排列时，该氨基酸序列包括(H35+D61+S143)，其中每个氨基酸残基的编号相应于蛋白酶10(SEQ ID NO：2的第1-188位氨基酸)的编号。
9.包括氨基酸序列的上述权利要求中任何一项的蛋白酶，当根据图1排列时，该氨基酸序列包括：
(A33+G34+H35+C36+G37)、D61、和
(C137+A138+E139+P140+G141+D142+S143+G144+G145)，
其中每个氨基酸残基的编号相应于蛋白酶10(SEQ ID NO：2的第1-188位氨基酸)的编号。
10.上述权利要求中任何一项的蛋白酶选自：
(a)具有与SEQ ID NO：14的第1至186位氨基酸，和/或(SEQ ID NOs：12、10、8、6、4或2)的第1-188位氨基酸至少40％同一性程度的氨基酸序列的多肽；
(b)由在低严谨条件下与
(i)大肠杆菌(Escherichia coli)DSM 15509中含有质粒的成熟蛋白酶编码部分，
(ii)SEQ ID NO：13的第726-1283位核苷酸、SEQ ID NO：11的第499-1062位核苷酸、SEQ ID NO：9的第502-1065位核苷酸、SEQ ID NO：7的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO：5的第496-1059位核苷酸、SEQ ID NO：3的第559-1122位核苷酸、和/或SEQ ID NO：1的第900-1466位核苷酸，
(iii)(i)或(ii)的至少100个核苷酸的亚序列，或
(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链
杂交的核酸序列编码的多肽；
(c)具有包括取代、缺失、和/或插入一个或多个氨基酸的、SEQ IDNO：14的第1至186位氨基酸、和/或(SEQ ID NOs：12、10、8、6、4或2)的第1-188位氨基酸的氨基酸序列的多肽的变体；
(d)(a)或(b)的等位变体；以及
(e)(a)、(b)、或(d)的具有蛋白酶活性的片段。
11.分离的核酸序列，包括编码权利要求1-10中任何一项多肽的核酸序列。
12.核酸构建体，包括与一个或多个在合适的表达宿主中指导多肽生产的调控序列可操作连接的权利要求11的核酸序列。
13.包括权利要求12的核酸构建体的重组表达载体。
14.包括权利要求12的核酸构建体或权利要求13的载体的重组宿主细胞。
15.用于生产权利要求1-10中任何一项多肽的方法，该方法包括
(a)培养权利要求14的重组宿主细胞以产生包括该多肽的上清液；以及(b)回收该多肽。
16.转基因的植物、或植物部分，其能够表达权利要求1-10中任何一项的多肽。
17.转基因的非人动物、或产品、或其成分，其能够表达权利要求1-10中任何一项的多肽。
18.权利要求1-10中任何一项的至少一个多肽(i)在动物饲料中；(ii)在用于动物饲料的组合物制备中；(iii)用于改善动物饲料的营养价值；(iv)用于增加动物饮食中可消化和/或可溶解的蛋白质；(v)用于增加动物饮食中蛋白质的水解度；和/或(vi)用于处理植物蛋白的用途。
19.动物饲料添加剂，包括权利要求1-10中任何一项的至少一个蛋白酶；以及
(a)至少一种脂溶性维生素，和/或
(b)至少一种水溶性维生素，和/或
(c)至少一种微量矿物质。
20.权利要求19的动物饲料添加剂，其包含Cu，优选其数量为提供1-500ppm的饲料中浓度的Cu。
21.权利要求19-20中任何一项的动物饲料添加剂，其包含浓度达到100,000ppm的Cu。
22.动物饲料组合物，其具有含量为50至800g/kg的粗蛋白，并且包括权利要求1-10中任何一项的至少一种蛋白酶，或权利要求19-21中任何一项的至少一种饲料添加剂。
23.权利要求22的动物饲料组合物，其包含Cu，优选浓度为1-500ppm。
24.清洁剂组合物，其包括权利要求1-10中任何一项的至少一种蛋白酶和至少一种表面活性剂。
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