JP3749180B2

JP3749180B2 - 蛋白質加水分解物、その製造方法、及びその蛋白質加水分解物を含有する飲食品

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Publication number: JP3749180B2
Application number: JP2001567762A
Authority: JP
Inventors: 宏紀早澤; 吉隆田村; 博宮川; 俊和七野; 靖川口; 彦克金原
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 2000-03-13
Filing date: 2001-03-12
Publication date: 2006-02-22
Anticipated expiration: 2021-03-12
Also published as: NZ518375A; EP1264838A4; AU4109601A; CN1239513C; WO2001068672A1; KR100478118B1; KR20020058054A; CA2391063A1; AU765219B2; CN1392877A; US20030072863A1; EP1264838A1; US6908633B2

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛋白質加水分解物、その製造方法、及びその蛋白質加水分解物を含有する飲食品に関し、特に、抗原性が低く、乳化性の良好な蛋白質分解物とこれを含有する飲食品、さらに、この蛋白質分解物を、高い回収率で得るための製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、食物アレルギーの発生頻度は増加する傾向にあり、アレルギー発症の有効な予防及び治療の重要性が増している。
食物アレルギーの発症については、乳児が、調製乳又は調製粉乳等の摂取時に、含有蛋白質を消化が不充分な状態で抗原性を有したまま体内に吸収してしまうことがあり、これが発症の１つの原因であると指摘されている。このため、特に、アレルギー発症の素因を有する疑いのある者のアレルギー発症の予防のためには、乳児期に摂取する調製乳又は調製粉乳が低抗原性であることが必要である。
このため、従来より、抗原性物質である乳蛋白質などの蛋白質を加水分解し、抗原性を低下させて、抗原残存活性が１０^−６以下である蛋白質加水分解物が多数開発されている（例えば、特公昭５４−３６２３５号公報、特公昭６２−６１０３９号公報、特公平７−７３５０７号公報、特許第２９５９７４７号公報、及び特開平８−２２８６９２号公報参照）。しかしながら、これらの蛋白質加水分解物について、高感度の抗原残存活性の測定方法であるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法を用いて抗原残存活性を測定した結果、抗原残存活性は１０^−７以上を示し、抗原性が若干残存していた（後述）。
【０００３】
一方、蛋白質は高度に加水分解することにより乳化性が低下するため、高度加水分解物を原料として得られた調製乳は、内部の脂肪球の乳化状態を維持することができず、脂肪球が凝集して分離してしまうという問題があった。こうして脂肪が分離した調製乳は、外観、風味が不良であるだけでなく、脂肪の吸収率も低下する。そこで、蛋白質加水分解物の乳化性の改善が、調製乳及び調製粉乳の製造において課題となっていた。
この課題を解決するため、乳清蛋白質を特定のｐＨ条件で、特定の三種類の酵素により加水分解することにより、抗原残存活性が低減され、乳化性に優れた蛋白質加水分解物が開発されている（特開平７−２０３８４４号公報）が、この抗原残存活性は１０^−５を示し、抗原性が十分には低減されていなかった（後述）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
アレルギー発症の予防及び治療が、重大な課題となっている現代において、抗原残存活性を限りなくゼロに近似させることは、食物アレルギー発生のリスクを低減し、安全な飲食品を提供するうえで、極めて重要であり、食品メーカーの社会的使命である。
本発明は、一層の抗原性の低減、具体的には、蛋白質の抗原残存活性をサンドウィッチＥＬＩＳＡ法の検出限界まで低減させ、かつ乳化性を改善した蛋白質加水分解物の取得、及び／又は原料蛋白質に対する蛋白質加水分解物の回収率の向上を目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、種々の蛋白質加水分解物の製造方法、特に種々の原料蛋白質の加水分解条件及び種々のポーラス型合成吸着剤の組み合わせ、及び得られた蛋白質加水分解物の特徴について研究を重ね、本発明を完成させた。
本発明の蛋白質分解物は、少なくとも２種類のペプチドを含有する蛋白質加水分解物において、前記蛋白質がカゼインまたは乳清蛋白質であり、分解率が３０乃至４５％であること、数平均分子量が３００以下であること、及び数平均分子量に対する重量平均分子量の比が１を超え、２以下であることを特徴とする蛋白質加水分解物であり、従来の蛋白質加水分解物に比較して、抗原性の低減及び乳化性に優れている。
【０００６】
本発明の蛋白質分解物の製造方法は、カゼインまたは乳清蛋白質からなる原料蛋白質を、分解率が３０乃至４５％の範囲で加水分解し、得られた蛋白質加水分解物１ｇ（蛋白質当量）に対して、それぞれ平均細孔径２乃至８ｎｍ及び平均細孔径２０乃至３０ｎｍを有する２種類のポーラス型合成吸着剤を、その表面積が合計３００乃至３０００ｍ^２の範囲で、同時又は個別に接触させ、非吸着成分を回収することを特徴とするものであり、従来の蛋白質加水分解物の製造方法に比較して、抗原性の低減、乳化性、及び原料蛋白質に対する蛋白質加水分解物の回収率に優れている。
またこの製造方法において、平均細孔径２乃至８ｎｍのポーラス型合成吸着剤：平均細孔径２０乃至３０ｎｍのポーラス型疎水性合成吸着剤の表面積の比が４：６乃至６：４の範囲となるように用いることを望ましい態様としてもいる。
【０００７】
本発明の飲食品は、前記の本発明の蛋白質加水分解物を含有することを特徴としている。本発明の飲食品は、アレルギー予防用飲食品又はアレルギー患者用飲食品とすることができ、特に、乳由来の蛋白質を原料蛋白質として得られた調製乳又は調製粉乳とすることができる。
したがって、本発明のさらなる態様は、アレルギー予防用飲食品若しくはアレルギー患者用飲食品中の、又はその製造における、上記の蛋白質加水分解物の使用である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本明細書において、分解率を除き、百分率は特に断りのない限り、重量による表示である。また、本明細書において、蛋白質当量は、窒素量に６．３８を乗じた値である。
本発明の蛋白質加水分解物は、少なくとも２種類のペプチドを含有する蛋白質加水分解物であって、蛋白質加水分解物から単一のペプチドまで単離精製されたものは、本発明の範囲に包含されない。
【０００９】
１）数平均分子量及び重量平均分子量
一般に、数平均分子量及び重量平均分子量は、文献（社団法人高分子学会編、「高分子科学の基礎」、第１１６乃至１１９頁、株式会社東京化学同人、１９７８年）に記載されるとおり、高分子化合物の分子量の平均値を次のとおり異なる指標に基づき示すものである。
即ち、蛋白質加水分解物等の高分子化合物は不均一な物質であり、かつ分子量に分布があるため、蛋白質加水分解物の分子量は、物理化学的に取り扱うためには、平均分子量で示す必要があり、数平均分子量（以下、Ｍｎと略記することがある。）は、分子の個数についての平均であり、ペプチド鎖ｉの分子量がＭｉであり、その分子数をＮｉとすると、次の式により定義される。
【００１０】
【数１】

【００１１】
また、重量平均分子量（以下、Ｍｗと略記することがある。）は、重量についての平均であり、次の式により定義される。
【００１２】
【数２】

【００１３】
これらＭｎ及びＭｗの関係は、前記各式から明らかなとおり、常にＭｎ≦Ｍｗの関係を有し、Ｍｎは高分子化合物に含まれる低分子量物質の寄与を敏感に受けるのに対して、Ｍｗは、高分子量物質の寄与を受け易い。
本来、アミノ酸配列の定まった単一の未分解蛋白質分子では、分子量に分布はなく、Ｍｎ＝Ｍｗとなるが、加水分解された場合、生成したペプチド断片の個々の分子量が大きく異なるため分子量分布が広範囲になる。即ち、この分布が広いものほど、Ｍｎ及びＭｗの差が大きくなる。従って、数平均分子量に対する重量平均分子量の比の値、即ちＭｗ／Ｍｎの値は、蛋白質加水分解物の分子量分布の広がりを示す指標として用いられる。
本発明において、数平均分子量及び重量平均分子量は、当業者には周知である高速液体クロマトグラフィーとＧＰＣ分析システムにより測定した値を用いる（例えば、宇井信生ら編、「タンパク質・ペプチドの高速液体クロマトグラフィー」、化学増刊第１０２号、第２４１頁、株式会社化学同人、１９８４年）。
本発明の蛋白質加水分解物において、数平均分子量は３００以下、好ましくは２００以上３００以下である。また、数平均分子量に対する重量平均分子量の比は、１を超え、２以下である。
【００１４】
２）蛋白質の分解率
本発明において、蛋白質の分解率とは、蛋白質加水分解物中の全窒素量に対するホルモル窒素の重量比を表す。全窒素量は、当業者に周知のケルダール法によって測定することができ、具体的には日本食品工業学会編、「食品分析法」、第１０２ページ、株式会社光琳、昭和５９年等に記載されているように、試料に分解促進剤として水銀・酸化水銀（ＩＩ）・硫酸銅を加え、濃硫酸・硫酸カリウムまたは硫酸・発煙硫酸中で加熱分解を行なって試料中の窒素を硫酸アンモニウムに変換し、これに強アルカリを加え水蒸気蒸留し、遊離したアンモニアを規定量の酸に捕集し、過剰の酸を逆滴定することで捕集したアンモニア量を求め、この量から全窒素量を算出するものである。ホルモル窒素は、アルカリ標準溶液で遊離アミノ酸を定量するために当業者に周知の方法のホルモル滴定によって求められたアミノ酸の定量値である。例えば満田他編、「食品工学実験書」、上巻、第５４７頁、養賢堂、１９７０年に記載されているように、試料をあらかじめ０．１Ｎ水酸化ナトリウムまたは０．１Ｎ塩酸で中和し（あるいはｐＨ７に調節し）、ホルマリンを添加すると、
【化１】

のようにオキシメチル誘導体となるので、これをフェノールフタレインを指示薬とするか、または電位差計を用い、０．１Ｎ水酸化ナトリウム標準溶液で滴定する。［０．１ＮＮａＯＨの１ｍｌ］＝［１．４ｍｇ α−アミノ酸窒素］として求めた窒素量が、ホルモル窒素の量である。
【００１５】
こうして得られた、全窒素量とホルモル窒素量の値から、
分解率（％）＝（ホルモル窒素量／全窒素量）×１００
により分解率を求める。本発明において、蛋白質の分解率は、３０乃至４５％である。
【００１６】
以下、本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明の理解を容易にするために、最初に本発明の蛋白質加水分解物の製造方法（以下、本発明の方法と記載する。）から説明する。
本発明の方法に使用される原料蛋白質は、獣乳等に由来するカゼインまたは乳清蛋白質である。また、これらの蛋白質を、限外濾過、イオン交換樹脂等の処理により濃縮した蛋白質濃縮物も使用できる。更に、前記蛋白質を予め軽度に加水分解した分解物であって、比較的大きな分子量を有する蛋白質加水分解物を出発原料とすることもできる。
この原料蛋白質を水又は温湯に分散し、溶解する。該溶解液の濃度は格別の制限はないが、通常、５〜１５％程度の蛋白質濃度とすることが効率性及び操作性の点から望ましい。
次いで、前記蛋白質溶液を６５〜９０℃で１〜３０分間程度加熱殺菌することが、雑菌の汚染による腐敗防止の点から望ましい。
【００１７】
本発明の原料蛋白質の加水分解の手段は、蛋白質の分解率を３０乃至４５％に調製できるものであれば特に限定されるものではなく、常法に従って、蛋白質分解酵素法によって行う。具体的には、蛋白質の分解率を３０乃至４５％に調製できる酵素の種類、量、温度、ｐＨ、加水分解時間等の蛋白質分解酵素法による加水分解条件を予備実験で設定し、のち蛋白質加水分解物を調製する。
尚、加水分解の程度の指標として、分解率を使用し、その範囲を３０乃至４５％としたのは、後記する試験例からも明らかなとおり、分解率が３０％未満では、抗原性が残存するためであり、分解率が４５％を超えるまで加水分解した場合は、最終製品である蛋白質加水分解物の乳化性が低下するためである。
【００１８】
本発明の原料蛋白質の加水分解の方法に使用される蛋白質分解酵素は、動物由来（例えば、パンクレアチン、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン等）、植物由来（例えば、パパイン、ブロメライン等）、微生物由来（例えば、乳酸菌、酵母、カビ、枯草菌、放線菌等）のエンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼ（ペプチダーゼ）、これらの粗精製物、菌体破砕物等を例示することができる。
前記原料蛋白質に対する蛋白質分解酵素の使用量は、基質濃度、酵素力価、反応温度及び反応時間により異なるが、一般的には、原料蛋白質１ｇ当り５０〜１００００活性単位の割合で酵素を単独、又は複数組み合わせて添加することにより加水分解が行われる。尚、酵素の添加は、一括、又は少量若しくは種類毎に分割し、逐次添加することもできる。
【００１９】
また、蛋白質加水分解反応のｐＨは、使用酵素の至適ｐＨに対応して、ｐＨ２〜１０の範囲から選択される。具体的には、前記蛋白質溶液に酵素を添加する前に、使用酵素の種類によりｐＨ２〜１０の範囲内で酸又はアルカリ剤の添加により所望のｐＨに調整することにより実施される。この場合、酸としては塩酸、クエン酸、リン酸等を、また、アルカリ剤としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム等をそれぞれ例示することができる。
蛋白質加水分解反応の温度は、格別の制限はなく、酵素作用の発現する最適温度範囲を含む実用に供せられ得る範囲、即ち、通常３０〜７０℃の範囲から選択される。温度を酵素の至適温度より低温又は高温、例えば５０〜６０℃の範囲に維持することにより蛋白質加水分解反応中の腐敗を防止することもできる。
蛋白質加水分解反応の時間は、使用酵素の種類及び組合せ、反応温度、初発ｐＨ等の反応条件によって進行状態が異なることから、前記のとおり、予備実験で設定された蛋白質の分解率を３０乃至４５％に調製できる範囲で、反応継続時間を決定する必要がある。
【００２０】
酵素反応の停止は、予備実験で設定された加水分解条件に基づいて加水分解の程度が、蛋白質の分解率が３０乃至４５％の範囲内となった時点で、酵素を失活又は除去することにより行う。失活操作は加熱処理（例えば、８５℃で１５分間等）により行うことができる。また、除去操作は限外濾過膜（ウルトラフィルトレーション）等により実施することができる。分解液中の酵素の失活又は除去後、必要に応じて、ケイソウ土（例えば、セライト等）、精密濾過（マイクロフィルトレーション）、限外濾過、遠心分離等の操作により分解液から沈殿を除去する。
得られた蛋白質加水分解物を含有する溶液は、そのまま使用することも可能であり、また、必要に応じてこの溶液を逆浸透膜法等の公知の方法により濃縮し、濃縮液として使用することも可能であり、更に、この濃縮液を公知の方法により乾燥して粉末となし、後に行われるポーラス型合成吸着剤による処理の前に所定濃度で水に溶解して使用することも可能である。
【００２１】
本発明の方法に使用されるポーラス型合成吸着剤は、直径数ｎｍ乃至数十ｎｍの細孔が表面に多数存在する多孔質構造を有している、いわゆるポーラス型であり、樹脂の表面積が大きく吸着性が高く、臭気成分、苦味成分、アミノ酸等の物質を、ファン・デル・ワールス力に基づく疎水性吸着等をすることが知られており、吸着成分を脱離するための再生工程が容易であり、工業的に使用し易い吸着剤である。
また、ポーラス型合成吸着剤は、主にスチレン及びジビニルベンゼンの共重合体、又はメタクリル酸エステル系ポリマーを樹脂の母体構造として形成するものである。これらの樹脂はイオン交換基が導入されておらず、加熱、酸、アルカリ等の物理的及び化学的処理に対して耐性なため、洗浄、殺菌が容易であって、細菌汚染に対して注意を払うべき飲食品、医薬品等の製造のために好適である。
更に、ポーラス型合成吸着剤として、樹脂の種類に基づき各種の異なった平均細孔径を有する吸着剤が市販されており、平均細孔径の大きさが吸着対象物質への親和性に大きく影響することから、平均細孔径の大きさが吸着剤の選択の指標となるので、目的に応じ、平均細孔径の大きさに基づいて吸着剤を選択する必要がある。
【００２２】
本発明の方法においては、後記する試験例からも明らかなとおり、それぞれ平均細孔径２乃至８ｎｍ及び平均細孔径２０乃至３０ｎｍを有する２種類のポーラス型合成吸着剤を使用することが、抗原性が極めて低く、乳化性が良好な蛋白質加水分解物を効率よく製造するために、必要である。
本発明の方法に使用される平均細孔径２乃至８ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤は、平均細孔径が２乃至８ｎｍを有するものであればいずれであってもよいが、例えば市販のセパビーズＳＰ−８２５、セパビーズＳＰ−８５０、ダイヤイオンＨＰ−２１（いずれも三菱化学社製）、アンバーライトＸＡＤ−４、アンバーライトＸＡＤ−２０００（いずれもローム＆ハース社製）等を例示することができる。
本発明の方法に使用される平均細孔径２０乃至３０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤は、平均細孔径が２０乃至３０ｎｍを有するものであればいずれであってもよいが、例えば市販のセパビーズＨＰ−１ＭＧ、セパビーズＳＰ−２０６、ダイヤイオンＨＰ−２０（いずれも三菱化学社製）等を例示することができる。
【００２３】
本発明のポーラス型合成吸着剤による吸着処理は、次のとおり実施する。前記のとおり調製された蛋白質の分解率が３０乃至４５％の範囲内にある蛋白質加水分解物を５乃至２０％の濃度の溶液に調整し、前記の２種類のポーラス型疎水性合成吸着剤に同時又は個別に接触させ、吸着処理を行う。
吸着処理は、前記蛋白質加水分解物と前記の２種類のポーラス型合成吸着剤とが効率良く接触する態様で行うことが望ましく、具体的には、一定量の蛋白質加水分解物水溶液の入った容器又はタンクの中に、スラリー状にした一定量のポーラス型合成吸着剤を添加して所定時間攪拌若しくは静置するか、又はカラムに充填した一定量のポーラス型合成吸着剤に一定量の蛋白質加水分解物水溶液を所定時間接触する態様で通過させるか、いずれかの方法により行われる。
カラム法により吸着処理を行う場合には、蛋白質加水分解物水溶液と吸着剤とが接触する時間は通常、空間速度（ＳｐａｃｅＶｏｌｕｍｅ、以下、ＳＶと記載する。）により表され、吸着剤一体積に対して、同体積の蛋白質加水分解物水溶液が、１時間で通過する速度がＳＶ＝１（単位；ｈ^−１）と定められており、この速度が遅いほど蛋白質加水分解物水溶液と合成吸着剤とが接触する時間が長くなり吸着性が高まるが、極端に遅い場合には生産効率が悪くなるので、通常はＳＶ＝０．５〜５ｈ^−１の範囲、望ましくは１〜３ｈ^−１の範囲で行うことが望ましい。
また、吸着処理のｐＨは、吸着対象物のポーラス型合成吸着剤への吸着の機序が一般に疎水性吸着に基づくため、吸着対象物が電荷をもたないｐＨ領域で行うことが好ましく、通常、ｐＨ５〜７の範囲で吸着処理を行うことが望ましい。
更に、吸着処理の温度は、蛋白質加水分解物の物性、風味、細菌増殖等の衛生的条件が考慮されていれば、特に限定されるものではない。
また、吸着処理において、前記の２種類のポーラス型合成吸着剤は、混合して同時に使用することができ、また、個別に使用すること、即ち、平均細孔径２乃至８ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤又は平均細孔径２０乃至３０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤のいずれか一方を使用して吸着処理し、引き続いて他方のポーラス型合成吸着剤を使用して吸着処理すること、のいずれの態様でも使用することができる。
【００２４】
尚、ポーラス型合成吸着剤は多孔質構造であるため表面積が大きく、吸着対象物質の量に対応して使用量（接触表面積）を調整する必要がある。即ち、吸着対象物質に対してポーラス型合成吸着剤の使用量が多すぎると、吸着対象物質以外に回収目的物質まで吸着し、回収率が低下する。逆に、吸着対象物質に対してポーラス型合成吸着剤の使用量が少なすぎると、吸着対象物質の除去が不十分となり、抗原性の低下が不十分となる。
本発明の方法においては、吸着剤の使用量は、後記する試験例からも明らかなとおり、前記のとおり調製された蛋白質の分解率が３０乃至４５％の範囲内にある蛋白質加水分解物１ｇ（蛋白質当量）に対して、それぞれ平均細孔径２乃至８ｎｍ及び平均細孔径２０乃至３０ｎｍを有する２種類のポーラス型合成吸着剤を、その表面積が合計３００乃至３０００ｍ^２の範囲で使用することが低抗原性で、乳化性の良好な蛋白質加水分解物を高い回収率で製造するために必要である。使用済の吸着剤は、酸又はアルカリ剤で洗浄することにより、吸着されている抗原性物質等の吸着対象物を容易に脱離して再生することができるので、反復使用が可能である。
尚、本発明の方法において吸着剤は、平均細孔径２乃至８ｎｍのポーラス型合成吸着剤：平均細孔径２０乃至３０ｎｍのポーラス型合成吸着剤の表面積の比において、３：７乃至７：３の範囲で使用することができ、この範囲で蛋白質の分解率に応じて変更することが望ましく、蛋白質の分解率が高い蛋白質加水分解物を吸着処理する場合には、平均細孔径２乃至８ｎｍのポーラス型合成吸着剤の表面積の比を多くすることが望ましい。
また、本発明の方法に使用される吸着剤が、平均細孔径２乃至８ｎｍのポーラス型合成吸着剤：平均細孔径２０乃至３０ｎｍのポーラス型合成吸着剤の表面積の比において４：６乃至６：４からなることが、後記する試験例からも明らかなとおり、原料蛋白質に対する蛋白質加水分解物の回収率が一層優れることから望ましい。
【００２５】
得られた蛋白質加水分解物を含有する溶液は、限外瀘過等の瀘過処理を行うことが望ましい。具体的には、６０００ダルトン以下、即ち、市販の１０００乃至６０００ダルトンに分画分子量を有する限外瀘過膜を使用し、瀘過処理を行い、一部残存する可能性のある高分子物質を除去し、膜透過画分を回収することにより実施される。
得られた蛋白質加水分解物を含有する溶液は、そのまま使用することもでき、また、必要に応じて、この溶液を逆浸透膜法等の公知の方法により濃縮した濃縮液として使用することもでき、更に、この濃縮液を公知の方法により乾燥し、粉末として使用することもできる。
【００２６】
以上の方法により、蛋白質加水分解物中に残存する抗原性物質をポーラス型疎水性合成吸着剤に効果的に吸着させることができ、原料蛋白質に対する蛋白質加水分解物の回収率を良好に保持させることができる。そして、本発明の方法によって、現時点において全ての従来技術と比較して抗原性が最も低いと考えられ実質的に抗原性を有さない、精製分離されたペプチドとは異なる蛋白質加水分解物を製造することができる。
前記本発明の方法により、本発明の蛋白質加水分解物、すなわち分解率が３０乃至４５％であること、数平均分子量が３００以下であること、及び数平均分子量に対する重量平均分子量の比が１を超え、２以下であることを特徴とする蛋白質加水分解物を製造することができる。
【００２７】
次に本発明の蛋白質加水分解物について詳細に説明する。本発明の蛋白質加水分解物は、分解率が３０乃至４５％であること及び数平均分子量が３００以下であることにより、抗原性が低減され、良好な乳化性を有している。また、数平均分子量に対する重量平均分子量の比が２以下であることにより、ほぼ単一に近似した分子量分布を示すまで、高分子の抗原性物質等の不純物が吸着除去され、実質的に抗原性を有さない良好な性質を有する蛋白質加水分解物である。
尚、数平均分子量に対する重量平均分子量の比が１となるのは、蛋白質加水分解物が、精製分離されたペプチドに代表される単一の分子量を有する物質である場合のみである。したがって、蛋白質加水分解物の数平均分子量に対する重量平均分子量の比が１を超えると定義されたことにより、本発明の蛋白質加水分解物が、少なくとも２種類の異なる分子量を有するペプチドを含有する組成物であることが容易に理解される。
【００２８】
本発明の第一の発明の蛋白質加水分解物は、良好な乳化性を有し、かつ現時点において全ての従来技術と比較して抗原性が最も低いと考えられ、実質的に抗原性がないという優れた特徴を有している。
本発明の飲食品は、上記本発明の蛋白質加水分解物を含有する飲食品である。
本発明の蛋白質加水分解物が実質的に抗原性を有していないことから、これを含む飲食品は、アレルギー予防用飲食品又はアレルギー患者用飲食品として好ましく用いられる。
本発明において、アレルギー予防用飲食品とは、アレルギー予防を目的として、乳幼児、妊産婦、免疫機能の低下した病人への蛋白質供給源として用いられる飲食品であって、この目的のために十分な程度に抗原性が低減された飲食品を指す。
また、アレルギー患者用飲食品とは、抗原性を有する飲食品を摂取するとアレルギーを発症することが明らかなアレルギー患者に対する、アレルギーを発症させないための蛋白質供給源として用いられる飲食品であって、この目的のために十分な程度に抗原性が低減された飲食品を指す。
さらに、本発明の蛋白質加水分解物が実質的に抗原性を有していないことに加え、乳化性が良好であることから、特に、調製粉乳又は調製乳の原料として好ましく用いられる。すなわち、本発明の蛋白質加水分解物を原料として得られた調製粉乳又は調製乳は、従来の低抗原性調製乳で問題であった脂肪の分離が起こらず、外観、風味、及び吸収率に優れている。
【００２９】
実施例
以下、実施例及び試験例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
以下の試験例においては、次の試験方法を採用した。
（１）蛋白質の分解率算出方法
ケルダール法（日本食品工業学会編、「食品分析法」、第１０２ページ、株式会社光琳、昭和５９年）により試料の全窒素量を測定し、ホルモル滴定法（満田他編、「食品工学実験書」、上巻、第５４７頁、養賢堂、１９７０年）により試料のホルモル窒素量を測定し、これらの測定値から分解率を次式により算出した。
分解率（％）＝（ホルモル窒素量／全窒素量）×１００
【００３０】
（２）数平均分子量及び重量平均分子量の測定方法
高速液体クロマトグラフィーにより測定した（宇井信生ら編、「タンパク質・ペプチドの高速液体クロマトグラフィー」、化学増刊第１０２号、第２４１頁、株式会社化学同人、１９８４年）。
具体的には、ポリハイドロキシエチル・アスパルアミド・カラム［ＰｏｌｙＨｙｄｏｒｏｘｙｅｔｈｙｌＡｓｐａｒｔａｍｉｄｅＣｏｌｕｍｎ：ポリ・エル・シー（ＰｏｌｙＬＣ）社製。直径４．６ｍｍ及び長さ４００ｍｍ］を使用し、２０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭぎ酸により溶出速度０．５ｍｌ／分で溶出した。検出はＵＶ検出器（島津製作所社製。２１５ｎｍの吸光度）を使用し、分子量分布を測定し、ＧＰＣ分析システム（島津製作所製）によりデータ解析し、数平均分子量及び重量平均分子量を算出した。
【００３１】
（３）抗原残存活性の測定方法
サンドウィッチＥＬＩＳＡ法により測定した（松橋直他著、「免疫学実験入門」、第１６０頁、学会出版センター、１９８５年）。
具体的には、抗原蛋白質をウサギに免疫して得たウサギ抗血清から特異ＩｇＧを精製して使用し、これを０．１Ｍ炭酸緩衝液にて希釈してポリスチレン製マイクロプレート（ヌンク社製）の各ウェルに１００μｌずつ分注し、３７℃で２時間静置し、のち０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎと記載することがある。）により洗浄した。
次いで、１％ゼラチン（バイオラド社製）を含むＰＢＳを１００μｌずつ前記各ウェルに分注し、３７℃で３０分間静置し、のちＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより洗浄した。試料及び標準蛋白質をそれぞれＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより希釈し、１００μｌずつ前記各ウェルに分注し、３７℃で１時間静置し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより洗浄した。
ビオチン化特異ＩｇＧをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより希釈し、１００μｌずつ前記各ウェルに分注し、３７℃で１時間静置後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより洗浄した。ストレプトアビジン及びビオチン化ペルオキシダーゼをＰＢＳに溶解し、１００μｌずつ前記各ウェルに分注し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより洗浄した。
基質としてｏ−フェレンジアミン溶液を１００μｌずつ前記各ウェルに分注し、室温、暗所にて１０分間反応させ、３Ｍ硫酸を各ウェルに５０μｌずつ添加し、反応を停止した。
次いで、反応生成物をマイクロプレートリーダーを用いて、反応生成物の４９２ｎｍの吸光度を測定し、標準蛋白質の測定値と比較して試料の抗原残存活性を算出した。
【００３２】
（４）乳化性の評価方法
試料１００ｇ、コーン油（太陽油脂社製）２００ｇ、及びレシチン（味の素社製）４ｇを温水（６０℃）３００ｍｌに添加し、ＴＫホモミキサー（特殊機化工業社製）を用いて予備乳化し、水を添加して総量を１０００ｍｌに調整し、これをホモジナイザー（エイ・ピイ・ブイ社製）を用いて、一段目５ＭＰａ、二段目１５ＭＰａの圧力で乳化し、得られた乳化物の脂肪分離の有無を肉眼で観察し、乳化性を次の評価基準により評価した。
良：脂肪分離なし
不良：脂肪分離あり
【００３３】
（５）蛋白質加水分解物の回収率の算出方法
蛋白質加水分解物の回収率（Ａ）は、原料蛋白質の乾燥重量（Ｂ）及び得られた蛋白質加水分解物の乾燥重量（Ｃ）に基づいて、次式により算出した。
Ａ（％）＝（Ｃ／Ｂ）×１００
【００３４】
実施例１
市販の牛乳乳清蛋白質濃縮物１．３ｋｇ（ミライ社製。蛋白質当量として１ｋｇ）を脱イオン水９ｋｇに溶解し、蛋白質濃度約１０％の乳清蛋白質水溶液１３ｋｇを調製した。該乳清蛋白質水溶液をプレート式熱交換器を使用して７０℃で１分間加熱殺菌し、液温を５３℃に調整し、１０％水酸化ナトリウム水溶液及び２０％炭酸カリウム水溶液を使用して、ｐＨを９．５に調整し、パンクレアチンＦ（天野製薬社製）、プロテアーゼＮアマノ（天野製薬社製）、及びスミチームＬＰ２０（新日本化学工業社製）をそれぞれ蛋白質１ｇ当たり５００活性単位、１５０活性単位、及び２００活性単位の割合で添加し、蛋白質加水分解反応を開始した。１５時間経過し、分解率が３５％となった時点で、プレート式熱交換器を使用して１２０℃で１５秒間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。
この加水分解液を、分画分子量２００００の限外濾過膜（日東電工社製）により濾過し、濾液を凍結乾燥し、粉末状の蛋白質加水分解物約１０９０ｇ（蛋白質当量として８４０ｇ）を得た。
【００３５】
次いで、得られた蛋白質加水分解物全量を、脱イオン水９８１０ｇに溶解し、約１０％濃度の蛋白質加水分解物水溶液１０．９ｋｇを得た。
ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径８ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤［ダイヤイオンＨＰ−２１（三菱化学社製）。比表面積５８３ｍ^２／ｇ］及び平均細孔径２６ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤［ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社製）。比表面積５１１ｍ^２／ｇ］の２種類を、それぞれ７２０ｇ（表面積４２万ｍ^２）及び８２０ｇ（表面積４２万ｍ^２）、表面積の比を１：１の割合で混合した合計１５４０ｇの吸着剤を４ｌ容量のアクリル製カラムに充填して使用した。
前記蛋白質加水分解物水溶液の全量を前記ポーラス型合成吸着剤充填カラムに、流速ＳＶ＝３ｈ^−１、１０℃の条件で通液し、前記２種類の吸着剤に蛋白質加水分解物を同時に接触させ、即ち、蛋白質加水分解物１ｇ（蛋白質当量）に対して、２種類のポーラス型合成吸着剤の表面積が合計１０００ｍ^２となる条件で接触させ、溶出液を回収し、凍結乾燥し、蛋白質加水分解物約９１０ｇ（蛋白質当量として７００ｇ）を得た。
得られた蛋白質加水分解物を前記試験方法により試験した結果、数平均分子量は２６０であり、数平均分子量に対する重量平均分子量の比の値は１．８であり、抗原残存活性は１０^−８であって極めて低く、乳化性は良好で、かつ原料蛋白質に対する蛋白質加水分解物の回収率は７０％と優れていた。
【００３６】
実施例２
市販の牛乳カゼイン１２０ｇ（ニュージーランドデイリーボード製。蛋白質当量として１００ｇ）を蒸留水８８０ｇに分散し、１０％水酸化ナトリウム水溶液を使用して、ｐＨを７．０に調整し、カゼインを完全に溶解し、蛋白質濃度約１０％のカゼイン水溶液約１ｋｇを調製した。該カゼイン水溶液を８５℃で１５分間加熱殺菌し、液温を５０℃に調整し、１０％水酸化カリウム水溶液を使用して、ｐＨを８．５に調整し、パンクレアチンＦ（天野製薬社製）、アクチナーゼＡＳ（科研ファルマ社製）、及びプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）をそれぞれ蛋白質１ｇ当たり４００活性単位、１２５０活性単位、及び２５０活性単位の割合で添加し、蛋白質加水分解反応を開始した。１７時間経過し、分解率が３８％となった時点で、９０℃で２０分間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。
この加水分解液を、ケイソウ土濾過により不溶物を除去し、凍結乾燥し、粉末状の蛋白質加水分解物約９３ｇ（蛋白質当量として７８ｇ）を得た。
【００３７】
次いで、得られた蛋白質加水分解物全量を、脱イオン水８３７ｇに溶解し、約１０％濃度の蛋白質加水分解物水溶液９３０ｇを得た。
ポーラス型疎水性合成吸着剤として、平均細孔径４ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤［セパビーズＳＰ−８５０（三菱化学社製）。比表面積９９５ｍ^２／ｇ］及び平均細孔径２６ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤［ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社製）。比表面積５１１ｍ^２／ｇ］の２種類を、それぞれ６３ｇ（表面積６２４００ｍ^２）及び１８３ｇ（表面積９３６００ｍ^２）、いわゆる表面積の比を４：６の割合で混合した合計２４６ｇの吸着剤を１０００ｍｌ容量のガラス製カラムに充填して使用した。
前記蛋白質加水分解物水溶液の全量を前記ポーラス型合成吸着剤充填カラムに、流速ＳＶ＝２ｈ^−１、２５℃の条件で通液し、前記２種類の吸着剤に蛋白質加水分解物を同時に接触させ、即ち、蛋白質加水分解物１ｇ（蛋白質当量）に対して、２種類のポーラス型合成吸着剤の表面積が合計２０００ｍ^２となる条件で接触させ、溶出液を回収し、凍結乾燥し、蛋白質加水分解物約７８ｇ（蛋白質当量として６５ｇ）を得た。
得られた蛋白質加水分解物を前記試験方法により試験した結果、数平均分子量は２５８であり、数平均分子量に対する重量平均分子量の比の値は１．７であり、抗原残存活性は１０^−８であって極めて低く、乳化性は良好で、かつ原料蛋白質に対する蛋白質加水分解物の回収率は６５％と優れていた。
【００３８】
比較例１
特公昭５４−３６２３５号公報（以下、従来技術１と記載する。）の実施例１に記載された方法に従い、蛋白質加水分解物を調製した。
市販カゼイン［ハマーシュタインカゼイン、メルク社製］１ｋｇに水９ｋｇを加え、よく分散させ、２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加え、ｐＨを７．０に調整し、カゼインを完全に溶解し、約１０％のカゼイン水溶液を調製した。該蛋白溶液を８５℃１５分間殺菌し５０℃に冷却した。このカゼイン溶液にラクトバチルス・ヘルベティカス（ハンゼン社市販菌株）の菌体破壊凍結乾燥物（２０，０００活性単位／ｇ）、局方パンクレアチン［天野製薬社製、２５，０００活性単位／ｇ］及びアマノＡ［天野製薬社製、８０．０００活性単位／ｇ］をそれぞれ蛋白質１ｇ当り１０００活性単位ずつ、３種の酵素の活性単位の数の総和で３０００の割合で加え、５０℃で２４時間保持してカゼインを分解した後、８０℃で１５分間加熱して酵素を失活させ、冷却し約９．５ｌのカゼイン分解液を得た。
【００３９】
比較例２
特公昭６２−６１０３９号公報（以下、従来技術２と記載する。）の実施例２に記載された方法に従い、蛋白質加水分解物を調製した。
乳漿蛋白質を、限外ろ過膜としてカットオフ５０００の膜を用いた酵素反応器において連続的に酵素分解した。条件は、４０℃、ｐＨ８．５、初期蛋白質含有量８４．４ｇ／ｌ、使用した塩基２ＨＫＯＨ、酵素／基質の比１１．８％、予備加水分解期間２時間、反応器に供給する溶液の蛋白質含有量４５．５ｇ／ｌとした。
比較例３
特公平７−７３５０７号公報（以下、従来技術３と記載する。）の実施例１に記載された方法に従い、蛋白質加水分解物を調製した。
市販カゼイン２００ｇを１０％水酸化ナトリウムを使用し、ｐＨ８．０に調製し１０ｗｔ％となるように溶解した。９０℃１０分間加熱殺菌後、４５℃に調整し、パンクレアチンＦ（天野製薬）１０ｇ、プロテアーゼＮ「アマノ」（天野製薬）２ｇ、ラクトバチルス・ヘルベティカス菌体抽出物（１ｇ当り２００００活性単位）４ｇを加え４５℃で２４時間酵素加水分解した。９０℃５分間加熱失活後、ろ過により沈澱物を除去した。これを凍結乾燥し凍結乾燥品１７０ｇを得た。この凍結乾燥品１８ｇを２０ｗｔ％水溶液とし、不溶解物を除去した後、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１０１０×２０ｃｍカラムで溶出した。溶出液には、イオン交換水を使用し、流速は１０ｍｌ／分とした。溶出量２００〜５００ｍｌを分画し、凍結乾燥し、乾燥物６ｇを得た。
【００４０】
比較例４
特許第２９５９７４７号公報（以下、従来技術４と記載する。）の実施例１に記載された方法に従い、蛋白質加水分解物を調製した。
純度７５％の乳清蛋白質粉末（カリフォルニア・プロテイン社製）１ｋｇを、脱イオン水９ｋｇに溶解し、７５℃に１５秒間保持して殺菌し、ｐＨを９．０に調整し、プロテアーゼＮアマノ（アマノ製薬社製）１８０万ＰＵＮ単位（乳清蛋白質当り２４００ＰＵＮ単位）及びラクトバシラス・ヘルベティカス菌体破砕物６．８万活性単位（乳清蛋白質１ｇ当り９０活性単位）を添加し、５０℃に保持して加水分解し、バイオテックアナライザー（旭化成工業社製）を用いて経時的に遊離リジンの量を測定し、遊離リジン量が１４％に達した時点で、８０℃で６分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、のちクエン酸でｐＨを６．０に調整し、分画分子量１０，０００の限外ろ過膜（日東電工社製）で限外ろ過し、乳清蛋白質加水分解物を５．９％含有する溶液約１６ｋｇを得た。
【００４１】
比較例５
特開平８−２２８６９２号公報（以下、従来技術５と記載する。）の実施例１に記載された方法に従い、蛋白質加水分解物を調製した。
市販のカゼイン（ニュージーランドデイリーボード社製）１ｋｇに水９ｋｇを加え、よく分散させ、１０％水酸化ナトリウム水溶液を添加して、溶液のｐＨを７．０に調整し、カゼインを完全に溶解し、濃度約１０％のカゼイン水溶液を調製した。該カゼイン水溶液を８５℃で１０分間加熱殺菌し、５０℃に温度調整し、水酸化ナトリウムを添加してｐＨを９．５に調整した後、ビオプラーゼｓｐ−２０（長瀬生化学工業社製）１，００８，０００活性単位（蛋白質１ｇ当り１，２００活性単位）、プロテアーゼＮ（天野製薬社製）１，６８０，０００活性単位（蛋白質１ｇ当り２，０００活性単位）、及びＰＴＮ６．０Ｓ（ノボ・ノルディスク社製）５，８８０，０００活性単位（蛋白質１ｇ当り７，０００活性単位）を添加して、加水分解反応を開始し、経時的にカゼインの分解率及びＬ−アミノ酸センサー［バイオテックアナライザー（旭化成工業社製）］により１６種類のアミノ酸のモル数の合計の測定される測定値をそれぞれ測定し、カゼインの分解率が２４．１％及びＬ−アミノ酸センサーによる測定値が６．０ｍＭに達した時点で８０℃で６分間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。この加水分解液にろ過助剤としてスタンダードスーパーセル（東京珪藻土社製）を加え、吸引ろ過し、次いで、得られたろ過液を常法により濃縮、噴霧乾燥し、噴霧乾燥品０．９６ｋｇを得た。
【００４２】
比較例６
特開平７−２０３８４４号公報（以下、従来技術６と記載する。）の実施例２に記載された方法に従い、蛋白質加水分解物を調製した。
市販のＷＰＣ（蛋白質含量８５％、デンマークプロテイン社製）３ｋｇを１７ｋｇの精製水に溶解し、プレート型殺菌装置で７５℃で１５秒間殺菌し、のち水酸化カリウムを添加して溶液のｐＨを８．０に調整し、蛋白質１ｇ当りビオプラーゼ（長瀬産業社製）１，０００ＰＵＮ単位、トリプシン（ノボ社製）１０，０００ＵＳＰ単位、パパイン（天野製薬社製）２，０００ＰＵＮ単位及びプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）２００ＰＵＮ単位の割合で添加し、５０℃で１２時間分解した。分解後の分解液のｐＨが６．４であったので、水酸化ナトリウムを添加してｐＨを７．３に調整し、のちプレート型殺菌装置を用いて８５℃で５分間、１３０℃で２秒間加熱して酵素を失活させ、次いで常法により濃縮し、乾燥し、粉末状の乳清蛋白質分解物約３ｋｇを得た。
【００４３】
試験例１
この試験は、従来技術と比較して本発明の蛋白質加水分解物及びその製造方法が優れていることを示すために行った。
（１）試料
下記の７種類の試料を用いた。
・本発明の実施例１の方法により製造した蛋白質加水分解物
・比較例１の方法（従来技術１の実施例１と同一の方法）により製造した蛋白質加水分解物
・比較例２の方法（従来技術２の実施例２と同一の方法）により製造した蛋白質加水分解物
・比較例３の方法（従来技術３の実施例１と同一の方法）により製造した蛋白質加水分解物
・比較例４の方法（従来技術４の実施例１と同一の方法）により製造した蛋白質加水分解物
・比較例５の方法（従来技術５の実施例１と同一の方法）により製造した蛋白質加水分解物
・比較例６の方法（従来技術６の実施例２と同一の方法）により製造した蛋白質加水分解物
【００４４】
（２）試験方法
各試料の蛋白質の分解率、数平均分子量、数平均分子量に対する重量平均分子量の比の値（Ｍｗ／Ｍｎ）、抗原残存活性、及び乳化性を、いずれも前記の試験方法により試験した。
（３）試験結果
この試験の結果は、表１に示すとおりである。表１から明らかなとおり、従来技術の比較例１〜６に比較して本発明の実施例１の蛋白質加水分解物は、抗原残存活性が極めて低く、かつ乳化性に優れていることが判明した。
尚、本発明の試料については、原料蛋白質の種類、蛋白質の分解率を３０乃至４５％の範囲で、数平均分子量が３００以下の範囲で、又はＭｗ／Ｍｎを１を超え、２以下の範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００４５】
【表１】

【００４６】
試験例２
この試験は、抗原残存活性及び乳化性を指標として、蛋白質加水分解物の適正な分解率を調べるために行った。
（１）試料の調製
酵素反応の停止時期を変更して、表２に示すとおり、原料蛋白質の分解率を段階的に変更したことを除き、実施例１と同一の方法により４種類の試料（実施例３及び４、並びに比較例７及び８）を調製した。
（２）試験方法
各試料の蛋白質の分解率、数平均分子量、数平均分子量に対する重量平均分子量の比の値（Ｍｗ／Ｍｎ）、抗原残存活性、及び乳化性を、いずれも前記の試験方法により試験した。
【００４７】
（３）試験結果
この試験の結果は、表２に示すとおりである。表２から明らかなとおり、抗原残存活性が極めて低く、かつ乳化性に優れた蛋白質加水分解物を製造するためには、原料蛋白質の分解率を３０乃至４５％の範囲内とすることが必要であることが判明した。
また、数平均分子量が３００以下の範囲である場合に、抗原残存活性が極めて低く、乳化性を考慮すると数平均分子量が２００以上であることが望ましいことが示された。
尚、原料蛋白質の種類、又はＭｗ／Ｍｎを１を超え、２以下の範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００４８】
【表２】

【００４９】
試験例３
この試験は、抗原残存活性、乳化性、及び回収率を指標として、ポーラス型疎水性合成吸着剤の平均細孔径の大きさ及びその組合せを調べるために行った。
（１）試料の調製
平均細孔径の大きさの異なる各種の市販ポーラス型合成吸着剤を使用して、ポーラス型合成吸着剤の平均細孔径の大きさ及びその組合せを変更したことを除き、実施例１と同一の方法により次に示す２８種類の試料（実施例５乃至８、及び比較例９乃至３２）を調製した。
【００５０】
実施例５：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径２ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤（商品名セパビーズＳＰ−８２５、三菱化学社製）及び平均細孔径２０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤（商品名セパビーズＨＰ−２ＭＧ、三菱化学社製）の２種類を使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した本発明の蛋白質加水分解物
【００５１】
実施例６：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径２ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径３０ｎｍ（商品名セパビーズＳＰ−２０６、三菱化学社製）を有するポーラス型合成吸着剤の２種類を使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した本発明の蛋白質加水分解物
【００５２】
実施例７：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径８ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径２０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤の２種類を使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した本発明の蛋白質加水分解物
【００５３】
実施例８：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径８ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径３０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤の２種類を使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した本発明の蛋白質加水分解物
【００５４】
比較例９：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径１ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤（商品名セパビーズＳＰ−２０５、三菱化学社製）を単独で使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００５５】
比較例１０：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径２ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤を単独で使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００５６】
比較例１１：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径８ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤を単独で使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００５７】
比較例１２：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径１０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤（商品名セパビーズＳＰ−２０７、三菱化学社製）を単独で使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００５８】
比較例１３：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径２０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤を単独で使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００５９】
比較例１４：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径３０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤を単独で使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００６０】
比較例１５：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径４０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤（商品名アンバーライトＸ４Ｄ−９、ローム＆ハース社製）を単独で使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００６１】
比較例１６：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径１ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径２ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤の２種類を使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００６２】
比較例１７：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径１ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径８ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤の２種類を使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００６３】
比較例１８：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径１ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径１０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤の２種類を使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００６４】
比較例１９：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径１ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径２０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤の２種類を使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００６５】
比較例２０：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径１ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径３０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤の２種類を使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００６６】
比較例２１：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径１ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径４０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤の２種類を使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００６７】
比較例２２：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径２ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径８ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤の２種類を使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００６８】
比較例２３：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径２ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径１０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤の２種類を使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００６９】
比較例２４：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径２ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径４０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤の２種類を使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００７０】
比較例２５：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径８ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径１０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤の２種類を使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００７１】
比較例２６：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径８ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径４０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤の２種類を使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００７２】
比較例２７：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径１０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径２０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤の２種類を使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００７３】
比較例２８：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径１０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径３０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤の２種類を使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００７４】
比較例２９：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径１０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径４０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤の２種類を使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００７５】
比較例３０：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径２０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径３０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤の２種類を使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００７６】
比較例３１：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径２０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径４０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤の２種類を使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００７７】
比較例３２：ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径３０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径４０ｎｍを有するポーラス型合成吸着剤の２種類を使用したことを除き、実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００７８】
（２）試験方法各試料の抗原残存活性、乳化性、及び回収率を、いずれも前記の試験方法により試験した。
（３）試験結果
この試験の結果は、表３に示すとおりである。表３から明らかなとおり、抗原残存活性が極めて低く、かつ乳化性に優れた蛋白質加水分解物を、６０％以上の高回収率で製造するためには、それぞれ平均細孔径２乃至８ｎｍ及び平均細孔径２０乃至３０ｎｍを有する２種類のポーラス型合成吸着剤を使用することが必要であることが判明した。
尚、原料蛋白質の種類、蛋白質の分解率を３０乃至４５％の範囲で、又は前記２種類のポーラス型合成吸着剤の合計使用面積を、原料蛋白質を、分解率が３０乃至４５％の範囲で加水分解し、得られた蛋白質加水分解物１ｇ（蛋白質当量）に対して、３００乃至３０００ｍ^２の範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００７９】
【表３】

【００８０】
試験例４
この試験は、抗原残存活性及び回収率を指標として、ポーラス型合成吸着剤の使用表面積、並びに蛋白質加水分解物の適正な数平均分子量に対する重量平均分子量の比を調べるために行った。
（１）試料の調製
表４に示すとおり、蛋白質加水分解物１ｇ（蛋白質当量）に対するポーラス型合成吸着剤の使用表面積（ｍ^２）を変更したことを除き、実施例１と同一の方法により４種類の試料（実施例９及び１０、並びに比較例３３及び３４）を調製した。
（２）試験方法
各試料の数平均分子量に対する重量平均分子量の比の値（Ｍｗ／Ｍｎ）、抗原残存活性、及び回収率を、いずれも前記の試験方法により試験した。
【００８１】
（３）試験結果
この試験の結果は、表４に示すとおりである。表４から明らかなとおり、抗原残存活性が極めて低く、回収率に優れた蛋白質加水分解物の製造方法においては、原料蛋白質を、分解率が３０乃至４５％の範囲で加水分解し、得られた蛋白質加水分解物１ｇ（蛋白質当量）に対して、それぞれ平均細孔径２乃至８ｎｍ及び平均細孔径２０乃至３０ｎｍを有する２種類のポーラス型合成吸着剤を、その表面積が合計３００乃至３０００ｍ^２の範囲で使用することが必要であることが判明した。また、蛋白質加水分解物の数平均分子量に対する重量平均分子量の比が２以下である場合に、抗原残存活性が極めて低いことが判明した。
尚、原料蛋白質の種類、蛋白質の分解率を３０乃至４５％の範囲で、数平均分子量が３００以下の範囲で、又はポーラス型合成吸着剤の平均細孔径の大きさ及びその組合せを、それぞれ平均細孔径２乃至８ｎｍ及び平均細孔径２０乃至３０ｎｍを有する２種類のポーラス型疎水性合成吸着剤を組合せて使用する範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００８２】
【表４】

【００８３】
試験例５
この試験は、抗原残存活性及び回収率を指標として、平均細孔径２乃至８ｎｍのポーラス型合成吸着剤：平均細孔径２０乃至３０ｎｍのポーラス型合成吸着剤の表面積の比の望ましい範囲を調べるために行った。
（１）試料の調製
表５に示すとおり、平均細孔径８ｎｍのポーラス型合成吸着剤：平均細孔径２６ｎｍのポーラス型合成吸着剤の表面積の比を変更したことを除き、実施例１と同一の方法により４種類の試料（実施例１１及び１２、並びに比較例３５及び３６）を調製した。
（２）試験方法
各試料の抗原残存活性及び回収率を、いずれも前記の試験方法により試験した。
【００８４】
（３）試験結果
この試験の結果は、表５に示すとおりである。表５から明らかなとおり、抗原残存活性が極めて低い蛋白質加水分解物を、一層高い回収率で製造するためには、平均細孔径２乃至８ｎｍのポーラス型合成吸着剤：平均細孔径２０乃至３０ｎｍのポーラス型合成吸着剤の表面積の比率が、面積比で４：６乃至６：４の範囲であることが望ましいことが判明した。
尚、原料蛋白質の種類、蛋白質の分解率を３０乃至４５％の範囲で、ポーラス型合成吸着剤の平均細孔径の大きさ及びその組合せを、それぞれ平均細孔径２乃至８ｎｍ及び平均細孔径２０乃至３０ｎｍを有する２種類のポーラス型合成吸着剤を組合せて使用する範囲で、又は前記２種類のポーラス型合成吸着剤の合計使用面積を、原料蛋白質を、分解率が３０乃至４５％の範囲で加水分解し、得られた蛋白質加水分解物１ｇ（蛋白質当量）に対して、３００乃至３０００ｍ^２の範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００８５】
【表５】

【００８６】
実施例１３
実施例１と同一の方法により製造された蛋白質加水分解物２５ｋｇ、ラクトース（メグレ社製）６８ｋｇ、ラフィノース（日本甜菜製糖社製）１１２０ｇ、マルツデキストリン（松谷化学工業社製）１４．６ｋｇ、ミネラル混合物（富田製薬社製）９２０ｇ、及びビタミン混合物（田辺製薬社製）３５ｇを精製水３００ｋｇに溶解し、これにコハク酸モノグリセリド（花王社製）４５０ｇ及び調整脂肪（太陽油脂社製）４０ｋｇを添加し、均質化し、１２０℃で２秒間殺菌し、濃縮し、噴霧乾燥し、アレルギー予防用粉乳約１４５ｋｇを得た。
得られたアレルギー予防用粉乳を１４％濃度で調乳したミルクは、乳化性及び風味が良好であり、蛋白質成分の抗原残存活性が極めて低いことから、アレルギー予防用飲料に好適であった。
【００８７】
実施例１４
実施例２と同一の方法により製造された蛋白質加水分解物１６ｋｇ、ラクチュロース（森永乳業社製）５００ｇ、ラフィノース（日本甜菜製糖社製）５００ｇ、マルトデキストリン（松谷化学工業社製）６２ｋｇ、タピオカ澱粉（松谷化学工業社製）３ｋｇ、ミネラル混合物（富田製薬社製）９２０ｇ、及びビタミン混合物（田辺製薬社製）３５ｇを精製水６２０ｋｇに溶解し、これに調整脂肪（太陽油脂社製）２０ｋｇを添加し、均質化し、８０℃で６分間殺菌し、アレルギー患者用調製乳約６００ｋｇを得た。
得られたアレルギー患者用調製乳は、乳化性及び風味が良好であり、蛋白質成分の抗原残存活性が極めて低いことから、アレルギー患者用飲料に好適であった。
【００８８】
実施例１５
７ｋｇの温水（６０℃）に、実施例１と同一の方法により製造された蛋白質加水分解物５ｋｇ及びデキストリン（参松工業社製）１５ｋｇを添加し、ＴＫホモミキサー（特殊機化工業社製）を用いて溶解、分散させ、液状物を調製した。
前記液状物に、コハク酸モノグリセリド（花王社製）１４０ｇ、調整脂肪（太陽油脂社製）２．２ｋｇ、ミネラル混合物（富田製薬社製）４００ｇ、及びビタミン混合物（田辺製薬社製）２０ｇを添加し、ＴＫホモミキサー（特殊機化工業社製）を用いて予備乳化し、水を添加して総量を１００ｋｇに調整した。
次いで、予備乳化物を高圧ホモジナイザー（マントンゴーリン社製）を用いて、一段目５ＭＰａ、二段目５０ＭＰａの２段階処理を５回反復して均質化し、液状流動食約９２ｋｇを調製した。
液状流動食約１１ｋｇを、レトルトパウチ（東洋製罐社製）に２００ｍｌずつ充填し、のちレトルト殺菌機（日阪製作所社製）により１２５℃で１０分間殺菌し、アレルギー患者用液状流動食５０個を調製した。
得られたアレルギー治療用液状流動食は、乳化性及び風味が良好であり、蛋白質成分の抗原残存活性が極めて低いことから、アレルギー患者用飲食品に好適であった。
【００８９】
産業上の利用可能性
本発明の蛋白質加水分解物の製造方法は、原料蛋白質に対する蛋白質加水分解物の回収率を良好に保持して、アレルギー発症の素因を有する者に対して使用可能な低抗原性で乳化性に優れた蛋白質加水分解物を製造することができる。
本発明の蛋白質加水分解物は、良好な乳化性を有し、実質的に抗原性を有さないことから、アレルギー発症の予防及びアレルギー患者のための食品又は飲料へ応用可能である。
本発明の蛋白質加水分解物を含有する飲食品は、乳化性及び風味が良好であり、蛋白質成分の抗原残存活性が極めて低いことから、低抗原性調製乳及び調製粉乳などのアレルギー発症の予防食及びアレルギー患者用蛋白質源として有用である。具体的には、調製粉乳、調製乳、栄養補助食品、病態栄養食、流動食等の各種飲食品を例示することができる。

Claims

少なくとも２種類のペプチドを含有する蛋白質加水分解物において、前記蛋白質がカゼインまたは乳清蛋白質であり、蛋白質の分解率が３０乃至４５％であり、含有されるペプチドの数平均分子量が３００以下であり、かつ該数平均分子量に対する重量平均分子量の比が１を超え２以下であることを特徴とする蛋白質加水分解物。
カゼインまたは乳清蛋白質からなる原料蛋白質を、分解率が３０乃至４５％の範囲で加水分解する工程と、得られた加水分解物の蛋白質当量１ｇに対して、２乃至８ｎｍの範囲の平均細孔径、及び２０乃至３０ｎｍの範囲の平均細孔径を有する２種類のポーラス型合成吸着剤を、それらの表面積の合計が３００乃至３０００ｍ^２の範囲で、同時又は個別に接触させ、非吸着成分を回収する工程とを含むことを特徴とする蛋白質加水分解物の製造方法。
前記２乃至８ｎｍの範囲の平均細孔径を有するポーラス型合成吸着剤と前記２０乃至３０ｎｍの範囲の平均細孔径を有するポーラス型合成吸着剤が、その表面積の比において４：６乃至６：４の範囲で用いられる、請求項２記載の蛋白質加水分解物の製造方法。
請求項１記載の蛋白質加水分解物を含有することを特徴とする飲食品。
乳由来の蛋白質を原料蛋白質として得られた調製乳又は調製粉乳である、請求項４記載の飲食品。
アレルギー予防用飲食品又はアレルギー患者用飲食品である、請求項４記載の飲食品。
アレルギー予防用飲食品若しくはアレルギー患者用飲食品中の、又はその製造における、請求項１記載の蛋白質加水分解物の使用。