JPH04248959A - オリゴペプチド混合物及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、腸管吸収性に優れ、ア
ミノ酸バランスが良く、食餌アレルギーに対する予防及
び治療効果を有し、リン摂取制限患者の蛋白質栄養源と
しても優れ、広範な種々の用途に利用できるオリゴペプ
チド混合物及びその製造法に関する。

【従来の技術】近年、腎臓病等の食餌療法では、リンの
摂取制限が行われているが、一般に蛋白質はリン含量が
高いので、食餌制限療法においては高蛋白質の食餌の摂
取を制限するか、又はリン含量の少ない蛋白質を選択的
に摂取するか、の何れかの方法が採用されている。乳清
蛋白質はリン含量が少ないので、後者の方法における蛋
白質供給源として用いられている。しかしながら。高カ
ロリー栄養補給の観点から、より消化吸収が良く、リン
含量の少ない蛋白質源が求められている。

【０００２】一方、食餌蛋白質に起因するアレルギー患
者が、最近急増しており、乳児においては乳清蛋白質、
特にβーラクトグロブリンに起因するアレルギーが多い
ことが明らかになっている。従って、乳児用食品中の乳
清蛋白質の抗原性を低減するか、又は乳児用食品から乳
清蛋白質の抗原を実質的に除去することか求められてい
る。

【０００３】更に、消化吸収の観点からは、遊離アミノ
酸混合物よりもオリゴペプチドが吸収速度及び吸収後の
アミノ酸バランスの点において優れていることが明らか
にされている。

【０００４】以上のような背景から、乳清蛋白質を酵素
で加水分解したオリゴペプチド混合物を製造する方法が
開発されているが、それらの幾つかを例示すれば、次の
通りである。

【０００５】特公昭６２ー６１０３９号公報には、２〜
５のアミノ酸からなるペプチドを少なくとも５０％（重
量。以下、特に断りのない限り同じ）、及び遊離アミノ
酸を１５％含有し、実質的に蛋白質を含まないペプチド
水解物からなることを特徴とする乳漿蛋白質から得た全
酵素水解物が開示されている。

【０００６】特開平２ー２３１９号公報には、酵素で加
水分解したホエー製品をトリプシン，キモトリプシン，
それらの混合物，及びパンクレアチンから選択した酵素
により再度分解し、実質的に蛋白質に由来するアレルゲ
ンを含まない加水分解物の製造法が開示されている。

【０００７】特開平２ー１３８９９１号公報には、分子
量１０００以下、抗原性がなく［エライザ（ＥＬＩＳＡ
：　Ｅｎｚｙｍｅ　ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒ
ｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ）抑制試験法（以下、エライザ抑
制試験法と記載する）により測定］、遊離アミノ酸含量
が２０％以下、芳香族アミノ酸含量が１％以下の低分子
量ペプチドが開示されている。

【０００８】特開平２ー１８２１５５号公報には、乳清
蛋白質をトリプシン及びキモトリプシンの混合酵素で加
水分解し、遊離アミノ酸含量が１０％以下、分子量が１
５００〜３５００のペプチドからなる低アレルギー性部
分加水分解物が開示されている。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記特
公昭６２ー６１０３９号公報の発明においては、残余の
ペプチドについては何等の考慮も払われておらず、抗原
残存活性の有無についても何等定量的な言及がなされて
いない。

【００１０】また、上記特開平２ー２３１９号公報の発
明においては、加水分解物の分子量、遊離アミノ酸含量
等、ペプチドの消化吸収性に関係する諸性質について何
等考慮されていない。

【００１１】上記特開平２ー１３８９９１号公報の発明
においては、芳香族アミノ酸含量が極めて少なく、本来
乳清蛋白質がもっているアミノ酸スコアを著しく損なっ
ている。即ち、このペプチドの利用は、特殊な用途のみ
に制限される。

【００１２】更に、上記特開平２ー１８２１５５号公報
の発明においては、抗原性が存在すると考えられる分子
量３５００以上のペプチドを２５％含有しており、アレ
ルギー患者のアミノ酸供給源として必ずしも満足なもの
ではない。

【００１３】以上のように、乳清蛋白質を加水分解物す
ることによって得られ、食餌アレルギーの回避，予防及
び治療に有効であり、消化吸収に優れ、且つ遊離アミノ
酸含量が顕著に少なく、広範な用途に利用できるオリゴ
ペプチド混合物は従来知られていなかった。

【００１４】本発明者等は、前記の従来技術に鑑みて、
腸管吸収に優れ、アミノ酸バランスが良く、食餌アレル
ギーの予防及び治療効果を有し、リン摂取制限患者の蛋
白質栄養源としても優れ、広範な種々の用途に利用でき
るオリゴペプチド混合物及びその製造法の開発を課題と
して鋭意研究を行い、本発明を完成した。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、少なく
とも７０％（重量）の純度の乳清蛋白質を加水分解して
、下記の理化学的性質を有するオリゴペプチド混合物が
提供される。 （ａ）　　その加水分解物の分子量分布が２，０００以
下であること、（ｂ）　　抗乳清蛋白質血清を用いたエ
ライザ（ＥＬＩＺＡ：　Ｅｎｚｙｍｅ　ｌｉｎｋｅｄ　
ｉｍｍｕｎｏーｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ）　抑制試
験法により測定した抗原残存活性が１０−４以下である
こと、及び（ｃ）　　加水分解物の全アミノ酸含量に対
する遊離アミノ酸含量が５％（重量）以下であること。

【００１６】本発明の方法によれば、少なくとも７０％
（重量）の純度の乳清蛋白質を１０％以下の濃度（重量
）で水に溶解し、得られた水溶液のｐＨを７．５〜１０
に調整したのち、該水溶液に種々の酵素、特にバシラス
・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂーｔｉｌｕｓ）
由来のエンドペプチダーゼとトリプシンの２種類の酵素
、またはバシラス・サチリス由来のエンドペプチダーゼ
，トリプシン及びキモトリプシンの３種類の酵素を添加
して加水分解し、のち加熱により酵素を失活するか又は
ウルトラフィルトレーションにより酵素を除去すること
により、目的とするオリゴペプチド混合物が得られる。 　　更に、上記方法によって得られたオリゴペプチド混
合物溶液のｐＨを４．５〜５．５に調整し、加熱し、沈
澱物を除去することによって、残存する抗原性物質を実
質的に除去することもできる。

【００１７】本発明において、オリゴペプチド混合物を
製造するための出発原料は、純度が少なくとも７０％の
乳清蛋白質であり、それは例えば、ホエーから常法（例
えば、イオン交換法等。下記の参考例を参照）により精
製して得られる。乳清蛋白質は、１０％以下の濃度で水
に溶解され（下記の試験例１を参照）、得られた水溶液
のｐＨを８〜１０に調整する（下記の試験例２を参照）
。この水溶液を殺菌または滅菌することもできるが、乳
清蛋白質は加熱によってゲル化する傾向があるので注意
を要する。

【００１８】本発明において使用される酵素は、特に制
限はなく、上記の理科学的性質を有する加水分解物が得
られれば良いが、特にサチロペプチダーゼ（Ｓｕｂｔｉ
ｌｏｐｅｐｔｉーｄａｓｅ）を主体とするバシラス・サ
チリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の
エンドペプチダーゼ（以下、酵素Ｓと記載する）及びト
リプシンの混合物、または酵素Ｓ，トリプシン及びキモ
トリプシンの混合物を用いるのが望ましい（尚、市販の
トリプシンにはキモトリプシンを含んでいる場合があり
、この場合には、事実上３種の酵素を使用したことにな
る）。これらの酵素は、何れも市販品を使用することが
できる。酵素Ｓは常法による精製の程度によっては他の
酵素を含み得るが、粗製の酵素または結晶した純粋の酵
素の何れでも使用できる。

【００１９】尚、以下の記載において、使用する酵素の
活性の単位は、トリプシン及びキモトリプシンについて
はアメリカ薬局方に基づいており、「ＵＳＰ単位」と表
示する［ザ・ユナイテッド・ステーツ・ファーマコピア
・ザ・ナショナル・フォーミュラリー（Ｔｈｅ　Ｕｎｉ
ｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ　Ｔ
ｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ）、第３
０７ページ及び第１４３１ページ、ユナイテッド・ステ
ーツ・ファーマコピアル・コンベンション・インコーポ
レーテッド（Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｐｅｉａｌ　Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，　Ｉｎｃ．
）１９９０年による］。

【００２０】また、酵素Ｓの活性単位は、次の定義によ
る。即ち、ミルクカゼイン［ハマーシュタイン（Ｈａｍ
ｍｅｒｓｔｅｉｎ）。メルク社製］に酵素Ｓを作用させ
、３０℃で１分間に１μｇのチロシンに相当するアリル
アミノ酸のフォリン試薬での呈色反応を示す酵素活性度
を１単位とする。この単位をＵＳＰ単位と区別するため
、「ＰＵＮ単位」と表示する。

【００２１】本発明における酵素使用量は、乳清蛋白質
１ｇ当たり、酵素Ｓは１００〜５，０００ＰＵＮ単位、
望ましくは５００〜２，０００ＰＵＮ単位、トリプシン
は６００〜３０，０００ＵＳＰ単位、望ましくは３，０
００〜２０，０００ＵＳＰ単位、キモトリプシンは０〜
３，０００ＵＳＰ単位、望ましくは０〜２，０００ＵＳ
Ｐ単位が適当である（試験例３を参照）。

【００２２】前記濃度の乳清蛋白質水溶液に、前記酵素
を前記使用量の範囲で添加し、それらの酵素の至適作用
温度である３０〜５５℃の温度で３〜２４時間、望まし
くは６〜１２時間加水分解を行う。尚、２種又は３種の
酵素は、同時に添加しても、また酵素Ｓで加水分解後、
残余の酵素を添加しても良い。

【００２３】次いで加熱処理により酵素を失活させるか
又はウルトラフィルトレーション処理により酵素を除去
する。加熱処理は、７０℃１０分間から１４０℃２秒間
までの範囲で適宜行われる。ウルトラフィルトレーショ
ン処理は、酵素が透過せず、ペプチドが透過でき、回収
が容易な分画分子量１５，０００から２，０００の範囲
で行われる。

【００２４】酵素を失活または除去し、加水分解物を得
る。このようにして得られた加水分解物の抗原残存活性
（抗乳清蛋白質を用いたエライザ抑制試験法により測定
）は、１０−４以下である。更に、この加水分解物のｐ
Ｈを５．０〜５．５に調整し、少なくとも８０℃で１０
分間加熱し、沈澱物を除去して残存する抗原を実質的に
除去することもできる（試験例４を参照）。このように
して得られた加水分解物の抗原残存活性（抗乳清蛋白質
を用いたエライザ抑制試験法による測定）は、１０−５
以下である。尚、酵素の失活と，この抗原分離のための
加熱とを同時に行うこともできる。

【００２５】以上のようにして得られた本発明のオリゴ
ペプチド混合物は、後述する試験方法により測定すれば
、分子量分布が２，０００以下であり、抗乳清蛋白質血
清を用いたエライザ抑制試験法により測定し抗原残存活
性が１０−４以下であり、全アミノ酸含量に対する遊離
アミノ酸含量が５％以下であり、蛋白質１ｇ当たりの全
アミノ酸組成は、ほぼ次の範囲内にある。

【００２６】 　　　　Ｌ−アラニン　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５２〜　
　６８（ｍｇ）　　　　Ｌ−アルギニン　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　２５〜　　３２　　　　Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−
アスパラギンを含む）　　１１８〜１３１　　　　Ｌ−
システイン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　２４〜　　３５　　　　
Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−グルタミンを含む）　　　　　
　１８９〜２０１　　　　Ｌ−グリシン　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１９〜　　２２　　　　Ｌ−ヒスチジン　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　２１〜　　２３　　　　Ｌ−イソロイシン
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　６１〜　　７１　　　　Ｌ−ロイシン　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１１７〜１５８　　　　Ｌ−リジン　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　９６〜１２８　　　　Ｌ−メ
チオニン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　２３〜　　２５　　　　Ｌ
−フェニルアラニン　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　３５〜　　４８　　　　Ｌ−
プロリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　３８〜　　６４　　　
　Ｌ−セリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５〜　　５
８　　　　Ｌ−スレオニン　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５７〜　
　８３　　　　Ｌ−トリプトファン　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１７〜　
　２３　　　　Ｌ−チロシン　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３
７〜　　４７　　　　Ｌ−バリン　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　６１〜　　６６以上のようにして得られたオリゴ
ペプチド混合物含有液はそのまま利用しても良く、ある
いは常法により濃縮し、又は乾燥して、液状，ペースト
状又は粉末状として利用しても良い。これらのオリゴペ
プチド混合物は、食餌アレルギーの予防及び治療用に、
又はリン摂取制限患者の蛋白質資源，経腸栄養用，腹膜
透析用等の原料又は素材として広範な用途を有する。

【００２７】次に、試験例を示して本発明を詳述する。 本発明の試験例においては、次の試験方法を採用した。 （１）分子量分布の測定方法 高速液体クロマトグラフィーにより測定した（宇井信生
等編、「タンパク質・ペプチドの高速液体クロマトグラ
フィー」、化学増刊第１０２号、第２４１ページ、株式
会社化学同人、１９８４年）。アサヒパックＧＳ−３２
０（Ａｓａｈｉｐａｃｋ、旭化成社製、直径７．６ｍｍ
及び長さ５００ｍｍ）を用い、６Ｍ塩酸グアニジン、１
ｍＭＥＤＴＡ−２Ｎａ，１０ｍＭリン酸（ｐＨ６．５）
により溶出速度０．５ｍｌ／分で溶出した。検出はＲＩ
検出器を用い、データ解析はＧＰＣ分析システム（島津
製作所製）を使用した。 （２）抗原残存活性の測定方法 エライザ抑制試験法により次のようにして測定した。９
６穴プレート（ヌンク社製）に乳清蛋白質をコーティン
グし、洗浄し、ウサギ抗乳清蛋白質血清と加水分解物試
料の混合液をプレートの穴に供給して反応させ、洗浄後
アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（
ツアイメド・ラボラトリー社製）を反応させ、洗浄後ｐ
−ニトロフェニル・リン酸ナトリウムを添加し、３０分
後に５Ｎ水酸化ナトリウムを添加して反応を停止させ、
反応生成物をマイクロプレートリーダーで測定した（日
本小児アレルギー学会誌、第１巻、第３６ページ、１９
８７年）。 （３）アミノ酸組成の測定方法 トリプトファン、システイン及びメチオニン以外のアミ
ノ酸については、試料を６ＮのＨＣｌで１１０℃、２４
時間加水分解し、トリプトファンについては水酸化バリ
ウムで１１０℃、２２時間アルカリ分解し、システイン
及びメチオニンについては過ギ酸処理後６ＮのＨＣｌで
１１０℃、１８時間加水分解し、それぞれアミノ酸分析
機（日立製作所製：８３５型）により分解し、アミノ酸
の質量を求めた。 （４）遊離アミノ酸の測定方法 スルホサリチル酸で試料を除蛋白し、アミノ酸分析機（
日立製作所製：８３５型）により分析し、上記アミノ酸
組成の分析でえられた各アミノ酸の総質量に対する遊離
アミノ酸の総質量の百分率で表した。 ［試験例１］この試験は、加水分解に供する乳清蛋白質
溶液の好適な濃度を調べるために行われた。 （１）試料の調製 実施例１と同様の方法で種々の乳清蛋白質濃度（表１に
示した）の溶液を加水分解して、７種類の加水分解物試
料を調製した。 （２）試験方法 沈澱量は、酵素を失活させて遠心分離した沈渣の重量を
測定し、最初の乳清蛋白質の重量に対する遠心分離した
沈渣の百分率を算出し、抗原残存活性は前記のエライザ
抑制試験法によった。 （３）試験結果 この試験の結果は、表１に示すとおりであった。表１か
ら明らかなように、加熱により沈澱が発生せず、かつ高
原残存活性が１０−４以下となる乳清蛋白質の濃度は、
１０％以下であることが判明した。

【表１】 ［試験例２］この試験は、加水分解時の好適なｐＨ範囲
を調べるために行った。 （１）試料の調製 加水分解時のｐＨ及び時間を下記のように変更した以外
は、実施例１と同一の方法によって乳清蛋白質溶液を加
水分解し、６種類の加水分解物試料を調製した。尚、加
水分解時間の合計は何れも６時間である。 試料１：ｐＨ９で６時間 試料２：１時間をかけてｐＨ１０からｐＨ８に低下させ
、その後ｐＨ８で５時間 、試料３：ｐＨ１０で２時間、その後４時間をかけてｐ
Ｈ８に低下させた、 試料４：３時間をかけてｐＨ８からｐＨ７に低下させ、
その後ｐＨ７ｄｅ３時間 、試料５：６時間をかけてｐＨ１０からｐＨ８に低下さ
せた、 試料６：６時間をかけてｐＨ８からｐＨ７．５に低下さ
せた、 試料７：ｐＨ８．５で６時間、 試料８：３時間をかけてｐＨ７．５からｐＨ６．５に低
下させ、その後ｐＨ６．５で３時間、 （２）試験方法 沈澱量及び抗原残存活性は、共に試験例１と同一の方法
を用いた。 （３）試験結果 この試験の結果は表２に示すとおりであった。表２から
、試料のｐＨを７．５〜１０に調製し、１時間後ｐＨ７
〜８に保持し、その後ｐＨ６．５〜８に保持するのが望
ましいことが判明した。尚、上記３種類の酵素の組み合
わせ及び量を変更してもほぼ同一の結果が得られた。

【表２】 ［試験例３］この試験は酵素の適正量を調べるために行
われた。 （１）試料の調製 酵素の使用量を種々に変更した（表３参照）以外は実施
例１と同一の方法で乳清蛋白質溶液を加水分解し、１４
種類の加水分解物試料を調製した。 （２）試験方法 沈澱量及び抗原残存活性は、試験例１と同一である。 （３）試験結果 この試験の結果は、表３の示すとおりであった。

【表３】 表３から明らかなように、加熱により沈澱が生成ぜず、
かつ抗原残存活性が１０−４以下となる酵素の使用量は
、基質１ｇ当たり酵素Ｓが１００ＰＵＮ単位の場合、ト
リプシンは３０００ＵＳＰ単位以上、キモトリプシンは
０〜２００ＵＳＰ単位であり、酵素ＳＰが５００ＰＵＮ
単位以上の場合にはトリプシンが６００〜１８０００Ｕ
ＳＰ単位、キモトリプシンが０〜１３００ＵＳＰ単位で
あることが判明した。従って、本発明においては、乳清
蛋白質１ｇ当たり酵素Ｓが１００〜５，０００ＰＵＮ単
位、望ましくは５００〜２０００ＰＵＮ単位、トリプシ
ンが６００〜３００００ＵＳＰ単位、望ましくは３００
０〜２００００ＵＳＰ単位、キモトリプシンが０〜３０
００ＵＳＰ単位、望ましくは０〜２０００ＵＳＰ単位の
範囲で使用する。 ［試験例４］この試験は加水分解後の加熱失活時の適正
ｐＨを調べるためにおこなわれた。 （１）試料の調製 加熱時のｐＨを表４に示す通り変更した以外は実施例１
と同一の方法により８種類の加水分解物試料を調製した
。 （２）試験方法 沈澱量及び抗原残存活性を試験例１と同一の方法により
測定した。 （３）試験結果 この試験の結果は、表４に示すとおりであった。表４か
ら明らかなように、加水分解物のｐＨを４．５〜５．５
に調製し、加熱した試料は沈澱が多く、回収された加水
分解物の抗原残存活性は実質的に存在しないレベルに達
していた。尚、酵素の種類及び量を変更してもほぼ同一
の結果が得られた。 ［試験例５］この試験は、加水分解物の風味及び特異抗
体生産能を調べるために行われた。 （１）試料の調製 使用する酵素の種類及び添加量を表５に示したとおりに
変更した以外は、実施例１と同一の方法により８種類の
試料を調製した。尚、各種の分解度、遊離アミノ酸量、
分子量分布等の試料を調製するため、各種の酵素を種々
組み合わせて使用した。 （２）試験方法 ａ）風味 男女各１０名のパネルにより官能的に試験し、風味良（
０点）から風味不良（３点）までの４段階に評価し、評
価点の平均値から次のように判定した。 　　　　　　　　　　−：０．５点未満　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　良　　　　　　　　　
　＋：０．５点以上１．５点未満　　　　　　　　　　
やや良　　　　　　　　＋＋：１．５点以上２．５点未
満　　　　　　　　　　やや不良　　　　　　＋＋＋：
２．５点以上３．０点未満　　　　　　　　　　不良ｂ
）抗体生産能 未分解乳清蛋白質及び各試料１０ｍｇを０．５ｍｌのリ
ン酸緩衝生理食塩水に溶解し、０．５ｍｌのフロイント
・コンプリート・アジュバントを添加して乳化し、家兎
背部皮下に５日間隔で５回注射し、最終感作日から７日
目に全採血し、血清を遠心分離し、血清中の未分解乳清
蛋白質に対する特異抗体生産性をＥＬＩＳＡ法により試
験し、その結果から次のように判定した。 　　　　　　　　　　−：生産性が１０−４以下　　　
　　　　　　　　　　　　　抗体生産能がない　　　　
　　　　　　＋：生産性が１０−３以下　　　　　　　
　　　　　　　　　殆ど抗体生産能がない　　　　　　
　　＋＋：生産性が１０−１以下　　　　　　　　　　
　　　　　　やや抗体生産能がある　　　　　　＋＋＋
：生産性が１０−１以下　　　　　　　　　　　　　　
　　抗体生産能がある（３）試験結果 この試験の結果は、表５に示すとおりであった。表５か
ら明らかなように風味が良く、抗体生産能のないオリゴ
ペプチド混合物を得るためには、遊離アミノ酸の割合が
５％以下、分子量分布が２０００以下、ＥＬＩＳＡ法に
よる抗原残存活性が１０−４以下であることが必要であ
ると判明した。

【表５】 以下に、乳清蛋白質の精製方法の典型例を参考までに例
示する。 ［参考例１］温水で膨潤した３０ｇのＣＭ−セファデッ
クスＣ−２０（ファルマシア社製）にｐＨを塩酸で４に
調整したホエー１６ｋｇを添加し、１６時間撹拌した後
、イオン交換樹脂を濾別し、イオン交換樹脂を水洗して
ホエーを除去し、カラムに充填した。次いで５％塩化ナ
トリウム水溶液を通液し、イオン交換樹脂に吸着した乳
清蛋白質を溶出し、この溶出液を分画分子量２００００
の限外濾過膜（ＤＤＳ社製、ＧＲ６１ｐｐ）を装着した
モジュールを用いて平均圧力３ｋｇ／ｃｍ２で限外濾過
し、水を加えてダイアフィルトレーションを行って、塩
化ナトリウムを除去し、凍結乾燥し、高純度の乳清蛋白
質の粉末約４５ｇを得た。この粉末の乳清蛋白質含量は
９１，２％であった。 ［参考例２］ホエー１６ｋｇを参考例１と同一の方法に
より限外濾過し、水を加えてダイアフィルトレーション
を行って低分子量分画を除去し、凍結乾燥し、乳清蛋白
質の粉末約５７ｇを得た。この粉末の乳清蛋白質含量は
７５．１％であった。 ［参考例３］ホエー１６ｋｇを参考例１と同一の方法に
より限外濾過し、水を加えてダイアフィルトレーション
を行って低分子量分画を除去し、凍結乾燥し、乳清蛋白
質の粉末約５０ｇを得た。この粉末の乳清蛋白質含量は
８０％であった。

【実施例】次に本発明の若干の実施例を更に詳述するが
、本発明はそれらの実施例に限定するものではない。 実施例１ 参考例１と同一の方法により得た純度９０％の乳清蛋白
質粉末１ｋｇを脱イオン水９ｋｇに溶解し、ｐＨを１０
に調整し、酵素Ｓ（長瀬生化学工業社製）１００万ＰＵ
Ｎ単位を添加し、４０℃に１時間保持して加水分解し、
次いでｐＨを８に調整し、市販のトリプシン（ノボノデ
ィスク社製）６００万ＵＳＰ単位及びキモトリプシン（
ノボノディスク社製）３０万ＵＳＰ単位を添加し、６時
間４０℃に保持して加水分解し、８０℃で１０分間加熱
して酵素を失活させ、冷却し、生成した沈澱を遠心分離
して除去し、オリゴペプチド混合物を７．５％含有する
溶液約８ｋｇを得た。得られたオリゴペプチド混合物を
前記の試験方法により試験した結果、分子量２０００以
下、抗原残存活性１０−５、遊離アミノ酸含量５％であ
り、そのアミノ酸組成は下記の通りであった。 　　　　　　Ｌ−アラニン　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５７
．５（ｍｇ）　　　　　　Ｌ−アルギニン　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　３１．０　　　　　　Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−
アスパラギンを含む）　　１２４．３　　　　　　Ｌ−
システイン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　３４．３　　　　　　Ｌ
−グルタミン酸（Ｌ−グルタミンを含む）　　　　　　
１８９．２　　　　　　Ｌ−グリシン　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　２１．３　　　　　　Ｌ−ヒスチジン　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　２１．３　　　　　　Ｌ−イソロイシン　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　６１．４　　　　　　Ｌ−ロイシン　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１４１．９　　　　　　Ｌ−リジン　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１１３．４　　　　　　Ｌ−メチオニン　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　２３．２　　　　　　Ｌ−フェニルア
ラニン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　４１．０　　　　　　Ｌ−プロリン　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　４７．９　　　　　　Ｌ−セリン　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　４５．１　　　　　　Ｌ−スレ
オニン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　５７．３　　　　　　Ｌ−ト
リプトファン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　１７．５　　　　　　Ｌ−チロ
シン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　４３．３　　　　　　Ｌ−
バリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　６１．３実施例２ 参考例２と同一の方法により得た純度７５．１％の乳清
蛋白質粉末１ｋｇを脱イオン水１９ｋｇに溶解し、ｐＨ
を９．５に調整し、市販のビオプラーゼ（長瀬生化学工
業社製）５０万ＰＵＮ単位を添加し、５０℃に３０分間
保持して加水分解し、次いでｐＨを８に調整し、市販の
トリプシン（ノボノディスク社製）１００万ＵＳＰ単位
を添加し、１０時間同一温度に保持して加水分解し、の
ちｐＨを５．３に調整し、８０℃で１０分間加熱し、分
画分子量６０００の限外濾過膜で酵素を除去し、濃縮，
乾燥して粉末状のオリゴペプチド混合物約１ｋｇを得た
。得られたオリゴペプチド混合物を前記の試験方法によ
り試験した結果、分子量１８００以下、抗原残存活性１
０−４、遊離アミノ酸含量３％であった。 実施例３ 参考例３と同一の方法により得た純度８０％の乳清蛋白
質粉末１ｋｇを脱イオン水１９ｋｇに溶解し、７５℃に
１５秒間保持して殺菌し、ｐＨを８に調整し、市販のビ
オプラーゼ（長瀬生化学工業社製）４０万ＰＵＮ単位及
び市販のトリプシン（ノボノディスク社製）１０００Ｕ
ＳＰ単位を添加し、ｐＨを８に維持したまま４５℃に８
時間保持して加水分解し、のちｐＨを５．５に調整し、
８０℃で５分間加熱し、冷却し、生成した沈澱を遠心分
離して除去し、濃縮，噴霧乾燥し、粉末状のオリゴペプ
チド混合物約８００ｇを得た。得られたオリゴペプチド
混合物を前記の試験方法により試験した結果、分子量２
０００以下、抗原残存活性１０−６、遊離アミノ酸含量
５％であった。

【発明の効果】本発明によって奏せられる効果は次のと
おりである。 （１）　　本発明のオリゴペプチド混合物は、腸管吸収
性において優れ、アミノ酸バランスが極めて良好なので
、消化吸収能の未熟な乳幼児、又は消化吸収能が低下し
ている高齢者、病人への蛋白質供給源用素材として使用
できる 。（２）　　本発明のオリゴペプチド混合物は、実質的
に抗原残存活性がないので、　　　　　　アレルギー患
者、アレルギー予防を目的として乳幼児、妊産婦、消化
能が　　　　　　低下した病人への蛋白質供給源用素材
として使用できる。 （３）　　本発明のオリゴペプチド混合物は、リンを殆
ど含まないので、腎臓病患者等、リン摂取制限患者の蛋
白質栄養減の素材として使用できる。 （４）　　本発明のオリゴペプチド混合物は、特異抗体
生産能がなく、低分子量なので、腹膜透析液の浸透圧調
整用素材として使用できる。 （５）　　本発明の方法により、広範な用とを有するオ
リゴペプチド混合物を提供することができる。

【表４】

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　　　次の理化学的性質を有することを
   特徴とするオリゴペプチド混合物、（ａ）　　少なくと
   も７０％（重量）の純度の乳清蛋白質を加水分解して得
   られる加水分解物であって、その加水分解物の分子量分
   布が２，０００以下であること、（ｂ）　　抗乳清蛋白
   質血清を用いたエライザ（ＥＬＩＺＡ：　Ｅｎｚｙｍｅ
   　ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏーｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓ
   ｓａｙ）　抑制試験法により測定した抗原残存活性が１
   ０−４以下であること、及び（ｃ）　　全アミノ酸含量
   に対する遊離アミノ酸含量が５％（重量）以下であるこ
   と。
2. 【請求項２】　　　　少なくとも７０％（重量）の純度
   の乳清蛋白質を１０％（重量）以下の濃度で水に溶解し
   、得られた水溶液のｐＨを７．５〜１０に調整したのち
   、該水溶液にバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　
   ｓｕｂｔｉｌｕｓ）由来のエンドペプチダーゼとトリプ
   シンの２種類の酵素、またはバシラス・サチリス由来の
   エンドペプチダーゼ，トリプシン及びキモトリプシンの
   ３種類の酵素を添加して加水分解し、のち加熱により酵
   素を失活するか又はウルトラフィルトレーションにより
   酵素を除去することを特徴とするオリゴペプチド混合物
   の製造法。
3. 【請求項３】　　　　請求項第２項記載の方法において
   、得られたオリゴペプチド混合物溶液のｐＨを４．５〜
   ５．５に調整し、加熱し、沈澱物を除去して残存する抗
   原性物質を実質的に除去することすることを特徴とする
   オリゴペプチド混合物の製造法。