JP2012522498A - 乳由来タンパク質加水分解物の製法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
かかる人工栄養乳は、適切な離乳食が始まるまで、乳幼児の栄養要求を完全に満たさなければならない。更に、味は重要であり、少なくとも親は苦味のない人工栄養乳を好む。通常の牛乳の代わに加水分解乳タンパク質、例えば部分加水分解ホエータンパク質や高加水分解カゼインを含む人工栄養乳がよく使用される。アレルギー性が低く、味も許容し得るからである。
乳由来タンパク性物質の溶液を、
a)微生物から産生されるトリプシン様エンドペプチダーゼ、及び
b)微生物から産生される少なくとも1つの他のエンドペプチダーゼ、
を用いて処理することを含む方法に関する。
ホエー由来タンパク性物質及び/又はカゼインは、例えば液体濃縮物又は粉末の形で使用される。
i)配列番号2、4又は6の何れの成熟ポリペプチドと少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;
ii)(i)配列番号1、3又は5の何れの成熟ポリペプチドコード配列と、(ii)配列番号1、3又は5の何れの成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムDNA配列と、或いは(iii)(i)又は(ii)の完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド;
iii)配列番号1、3又は5の何れの成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも60%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド;及び
iv)配列番号2、4又は6の何れの成熟ポリペプチドの1又は2以上のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を含む変種、
よりなる群から選択される。
(同一の残基数×100)/
(アラインメント長 − アラインメント中のギャップ総数)
(同一のデオキシリボヌクレオチド数×100)/
(アラインメント長 − アラインメント中のギャップ総数)
i)配列番号8、10又は12の何れの成熟ポリペプチドと少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;
ii)(i)配列番号7、9又は11の何れの成熟ポリペプチドコード配列と、(ii)配列番号7、9又は11の何れの成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムDNA配列と、或いは(iii)(i)又は(ii)の完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド;
iii)配列番号7、9又は11の何れの成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも60%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド;及び
iv)配列番号8、10又は12の何れの成熟ポリペプチドの1又は2以上のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を含む変種、
よりなる群から選択される。
DH=(切断されるペプチド結合の数/ペプチド結合の総数)×100%
抽出されたブタ膵臓トリプシン調製物の微生物代替物
膵臓トリプシンNovo 6.0S(Novozymes A/Sから入手できる−以下のPTNで)は、ブタ膵臓組織の抽出により産生される生成物である。PTNの主要な成分はトリプシンとキモトリプシンであり、トリプシン:キモトリプシンの比は少なくとも12.5:1(活性ベース、すなわちUSPトリプシン単位:USPキモトリプシン単位)である。
CR=Suc−AAP(F/L/M)−pNAに対する最大活性/Suc−AAP非(F/L/M)−pNAに対する最大活性
トリプシンは、アルギニン残基又はリジン残基のカルボキシ末端側で切断する特異的セリンエンドペプチダーゼであり、すなわちこれらは、P1位のR又はKに対する厳密な優先性を有する。従ってトリプシン様プロテアーゼの適切な定義は、トリプシン比が>100であり、これは、8個の他のSuc−AAP非(R/K)−pNAの何れに対する活性が、最適なSuc−AAP(R/K)−pNA基質に対する活性の1%未満であることを意味する。
キモトリプシンは、芳香族アミノ酸残基(Trp、Tyr又はPhe)又は疎水性アミノ酸残基Leu、Met、及びHisの何れのカルボキシ末端側での切断に対してあまり厳密ではない優先性を有する。トリプシンと比較して、キモトリプシンはあまり特異的ではないエンドペプチダーゼであり、キモトリプシン様プロテアーゼの妥当な定義は、キモトリプシン比>5であり、これは、7個の他のSuc−AAP非(F/L/M)−pNA基質の何れの上の活性が、最適なSuc−AAP非(F/L/M)−pNA基質に対する活性の20%未満であることを意味する。
プロテアーゼ:
PTN
ブタトリプシン(UNIPROT:P00761)
フザリウムトリプシン(フザリウム・オキシスポルムからのトリプシン様プロテアーゼ、配列番号2)
ウシTLCK-処理キモトリプシン(Sigma, C-3142)
アルカラーゼ(Novozymes A/Sから入手できる)
バシロペプチダーゼ F(バシルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)から, UNIPROT:Q65JX1)
ブラキスポリエラ(Brachysporiella)プロテアーゼ(ブラキスポリエラ・ガヤナから、配列番号12)
エスペラーゼ(Novozymes A/Sから入手できる)
メタリジウムプロテアーゼ(メタリジウム・アニソプリイから入手できる、配列番号10)
ノカルジオプシスプロテアーゼ(ノカルジオプシスNRRL18262種由来である、配列番号8)
サビナーゼ(Novozymes A/Sから入手できる)
Suc-AAPA-pNA(Bachem L-1775)
Suc-AAPR-pNA(Bachem L-1720)
Suc-AAPD-pNA(Bachem L-1835)
Suc-AAPE-pNA(Bachem L-1710)
Suc-AAPI-pNA(Bachem L-1790)
Suc-AAPL-pNA(Bachem L-1390)
Suc-AAPK-pNA(Bachem L-1725)
Suc-AAPM-pNA(Bachem L-1395)
Suc-AAPF-pNA(Bachem L-1400)
Suc-AAPV-pNA(Bachem L-1770)
室温(25℃)
アッセイ緩衝液:100mM コハク酸、100mM HEPES、100mM CHES, 100mM CABS, 1mM CaCl2, 150mM KCl, 0.01% トリトンX-100、pH 9.0。
20μlのペプチダーゼ希釈駅(0.01%トリトンX-100で希釈)をマイクロタイタープレートのウェルに入れた。200μlのpNA基質(50mgを1.0ml DMSOに溶解し、更にアッセイ緩衝液で90×希釈した)を加えることにより、アッセイを開始した。OD405での初期上昇をペプチダーゼ活性の尺度として追跡した。4分間の測定時間内で直線(又はほぼ直線)プロットが達成されなかった場合、ペプチダーゼを更に希釈し、アッセイを繰り返した。
トリプシン比>100を有するプロテアーゼとしてトリプシン様プロテアーゼの上記定義を使用すると、ブタトリプシン(TR=1750)とフザリウム(Fusarium)トリプシン(TR>10,000)は、トリプシン様プロテアーゼである。試験したプロテアーゼの残りは、トリプシン様プロテアーゼではない。
微生物エンドペプチダーゼの組合せによるWPCの加水分解
次の工程は、微生物エンドペプチダーゼの混合物を使用したホエータンパク質濃縮物(WPC)で、2つの酵素混合物を同様に使用した場合にPTNについて得られるものと同じ程度の加水分解(DH)が得られるかどうかを調べることであった。
我々が行った加水分解アッセイは、2工程加水分解法である。8.4%のWPC(80%ホエータンパク質を含有する)をpH8.0の緩衝液に懸濁した。1回目の加水分解工程は、酵素量の半分を加え、溶液を55℃で攪拌しながら2時間インキュベートすることにより行った。次に部分加水分解ホエータンパク質基質を、短時間の熱処理(90℃で5分間)により変性させた。2回目の加水分解工程は、酵素量の他の半分を加え、溶液を55℃で攪拌しながら30分間インキュベートすることにより行った。最後に酵素反応を停止させ、更に短時間の熱処理(90℃で10分間)により酵素を不活性化させた。ホエータンパク質/ペプチドの最終濃度は6.4%WPであった。このアッセイを使用することにより、我々は、PTNを微生物代替物と比較することができるはずである。
84mg/mlのWPC(全乾燥物質の約80%のタンパク質を含むArlaからのLactProdan80)を、1.0M HEPES/NaOH、50mM CaCl2、pH8.0に懸濁し、27%NaOHを用いてpHをpH8.0に調整した。この懸濁物1000μlを氷上のエッペンドルフチューブに入れた。25μlのプロテアーゼ溶液を加え、エッペンドルフチューブを、あらかじめ55℃に加熱したエッペンドルフサーモミキサーに移した。サーモミキサー上でチューブを120分間インキュベートした(55℃、1400rpm)。チューブを、あらかじめ90℃に加熱した別のエッペンドルフサーモミキサーに移し、このサーモミキサー上で5分間インキュベートした(90℃、1400rpm)。チューブを最初の55℃のエッペンドルフサーモミキサーに戻し、5分後(加水分解混合物を55℃にするため)、25μlのペプチダーゼ溶液を加え、チューブをサーモミキサー上で30分間インキュベートした(55℃、1400rpm)。最後にチューブを再度90℃のサーモミキサーに移し、このサーモミキサー上で10分間インキュベートした(90℃、1400rpm)。
加水分解物を0.1% SDSで5×希釈した。この希釈物の20μlを、還元剤を有する20μlの2×SDS−PAGE試料緩衝液と混合した。この混合物を沸騰させ、10μlを4〜20%トリス−グリシンゲルに適用した。
加水分解物を0.01% トリトンX−100で80×希釈した。この希釈物30μlをマイクロタイタープレート(MTP)に移し、225μlの新たに調製したOPA試薬を加え、2分後、MTPリーダーで340nmの吸光度を読んだ。未知試料の応答をセリン標準希釈シリーズと比較し、mg/mlセリンとして表した。「OPA応答」を「mg/ml基質」に対する「加水分解物中のmg/mlセリン」として計算した。DHの計算のために、酵素ブランクの「OPA応答」を引いた。
3.81gのテトラホウ酸二ナトリウム(Merch 6308)と1.00gのSDS(BIO-RAD 161-0301)を80mlの脱イオン水に溶解した。使用直前に、2.0mlのエタノール中に溶解した80mgのo−フタルジアルデヒド(MercK 821027)を加え、1.0mlの10%(w/w)DTE(Merch 24511)を加えた。最後に脱イオン水を用いて、容量を100mlに調整した。
微生物PTN−リプレーサー(PTNとして与える)を使用して、WPCの同程度の加水分解(DH)を得ることが可能のようである。トリプシン様プロテアーゼ単独では、PTNと同じDHを得ることはできないことも、結果から明らかである。
フザリウム(Fusarium)トリプシンとブラキスポリエラ(Brachysporiella)エンドペプチダーゼの切断特異性分析
初めに:
微生物トリプシン様エンドペプチダーゼであるフザリウム(Fusarium)トリプシンのタンパク質分解的切断特異性を、ブタトリプシンと比較した。ブラキスポリエラ(Brachysporiella)からの微生物キモトリプシン様エンドペプチダーゼのタンパク質分解的切断特異性を、TLCK処理ブタキモトリプシンのタンパク質分解的特異性と比較した(TLCKは、キモトリプシンに影響を与えることなくトリプシンを不活性化する)。
プロテアーゼ:
ブタトリプシン(UniProt accession: P00761)
フザリウムトリプシン(フザリウム・オキシスポルムのトリプシン様プロテアーゼ、配列番号2)
ウシTLCK処理キモトリプシン(Sigma, C-3142)
ブラキスポリエラプロテアーゼ(ブラキスポリエラ・ガヤナから、配列番号12)
基質:
ベータ−ラクトグロブリンA、牛乳から(Sigma L7880 097K7010)
ベータ−ラクトグロブリンAの変性:
牛乳(Sigma L7880 097K7010)からの約11mg量のベータ−ラクトグロブリンAを1mlの緩衝液(100mM 酢酸アンモニウム、1mM CaCl2、pH8)に溶解した。ベータ−ラクトグロブリンのジスルフィド結合をジチオスレイトール(DTT、CAS番号3483-12-3)を加えて還元し、最終濃度20mMとした。混合物を室温(25℃)で30分インキュベートした。次に2−ヨードアセトアミド(CAS番号144-48-9)を最終濃度55mMになるように加えた。後者の混合物を暗所で室温で30分インキュベートした。
190μlの溶液に対応する400μg量のベータ−ラクトグロブリンを40℃で以下の量のプロテアーゼを用いてインキュベートした:
ブタトリプシン 8μg
フザリウムトリプシン 16μg
ウシTLCK処理キモトリプシン 4μg
ブラキスポリエラプロテアーゼ 4μg
すべてのタンパク質分解試料を、Waters C18カラム(ACQUITY UPLC(商標)BEH C18、1.7μm、2.1×100mm)、Thermo ScientificのAccela液体クロマトグラフィーシステム、及びThermo ScientificのLTQ Orbitrap XL ETDハイブリッド質量スペクトル装置からなるRP-HPLC-ESI-Orbitrap MS/MS装置で分析した。20μlの容量をカラムに注入した。ペプチドを以下の勾配により分離した:
比較のために、フザリウム(Fusarium)トリプシンアッセイ(下のトレース)のUVクロマトグラムを、ブタトリプシンアッセイ(上のトレース)とともに図1に示し、いくつかの主要なペプチドの配列同一性を示す。同様に図2では、ブラキスポリエラ(Brachysporiella)プロテアーゼアッセイ(下のトレース)のUVクロマトグラムを、ウシキモトリプシン(下のトレース)とともに示す。すべての場合で、同定されたペプチドは、上のトレースと下のトレースの両方で検出されている。
図1では、ウシベータ−ラクトグロブリンAの共通のタンパク質分解ペプチドが、フザリウム(Fusarium)トリプシンとブタトリプシンについて検出され、従って2つのエンドペプチダーゼは両方ともトリプシン様特異性を有する。図2では、ベータ−ラクトグロブリンAの一部の共通のタンパク質分解ペプチドがブラキスポリエラ(Brachysporiella)プロテアーゼとウシキモトリプシンについて検出される。
Claims (15)
- 乳由来タンパク質加水分解物の調製法であって、
乳由来タンパク性物質の溶液を、
a)微生物から産生されるトリプシン様エンドペプチダーゼ、及び
b)微生物から産生される少なくとも1つの他のエンドペプチダーゼ、
を用いて処理することを含む方法。 - トリプシン様エンドペプチダーゼが、フザリウム(Fusarium)株由来である、請求項1記載の方法。
- トリプシン様エンドペプチダーゼが、
i)配列番号2、4又は6の何れの成熟ポリペプチドと少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;
ii)(i)配列番号1、3又は5の何れの成熟ポリペプチドコード配列と、(ii)配列番号1、3又は5の何れの成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムDNA配列と、或いは(iii)(i)又は(ii)の完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド;
iii)配列番号1、3又は5の何れの成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも60%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド;及び
iv)配列番号2、4又は6の何れの成熟ポリペプチドの1又は2以上のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を含む変種
よりなる群から選択される、請求項1又は2記載の方法。 - トリプシン様エンドペプチダーゼと乳由来タンパク質との比が、0.01〜10重量/重量%、好ましくは0.01〜5%、より好ましくは0.05〜2.5%、更に好ましくは0.5〜1%である、請求項1〜3の何れか1項記載の方法。
- 少なくとも1つの他のエンドペプチダーゼが、アルギニン及びリジンのカルボキシ末端側での切断よりも、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、メチオニン、及びヒスチジンのカルボキシ末端側での切断に対して、より高い特異性を有する、請求項1〜4の何れか1項記載の方法。
- 少なくとも1つの他のエンドペプチダーゼのキモトリプシン比が少なくとも3である、請求項1〜5の何れか1項記載の方法。
- 少なくとも1つの他のエンドペプチダーゼが、ノカルジオプシス(Nocardiopsis)、メタリジウム(Metarhizium)又はブラキスポリエラ(Brachysporiella)株由来である、請求項1〜6の何れか1項記載の方法。
- 少なくとも1つの他のエンドペプチダーゼが、
i)配列番号8、10又は12の何れの成熟ポリペプチドと少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;
ii)(i)配列番号7、9又は11の何れの成熟ポリペプチドコード配列と、(ii)配列番号7、9又は11の何れの成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムDNA配列と、或いは(iii)(i)又は(ii)の完全長相補鎖と、少なくとも低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド;
iii)配列番号7、9又は11の何れの成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも60%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド;及び
iv)配列番号8、10又は12の何れの成熟ポリペプチドの1又は2以上のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を含む変種、
よりなる群から選択される、請求項1〜7の何れか1項記載の方法。 - 少なくとも1つの他のエンドペプチダーゼの乳由来タンパク質に対する比が、0.001〜1%重量/重量、好ましくは0.001〜0.5%、より好ましくは0.005〜0.25%、更に好ましくは0.02〜0.1%である、請求項1〜8の何れか1項記載の方法。
- エンドペプチダーゼ重量基準で、少なくとも1つの他のエンドペプチダーゼの濃度が、トリプシン様エンドペプチダーゼの濃度の2%〜50%である、請求項1〜9の何れか1項記載の方法。
- 加水分解が、約40℃〜60℃の温度で1〜6時間、pH値6.5〜8.5の範囲内で行われる、請求項1〜10の何れか1項記載の方法。
- 得られるタンパク質加水分解物の加水分解度が、5〜30%、好ましくは10〜25%、より好ましくは12〜20%である、請求項1〜11の何れか1項記載の方法。
- 得られるタンパク質加水分解物を構成するペプチドのうち、20,000kDaより大きい分子量を有するペプチドが、重量基準で1%未満である、請求項1〜12の何れか1項記載の方法。
- 得られるタンパク質加水分解物のELISAにより測定される抗原性が、対応する非加水分解乳由来タンパク性物質に比べて、少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約85%、より好ましくは少なくとも約90%、又は少なくとも約95%、とりわけ好ましくは少なくとも約98%、特に好ましくは少なくとも約99%低い、請求項1〜13の何れか1項記載の方法。
- 請求項1〜14の何れか1項記載の方法において、人工栄養乳組成物中に乳由来タンパク質加水分解物を含める工程を更に含んでなる、人工栄養乳組成物を調製する方法。
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