BRPI1013708B1 - processo para preparar um hidrolisado de proteína à base de leite - Google Patents

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Abstract

processo para preparar um hidrolisado de proteína à base de leite a presente invenção diz respeito a um processo enzimático para fabricar um hidrolisado de proteína à base de leite e uso de tal hidrolisado, por exemplo, em uma composição de fórmula de bebê.

Description

“PROCESSO PARA PREPARAR UM HIDROLISADO DE PROTEÍNA À BASE DE LEITE”
Referência à listagem de sequências
Este pedido contém uma Listagem de Sequências na forma legível por computador. A forma legível por computador é aqui incorporada por referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção diz respeito a um processo enzimático para fabricar um hidrolisado de proteína à base de leite e o uso de tal hidrolisado, por exemplo, em uma composição de fórmula de bebê.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
As fórmulas para bebê foram desenvolvidas, que permitem substituir a amamentação de bebês.
Tais fórmulas de bebê devem satisfazer totalmente as exigências nutricionais de bebês até a introdução de alimentação complementar apropriada. Além disso, o sabor é importante, visto que pelo menos os pais preferem fórmulas para bebê tendo um sabor não amargo. As fórmulas para bebê que ao invés de leite de vaca comum compreendem proteína láctea hidrolisada, por exemplo, proteína de soro de leite parcialmente hidrolisado ou caseína extensivamente hidrolisado, são frequentemente usados visto que tais fórmulas são menos alergênicas e ainda têm um sabor aceitável.
Os processos para a preparação de hidrolisados parciais descritos na literatura frequentemente compreendem o uso de enzimas pancreáticas tais como preparações de tripsina produzidas pela extração de tecido pancreático porcino (ver, por exemplo, a WO9304593 A1, US5039532 A). Alguns dos processos descritos compreendem o uso de uma mistura de tripsina e quimiotripsina. Por exemplo, a EP0353122 A divulga um processo para preparar um hidrolisado de proteína de soro de leite hipoalergênico
Petição 870180142374, de 18/10/2018, pág. 8/37 usando uma mistura de tripsina e quimiotripsina, em que a razão das atividades de quimiotripsina/tripsina está entre 1,5 e 3,0. Na EP0631731 Al, uma mistura de tripsina e quimiotripsina tendo uma razão de Tripsina para quimiotripsina de 1,3 a 18 em unidades USP, mais preferivelmente de 4 a 6, é dita tipicamente resultar em um hidrolisado de propriedades desejáveis.
Por várias razões, o uso de enzimas proteolíticas produzidas a partir de um microorganismo pode conferir benefícios. Por exemplo, a produção de enzima de um microorganismo é eficiente e fácil de controlar. Portanto, tais enzimas podem ser produzidas em quantidades maiores e em alta pureza. Também, o uso de enzimas microbianas ajudaram a superar as dificuldades relacionadas com QA aumentada como respeito à extração de enzimas de uma fonte animal.
Um objetivo para os presentes inventores tem sido desenvolver um processo para fabricar um hidrolisado de proteína à base de leite com enzimas microbianamente produzidas que tem uma alergenicidade baixa. Um outro objetivo foi desenvolver um processo para fabricar um hidrolisado de proteína à base de leite com enzimas microbianamente produzidas que tem um perfil de fragmento de proteína tendo similaridade com o perfil de fragmento de proteína de hidrolisados preparado com preparações extraídas que compreendem tripsina e quimiotripsina. Um outro objetivo foi desenvolver um processo para fabricar um hidrolisado de proteína à base de leite com enzimas microbianamente produzidas que tem um sabor aceitável. Em particular, seria altamente desejável ter um hidrolisado de proteína do soro do leite parcial que tivesse baixa alergenicidade, que tivesse um perfil de fragmento de proteína tendo similaridade com o perfil de fragmento de proteína de hidrolisados preparados com preparações extraídas que compreendem tripsina e quimiotripsina, e/ou que tivesse um sabor aceitável, em particular com respeito ao amargor.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Surpreendentemente verificou-se que as enzimas microbianamente produzidas podem ser usadas para a produção de um hidrolisado de proteína à base de leite, por exemplo, para a inclusão dentro de uma fórmula de bebê.
A invenção portanto diz respeito a um processo para preparar um hidrolisado de proteína à base de leite que compreende o tratamento de uma solução de um material proteináceo à base de leite com
a) uma endopeptidase tipo tripsina produzida a partir de um microorganismo, e
b) pelo menos uma outra endopeptidase produzida a partir de um microorganismo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Fig. 1 mostra cromatogramas de UV de tripsina de Fusarium (traço de fundo) comparados com a tripsina porcina (traço superior) e a identidade da sequência de peptídeo de alguns pico principais é demonstrada.
A Fig. 2 mostra cromatogramas de UV de protease de Brachysporiella (traço de fundo) comparados com quimiotripsina bovina (traço superior) e a identidade da sequência de peptídeo de alguns picos principais são demonstrados.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
No processo de acordo com a invenção, um material proteináceo à base de leite é usado como material de partida. Tal material proteináceo à base de leite, por exemplo, pode consistir de material proteináceo com base em soro do leite, caseína ou misturas de material proteináceo com base em soro do leite e caseína. O material proteináceo com base em soro do leite pode ser originados de um soro de leite obtido da fabricação de queijo, particularmente um soro de leite doce tal como aquele resultante da coagulação da caseína pela renina. O material proteináceo com base em soro do leite também pode ser usado na forma de concentrados na faixa de 35 a 80 % de proteína como obtido pela ultrafiltração (soro de leite UF), ou a partir de isolados de proteína do soro de leite. Este material proteináceo com base em soro do leite, opcionalmente, também pode ser desmineralizado pela troca de íon e/ou eletrodiálise (soro de leite ED). Em uma forma de realização preferida, o material proteináceo à base de leite é concentrado de proteína do soro de leite (WPC).
A fonte de caseína pode ser caseína ácida ou sólidos de leite desnatado.
O material proteináceo com base em soro do leite e/ou a caseína podem ser usados, por exemplo, na forma de concentrados líquidos ou pós.
Em uma forma de realização preferida, o material proteináceo à base de leite é um material proteináceo com base em soro do leite. Em uma forma de realização mais preferida, a fonte de tal material proteináceo com base em soro do leite é soro de leite doce a partir do qual o caseíno-glicomacropeptídeo (CGMP) foi removido ou isolado de proteína do soro de leite. Em uma forma de realização ainda mais preferida, a fonte de tal material proteináceo com base em soro do leite é soro de leite doce do qual que o caseíno-glico-macropeptídeo foi removido.
A remoção do CGMP do soro de leite doce resulta em um material de proteína com um teor de treonina mais próximo daquele do leite humano. Este soro de leite doce modificado pode ser então suplementado com aqueles aminoácidos a respeito dos quais o mesmo tem um teor baixo (principalmente histidina e arginina). Um processo para a remoção de CGMP do soro de leite doce é descrito na EP 880902.
Para o processo da invenção, o material proteináceo é diluído ou reconstituído em soluções ou suspensões, que preferivelmente compreendem em tomo de 2 a 35 % em peso de material proteináceo, mais preferivelmente em tomo de 5 a 30 % em peso.
No processo da invenção, o material proteináceo à base de leite é tratado com pelo menos duas endopeptidases, que foram ambas produzidas a partir de um microorganismo.
Tais endopeptidases a serem usadas no processo da invenção podem ser produzidas a partir de um microorganismo de qualquer gênero. Para os propósitos da presente invenção, o termo “produzida a partir de” como aqui usado em conexão com um dado organismo deve significar que o polipeptídeo usado de acordo com a invenção é produzido pela fermentação de uma célula do organismo dado. O polipeptídeo pode ser nativo para o organismo a partir do qual o mesmo é produzido ou pode ser produzido heterologamente a partir de um organismo hospedeiro em que uma sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo foi inserida.
Uma das endopeptidases a serem usadas em um processo de acordo com a invenção é uma endopeptidase tipo tripsina. O termo “endopeptidase tipo tripsina” é aqui definido como uma endopeptidase que preferencialmente cliva peptídeos ou proteínas no lado do terminal C do isômero L da arginina e/ou lisina.
Em uma forma de realização preferida, a endopeptidase tipo tripsina preferencialmente cliva peptídeos ou proteínas no lado do terminal C da arginina e lisina. Isto significa que a endopeptidase tem uma especificidade mais alta para clivar tanto depois da arginina quanto da lisina do que a mesma tem para clivar depois de qualquer outro aminoácido.
Em uma outra forma de realização preferida, a endopeptidase tipo tripsina preferencialmente cliva peptídeos ou proteínas no lado do terminal C da arginina ou lisina. Isto significa que a endopeptidase tem uma especificidade mais alta para clivar depois de qualquer um de arginina ou lisina do que a mesma tem para clivar depois de qualquer outro aminoácido.
Em uma outra forma de realização preferida, a endopeptidase tipo tripsina preferencialmente cliva peptídeos ou proteínas no lado do terminal C da arginina. Isto significa que a endopeptidase tem uma especificidade mais alta para clivar depois da arginina do que a mesma tem para clivar depois de qualquer outro aminoácido.
Em uma outra forma de realização preferida, a endopeptidase tipo tripsina preferencialmente cliva peptídeos ou proteínas no lado do terminal C da lisina. Isto significa que a endopeptidase tem uma especificidade mais alta para clivar depois da lisina do que a mesma tem para clivar depois de qualquer outro aminoácido.
Em uma outra forma de realização preferida, a endopeptidase tipo tripsina especificamente cliva peptídeos ou proteínas no lado do terminal C da arginina e lisina.
Uma endopeptidase tipo tripsina de acordo com a invenção em uma forma de realização preferida tem uma razão de Tripsina de mais do que 100, em que a razão de Tripsina é determinada como a atividade da enzima quando da divagem depois de Arg ou Lys (qualquer que for o maior) dividido pela atividade da enzima quando da divagem depois de qualquer um de Ala, Asp, Glu, He, Leu, Met, Phe ou Vai (qualquer que for o maior). Isto é, em uma forma de realização preferida, uma endopeptidase tipo tripsina de acordo com a invenção tem uma especificidade para clivar depois de Arg ou Lys (qualquer que for o maior) que é pelo menos 100 vezes maior do que a sua especificidade para clivar depois de qualquer um de Ala, Asp, Glu, Ile, Leu, Met, Phe ou Vai (qualquer que for o maior). Tais medições de atividade para determinar a razão de Tripsina devem ser realizadas e um valor de pH onde a atividade da endopeptidase é pelo menos metade da atividade da endopeptidase no seu pH ótimo. A razão de Tripsina pode ser determinada como descrito no Exemplo 1 do presente pedido.
Tipicamente, tal endopeptidase tipo tripsina tem atividade proteolítica ótima em um pH de cerca de 6,0 a cerca de 11,0, preferivelmente em um pH de cerca de 8 a cerca de 10, e em uma temperatura de cerca de 40°C a cerca de 70°C, preferivelmente em uma temperatura de cerca de 45°C a cerca de 65°C ou de cerca de 45°C a cerca de 60°C.
Em uma forma de realização preferida, a endopeptidase tipo tripsina é uma endopeptidase fungica. Em uma mais formas de realização preferidas, a endopeptidase tipo tripsina é derivada de uma cepa de Fusarium, preferivelmente Fusarium oxisporum. A mesma pode, por exemplo, ter a sequência de aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 do presente pedido (SWISSPROT N2 P35049). Uma endopeptidase tipo tripsina de Fusarium oxisporum tendo a sequência de aminoácido mostrada como aminoácidos 25 a 248 da SEQ ID NO: 2 foi anteriormente descrita (US5.288.627, US5.693.520).
Em uma forma de realização, a endopeptidase tipo tripsina é derivada de Fusarium solani, por exemplo, AP977S tendo a sequência de aminoácido mostrada como a SEQ ID NO: 4 do presente pedido (GENESEQP: ADZ80577). Em uma outra forma de realização, a endopeptidase tipo tripsina é derivada de Fusarium cf. solani, por exemplo, AP971 tendo a sequência de aminoácido mostrada como a SEQ ID NO: 6 do presente pedido.
Para os propósitos da presente invenção, o termo “derivada de” como aqui usado em conexão com derivar um polinucleotídeo ou um polipeptídeo de uma dada fonte (isto é, um organismo biológico) pode significar que o polinucleotídeo (ou o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo) é idêntica a ou uma variante de uma sequência de polinucleotídeo naturalmente presente neste organismo fonte, independente se a sequência de polinucleotídeo foi inserida dentro ou o polipeptídeo é produzido por um outro organismo.
Em uma forma de realização preferida, a endopeptidase tipo tripsina é produzida a partir de um fungo. Em uma forma de realização mais preferida, a endopeptidase tipo tripsina é produzida a partir de uma cepa de Fusarium.
Em uma forma de realização preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina é selecionada do grupo que consiste de:
i) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 60 % de identidade com o polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 4 ou 6;
ii) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos baixa severidade com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 3 ou 5, (ii) a sequência de DNA genômico que compreende a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 3 ou 5, ou (iii) um filamento complementar de tamanho natural de (i) ou (ii);
iii) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 60 % de identidade com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 3 ou 5; e iv) uma variante que compreende uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 4 ou 6.
O termo “polipeptídeo maduro” é aqui definido como um polipeptídeo tendo atividade de endopeptidase que está na sua forma final seguinte à tradução e quaisquer modificações pós-traducionais, tal como o processamento de terminal N, truncagem de terminal C, glicosilação, fosforilação, etc.
O termo “sequência que codifica o polipeptídeo maduro” é aqui definido como uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade de endopeptidase.
O polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 pode ser os aminoácidos de 25 a 248. O polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 4 pode ser os aminoácidos de 26 a 251. O polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 6 pode ser os aminoácidos de 18 a 250.
Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277), preferivelmente a versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usado são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (EMBOSS versão de BLOSUM62). A saída de Needle rotulada “identidade mais longa” (obtida usando a opção -nobrief) é usada como a identidade percentual e é calculada como segue:
(Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento)
Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferivelmente a versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). A saída de Needle rotulada “identidade mais longa” (obtida usando a opção -nobrief) é usada como a identidade percentual e é calculada como segue:
(Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento Número Total de Intervalos no Alinhamento)
Em uma forma de realização preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 60 %, preferivelmente pelo menos 70 % ou pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 % ou pelo menos 90 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 %, e o mais preferivelmente pelo menos 98 % de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2. Em uma forma de realização mais preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina compreende a sequência de aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2. Em uma outra forma de realização mais preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina compreende os aminoácidos de 25 a 248 da SEQ ID NO: 2. Em uma forma de realização ainda mais preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina consiste da sequência de aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2. Em uma forma de realização ainda mais preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina consiste dos aminoácidos de 25 a 248 da SEQ ID NO: 2.
Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 60 %, preferivelmente pelo menos 70 % ou pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 % ou pelo menos 90 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 %, e o mais preferivelmente pelo menos 98 % de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 4. Em uma forma de realização mais preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina compreende a sequência de aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 4. Em uma outra forma de realização mais preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina compreende os aminoácidos de 26 a 251 da SEQ ID NO: 4. Em uma forma de realização ainda mais preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina consiste da sequência de aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 4. Em uma forma de realização ainda mais preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina consiste dos aminoácidos de 26 a 251 da SEQ ID NO: 4.
Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 60 %, preferivelmente pelo menos 70 % ou pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 % ou pelo menos 90 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 %, e o mais preferivelmente pelo menos 98 % de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 6. Em uma forma de realização mais preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina compreende a sequência de aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 6. Em uma outra forma de realização mais preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina compreende os aminoácidos de 18 a 250 da SEQ ID NO: 6. Em uma forma de realização ainda mais preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina consiste da sequência de aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 6. Em uma forma de realização ainda mais preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina consiste dos aminoácidos de 18 a 250 da SEQ ID NO: 6.
Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de severidade muito baixa, preferivelmente condições de severidade baixa, mais preferivelmente condições de severidade média, mais preferivelmente condições de severidade média-alta, ainda mais preferivelmente condições de severidade alta, e o mais preferivelmente condições de severidade muito alta, com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNA genômico que compreende a sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementar de tamanho natural de (i) ou (ii). (J. Sambrook, E. F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).
Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de severidade muito baixa, preferivelmente condições de severidade baixa, mais preferivelmente condições de severidade média, mais preferivelmente condições de severidade média-alta, ainda mais preferivelmente condições de severidade alta, e o mais preferivelmente condições de severidade muito alta, com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NQ: 3, (ii) a sequência de DNA genômico que compreende a sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3, ou (iii) um filamento complementar de tamanho natural de (i) ou (ii).
Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de severidade muito baixa, preferivelmente condições de severidade baixa, mais preferivelmente condições de severidade média, mais preferivelmente condições de severidade média-alta, ainda mais preferivelmente condições de severidade alta, e o mais preferivelmente condições de severidade muito alta, com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 5, (ii) a sequência de DNA genômico que compreende a sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 5, ou (iii) um filamento complementar de tamanho natural de (i) ou (ii).
No contexto da presente invenção, condições de severidade de muito baixa a muito alta são definidas como pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, 0,3 % de SDS, 200 pg/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e 25 % formamida para as severidades muito baixa e baixa, 35 % de formamida para as severidades média e meio-alta, ou 50 % de formamida para as severidades alta e muito alta, a seguir dos procedimentos de Southern blotting padrão por 12 a 24 horas otimamente. O material carregador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando 2X
SSC, 0,2 % de SDS preferivelmente a 45°C (severidade muito baixa), mais preferivelmente a 50°C (severidade baixa), mais preferivelmente a 55°C (severidade média), mais preferivelmente a 60°C (severidade meio-alta), ainda mais preferivelmente a 65°C (severidade alta), e o mais preferivelmente a 70°C (severidade muito alta).
Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina é codificada por um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 60 %, preferivelmente pelo menos 70 % ou pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 % ou pelo menos 90 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 %, e o mais preferivelmente pelo menos 98 %, de identidade com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1.
Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina é codificada por um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 60 %, preferivelmente pelo menos 70 % ou pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 % ou pelo menos 90 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 %, e o mais preferivelmente pelo menos 98 %, de identidade com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3.
Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina é codificada por um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 60 %, preferivelmente pelo menos 70 % ou pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 % ou pelo menos 90 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 %, e o mais preferivelmente pelo menos 98 %, de identidade com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 5.
Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina é uma variante que compreende uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 4 ou 6.
No contexto da presente invenção, tal variante pode ser uma variante alélica (natural) ou a mesma pode ser uma variante artificial. A mesma pode compreender uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (ou vários) aminoácidos de um polipeptídeo maduro. Preferivelmente, as mudanças de aminoácido são de uma natureza menor, isto é substituições ou inserções de aminoácido conservativas que não afetam significantemente a dobra e/ou a atividade da proteína; deleções pequenas, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; extensões de terminal amino ou carboxila pequenas, tais como um resíduo de metionina de terminal amino; um peptídeo ligador pequeno de até cerca de 20 a 25 resíduos; ou uma extensão pequena que facilita a purificação pela mudança da carga líquida ou uma outra função, tal como uma região de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.
A concentração de endopeptidase tipo tripsina é preferivelmente de 1.000 a 1.000.000 de Unidades de Tripsina USP por g com base na proteína do leite, mais preferivelmente de 5.000 a 500.000, e o mais preferivelmente de 25.000 a 250.000.
Uma Unidade de Tripsina USP é a atividade que causa uma mudança na absorbância a 253 nm de 0,003 no pH 7,6 e 25°C usando o cloridreto do éster etílico de N-benzoil-L-arginina (BAEE) como substrato.
A atividade específica pode variar muito significantemente entre endopeptidases iguais à tripsina diferentes, mas a pessoa habilitada facilmente será capaz de determinar em que quantidade a endopeptidase tipo tripsina deva ser usada, por exemplo, com base no grau de hidrólise.
A razão da endopeptidase tipo tripsina para a proteína à base de leite é preferivelmente de 0,01 a 10 % peso/peso, mais preferivelmente de 0,01 a 5 %, mais preferivelmente de 0,05 a 2,5 %, ainda mais preferivelmente de 0,5 a 1 %, e o mais preferivelmente em tomo de 0,75 %.
Em um processo de acordo com a presente invenção, um material proteináceo à base de leite é tratado com uma endopeptidase tipo tripsina e pelo menos uma outra endopeptidase.
Em uma forma de realização preferida, a pelo menos uma outra endopeptidase é uma serina endopeptidase.
Em uma outra forma de realização preferida, a pelo menos uma outra endopeptidase tem uma atividade que é menos específica do que a endopeptidase tipo tripsina.
Em uma outra forma de realização preferida, a pelo menos uma outra endopeptidase tem uma atividade que se parece com a atividade da quimiotripsina de mamífero, por exemplo, quimiotripsina extraída de tecido pancreático porcino.
Em uma outra forma de realização preferida, a pelo menos uma outra endopeptidase tem uma especificidade mais alta para clivar no lado do terminal carbóxi de cada um de tirosina, fenilalanina, triptofano, leucina, metionina ou histidina do que para clivar no lado do terminal carbóxi de qualquer outro aminoácido natural.
Em uma outra forma de realização preferida, a pelo menos uma outra endopeptidase tem uma especificidade para clivar no lado do terminal carbóxi de pelo menos um de tirosina, fenilalanina, triptofano, leucina, metionina ou histidina, que é pelo menos 3 vezes mais alta, preferivelmente pelo menos 5 vezes mais alta, do que a sua especificidade para clivar no lado do terminal carbóxi de cada um de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, isoleucina, lisina, prolina, serina, treonina e valina.
Em uma outra forma de realização preferida, a pelo menos uma outra endopeptidase tem uma especificidade mais alta para clivar no lado do terminal carbóxi de cada um de pelo menos três aminoácidos do grupo que consiste de tirosina, fenilalanina, triptofano, leucina, metionina e histidina do que para clivar no lado do terminal carbóxi da arginina.
Em uma outra forma de realização preferida, a pelo menos uma outra endopeptidase tem uma especificidade mais alta para clivar no lado do terminal carbóxi de cada um de pelo menos três aminoácidos do grupo que consiste de tirosina, fenilalanina, triptofano, leucina, metionina e histidina do que para clivar no lado do terminal carbóxi da lisina.
Em uma outra forma de realização preferida, a pelo menos uma outra endopeptidase tem uma especificidade mais alta para clivar no lado do terminal carbóxi de cada um de tirosina, fenilalanina, triptofano, leucina, metionina e histidina do que para clivar no lado do terminal carbóxi tanto de arginina quanto de lisina.
Em uma outra forma de realização preferida, a pelo menos uma outra endopeptidase tem uma Razão de Quimiotripsina de pelo menos 3, preferivelmente pelo menos 5. Uma Razão de Quimiotripsina de pelo menos 5 significa que a atividade da enzima quando da clivagem depois um de Phe, Leu ou Met (qualquer que for o maior) é pelo menos cinco vezes maior do que a atividade quando da clivagem depois de qualquer um de Ala, Arg, Asp, Glu, Ile, Lys ou Vai (qualquer que for o maior). Isto é, a pelo menos uma outra endopeptidase tem uma especificidade para clivar depois de um de Phe, Leu ou Met (qualquer que for o maior) que é pelo menos 3 vezes mais alta, preferivelmente pelo menos 5 vezes mais alta, do que a sua especificidade para clivar depois de qualquer um de Ala, Arg, Asp, Glu, Ile, Lys ou Vai (qualquer que for o maior). Tais atividades de medição para determinar a Razão de Quimiotripsina deve ser realizada em um valor de pH onde a atividade da endopeptidase é pelo menos metade da atividade da endopeptidase no seu pH ótimo. A Razão de Quimiotripsina pode ser determinada como descrito no Exemplo 1 do presente pedido.
Em uma outra forma de realização preferida, a pelo menos uma outra endopeptidase é uma endopeptidase bacteriana. Em uma forma de realização mais preferida, a pelo menos uma outra endopeptidase é derivada de uma cepa de Nocardiopsis, preferivelmente de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 (anteriormente descrita, por exemplo, na WO 88/03947). A mesma, por exemplo, pode ter a sequência de aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 8 do presente pedido. O DNA e as sequências de aminoácido da protease derivada de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 foram anteriormente publicadas, por exemplo, no pedido de patente DK N° 1996 00013.
Em uma outra forma de realização mais preferida, a pelo menos uma outra endopeptidase é derivada de Metarhizium, preferivelmente Metarhizium anisopliae, por exemplo, tendo a sequência de aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 10 do presente pedido (TREMBL: Q9Y843). Em uma outra forma de realização mais preferida, a pelo menos uma outra endopeptidase é derivada de Brachysporiella, preferivelmente Brachysporiella gayana, por exemplo, tendo a sequência de aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 12 do presente pedido (CGMCC 0865). O DNA e as sequências de aminoácido das proteases derivadas de Metarhizium anisopliae e Brachysporiella gayana foram anteriormente publicadas, por exemplo, na WO04072279.
Em uma outra forma de realização preferida, a pelo menos uma outra endopeptidase é produzida a partir de uma bactéria.
Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a pelo menos uma outra endopeptidase é selecionada do grupo que consiste de:
i) um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 60 % de identidade com o polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOS: 8, 10 ou 12;
ii) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelo menos baixa severidade com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOS: 7, 9 ou 11, (ii) a sequência de DNA genômico que compreende a sequência codificadora de polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOS: 7, 9 ou 11, ou (iii) um filamento complementar de tamanho natural de (i) ou (ii);
iii) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 60 % de identidade com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOS: 7, 9 ou 11; e iv) uma variante que compreende uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOS: 8, 10 ou 12.
O polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 10 pode ser os aminoácidos de 187 a 374. O polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 12 pode ser os aminoácidos de 190 a 375.
Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a pelo menos uma outra endopeptidase compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 60 %, preferivelmente pelo menos 70 % ou pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 % ou pelo menos 90 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 %, e o mais preferivelmente pelo menos 98 % de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 8. Em uma forma de realização mais preferida da invenção, a pelo menos uma outra endopeptidase compreende a sequência de aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 8. Em uma outra forma de realização mais preferida da invenção, a pelo menos uma outra endopeptidase compreende os aminoácidos de 1 a 188 da SEQ ID NO: 8. Em uma forma de realização ainda mais preferida da invenção, a pelo menos uma outra endopeptidase consiste da sequência de aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 8. Em uma forma de realização ainda mais preferida da invenção, a pelo menos uma outra endopeptidase consiste dos aminoácidos de 1 a 188 da SEQ ID NO: 8.
Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a pelo menos uma outra endopeptidase compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 60 %, preferivelmente pelo menos 70 % ou pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 % ou pelo menos 90 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 %, e o mais preferivelmente pelo menos 98 % de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO:
10. Em uma forma de realização mais preferida da invenção, a pelo menos uma outra endopeptidase compreende a sequência de aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 10. Em uma outra forma de realização mais preferida da invenção, a pelo menos uma outra endopeptidase compreende os aminoácidos de 187 a 374 da SEQ ID NO: 10. Em uma forma de realização ainda mais preferida da invenção, a pelo menos uma outra endopeptidase consiste da sequência de aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 10. Em uma forma de realização ainda mais preferida da invenção, a pelo menos uma outra endopeptidase consiste dos aminoácidos de 187 a 374 da SEQ ID NO: 10.
Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a pelo menos uma outra endopeptidase compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 60 %, preferivelmente pelo menos 70 % ou pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 % ou pelo menos 90 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 %, e o mais preferivelmente pelo menos 98 % de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO:
12. Em uma forma de realização mais preferida da invenção, a pelo menos uma outra endopeptidase compreende a sequência de aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 12. Em uma outra forma de realização mais preferida da invenção, a pelo menos uma outra endopeptidase compreende os aminoácidos de 190 a 375 da SEQ ID NO: 12. Em uma forma de realização ainda mais preferida da invenção, a pelo menos uma outra endopeptidase consiste da sequência de aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 12. Em uma forma de realização ainda mais preferida da invenção, a pelo menos uma outra endopeptidase consiste dos aminoácidos de
190 a 375 da SEQ ID NO: 12.
Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a pelo menos uma outra endopeptidase é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de severidade muito baixa, preferivelmente condições de severidade baixa, mais preferivelmente condições de severidade média, mais preferivelmente condições de severidade média-alta, ainda mais preferivelmente condições de severidade alta, e o mais preferivelmente condições de severidade muito alta, com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 7, (ii) a sequência de DNA genômico que compreende a sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 7, ou (iii) um filamento complementar de tamanho natural de (i) ou (ii).
Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a pelo menos uma outra endopeptidase é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de severidade muito baixa, preferivelmente condições de severidade baixa, mais preferivelmente condições de severidade média, mais preferivelmente condições de severidade média-alta, ainda mais preferivelmente condições de severidade alta, e o mais preferivelmente condições de severidade muito alta, com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 9, (ii) a sequência de DNA genômico que compreende a sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 9, ou (iii) um filamento complementar de tamanho natural de (i) ou (ii).
Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a pelo menos uma outra endopeptidase é codificada por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de severidade muito baixa, preferivelmente condições de severidade baixa, mais preferivelmente condições de severidade média, mais preferivelmente condições de severidade média-alta, ainda mais preferivelmente condições de severidade alta, e o mais preferivelmente condições de severidade muito alta, com (i) a sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 11, (ii) a sequência de DNA genômico que compreende a sequência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 11, ou (iii) um filamento complementar de tamanho natural de (i) ou (ii).
Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a pelo menos uma outra endopeptidase é codificada por um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 60 %, preferivelmente pelo menos 70 % ou pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 % ou pelo menos 90 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 %, e o mais preferivelmente pelo menos 98 %, de identidade com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 7.
Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a pelo menos uma outra endopeptidase é codificada por um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 60 %, preferivelmente pelo menos 70 % ou pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 % ou pelo menos 90 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 %, e o mais preferivelmente pelo menos 98 %, de identidade com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 9.
Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a pelo menos uma outra endopeptidase é codificada por um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 60 %, preferivelmente pelo menos 70 % ou pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 85 % ou pelo menos 90 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 %, e o mais preferivelmente pelo menos 98 %, de identidade com a sequência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 11.
Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a endopeptidase tipo tripsina é uma variante que compreende uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de qualquer uma das SEQ ID NOS: 8, 10 ou 12.
A concentração da pelo menos uma outra endopeptidase é preferivelmente de 100 a 100.000 Unidades de Quimiotripsina USP por g com base na proteína do leite, mais preferivelmente de 500 a 50.000, e o mais preferivelmente de 1.000 a 20.000.
Uma Unidade de Quimiotripsina USP é a atividade que causa uma mudança na absorbância a 237 nm de 0,0075 no pH 7,0 e 25°C usando o éster etílico de N-acetil-L-tirosina (ATEE) como substrato.
A atividade específica pode variar muito significantemente entre endopeptidases diferentes, mas a pessoa habilitada facilmente será capaz de determinar em qual quantidade a pelo menos uma outra endopeptidase deva ser usada, por exemplo, com base no grau de hidrólise.
A razão da pelo menos uma outra endopeptidase para a proteína à base de leite é preferivelmente de 0,001 a 1 % peso/peso, mais preferivelmente de 0,001 a 0,5 %, mais preferivelmente de 0,005 a 0,25 %, ainda mais preferivelmente de 0,02 a 0,1 %, e o mais preferivelmente em tomo de 0,05 %.
Preferivelmente, a pelo menos uma outra endopeptidase é adicionada a uma concentração que está entre 2 % e 50 % da concentração de endopeptidase tipo tripsina adicionada com base no peso das endopeptidases, mais preferivelmente entre 5 % e 20 %, ainda mais preferivelmente entre 5 % e 15 %, e o mais preferivelmente cerca de 10 %.
Preferivelmente, a atividade da endopeptidase tipo tripsina medida em Unidades de Tripsina USP está entre 5 vezes e 500 vezes mais alta, mais preferivelmente entre 10 vezes e 200 vezes mais alta, do que a atividade da pelo menos uma outra endopeptidase medida em Unidades de Quimiotripsina USP.
Uma etapa preliminar opcional antes da hidrólise é préaquecer a solução ou suspensão de material proteináceo à base de leite, por exemplo, para garantir a desnaturação das frações da proteína do soro de leite, por exemplo, albumina sérica (BSA), a-lactalbumina, β-lactoglobulina e imunoglobulinas (particularmente IgG). Esta etapa usualmente resulta em uma antigenicidade residual diminuída quando imunoquimicamente avaliada (como descrito a seguir). Em uma forma de realização preferida, uma etapa de pré-tratamento é realizada que compreende o aquecimento do material proteináceo a cerca de 75-95°C por cerca de 5 a 30 minutos. Em uma outra forma de realização preferida, uma etapa de pré-tratamento é realizada que compreende o aquecimento do material proteináceo acima de 135°C por cerca de 1 a 5 segundos. Em uma outra forma de realização preferida, uma etapa de pré-tratamento é realizada que compreende o aquecimento do material proteináceo a cerca de 130°C por cerca de 30 a 60 segundos.
A pessoa habilitada saberá quais as condições para preferivelmente aplicar a reação de hidrólise. A mesma pode ser realizada, por exemplo, como divulgado na US5039532 ou EP0631731A1. A mesma, por exemplo, pode ser conduzida em uma temperatura de cerca de 40°C a 60°C, durante 1 a 6 horas, em valores de pH dentro da faixa de 6,5 a 8,5, preferivelmente de 6,5 a 8.
Em uma forma de realização preferida, a seguir de um primeiro tratamento com as peptidases, o material proteináceo é submetido ainda a uma segunda hidrólise proteolítica seguida pela inativação da endopeptidase. Em uma forma de realização mais preferida, o material proteináceo é submetido a um tratamento térmico entre a primeiro e a segunda hidrólises proteolíticas como divulgado na US5039532.
Independente das condições da hidrólise, o hidrolisado preferivelmente é submetido a uma etapa adicional de inativação das endopeptidases. Esta inativação da peptidase em uma forma de realização preferida compreende um tratamento térmico de cerca de 0,1 a 30 min a uma temperatura de cerca de 70 a 110°C, preferivelmente de 75 a 95°C. Altemativamente, as endopeptidases podem ser inativadas pela esterilização em temperatura ultra-alta (por exemplo, a cerca de 130°C por cerca de 30 a 60 segundos).
O hidrolisado de proteína obtido pode ser ainda clarificado. O mesmo pode ser armazenado em um estado líquido. O hidrolisado também pode ser ultrafiltrado, o mesmo pode ser concentrado, por exemplo, pela evaporação, e o mesmo pode ser secado, por exemplo, pela secagem por pulverização ou liofilização.
Em uma forma de realização preferida, o hidrolisado de proteína obtido tem um grau moderado de hidrólise. Em uma outra forma de realização preferida, o hidrolisado de proteína obtido é um hidrolisado parcial. Em uma outra forma de realização preferida, o hidrolisado de proteína obtido tem um grau de hidrólise entre 5 e 30 %, preferivelmente entre 10 e 25 % e o mais preferivelmente entre 12 e 20 %. Um grau particularmente preferido de hidrólise está em tomo de 14 %. Um outro grau particularmente preferido de hidrólise está em tomo de 15 %.
O grau de hidrólise (DH) expressa o grau da hidrólise de proteína obtido pelo método. No contexto da invenção, o grau de hidrólise (DH) é definido como segue:
DH = (Número de ligações de peptídeo clivadas/Número total de ligações de peptídeo) x 100 %
O grau of hidrólise (DH) do hidrolisado de proteína obtido pode ser medido espectrofotometricamente de acordo com o método de Church, F. C. et al. (1983) Spectrofotometric Assay Using oPhthaldialdehyde for Determination of Proteolysis in Milk and Isolated Milk Protein, J. Dairy Sci. 66: 1219-1227.
A distribuição do peso molecular dos peptideos no hidrolisado de proteína obtido pode ser determinada, por exemplo, pela cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Em uma forma de realização preferida, o hidrolisado da invenção é compreendido de peptídeos onde menos do que 1 % em uma base em peso tem um peso molecular acima de 20.000 kDa.
O hidrolisado obtido pelo método da invenção é preferivelmente destituído de proteína láctea intacta detectável. A ausência de proteína láctea intacta no hidrolisado pode ser demonstrada pela eletroforese em dodecilsulfato de sódio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). A comparação direta entre um material de partida de proteína hidrolisado e não hidrolisado pode ser feita no mesmo gel. Em uma forma de realização preferida, o hidrolisado da invenção é compreendido de peptídeos onde menos do que 1 % em uma base em peso é intacto com base na proteína do leite.
A antigenicidade residual do hidrolisado obtido pelo método da invenção pode ser determinada usando um ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA). A proteína láctea não hidrolisada é imobilizada em uma fase sólida nas concentrações que caem dentro da faixa de resposta de dose linear estabelecida no ensaio. As preparações hidrolisadas são similarmente imobilizadas. Subsequentemente, as incubações sequenciais com conjugado reativo de coelho anti-proteína de leite de vaca e uma enzima com IgG de coelho revela a presença de proteínas e peptídeos antigenicamente reconhecíveis. Os resultados obtidos com o hidrolisado são comparados em uma base de massa com aqueles obtidos com o material de partida de proteína não hidrolisada. A redução da antigenicidade percentual do hidrolisado é depois calculada.
Em uma forma de realização preferida, o hidrolisado de proteína obtido por um processo de acordo com a invenção tem uma redução na antigenicidade de pelo menos cerca de 80 %, preferivelmente pelo menos cerca de 85 %, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90 % ou pelo menos cerca de 95 %, o mais preferivelmente pelo menos cerca de 98 %, e ainda o mais preferivelmente a redução na antigenicidade é de pelo menos cerca de 99 %, em relação ao material proteináceo à base de leite não hidrolisado correspondente como medido pelo ELISA.
Em uma forma de realização preferida, o hidrolisado de proteína obtido por um processo de acordo com a invenção é para uma composição de fórmula de bebê.
Em uma forma de realização preferida, a invenção diz respeito a um processo para preparar uma composição de fórmula de bebê, que compreende as etapas de obter um hidrolisado de proteína à base de leite como divulgado acima e que compreende ainda uma etapa de incluir o hidrolisado de proteína à base de leite dentro de uma composição de fórmula de bebê.
Tal composição de fórmula de bebê pode estar na forma de um pó, um concentrado líquido, ou um líquido pronto para o uso.
Tal composição de fórmula de bebê preferivelmente contém ingredientes que são planejados para atingir as necessidades nutricionais de um bebê humano. Assim, além de um hidrolisado de proteína obtido de acordo com um processo da invenção, a fórmula de bebê deve preferivelmente conter uma fonte de lipídeo, uma fonte de carboidrato e outros nutrientes tais como vitaminas e minerais. Tipicamente, óleos de animal, óleos vegetais, amido, sacarose, lactose e/ou sólidos de xarope de milho podem ser adicionados à fórmula para fornecer parte ou todo dos nutrientes acima.
E preferido que uma composição de fórmula de bebê que compreende um hidrolisado de proteína da invenção seja nutricionalmente completa. Pelo termo “nutricionalmente completo” é intencionado que a composição contenha nutrientes adequados para sustentar a vida humana saudável por períodos prolongados.
Em uma forma de realização preferida, uma composição de fórmula de bebê que compreende um hidrolisado de proteína da invenção adicionalmente inclui arginina livre em uma quantidade de 0,1 a 2 % em peso de proteína e/ou histidina livre em uma quantidade de 0,1 a 3 % em peso de proteína. A adição de arginina livre e/ou histidina livre é particularmente preferida se soro de leite doce modificado ou isolado de proteína do soro de leite são usados como o material proteináceo à base de leite no processo da invenção.
Em uma outra forma de realização preferida, uma composição de fórmula de bebê que compreende um hidrolisado de proteína da invenção está na forma de uma composição nutricionalmente completa que compreende uma quantidade de hidrolisado de proteína à base de leite de pelo menos 5 % de sólido seco, preferivelmente de cerca de 10 a 30 % de sólido seco.
EXEMPLOS
Exemplo 1
Alternativa microbiana para preparação de tripsina pancreática porcina extraída
A Tripsina Pancreática Novo 6.OS (disponível da Novozymes A/S - a seguir PTN) é um produto produzido pela extração de tecido pancreático porcino. Os componentes principais na PTN são tripsina e quimiotripsina com uma razão de tripsina:quimiotripsina de pelo menos 12,5:1 (base de atividade, isto é Unidades de Tripsina USP:Unidades de Quimiotripsina USP).
Para identificar uma alternativa microbiana adequada para uma preparação de enzima extraída como PTN, a atividade no pH 9 de proteases microbianas diferentes em 10 substratos Suc-AAPX-pNA diferentes disponíveis da Bachem (X = A, R, D, E, I, L, K, M, F e V) foi medida. Com base nestas medições, a Razão de Tripsina (TR) e a Razão de Quimiotripsina (CR) para cada protease microbiana foram calculadas. A Razão de Tripsina e a Razão de Quimiotripsina são definidas como segue:
TR = atividade máx no Suc-AAP(R/K)-pNA/atividade máx no SucAAPnon(R/K)-pNA
CR = atividade máx no Suc-AAP(F/L/M)-pNA/atividade máx no Sue28
AAPnon(F/L/M)-pNA
Razão de Tripsina:
As Tripsinas são serina endopeptidases específicas que clivam no lado do terminal carbóxi de um resíduo de arginina ou um resíduo de lisina, isto é elas têm uma preferência explícita para R ou K na posição Pl. Portanto, uma definição razoável de uma protease tipo tripsina é que a razão de Tripsina é > 100, significando que a atividade em qualquer um dos outros 8 substratos Suc-AAPnon(R/K)-pNA é menor do que 1 % da atividade no melhor substrato de Suc-AAP(R/K)-pNA.
Razão de Quimiotripsina:
As Quimiotripsinas são conhecidas ter uma preferência menos explícita para clivar no lado do terminal carbóxi de resíduos de aminoácido aromáticos (Trp, Tyr ou Phe) ou dos resíduos de aminoácido hidrofóbicos Leu, Met e His. Quando comparada com a tripsina, a quimiotripsina é uma endopeptidase menos específica, uma definição razoável de uma protease tipo quimiotripsina é que a Razão de Quimiotripsina é > 5, significando que a atividade em qualquer um dos outros 7 substratos de Suc-AAPnon(F/L/M)pNA é menor do que 20 % da atividade no melhor substrato de SucAAP(F/L/M)-pNA.
Ensaio de Suc-AAPX-pNA:
Proteases: PTN
Tripsina Porcina (UNIPROT: P00761)
Tripsina de Fusarium (protease tipo tripsina de Fusarium oxisporum, SEQ ID NO: 2)
Quimiotripsina tratada com TLCK bovino (Sigma, C-3142)
Alcalase (disponível da Novozymes A/S)
Bacilopeptidase F (dei?, licheniformis, UNIPROT: Q65JX1) Protease de Brachysporiella (de Brachysporiella gayana, SEQ
ID NO: 12)
Esperase (disponível da Novozymes A/S)
Protease de Metarhizium (de Metarhizium anisopliae, SEQ ID NO: 10)
Protease de Nocardiopsis (de Nocardiopsis sp. NRRL 18262, SEQ ID NO: 8)
Savinase (disponível da Novozymes A/S)
Substratos: Suc-AAPA-pNA (Bachem L-1775)
Suc-AAPR-pNA (Bachem L-1720)
Suc-AAPD-pNA (Bachem L-1835)
Suc-AAPE-pNA (Bachem L-1710)
Suc-AAPI-pNA (Bachem L-1790)
Suc-AAPL-pNA (Bachem L-1390)
Suc-AAPK-pNA (Bachem L-1725)
Suc-AAPM-pNA (Bachem L-1395)
Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400)
Suc-AAPV-pNA (Bachem L-1770)
Temperatura: temperatura ambiente (25°C)
Tampão de ensaio: 100 mM de ácido succínico, 100 mM de HEPES, 100 mM de CHES, 100 mM de CABS, 1 mM de CaCl2, 150 mM de KC1, 0,01 % de Triton X-100, pH 9,0.
Ensaio: 20 μΐ de diluição de peptidase (diluídos em 0,01 % de Triton X-100) foram colocados em um reservatório em uma placa Microtituladora. O ensaio foi iniciado pela adição de 200 μΐ de substrato de pNA (50 mg dissolvidos em 1,0 ml de DMSO e diluídos ainda 90x com o Tampão de ensaio). O aumento inicial em OD405 foi monitorado como uma medida da atividade de peptidase. Se uma plotagem linear (ou quase linear) não foi obtida no tempo de medição de 4 minutos, a peptidase foi diluída ainda mais e o ensaio foi repetido.
Dados:
Suc-AAPX-pNA Tripsina Porcina Tripsina de Fusariu m Quimiotripsina bovina Alcalase Bacilop eptidase F Protease de Brachys Esperas e Protease de Metarhi Protease de Nocardi Savinas e
Suc-AAPA-pNA 0,0000 0,0000 0,0009 0,0250 1,0000 0,0185 0,1608 0,0237 0,1297 0,1031
Suc-AAPR-pNA 1,0000 1,0000 0,0062 0,0118 0,5819 0,0456 0,0086 0,0374 0,0906 0,0013
Suc-AAPD-pNA 0,0000 0,0000 0,0001 0,0005 0,7323 0,0084 0,0139 0,0075 0,0007 0,0004
Suc-AAPI-pNA 0,0000 0,0000 0,0007 0,0003 0,0023 0,0009 0,0019 0,0007 0,0003 0,0001
Suc-AAPM-pNA 0,0003 0,0000 0,3476 0,3758 0,6546 0,4439 1,0000 0,4210 0,7808 0,9177
Suc-AAPV-pNA 0,0000 0,0000 0,0004 0,0003 0,3544 0,0027 0,0009 0,0020 0,0137 0,0006
Suc-AAPL-pNA 0,0000 0,0000 0,2244 0,8650 0,0557 0,2838 0,6591 0,1940 0,1800 0,1789
Suc-AAPE-pNA 0,0000 0,0000 0,0003 0,0029 0,0144 0,0007 0,0060 0,0004 0,0000 0,0082
Suc-AAPK-pNA 0,5140 0,5307 0,0003 0,0190 0,1562 0,0219 0,0052 0,0264 0,0754 0,0097
Suc-AAPF-pNA 0,0006 0,0000 1,0000 1,0000 0,0089 1,0000 0,3889 1,0000 1,0000 1,0000
Máx de SucAAP(R/K)-pNA 1,0000 1,0000 0,0062 0,0190 0,5819 0,0456 0,0086 0,0374 0,0906 0,0097
Máx de Suc- AAPnon(R/K)pNA 0,0006 0,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000
Razão de Tripsina 1750 >10000 0,006 0,019 0,58 0,046 0,009 0,037 0,091 0,010
Máx de Suc- AAP(F/L/M)pNA 0,0006 0,0000 1,0000 1,0000 0,6546 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000
Máx de Suc- AAPnon(F/L/M)pNA 1,0000 1,0000 0,0062 0,0250 1,0000 0,0456 0,1608 0,0374 0,1297 0,1031
Razão de Quimiotripsina 0,0006 0,0000 160 40 0,65 22 6,2 27 7,7 9,7
Os dados de atividade relatados para cada endopeptidase na
Tabela são relativos à atividade para o melhor substrato de Suc-AAPX-pNA.
Conclusão:
Usando a definição acima de uma protease tipo tripsina como 5 uma protease tendo uma razão de Tripsina de > 100, Tripsina porcina (TR = 1750) e tripsina de Fusarium (TR > 10.000) são proteases iguais às tripsinas. O resto das proteases testadas não são proteases iguais às tripsinas.
Usando a definição acima de uma quimioprotease tipo tripsina como uma protease tendo uma Razão de Quimiotripsina de > 5, 10 Quimiotripsina bovina (CR = 160), Alcalase (CR = 40), Protease de Brachysporiella (CR = 22), Esperase (CR = 6,2), Protease de Metarhizium (CR = 27), protease de Nocardiopsis (CR = 7,7) e Savinase (CR = 9,7) são quimioproteases iguais às tripsinas. O resto das proteases testadas não são quimioproteases iguais às tripsinas.
Uma definição alternativa de uma quimioprotease tipo tripsina seria calcular a soma dos quadrados das diferenças de atividade relativa para a quimiotripsina. Usando esta definição, a protease de Metarhizium revela-se como a serina protease mais tipo quimiotripsina, seguido pela protease de
Brachysporiella, protease de Nocardiopsis, Savinase e Alcalase (dados não mostrados).
Exemplo 2
Hidrólise de WPC com combinações de endopeptidases microbianas
A etapa seguinte foi observar se é possível obter o mesmo grau de hidrólise (DH) de um concentrado de proteína do soro de leite (WPC) usando uma mistura de endopeptidases microbianas como a que pode ser obtida a partir de PTN quando as misturas das duas enzimas são dosadas de uma maneira igual.
Experimentos de Hidrólise:
O ensaio de hidrólise que foi realizado um procedimento de hidrólise de duas etapas. 8,4 % de WPC (contendo 80 % de proteína do soro de leite) foram colocados em suspensão em tampão pH 8,0. A primeira etapa de hidrólise foi realizada pela adição de metade da dose de enzima e incubando a solução com agitação por 2 horas a 55°C. Depois o substrato da proteína do soro de leite parcialmente hidrolisado foi desnaturado por um tratamento térmico curto (5 minutos a 90°C). A segunda etapa de hidrólise foi realizada pela adição da outra metade da dose de enzima e incubando a solução com agitação por 30 minutos a 55°C. Finalmente, a reação de enzima foi interrompida e as enzimas inativadas por um outro tratamento térmico curto (10 minutos a 90°C). A concentração final de proteína do soro de leite/peptídeos foi de 6,4 % de WP. Pelo uso deste ensaio, deve ser capaz de comparar PTN com uma alternativa microbiana.
Como H+ é produzido durante a hidrólise na faixa alcalina, foi checado o pH para algumas das dosagens de enzima mais altas. Foi possível detectar nenhuma queda no pH, indicando que o nosso tampão de pH 8,0 é forte o bastante para controlar o pH durante a hidrólise.
Primeiro, foram testadas 4 doses diferentes de PTN (0,625, 1,25, 2,5 e 5,0 mg de tripsina/g de proteína do soro de leite). Para a dose mais baixa o hidrolisado de proteína de soro de leite foi muito viscoso e quase impossível de sair do tubo de Eppendorf e portanto DH não foi determinado para este hidrolisado. Uma análise de SDS-PAGE dos hidrolisados de PTN mostrou que pelo menos para a dose de 5,0 mg de tripsina/g de proteína do soro de leite, a maior parte das proteínas intactas foram degradadas. No gel de SDS-PAGE seguinte, quantidades iguais de proteína/peptídeos são carregadas em cada linha. DH = 9,4 % para a dosagem de 5,0 mg de tripsina/g de proteína do soro de leite PTN. ° C
Depois foram conduzids alguns experimentos de hidrólise com tripsinas purificadas (Tripsina Porcina e Tripsina de Fusarium). Não foi possível obter um DH acima de aprox. 6,5 %, mesmo em dosagens relativamente altas. Ver a seção de Dados abaixo.
Finalmente, foi conduzida uma terceira série de experimentos de hidrólise onde foi mantida a dosagem da tripsina de Fusarium constante a 5,0 mg de tripsina/g de proteína do soro de leite e variamos as dosagens da quimioprotease tipo tripsina (0,25, 0,5 e 1,0 mg de protease/g de proteína do soro de leite). Aqui foram obtidos valores DH na mesma faixa como PTN dosado da mesma maneira (DH = 9,4 %).
E observado que o efeito sobre DH de aumentar as dosagens da segunda quimioprotease tipo tripsina têm efeitos diferentes dependendo da segunda protease. A combinação de tripsina de Fusarium e Glutamil peptidase BL de Bacillus licheniformis (que não é uma quimioprotease tipo tripsina) parece estabilizar como foi observado para a tripsina de Fusarium sozinha.
Existe uma correlação entre os valores DH (ver a seção de Dados abaixo) e a aparência dos hidrolisados de proteína de soro de leite sobre os géis de SDS-PAGE. Uma combinação de tripsina de Fusarium e protease de Nocardiopsis parece (a partir dos géis de SDS-PAGE - não mostrado) ser a melhor combinação de serina protease para remover proteínas intactas do substrato de WPC.
Ensaio de Hidrólise:
Endopeptidases usadas:
Enzima Cone, (mg/ml)
Tripsina Quimiotripsina
PTN 6.0S 187 mg/g (1310 USP/mg) 18,7 mg/g (84 USP/mg)
Tripsina Porcina 3,1
Tripsina de Fusarium 8,0
Protease de Metarhizium 2,6
Protease de Brachysporiella 10,6
Alcalase 19,6
Protease de Nocardiopsis 8,8
Glutamil peptidase BL 3,7
Para o cálculo do teor de tripsina e quimiotripsina em PTN 6.OS, foi usada uma atividade específica para a Tripsina Porcina = 7000 USP/mg e uma atividade específica para a Quimiotripsina Porcina = 4500 USP/mg. A concentração de enzima nas outras preparações foi estimada a partir de A280/E280. PTN foi dissolvida em 20 mM de HEPES/NaOH, 5 mM de CaCl2, pH 8. Outras enzimas foram usadas “como tal” depois de descongelar.
Hidrólise:
mg/ml WPC (LactProdan80 da Arla que compreende cerca de 80 % de proteína de matéria seca total) foi colocada em suspensão em 1,0 M de HEPES/NaOH, 50 mM de CaCl2, pH 8,0 e o pH foi ajustado ao pH 8,0 com 27 % de NaOH. 1000 μΐ desta suspensão foi colocada em um tubo Eppendorf em gelo. 25 μΐ de solução de Peptidase foram adicionados e o tubo de Eppendorf foi transferido a um termo-misturador Eppendorf pré-aquecido a 55°C. O tubo foi incubado por 120 minutos no termo-misturador (55°C, 1400 rpm). O tubo foi depois transferido para um outro termo-misturador de Eppendorf que foi pré-aquecido a 90°C e incubados por 5 minutos neste termo-misturador (90°C, 1400 rpm). O tubo foi transferido de volta para o primeiro termo-misturador de Eppendorf a 55°C e depois de 5 minutos (para levar a mistura de hidrólise de volta para 55°C), 25 μΐ da solução de Peptidase foram adicionados e o tubo foi incubado por 30 minutos no termo-misturador (55°C, 1400 rpm). Finalmente, o tubo foi mais uma vez transferido para o termo-misturador a 90°C e incubado por 10 minutos neste termo-misturador (90°C, 1400 rpm).
O hidrolisado (com 64 mg/ml de proteína do soro de leite) foi analisado pela SDS-PAGE (não mostrado) e DH foi medido usando o método OPA.
SDS-PAGE:
O hidrolisado foi diluído 5x em 0,1 % de SDS. 20 μΐ desta diluição foram misturados com 20 μΐ de tampão de amostra de 2x SDS-PAGE com agente redutor. Esta mistura foi fervida e 10 μΐ foram aplicados a um gel de Tris-glicina de 4 a 20 %.
método OPA para medir DH:
O hidrolisado foi diluído 80x em 0,01 % de Triton X-100. 30 μΐ desta diluição foi transferida a uma Placa MicroTituladora (MTP) e 225 μΐ de reagente OPA recém preparado foram adicionados e depois de 2 minutos a absorbância a 340 nm foi lida em uma leitora MTP. A resposta de amostras desconhecidas foram comparadas com uma série de diluição de padrão de serina e expressada como mg/ml de serina. A “resposta OPA” foi calculada como “mg/ml de serina no hidrolisado” em relação a “mg/ml de substrato”. A “resposta OPA” do branco de enzima foi subtraída para o cálculo de DH. Reagente OPA:
3,81 g de tetraborato de di-sódio (Merck 6308) e 1,00 g de SDS (BIO-RAD 161-0301) foram dissolvidos em 80 ml de água desionizada. Exatamente antes do uso, 80 mg de o-ftaldialdeído (Merck 821027) dissolvidos em 2,0 ml de etanol foram adicionados e 1,0 ml de DTE a 10 % (p/v) (Merck 24511). Finalmente, o volume foi ajustado a 100 ml com água desionizada.
Dados:
| Dosagem | “Resposta | |
Enzima Tripsina Quimiotripsina OPA” Total (%) DH (%)
(mg/g WP) (mg/g WP)
Branco 0 0 9,4 0,0
PTN 1,25 0,125 16,6 7,2
PTN 2,5 0,25 17,3 7,9
PTN 5 0,5 18,8 9,4
Tripsina Porcina 2,5 15,8 6,4
Tripsina Porcina 5 16,0 6,6
Tripsina de Fusarium 5 15,5 6,1
Tripsina de Fusarium 10 15,9 6,5
Branco 0 0 9,5 0,0
Tripsina de Fusarium + Metarhizium 5 0,25 18,1 8,6
Tripsina de Fusarium + Metarhizium 5 0,5 19,3 9,8
Tripsina de Fusarium + Metarhizium 5 1,0 21,6 12,1
Tripsina de Fusarium + Brachysporiella 5 0,25 17,3 7,8
Tripsina de Fusarium + Brachysporiella 5 0,5 17,9 8,4
Fusarium + Brachysporiella 5 1,0 19,1 9,6
Tripsina de Fusarium + Alcalase 5 0,25 19,6 10,1
Tripsina de Fusarium + Alcalase 5 0,5 22,4 12,9
Tripsina de Fusarium + Alcalase 5 1,0 24,1 14,6
Tripsina de Fusarium + Nocardiopsis 5 0,25 19,1 9,6
Tripsina de Fusarium + Nocardiopsis 5 0,5 20,0 10,5
Tripsina de Fusarium + Nocardiopsis 5 1,0 21,0 11,5
Fusaríum + Glutamil peptidase BL 5 0,25 18,9 9,4
Fusarium + Glutamil peptidase BL 5 0,5 19,4 9,9
Fusarium + Glutamil peptidase BL 5 1,0 19,8 10,3
Conclusão:
Parece ser possível obter o mesmo grau de hidrólise (DH) de
WPC usando um substituto de PTN microbiano (dosado como PTN).
Também é óbvio a partir dos resultados que uma protease tipo tripsina sozinha não será capaz de dar o mesmo DH como PTN.
Exemplo 3
Análise das especificidades de clivagem de Tripsina de Fusarium e endopeptidase de Brachysporiella
Introdução:
A especificidade da clivagem proteolítica da endopeptidase microbiana tipo tripsina, a tripsina de Fusarium, foi comparada com a tripsina porcina. E a especificidade da clivagem proteolítica da quimoendopeptidase microbiana tipo tripsina de Brachysporiella foi comparada com a especificidade proteolítica de quimiotripsina porcina tratada com TLCK. (TLCK inativa a atividade de tripsina sem afetar a quimiotripsina).
As análises de especificidade de clivagem foram realizadas pela incubação das endopeptidases descritas com o substrato modelo desnaturado de beta-lactoglobulina A bovina. As sequências dos peptídeos proteolíticos resultantes foram determinadas pelo RP-HPLC-ESI-Orbitrap MS/MS em tempo real combinado com um programa de análise de dados de espectrometria de massa em tandem usado para a identificação de proteína (SEQUEST) e uma base de dados contendo apenas beta-lactoglobulina A bovina.
Amostras:
Proteases: Tripsina Porcina (acesso UniProt: P00761)
Tripsina de Fusarium (protease tipo tripsina de Fusarium oxisporum, SEQ ID NO: 2)
Quimiotripsina tratada comum TLCK Bovina (Sigma, C-3142)
Protease de Brachysporiella (de Brachysporiella gayana, SEQ ID NO. 12)
Substrato: Beta-lactoglobulina A, de leite bovino (Sigma L7880 097K7010)
Proteólise:
Desnaturação de beta-lactoglobulina A:
Uma quantidade de cerca de 11 mg de Beta-lactoglobulina A de leite bovino (Sigma L7880 097K7010) foi dissolvida em 1 ml de tampão (100 mM de acetato de amônio, 1 mM de CaCl2 pH 8. As pontes de dissulfeto de beta-lactoglobulina foram reduzidas pela adição de ditiotreitol (DTT, CAS número 3483-12-3) a uma concentração final de 20 mM. A mistura foi incubada na temperatura ambiente (25°C) por 30 min. Subsequentemente 2lodoacetamida (CAS número 144-48-9) foi adicionada a uma concentração final de 55 mM. A última mistura foi incubada no escuro e na temperatura ambiente por 30 min.
A beta-lactoglobulina A desnaturada foi trocada de tampão para 100 mM de acetato de amônio, 1 mM de CaCl2 pH 8 antes da incubação com as proteases. A mudança de tampão foi realizada em uma coluna de Dessalinização PD-10 da GE-healthcare (material de coluna Sephadex G-25). Primeiro a coluna foi equilibrada com 25 ml de acetato de amônio a 100 mM, 1 mM de CaCl2 pH 8. O volume da amostra de beta-lactoglobulina foi ajustado a um volume final de 2,5 ml com tampão de equilíbrio e carregado na coluna. A beta-lactoglobulina A foi eluída com 3,5 ml de acetato de amônio a 100 mM, 1 mM de CaCl2 pH 8. A concentração de proteína final da beta-lactoglobulina trocada de tampão foi determinada para 2 mg/ml pela análise espectrofotométrica a 280 nm e um coeficiente de extinção estimado (A280) de 1.
Incubação proteolítica:
Uma quantidade de 400 pg de beta-lactoglobulina que corresponde a 190 μΐ de solução foi incubada a 40°C com a seguinte quantidade de proteases:
Tripsina porcina 8 pg
Tripsina de Fusarium 16 pg
Quimiotripsina tratada com TLCK bovina 4 pg
Protease de Brachysporiella 4 pg
O processo de proteólise foi interrompido depois de 18 horas pela adição de solução aquosa de ácido trifluoroacético a 10 % (TFA, CAS número 76-05-1) a uma concentração final de 1 % de TFA nas amostra. Todas as amostras foram armazenadas a -20°C antes da análise pela LC-MS/MS Método de LC-MS/MS:
Todas as amostras proteolíticas foram analisadas em um sistema RP-HPLC-ESI-Orbitrap MS/MS que consiste de coluna Waters Cl8 (ACQUITY UPLC® BEH Cl8, 1,7 pm, 2,1 x 100 mm), um sistema de cromatografia líquida Accela da Thermo Scientific e um espectrômetro de massa híbrido LTQ Orbitrap XL ETD da Thermo Scientific. Um volume de 20 μΐ foi injetado na coluna. Os peptídeos foram separados pelo seguinte gradiente:
Solvente A: 0,1 % de ácido fórmico (CAS número 64-18-6 ) em água UHQ e solvente B: 0,1 % de ácido fórmico em acetonitrila (CAS número 75-05-8)
Tempo (min) % de solvente B
0 5
2 5
49 50
51 90
53 90
55 5
60 5
Os peptídeos de elução foram monitorados em tempo real por um detetor de UV a 214 nm e subsequentemente em tempo real por um espectrômetro de massa no modo MS/MS. Os cromatogramas de UV resultantes são mostrados nas Figuras 1 e 2. O íon precursor no espectrômetro de massa foi detectado em uma resolução de 30.000 (FWHM) e os ions do fragmento em uma resolução de 15.000 (FWHM). Os espectros de MS e MS/MS resultantes foram analisados com o software SEQUEST (algoritmo condicionado às patentes U.S. 6.017.693 e 5.538.897) via Proteome Discoverer (versão 1,0, Thermo Fisher Scientific) contra beta-lactoglobulina. A enzima de clivagem foi definida como “Nenhuma enzima” com especificidade de clivagem “não específica”. Os fragmentos proteolíticos de alguns dos picos de UV intensivos altos foram identificados como indicado nas Figuras 1 e 2.
Resultados:
Para a comparação o cromatograma de UV do ensaio de
Tripsina de Fusarium (traço de fundo) é demonstrado na Figura 1 junto com o ensaio de tripsina porcina (traço superior) e a identidade de sequência de alguns peptídeos principais é demonstrada. Do mesmo modo, na Figura 2, o cromatograma de UV do ensaio de protease de Brachysporiella (traço de fundo) é demonstrado junto com a quimiotripsina bovina (traço superior). Em 10 todos os casos, os peptídeos identificados foram detectados tanto no traço superior quanto no de fundo.
Conclusão:
Na Figura 1, peptídeos proteolíticos comuns de betalactoglobulina A bovina são detectados quanto a tripsina de Fusarium e 15 tripsina porcina, assim as duas endoproteases ambas têm especificidade tipo tripsina. Na Figura 2, alguns peptídeos proteolíticos comuns de betalactoglobulina A bovina são detectados quanto a protease de Brachysporiella e quimiotripsina bovina.

Claims (8)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Processo para preparar um hidrolisado de proteína à base de leite, caracterizado pelo fato de que compreende o tratamento de uma solução de um material proteináceo à base de leite com
    a) uma endopeptidase tipo tripsina produzida a partir de um microorganismo e compreendendo uma sequência de aminoácido correspondente ao polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, em que a endopeptidase tipo tripsina é de uma cepa de Fusarium, e
    b) pelo menos uma outra endopeptidase produzida a partir de um microorganismo e compreendendo uma sequência de aminoácido correspondente ao polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8, em que a pelo menos uma outra endopeptidase é de uma cepa de Nocardiopsis.
  2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a razão da endopeptidase tipo tripsina para a proteína à base de leite é de 0,01 a 10 % peso/peso.
  3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a razão da pelo menos uma outra endopeptidase para a proteína à base de leite é de 0,001 a 1 % peso/peso.
  4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de adicionar a pelo menos uma outra endopeptidase em uma concentração que está entre 2 % e 50 % da concentração de endopeptidase tipo tripsina adicionados com base no peso das endopeptidases.
  5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de conduzir a hidrólise em uma temperatura de cerca de 40°C a 60°C, durante 1 a 6 horas, nos valores de pH dentro da faixa de 6,5 a 8,5.
  6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender adicionar o hidrolisado de proteína à base de leite obtido em uma composição de fórmula de bebê.
  7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado
    Petição 870190057445, de 21/06/2019, pág. 8/9 pelo fato de que a endopeptidase tipo tripsina é um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido correspondente ao polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.
  8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a endopeptidase tipo tripsina é um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido correspondente ao polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8.
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