JP3749180B2 - 蛋白質加水分解物、その製造方法、及びその蛋白質加水分解物を含有する飲食品 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛋白質加水分解物、その製造方法、及びその蛋白質加水分解物を含有する飲食品に関し、特に、抗原性が低く、乳化性の良好な蛋白質分解物とこれを含有する飲食品、さらに、この蛋白質分解物を、高い回収率で得るための製造方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
近年、食物アレルギーの発生頻度は増加する傾向にあり、アレルギー発症の有効な予防及び治療の重要性が増している。
食物アレルギーの発症については、乳児が、調製乳又は調製粉乳等の摂取時に、含有蛋白質を消化が不充分な状態で抗原性を有したまま体内に吸収してしまうことがあり、これが発症の1つの原因であると指摘されている。このため、特に、アレルギー発症の素因を有する疑いのある者のアレルギー発症の予防のためには、乳児期に摂取する調製乳又は調製粉乳が低抗原性であることが必要である。
このため、従来より、抗原性物質である乳蛋白質などの蛋白質を加水分解し、抗原性を低下させて、抗原残存活性が10−6以下である蛋白質加水分解物が多数開発されている(例えば、特公昭54−36235号公報、特公昭62−61039号公報、特公平7−73507号公報、特許第2959747号公報、及び特開平8−228692号公報参照)。しかしながら、これらの蛋白質加水分解物について、高感度の抗原残存活性の測定方法であるサンドウィッチELISA法を用いて抗原残存活性を測定した結果、抗原残存活性は10−7以上を示し、抗原性が若干残存していた(後述)。
【0003】
一方、蛋白質は高度に加水分解することにより乳化性が低下するため、高度加水分解物を原料として得られた調製乳は、内部の脂肪球の乳化状態を維持することができず、脂肪球が凝集して分離してしまうという問題があった。こうして脂肪が分離した調製乳は、外観、風味が不良であるだけでなく、脂肪の吸収率も低下する。そこで、蛋白質加水分解物の乳化性の改善が、調製乳及び調製粉乳の製造において課題となっていた。
この課題を解決するため、乳清蛋白質を特定のpH条件で、特定の三種類の酵素により加水分解することにより、抗原残存活性が低減され、乳化性に優れた蛋白質加水分解物が開発されている(特開平7−203844号公報)が、この抗原残存活性は10−5を示し、抗原性が十分には低減されていなかった(後述)。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
アレルギー発症の予防及び治療が、重大な課題となっている現代において、抗原残存活性を限りなくゼロに近似させることは、食物アレルギー発生のリスクを低減し、安全な飲食品を提供するうえで、極めて重要であり、食品メーカーの社会的使命である。
本発明は、一層の抗原性の低減、具体的には、蛋白質の抗原残存活性をサンドウィッチELISA法の検出限界まで低減させ、かつ乳化性を改善した蛋白質加水分解物の取得、及び/又は原料蛋白質に対する蛋白質加水分解物の回収率の向上を目的とする。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、種々の蛋白質加水分解物の製造方法、特に種々の原料蛋白質の加水分解条件及び種々のポーラス型合成吸着剤の組み合わせ、及び得られた蛋白質加水分解物の特徴について研究を重ね、本発明を完成させた。
本発明の蛋白質分解物は、少なくとも2種類のペプチドを含有する蛋白質加水分解物において、前記蛋白質がカゼインまたは乳清蛋白質であり、分解率が30乃至45%であること、数平均分子量が300以下であること、及び数平均分子量に対する重量平均分子量の比が1を超え、2以下であることを特徴とする蛋白質加水分解物であり、従来の蛋白質加水分解物に比較して、抗原性の低減及び乳化性に優れている。
【0006】
本発明の蛋白質分解物の製造方法は、カゼインまたは乳清蛋白質からなる原料蛋白質を、分解率が30乃至45%の範囲で加水分解し、得られた蛋白質加水分解物1g(蛋白質当量)に対して、それぞれ平均細孔径2乃至8nm及び平均細孔径20乃至30nmを有する2種類のポーラス型合成吸着剤を、その表面積が合計300乃至3000m2の範囲で、同時又は個別に接触させ、非吸着成分を回収することを特徴とするものであり、従来の蛋白質加水分解物の製造方法に比較して、抗原性の低減、乳化性、及び原料蛋白質に対する蛋白質加水分解物の回収率に優れている。
またこの製造方法において、平均細孔径2乃至8nmのポーラス型合成吸着剤:平均細孔径20乃至30nmのポーラス型疎水性合成吸着剤の表面積の比が4:6乃至6:4の範囲となるように用いることを望ましい態様としてもいる。
【0007】
本発明の飲食品は、前記の本発明の蛋白質加水分解物を含有することを特徴としている。本発明の飲食品は、アレルギー予防用飲食品又はアレルギー患者用飲食品とすることができ、特に、乳由来の蛋白質を原料蛋白質として得られた調製乳又は調製粉乳とすることができる。
したがって、本発明のさらなる態様は、アレルギー予防用飲食品若しくはアレルギー患者用飲食品中の、又はその製造における、上記の蛋白質加水分解物の使用である。
【0008】
【発明の実施の形態】
本明細書において、分解率を除き、百分率は特に断りのない限り、重量による表示である。また、本明細書において、蛋白質当量は、窒素量に6.38を乗じた値である。
本発明の蛋白質加水分解物は、少なくとも2種類のペプチドを含有する蛋白質加水分解物であって、蛋白質加水分解物から単一のペプチドまで単離精製されたものは、本発明の範囲に包含されない。
【0009】
1)数平均分子量及び重量平均分子量
一般に、数平均分子量及び重量平均分子量は、文献(社団法人高分子学会編、「高分子科学の基礎」、第116乃至119頁、株式会社東京化学同人、1978年)に記載されるとおり、高分子化合物の分子量の平均値を次のとおり異なる指標に基づき示すものである。
即ち、蛋白質加水分解物等の高分子化合物は不均一な物質であり、かつ分子量に分布があるため、蛋白質加水分解物の分子量は、物理化学的に取り扱うためには、平均分子量で示す必要があり、数平均分子量(以下、Mnと略記することがある。)は、分子の個数についての平均であり、ペプチド鎖iの分子量がMiであり、その分子数をNiとすると、次の式により定義される。
【0010】
【数1】
【0011】
また、重量平均分子量(以下、Mwと略記することがある。)は、重量についての平均であり、次の式により定義される。
【0012】
【数2】
【0013】
これらMn及びMwの関係は、前記各式から明らかなとおり、常にMn≦Mwの関係を有し、Mnは高分子化合物に含まれる低分子量物質の寄与を敏感に受けるのに対して、Mwは、高分子量物質の寄与を受け易い。
本来、アミノ酸配列の定まった単一の未分解蛋白質分子では、分子量に分布はなく、Mn=Mwとなるが、加水分解された場合、生成したペプチド断片の個々の分子量が大きく異なるため分子量分布が広範囲になる。即ち、この分布が広いものほど、Mn及びMwの差が大きくなる。従って、数平均分子量に対する重量平均分子量の比の値、即ちMw/Mnの値は、蛋白質加水分解物の分子量分布の広がりを示す指標として用いられる。
本発明において、数平均分子量及び重量平均分子量は、当業者には周知である高速液体クロマトグラフィーとGPC分析システムにより測定した値を用いる(例えば、宇井信生ら編、「タンパク質・ペプチドの高速液体クロマトグラフィー」、化学増刊第102号、第241頁、株式会社化学同人、1984年)。
本発明の蛋白質加水分解物において、数平均分子量は300以下、好ましくは200以上300以下である。また、数平均分子量に対する重量平均分子量の比は、1を超え、2以下である。
【0014】
2)蛋白質の分解率
本発明において、蛋白質の分解率とは、蛋白質加水分解物中の全窒素量に対するホルモル窒素の重量比を表す。全窒素量は、当業者に周知のケルダール法によって測定することができ、具体的には日本食品工業学会編、「食品分析法」、第102ページ、株式会社光琳、昭和59年等に記載されているように、試料に分解促進剤として水銀・酸化水銀(II)・硫酸銅を加え、濃硫酸・硫酸カリウムまたは硫酸・発煙硫酸中で加熱分解を行なって試料中の窒素を硫酸アンモニウムに変換し、これに強アルカリを加え水蒸気蒸留し、遊離したアンモニアを規定量の酸に捕集し、過剰の酸を逆滴定することで捕集したアンモニア量を求め、この量から全窒素量を算出するものである。ホルモル窒素は、アルカリ標準溶液で遊離アミノ酸を定量するために当業者に周知の方法のホルモル滴定によって求められたアミノ酸の定量値である。例えば満田他編、「食品工学実験書」、上巻、第547頁、養賢堂、1970年に記載されているように、試料をあらかじめ0.1N水酸化ナトリウムまたは0.1N塩酸で中和し(あるいはpH7に調節し)、ホルマリンを添加すると、
【化1】
のようにオキシメチル誘導体となるので、これをフェノールフタレインを指示薬とするか、または電位差計を用い、0.1N水酸化ナトリウム標準溶液で滴定する。[0.1N NaOHの1ml]=[1.4mg α−アミノ酸窒素]として求めた窒素量が、ホルモル窒素の量である。
【0015】
こうして得られた、全窒素量とホルモル窒素量の値から、
分解率(%)=(ホルモル窒素量/全窒素量)×100
により分解率を求める。本発明において、蛋白質の分解率は、30乃至45%である。
【0016】
以下、本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明の理解を容易にするために、最初に本発明の蛋白質加水分解物の製造方法(以下、本発明の方法と記載する。)から説明する。
本発明の方法に使用される原料蛋白質は、獣乳等に由来するカゼインまたは乳清蛋白質である。また、これらの蛋白質を、限外濾過、イオン交換樹脂等の処理により濃縮した蛋白質濃縮物も使用できる。更に、前記蛋白質を予め軽度に加水分解した分解物であって、比較的大きな分子量を有する蛋白質加水分解物を出発原料とすることもできる。
この原料蛋白質を水又は温湯に分散し、溶解する。該溶解液の濃度は格別の制限はないが、通常、5〜15%程度の蛋白質濃度とすることが効率性及び操作性の点から望ましい。
次いで、前記蛋白質溶液を65〜90℃で1〜30分間程度加熱殺菌することが、雑菌の汚染による腐敗防止の点から望ましい。
【0017】
本発明の原料蛋白質の加水分解の手段は、蛋白質の分解率を30乃至45%に調製できるものであれば特に限定されるものではなく、常法に従って、蛋白質分解酵素法によって行う。具体的には、蛋白質の分解率を30乃至45%に調製できる酵素の種類、量、温度、pH、加水分解時間等の蛋白質分解酵素法による加水分解条件を予備実験で設定し、のち蛋白質加水分解物を調製する。
尚、加水分解の程度の指標として、分解率を使用し、その範囲を30乃至45%としたのは、後記する試験例からも明らかなとおり、分解率が30%未満では、抗原性が残存するためであり、分解率が45%を超えるまで加水分解した場合は、最終製品である蛋白質加水分解物の乳化性が低下するためである。
【0018】
本発明の原料蛋白質の加水分解の方法に使用される蛋白質分解酵素は、動物由来(例えば、パンクレアチン、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン等)、植物由来(例えば、パパイン、ブロメライン等)、微生物由来(例えば、乳酸菌、酵母、カビ、枯草菌、放線菌等)のエンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼ(ペプチダーゼ)、これらの粗精製物、菌体破砕物等を例示することができる。
前記原料蛋白質に対する蛋白質分解酵素の使用量は、基質濃度、酵素力価、反応温度及び反応時間により異なるが、一般的には、原料蛋白質1g当り50〜10000活性単位の割合で酵素を単独、又は複数組み合わせて添加することにより加水分解が行われる。尚、酵素の添加は、一括、又は少量若しくは種類毎に分割し、逐次添加することもできる。
【0019】
また、蛋白質加水分解反応のpHは、使用酵素の至適pHに対応して、pH2〜10の範囲から選択される。具体的には、前記蛋白質溶液に酵素を添加する前に、使用酵素の種類によりpH2〜10の範囲内で酸又はアルカリ剤の添加により所望のpHに調整することにより実施される。この場合、酸としては塩酸、クエン酸、リン酸等を、また、アルカリ剤としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム等をそれぞれ例示することができる。
蛋白質加水分解反応の温度は、格別の制限はなく、酵素作用の発現する最適温度範囲を含む実用に供せられ得る範囲、即ち、通常30〜70℃の範囲から選択される。温度を酵素の至適温度より低温又は高温、例えば50〜60℃の範囲に維持することにより蛋白質加水分解反応中の腐敗を防止することもできる。
蛋白質加水分解反応の時間は、使用酵素の種類及び組合せ、反応温度、初発pH等の反応条件によって進行状態が異なることから、前記のとおり、予備実験で設定された蛋白質の分解率を30乃至45%に調製できる範囲で、反応継続時間を決定する必要がある。
【0020】
酵素反応の停止は、予備実験で設定された加水分解条件に基づいて加水分解の程度が、蛋白質の分解率が30乃至45%の範囲内となった時点で、酵素を失活又は除去することにより行う。失活操作は加熱処理(例えば、85℃で15分間等)により行うことができる。また、除去操作は限外濾過膜(ウルトラフィルトレーション)等により実施することができる。分解液中の酵素の失活又は除去後、必要に応じて、ケイソウ土(例えば、セライト等)、精密濾過(マイクロフィルトレーション)、限外濾過、遠心分離等の操作により分解液から沈殿を除去する。
得られた蛋白質加水分解物を含有する溶液は、そのまま使用することも可能であり、また、必要に応じてこの溶液を逆浸透膜法等の公知の方法により濃縮し、濃縮液として使用することも可能であり、更に、この濃縮液を公知の方法により乾燥して粉末となし、後に行われるポーラス型合成吸着剤による処理の前に所定濃度で水に溶解して使用することも可能である。
【0021】
本発明の方法に使用されるポーラス型合成吸着剤は、直径数nm乃至数十nmの細孔が表面に多数存在する多孔質構造を有している、いわゆるポーラス型であり、樹脂の表面積が大きく吸着性が高く、臭気成分、苦味成分、アミノ酸等の物質を、ファン・デル・ワールス力に基づく疎水性吸着等をすることが知られており、吸着成分を脱離するための再生工程が容易であり、工業的に使用し易い吸着剤である。
また、ポーラス型合成吸着剤は、主にスチレン及びジビニルベンゼンの共重合体、又はメタクリル酸エステル系ポリマーを樹脂の母体構造として形成するものである。これらの樹脂はイオン交換基が導入されておらず、加熱、酸、アルカリ等の物理的及び化学的処理に対して耐性なため、洗浄、殺菌が容易であって、細菌汚染に対して注意を払うべき飲食品、医薬品等の製造のために好適である。
更に、ポーラス型合成吸着剤として、樹脂の種類に基づき各種の異なった平均細孔径を有する吸着剤が市販されており、平均細孔径の大きさが吸着対象物質への親和性に大きく影響することから、平均細孔径の大きさが吸着剤の選択の指標となるので、目的に応じ、平均細孔径の大きさに基づいて吸着剤を選択する必要がある。
【0022】
本発明の方法においては、後記する試験例からも明らかなとおり、それぞれ平均細孔径2乃至8nm及び平均細孔径20乃至30nmを有する2種類のポーラス型合成吸着剤を使用することが、抗原性が極めて低く、乳化性が良好な蛋白質加水分解物を効率よく製造するために、必要である。
本発明の方法に使用される平均細孔径2乃至8nmを有するポーラス型合成吸着剤は、平均細孔径が2乃至8nmを有するものであればいずれであってもよいが、例えば市販のセパビーズSP−825、セパビーズSP−850、ダイヤイオンHP−21(いずれも三菱化学社製)、アンバーライトXAD−4、アンバーライトXAD−2000(いずれもローム&ハース社製)等を例示することができる。
本発明の方法に使用される平均細孔径20乃至30nmを有するポーラス型合成吸着剤は、平均細孔径が20乃至30nmを有するものであればいずれであってもよいが、例えば市販のセパビーズHP−1MG、セパビーズSP−206、ダイヤイオンHP−20(いずれも三菱化学社製)等を例示することができる。
【0023】
本発明のポーラス型合成吸着剤による吸着処理は、次のとおり実施する。前記のとおり調製された蛋白質の分解率が30乃至45%の範囲内にある蛋白質加水分解物を5乃至20%の濃度の溶液に調整し、前記の2種類のポーラス型疎水性合成吸着剤に同時又は個別に接触させ、吸着処理を行う。
吸着処理は、前記蛋白質加水分解物と前記の2種類のポーラス型合成吸着剤とが効率良く接触する態様で行うことが望ましく、具体的には、一定量の蛋白質加水分解物水溶液の入った容器又はタンクの中に、スラリー状にした一定量のポーラス型合成吸着剤を添加して所定時間攪拌若しくは静置するか、又はカラムに充填した一定量のポーラス型合成吸着剤に一定量の蛋白質加水分解物水溶液を所定時間接触する態様で通過させるか、いずれかの方法により行われる。
カラム法により吸着処理を行う場合には、蛋白質加水分解物水溶液と吸着剤とが接触する時間は通常、空間速度(Space Volume、以下、SVと記載する。)により表され、吸着剤一体積に対して、同体積の蛋白質加水分解物水溶液が、1時間で通過する速度がSV=1(単位;h−1)と定められており、この速度が遅いほど蛋白質加水分解物水溶液と合成吸着剤とが接触する時間が長くなり吸着性が高まるが、極端に遅い場合には生産効率が悪くなるので、通常はSV=0.5〜5h−1の範囲、望ましくは1〜3h−1の範囲で行うことが望ましい。
また、吸着処理のpHは、吸着対象物のポーラス型合成吸着剤への吸着の機序が一般に疎水性吸着に基づくため、吸着対象物が電荷をもたないpH領域で行うことが好ましく、通常、pH5〜7の範囲で吸着処理を行うことが望ましい。
更に、吸着処理の温度は、蛋白質加水分解物の物性、風味、細菌増殖等の衛生的条件が考慮されていれば、特に限定されるものではない。
また、吸着処理において、前記の2種類のポーラス型合成吸着剤は、混合して同時に使用することができ、また、個別に使用すること、即ち、平均細孔径2乃至8nmを有するポーラス型合成吸着剤又は平均細孔径20乃至30nmを有するポーラス型合成吸着剤のいずれか一方を使用して吸着処理し、引き続いて他方のポーラス型合成吸着剤を使用して吸着処理すること、のいずれの態様でも使用することができる。
【0024】
尚、ポーラス型合成吸着剤は多孔質構造であるため表面積が大きく、吸着対象物質の量に対応して使用量(接触表面積)を調整する必要がある。即ち、吸着対象物質に対してポーラス型合成吸着剤の使用量が多すぎると、吸着対象物質以外に回収目的物質まで吸着し、回収率が低下する。逆に、吸着対象物質に対してポーラス型合成吸着剤の使用量が少なすぎると、吸着対象物質の除去が不十分となり、抗原性の低下が不十分となる。
本発明の方法においては、吸着剤の使用量は、後記する試験例からも明らかなとおり、前記のとおり調製された蛋白質の分解率が30乃至45%の範囲内にある蛋白質加水分解物1g(蛋白質当量)に対して、それぞれ平均細孔径2乃至8nm及び平均細孔径20乃至30nmを有する2種類のポーラス型合成吸着剤を、その表面積が合計300乃至3000m2の範囲で使用することが低抗原性で、乳化性の良好な蛋白質加水分解物を高い回収率で製造するために必要である。 使用済の吸着剤は、酸又はアルカリ剤で洗浄することにより、吸着されている抗原性物質等の吸着対象物を容易に脱離して再生することができるので、反復使用が可能である。
尚、本発明の方法において吸着剤は、平均細孔径2乃至8nmのポーラス型合成吸着剤:平均細孔径20乃至30nmのポーラス型合成吸着剤の表面積の比において、3:7乃至7:3の範囲で使用することができ、この範囲で蛋白質の分解率に応じて変更することが望ましく、蛋白質の分解率が高い蛋白質加水分解物を吸着処理する場合には、平均細孔径2乃至8nmのポーラス型合成吸着剤の表面積の比を多くすることが望ましい。
また、本発明の方法に使用される吸着剤が、平均細孔径2乃至8nmのポーラス型合成吸着剤:平均細孔径20乃至30nmのポーラス型合成吸着剤の表面積の比において4:6乃至6:4からなることが、後記する試験例からも明らかなとおり、原料蛋白質に対する蛋白質加水分解物の回収率が一層優れることから望ましい。
【0025】
得られた蛋白質加水分解物を含有する溶液は、限外瀘過等の瀘過処理を行うことが望ましい。具体的には、6000ダルトン以下、即ち、市販の1000乃至6000ダルトンに分画分子量を有する限外瀘過膜を使用し、瀘過処理を行い、一部残存する可能性のある高分子物質を除去し、膜透過画分を回収することにより実施される。
得られた蛋白質加水分解物を含有する溶液は、そのまま使用することもでき、また、必要に応じて、この溶液を逆浸透膜法等の公知の方法により濃縮した濃縮液として使用することもでき、更に、この濃縮液を公知の方法により乾燥し、粉末として使用することもできる。
【0026】
以上の方法により、蛋白質加水分解物中に残存する抗原性物質をポーラス型疎水性合成吸着剤に効果的に吸着させることができ、原料蛋白質に対する蛋白質加水分解物の回収率を良好に保持させることができる。そして、本発明の方法によって、現時点において全ての従来技術と比較して抗原性が最も低いと考えられ実質的に抗原性を有さない、精製分離されたペプチドとは異なる蛋白質加水分解物を製造することができる。
前記本発明の方法により、本発明の蛋白質加水分解物、すなわち分解率が30乃至45%であること、数平均分子量が300以下であること、及び数平均分子量に対する重量平均分子量の比が1を超え、2以下であることを特徴とする蛋白質加水分解物を製造することができる。
【0027】
次に本発明の蛋白質加水分解物について詳細に説明する。本発明の蛋白質加水分解物は、分解率が30乃至45%であること及び数平均分子量が300以下であることにより、抗原性が低減され、良好な乳化性を有している。また、数平均分子量に対する重量平均分子量の比が2以下であることにより、ほぼ単一に近似した分子量分布を示すまで、高分子の抗原性物質等の不純物が吸着除去され、実質的に抗原性を有さない良好な性質を有する蛋白質加水分解物である。
尚、数平均分子量に対する重量平均分子量の比が1となるのは、蛋白質加水分解物が、精製分離されたペプチドに代表される単一の分子量を有する物質である場合のみである。したがって、蛋白質加水分解物の数平均分子量に対する重量平均分子量の比が1を超えると定義されたことにより、本発明の蛋白質加水分解物が、少なくとも2種類の異なる分子量を有するペプチドを含有する組成物であることが容易に理解される。
【0028】
本発明の第一の発明の蛋白質加水分解物は、良好な乳化性を有し、かつ現時点において全ての従来技術と比較して抗原性が最も低いと考えられ、実質的に抗原性がないという優れた特徴を有している。
本発明の飲食品は、上記本発明の蛋白質加水分解物を含有する飲食品である。
本発明の蛋白質加水分解物が実質的に抗原性を有していないことから、これを含む飲食品は、アレルギー予防用飲食品又はアレルギー患者用飲食品として好ましく用いられる。
本発明において、アレルギー予防用飲食品とは、アレルギー予防を目的として、乳幼児、妊産婦、免疫機能の低下した病人への蛋白質供給源として用いられる飲食品であって、この目的のために十分な程度に抗原性が低減された飲食品を指す。
また、アレルギー患者用飲食品とは、抗原性を有する飲食品を摂取するとアレルギーを発症することが明らかなアレルギー患者に対する、アレルギーを発症させないための蛋白質供給源として用いられる飲食品であって、この目的のために十分な程度に抗原性が低減された飲食品を指す。
さらに、本発明の蛋白質加水分解物が実質的に抗原性を有していないことに加え、乳化性が良好であることから、特に、調製粉乳又は調製乳の原料として好ましく用いられる。すなわち、本発明の蛋白質加水分解物を原料として得られた調製粉乳又は調製乳は、従来の低抗原性調製乳で問題であった脂肪の分離が起こらず、外観、風味、及び吸収率に優れている。
【0029】
実施例
以下、実施例及び試験例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
以下の試験例においては、次の試験方法を採用した。
(1)蛋白質の分解率算出方法
ケルダール法(日本食品工業学会編、「食品分析法」、第102ページ、株式会社光琳、昭和59年)により試料の全窒素量を測定し、ホルモル滴定法(満田他編、「食品工学実験書」、上巻、第547頁、養賢堂、1970年)により試料のホルモル窒素量を測定し、これらの測定値から分解率を次式により算出した。
分解率(%)=(ホルモル窒素量/全窒素量)×100
【0030】
(2)数平均分子量及び重量平均分子量の測定方法
高速液体クロマトグラフィーにより測定した(宇井信生ら編、「タンパク質・ペプチドの高速液体クロマトグラフィー」、化学増刊第102号、第241頁、株式会社化学同人、1984年)。
具体的には、ポリハイドロキシエチル・アスパルアミド・カラム[Poly Hydoroxyethyl Aspartamide Column:ポリ・エル・シー(Poly LC)社製。直径4.6mm及び長さ400mm]を使用し、20mM塩化ナトリウム、50mMぎ酸により溶出速度0.5ml/分で溶出した。検出はUV検出器(島津製作所社製。215nmの吸光度)を使用し、分子量分布を測定し、GPC分析システム(島津製作所製)によりデータ解析し、数平均分子量及び重量平均分子量を算出した。
【0031】
(3)抗原残存活性の測定方法
サンドウィッチELISA法により測定した(松橋直他著、「免疫学実験入門」、第160頁、学会出版センター、1985年)。
具体的には、抗原蛋白質をウサギに免疫して得たウサギ抗血清から特異IgGを精製して使用し、これを0.1M炭酸緩衝液にて希釈してポリスチレン製マイクロプレート(ヌンク社製)の各ウェルに100μlずつ分注し、37℃で2時間静置し、のち0.05%Tween20を含むPBS(以下、PBS−Tweenと記載することがある。)により洗浄した。
次いで、1%ゼラチン(バイオラド社製)を含むPBSを100μlずつ前記各ウェルに分注し、37℃で30分間静置し、のちPBS−Tweenにより洗浄した。試料及び標準蛋白質をそれぞれPBS−Tweenにより希釈し、100μlずつ前記各ウェルに分注し、37℃で1時間静置し、PBS−Tweenにより洗浄した。
ビオチン化特異IgGをPBS−Tweenにより希釈し、100μlずつ前記各ウェルに分注し、37℃で1時間静置後、PBS−Tweenにより洗浄した。ストレプトアビジン及びビオチン化ペルオキシダーゼをPBSに溶解し、100μlずつ前記各ウェルに分注し、PBS−Tweenにより洗浄した。
基質としてo−フェレンジアミン溶液を100μlずつ前記各ウェルに分注し、室温、暗所にて10分間反応させ、3M硫酸を各ウェルに50μlずつ添加し、反応を停止した。
次いで、反応生成物をマイクロプレートリーダーを用いて、反応生成物の492nmの吸光度を測定し、標準蛋白質の測定値と比較して試料の抗原残存活性を算出した。
【0032】
(4)乳化性の評価方法
試料100g、コーン油(太陽油脂社製)200g、及びレシチン(味の素社製)4gを温水(60℃)300mlに添加し、TKホモミキサー(特殊機化工業社製)を用いて予備乳化し、水を添加して総量を1000mlに調整し、これをホモジナイザー(エイ・ピイ・ブイ社製)を用いて、一段目5MPa、二段目15MPaの圧力で乳化し、得られた乳化物の脂肪分離の有無を肉眼で観察し、乳化性を次の評価基準により評価した。
良:脂肪分離なし
不良:脂肪分離あり
【0033】
(5)蛋白質加水分解物の回収率の算出方法
蛋白質加水分解物の回収率(A)は、原料蛋白質の乾燥重量(B)及び得られた蛋白質加水分解物の乾燥重量(C)に基づいて、次式により算出した。
A(%)=(C/B)×100
【0034】
実施例1
市販の牛乳乳清蛋白質濃縮物1.3kg(ミライ社製。蛋白質当量として1kg)を脱イオン水9kgに溶解し、蛋白質濃度約10%の乳清蛋白質水溶液13kgを調製した。該乳清蛋白質水溶液をプレート式熱交換器を使用して70℃で1分間加熱殺菌し、液温を53℃に調整し、10%水酸化ナトリウム水溶液及び20%炭酸カリウム水溶液を使用して、pHを9.5に調整し、パンクレアチンF(天野製薬社製)、プロテアーゼNアマノ(天野製薬社製)、及びスミチームLP20(新日本化学工業社製)をそれぞれ蛋白質1g当たり500活性単位、150活性単位、及び200活性単位の割合で添加し、蛋白質加水分解反応を開始した。15時間経過し、分解率が35%となった時点で、プレート式熱交換器を使用して120℃で15秒間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、10℃に冷却した。
この加水分解液を、分画分子量20000の限外濾過膜(日東電工社製)により濾過し、濾液を凍結乾燥し、粉末状の蛋白質加水分解物約1090g(蛋白質当量として840g)を得た。
【0035】
次いで、得られた蛋白質加水分解物全量を、脱イオン水9810gに溶解し、約10%濃度の蛋白質加水分解物水溶液10.9kgを得た。
ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径8nmを有するポーラス型合成吸着剤[ダイヤイオンHP−21(三菱化学社製)。比表面積583m2/g]及び平均細孔径26nmを有するポーラス型合成吸着剤[ダイヤイオンHP−20(三菱化学社製)。比表面積511m2/g]の2種類を、それぞれ720g(表面積42万m2)及び820g(表面積42万m2)、表面積の比を1:1の割合で混合した合計1540gの吸着剤を4l容量のアクリル製カラムに充填して使用した。
前記蛋白質加水分解物水溶液の全量を前記ポーラス型合成吸着剤充填カラムに、流速SV=3h−1、10℃の条件で通液し、前記2種類の吸着剤に蛋白質加水分解物を同時に接触させ、即ち、蛋白質加水分解物1g(蛋白質当量)に対して、2種類のポーラス型合成吸着剤の表面積が合計1000m2となる条件で接触させ、溶出液を回収し、凍結乾燥し、蛋白質加水分解物約910g(蛋白質当量として700g)を得た。
得られた蛋白質加水分解物を前記試験方法により試験した結果、数平均分子量は260であり、数平均分子量に対する重量平均分子量の比の値は1.8であり、抗原残存活性は10−8であって極めて低く、乳化性は良好で、かつ原料蛋白質に対する蛋白質加水分解物の回収率は70%と優れていた。
【0036】
実施例2
市販の牛乳カゼイン120g(ニュージーランドデイリーボード製。蛋白質当量として100g)を蒸留水880gに分散し、10%水酸化ナトリウム水溶液を使用して、pHを7.0に調整し、カゼインを完全に溶解し、蛋白質濃度約10%のカゼイン水溶液約1kgを調製した。該カゼイン水溶液を85℃で15分間加熱殺菌し、液温を50℃に調整し、10%水酸化カリウム水溶液を使用して、pHを8.5に調整し、パンクレアチンF(天野製薬社製)、アクチナーゼAS(科研ファルマ社製)、及びプロテアーゼAアマノ(天野製薬社製)をそれぞれ蛋白質1g当たり400活性単位、1250活性単位、及び250活性単位の割合で添加し、蛋白質加水分解反応を開始した。17時間経過し、分解率が38%となった時点で、90℃で20分間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、10℃に冷却した。
この加水分解液を、ケイソウ土濾過により不溶物を除去し、凍結乾燥し、粉末状の蛋白質加水分解物約93g(蛋白質当量として78g)を得た。
【0037】
次いで、得られた蛋白質加水分解物全量を、脱イオン水837gに溶解し、約10%濃度の蛋白質加水分解物水溶液930gを得た。
ポーラス型疎水性合成吸着剤として、平均細孔径4nmを有するポーラス型合成吸着剤[セパビーズSP−850(三菱化学社製)。比表面積995m2/g]及び平均細孔径26nmを有するポーラス型合成吸着剤[ダイヤイオンHP−20(三菱化学社製)。比表面積511m2/g]の2種類を、それぞれ63g(表面積62400m2)及び183g(表面積93600m2)、いわゆる表面積の比を4:6の割合で混合した合計246gの吸着剤を1000ml容量のガラス製カラムに充填して使用した。
前記蛋白質加水分解物水溶液の全量を前記ポーラス型合成吸着剤充填カラムに、流速SV=2h−1、25℃の条件で通液し、前記2種類の吸着剤に蛋白質加水分解物を同時に接触させ、即ち、蛋白質加水分解物1g(蛋白質当量)に対して、2種類のポーラス型合成吸着剤の表面積が合計2000m2となる条件で接触させ、溶出液を回収し、凍結乾燥し、蛋白質加水分解物約78g(蛋白質当量として65g)を得た。
得られた蛋白質加水分解物を前記試験方法により試験した結果、数平均分子量は258であり、数平均分子量に対する重量平均分子量の比の値は1.7であり、抗原残存活性は10−8であって極めて低く、乳化性は良好で、かつ原料蛋白質に対する蛋白質加水分解物の回収率は65%と優れていた。
【0038】
比較例1
特公昭54−36235号公報(以下、従来技術1と記載する。)の実施例1に記載された方法に従い、蛋白質加水分解物を調製した。
市販カゼイン[ハマーシュタインカゼイン、メルク社製]1kgに水9kgを加え、よく分散させ、2N水酸化ナトリウム水溶液を加え、pHを7.0に調整し、カゼインを完全に溶解し、約10%のカゼイン水溶液を調製した。該蛋白溶液を85℃15分間殺菌し50℃に冷却した。このカゼイン溶液にラクトバチルス・ヘルベティカス(ハンゼン社市販菌株)の菌体破壊凍結乾燥物(20,000活性単位/g)、局方パンクレアチン[天野製薬社製、25,000活性単位/g]及びアマノA[天野製薬社製、80.000活性単位/g]をそれぞれ蛋白質1g当り1000活性単位ずつ、3種の酵素の活性単位の数の総和で3000の割合で加え、50℃で24時間保持してカゼインを分解した後、80℃で15分間加熱して酵素を失活させ、冷却し約9.5lのカゼイン分解液を得た。
【0039】
比較例2
特公昭62−61039号公報(以下、従来技術2と記載する。)の実施例2に記載された方法に従い、蛋白質加水分解物を調製した。
乳漿蛋白質を、限外ろ過膜としてカットオフ5000の膜を用いた酵素反応器において連続的に酵素分解した。条件は、40℃、pH8.5、初期蛋白質含有量84.4g/l、使用した塩基2HKOH、酵素/基質の比11.8%、予備加水分解期間2時間、反応器に供給する溶液の蛋白質含有量45.5g/lとした。
比較例3
特公平7−73507号公報(以下、従来技術3と記載する。)の実施例1に記載された方法に従い、蛋白質加水分解物を調製した。
市販カゼイン200gを10%水酸化ナトリウムを使用し、pH8.0に調製し10wt%となるように溶解した。90℃10分間加熱殺菌後、45℃に調整し、パンクレアチンF(天野製薬)10g、プロテアーゼN「アマノ」(天野製薬)2g、ラクトバチルス・ヘルベティカス菌体抽出物(1g当り20000活性単位)4gを加え45℃で24時間酵素加水分解した。90℃5分間加熱失活後、ろ過により沈澱物を除去した。これを凍結乾燥し凍結乾燥品170gを得た。この凍結乾燥品18gを20wt%水溶液とし、不溶解物を除去した後、Sephadex G−10 10×20cmカラムで溶出した。溶出液には、イオン交換水を使用し、流速は10ml/分とした。溶出量200〜500mlを分画し、凍結乾燥し、乾燥物6gを得た。
【0040】
比較例4
特許第2959747号公報(以下、従来技術4と記載する。)の実施例1に記載された方法に従い、蛋白質加水分解物を調製した。
純度75%の乳清蛋白質粉末(カリフォルニア・プロテイン社製)1kgを、脱イオン水9kgに溶解し、75℃に15秒間保持して殺菌し、pHを9.0に調整し、プロテアーゼNアマノ(アマノ製薬社製)180万PUN単位(乳清蛋白質当り2400PUN単位)及びラクトバシラス・ヘルベティカス菌体破砕物6.8万活性単位(乳清蛋白質1g当り90活性単位)を添加し、50℃に保持して加水分解し、バイオテックアナライザー(旭化成工業社製)を用いて経時的に遊離リジンの量を測定し、遊離リジン量が14%に達した時点で、80℃で6分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、のちクエン酸でpHを6.0に調整し、分画分子量10,000の限外ろ過膜(日東電工社製)で限外ろ過し、乳清蛋白質加水分解物を5.9%含有する溶液約16kgを得た。
【0041】
比較例5
特開平8−228692号公報(以下、従来技術5と記載する。)の実施例1に記載された方法に従い、蛋白質加水分解物を調製した。
市販のカゼイン(ニュージーランドデイリーボード社製)1kgに水9kgを加え、よく分散させ、10%水酸化ナトリウム水溶液を添加して、溶液のpHを7.0に調整し、カゼインを完全に溶解し、濃度約10%のカゼイン水溶液を調製した。該カゼイン水溶液を85℃で10分間加熱殺菌し、50℃に温度調整し、水酸化ナトリウムを添加してpHを9.5に調整した後、ビオプラーゼsp−20(長瀬生化学工業社製)1,008,000活性単位(蛋白質1g当り1,200活性単位)、プロテアーゼN(天野製薬社製)1,680,000活性単位(蛋白質1g当り2,000活性単位)、及びPTN6.0S(ノボ・ノルディスク社製)5,880,000活性単位(蛋白質1g当り7,000活性単位)を添加して、加水分解反応を開始し、経時的にカゼインの分解率及びL−アミノ酸センサー[バイオテックアナライザー(旭化成工業社製)]により16種類のアミノ酸のモル数の合計の測定される測定値をそれぞれ測定し、カゼインの分解率が24.1%及びL−アミノ酸センサーによる測定値が6.0mMに達した時点で80℃で6分間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、10℃に冷却した。この加水分解液にろ過助剤としてスタンダードスーパーセル(東京珪藻土社製)を加え、吸引ろ過し、次いで、得られたろ過液を常法により濃縮、噴霧乾燥し、噴霧乾燥品0.96kgを得た。
【0042】
比較例6
特開平7−203844号公報(以下、従来技術6と記載する。)の実施例2に記載された方法に従い、蛋白質加水分解物を調製した。
市販のWPC(蛋白質含量85%、デンマークプロテイン社製)3kgを17kgの精製水に溶解し、プレート型殺菌装置で75℃で15秒間殺菌し、のち水酸化カリウムを添加して溶液のpHを8.0に調整し、蛋白質1g当りビオプラーゼ(長瀬産業社製)1,000PUN単位、トリプシン(ノボ社製)10,000USP単位、パパイン(天野製薬社製)2,000PUN単位及びプロテアーゼAアマノ(天野製薬社製)200PUN単位の割合で添加し、50℃で12時間分解した。分解後の分解液のpHが6.4であったので、水酸化ナトリウムを添加してpHを7.3に調整し、のちプレート型殺菌装置を用いて85℃で5分間、130℃で2秒間加熱して酵素を失活させ、次いで常法により濃縮し、乾燥し、粉末状の乳清蛋白質分解物約3kgを得た。
【0043】
試験例1
この試験は、従来技術と比較して本発明の蛋白質加水分解物及びその製造方法が優れていることを示すために行った。
(1)試料
下記の7種類の試料を用いた。
・本発明の実施例1の方法により製造した蛋白質加水分解物
・比較例1の方法(従来技術1の実施例1と同一の方法)により製造した蛋白質加水分解物
・比較例2の方法(従来技術2の実施例2と同一の方法)により製造した蛋白質加水分解物
・比較例3の方法(従来技術3の実施例1と同一の方法)により製造した蛋白質加水分解物
・比較例4の方法(従来技術4の実施例1と同一の方法)により製造した蛋白質加水分解物
・比較例5の方法(従来技術5の実施例1と同一の方法)により製造した蛋白質加水分解物
・比較例6の方法(従来技術6の実施例2と同一の方法)により製造した蛋白質加水分解物
【0044】
(2)試験方法
各試料の蛋白質の分解率、数平均分子量、数平均分子量に対する重量平均分子量の比の値(Mw/Mn)、抗原残存活性、及び乳化性を、いずれも前記の試験方法により試験した。
(3)試験結果
この試験の結果は、表1に示すとおりである。表1から明らかなとおり、従来技術の比較例1〜6に比較して本発明の実施例1の蛋白質加水分解物は、抗原残存活性が極めて低く、かつ乳化性に優れていることが判明した。
尚、本発明の試料については、原料蛋白質の種類、蛋白質の分解率を30乃至45%の範囲で、数平均分子量が300以下の範囲で、又はMw/Mnを1を超え、2以下の範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【0045】
【表1】
【0046】
試験例2
この試験は、抗原残存活性及び乳化性を指標として、蛋白質加水分解物の適正な分解率を調べるために行った。
(1)試料の調製
酵素反応の停止時期を変更して、表2に示すとおり、原料蛋白質の分解率を段階的に変更したことを除き、実施例1と同一の方法により4種類の試料(実施例3及び4、並びに比較例7及び8)を調製した。
(2)試験方法
各試料の蛋白質の分解率、数平均分子量、数平均分子量に対する重量平均分子量の比の値(Mw/Mn)、抗原残存活性、及び乳化性を、いずれも前記の試験方法により試験した。
【0047】
(3)試験結果
この試験の結果は、表2に示すとおりである。表2から明らかなとおり、抗原残存活性が極めて低く、かつ乳化性に優れた蛋白質加水分解物を製造するためには、原料蛋白質の分解率を30乃至45%の範囲内とすることが必要であることが判明した。
また、数平均分子量が300以下の範囲である場合に、抗原残存活性が極めて低く、乳化性を考慮すると数平均分子量が200以上であることが望ましいことが示された。
尚、原料蛋白質の種類、又はMw/Mnを1を超え、2以下の範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【0048】
【表2】
【0049】
試験例3
この試験は、抗原残存活性、乳化性、及び回収率を指標として、ポーラス型疎水性合成吸着剤の平均細孔径の大きさ及びその組合せを調べるために行った。
(1)試料の調製
平均細孔径の大きさの異なる各種の市販ポーラス型合成吸着剤を使用して、ポーラス型合成吸着剤の平均細孔径の大きさ及びその組合せを変更したことを除き、実施例1と同一の方法により次に示す28種類の試料(実施例5乃至8、及び比較例9乃至32)を調製した。
【0050】
実施例5: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径2nmを有するポーラス型合成吸着剤(商品名セパビーズSP−825、三菱化学社製)及び平均細孔径20nmを有するポーラス型合成吸着剤(商品名セパビーズHP−2MG、三菱化学社製)の2種類を使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した本発明の蛋白質加水分解物
【0051】
実施例6: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径2nmを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径30nm(商品名セパビーズSP−206、三菱化学社製)を有するポーラス型合成吸着剤の2種類を使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した本発明の蛋白質加水分解物
【0052】
実施例7: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径8nmを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径20nmを有するポーラス型合成吸着剤の2種類を使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した本発明の蛋白質加水分解物
【0053】
実施例8: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径8nmを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径30nmを有するポーラス型合成吸着剤の2種類を使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した本発明の蛋白質加水分解物
【0054】
比較例9: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径1nmを有するポーラス型合成吸着剤(商品名セパビーズSP−205、三菱化学社製)を単独で使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0055】
比較例10: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径2nmを有するポーラス型合成吸着剤を単独で使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0056】
比較例11: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径8nmを有するポーラス型合成吸着剤を単独で使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0057】
比較例12: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径10nmを有するポーラス型合成吸着剤(商品名セパビーズSP−207、三菱化学社製)を単独で使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0058】
比較例13: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径20nmを有するポーラス型合成吸着剤を単独で使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0059】
比較例14: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径30nmを有するポーラス型合成吸着剤を単独で使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0060】
比較例15: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径40nmを有するポーラス型合成吸着剤(商品名アンバーライトX4D−9、ローム&ハース社製)を単独で使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0061】
比較例16: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径1nmを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径2nmを有するポーラス型合成吸着剤の2種類を使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0062】
比較例17: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径1nmを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径8nmを有するポーラス型合成吸着剤の2種類を使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0063】
比較例18: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径1nmを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径10nmを有するポーラス型合成吸着剤の2種類を使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0064】
比較例19: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径1nmを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径20nmを有するポーラス型合成吸着剤の2種類を使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0065】
比較例20: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径1nmを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径30nmを有するポーラス型合成吸着剤の2種類を使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0066】
比較例21: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径1nmを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径40nmを有するポーラス型合成吸着剤の2種類を使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0067】
比較例22: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径2nmを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径8nmを有するポーラス型合成吸着剤の2種類を使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0068】
比較例23: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径2nmを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径10nmを有するポーラス型合成吸着剤の2種類を使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0069】
比較例24: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径2nmを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径40nmを有するポーラス型合成吸着剤の2種類を使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0070】
比較例25: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径8nmを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径10nmを有するポーラス型合成吸着剤の2種類を使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0071】
比較例26: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径8nmを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径40nmを有するポーラス型合成吸着剤の2種類を使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0072】
比較例27: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径10nmを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径20nmを有するポーラス型合成吸着剤の2種類を使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0073】
比較例28: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径10nmを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径30nmを有するポーラス型合成吸着剤の2種類を使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0074】
比較例29: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径10nmを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径40nmを有するポーラス型合成吸着剤の2種類を使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0075】
比較例30: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径20nmを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径30nmを有するポーラス型合成吸着剤の2種類を使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0076】
比較例31: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径20nmを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径40nmを有するポーラス型合成吸着剤の2種類を使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0077】
比較例32: ポーラス型合成吸着剤として、平均細孔径30nmを有するポーラス型合成吸着剤及び平均細孔径40nmを有するポーラス型合成吸着剤の2種類を使用したことを除き、実施例1と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【0078】
(2)試験方法 各試料の抗原残存活性、乳化性、及び回収率を、いずれも前記の試験方法により試験した。
(3)試験結果
この試験の結果は、表3に示すとおりである。表3から明らかなとおり、抗原残存活性が極めて低く、かつ乳化性に優れた蛋白質加水分解物を、60%以上の高回収率で製造するためには、それぞれ平均細孔径2乃至8nm及び平均細孔径20乃至30nmを有する2種類のポーラス型合成吸着剤を使用することが必要であることが判明した。
尚、原料蛋白質の種類、蛋白質の分解率を30乃至45%の範囲で、又は前記2種類のポーラス型合成吸着剤の合計使用面積を、原料蛋白質を、分解率が30乃至45%の範囲で加水分解し、得られた蛋白質加水分解物1g(蛋白質当量)に対して、300乃至3000m2の範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【0079】
【表3】
【0080】
試験例4
この試験は、抗原残存活性及び回収率を指標として、ポーラス型合成吸着剤の使用表面積、並びに蛋白質加水分解物の適正な数平均分子量に対する重量平均分子量の比を調べるために行った。
(1)試料の調製
表4に示すとおり、蛋白質加水分解物1g(蛋白質当量)に対するポーラス型合成吸着剤の使用表面積(m2)を変更したことを除き、実施例1と同一の方法により4種類の試料(実施例9及び10、並びに比較例33及び34)を調製した。
(2)試験方法
各試料の数平均分子量に対する重量平均分子量の比の値(Mw/Mn)、抗原残存活性、及び回収率を、いずれも前記の試験方法により試験した。
【0081】
(3)試験結果
この試験の結果は、表4に示すとおりである。表4から明らかなとおり、抗原残存活性が極めて低く、回収率に優れた蛋白質加水分解物の製造方法においては、原料蛋白質を、分解率が30乃至45%の範囲で加水分解し、得られた蛋白質加水分解物1g(蛋白質当量)に対して、それぞれ平均細孔径2乃至8nm及び平均細孔径20乃至30nmを有する2種類のポーラス型合成吸着剤を、その表面積が合計300乃至3000m2の範囲で使用することが必要であることが判明した。また、蛋白質加水分解物の数平均分子量に対する重量平均分子量の比が2以下である場合に、抗原残存活性が極めて低いことが判明した。
尚、原料蛋白質の種類、蛋白質の分解率を30乃至45%の範囲で、数平均分子量が300以下の範囲で、又はポーラス型合成吸着剤の平均細孔径の大きさ及びその組合せを、それぞれ平均細孔径2乃至8nm及び平均細孔径20乃至30nmを有する2種類のポーラス型疎水性合成吸着剤を組合せて使用する範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【0082】
【表4】
【0083】
試験例5
この試験は、抗原残存活性及び回収率を指標として、平均細孔径2乃至8nmのポーラス型合成吸着剤:平均細孔径20乃至30nmのポーラス型合成吸着剤の表面積の比の望ましい範囲を調べるために行った。
(1)試料の調製
表5に示すとおり、平均細孔径8nmのポーラス型合成吸着剤:平均細孔径26nmのポーラス型合成吸着剤の表面積の比を変更したことを除き、実施例1と同一の方法により4種類の試料(実施例11及び12、並びに比較例35及び36)を調製した。
(2)試験方法
各試料の抗原残存活性及び回収率を、いずれも前記の試験方法により試験した。
【0084】
(3)試験結果
この試験の結果は、表5に示すとおりである。表5から明らかなとおり、抗原残存活性が極めて低い蛋白質加水分解物を、一層高い回収率で製造するためには、平均細孔径2乃至8nmのポーラス型合成吸着剤:平均細孔径20乃至30nmのポーラス型合成吸着剤の表面積の比率が、面積比で4:6乃至6:4の範囲であることが望ましいことが判明した。
尚、原料蛋白質の種類、蛋白質の分解率を30乃至45%の範囲で、ポーラス型合成吸着剤の平均細孔径の大きさ及びその組合せを、それぞれ平均細孔径2乃至8nm及び平均細孔径20乃至30nmを有する2種類のポーラス型合成吸着剤を組合せて使用する範囲で、又は前記2種類のポーラス型合成吸着剤の合計使用面積を、原料蛋白質を、分解率が30乃至45%の範囲で加水分解し、得られた蛋白質加水分解物1g(蛋白質当量)に対して、300乃至3000m2の範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【0085】
【表5】
【0086】
実施例13
実施例1と同一の方法により製造された蛋白質加水分解物25kg、ラクトース(メグレ社製)68kg、ラフィノース(日本甜菜製糖社製)1120g、マルツデキストリン(松谷化学工業社製)14.6kg、ミネラル混合物(富田製薬社製)920g、及びビタミン混合物(田辺製薬社製)35gを精製水300kgに溶解し、これにコハク酸モノグリセリド(花王社製)450g及び調整脂肪(太陽油脂社製)40kgを添加し、均質化し、120℃で2秒間殺菌し、濃縮し、噴霧乾燥し、アレルギー予防用粉乳約145kgを得た。
得られたアレルギー予防用粉乳を14%濃度で調乳したミルクは、乳化性及び風味が良好であり、蛋白質成分の抗原残存活性が極めて低いことから、アレルギー予防用飲料に好適であった。
【0087】
実施例14
実施例2と同一の方法により製造された蛋白質加水分解物16kg、ラクチュロース(森永乳業社製)500g、ラフィノース(日本甜菜製糖社製)500g、マルトデキストリン(松谷化学工業社製)62kg、タピオカ澱粉(松谷化学工業社製)3kg、ミネラル混合物(富田製薬社製)920g、及びビタミン混合物(田辺製薬社製)35gを精製水620kgに溶解し、これに調整脂肪(太陽油脂社製)20kgを添加し、均質化し、80℃で6分間殺菌し、アレルギー患者用調製乳約600kgを得た。
得られたアレルギー患者用調製乳は、乳化性及び風味が良好であり、蛋白質成分の抗原残存活性が極めて低いことから、アレルギー患者用飲料に好適であった。
【0088】
実施例15
7kgの温水(60℃)に、実施例1と同一の方法により製造された蛋白質加水分解物5kg及びデキストリン(参松工業社製)15kgを添加し、TKホモミキサー(特殊機化工業社製)を用いて溶解、分散させ、液状物を調製した。
前記液状物に、コハク酸モノグリセリド(花王社製)140g、調整脂肪(太陽油脂社製)2.2kg、ミネラル混合物(富田製薬社製)400g、及びビタミン混合物(田辺製薬社製)20gを添加し、TKホモミキサー(特殊機化工業社製)を用いて予備乳化し、水を添加して総量を100kgに調整した。
次いで、予備乳化物を高圧ホモジナイザー(マントンゴーリン社製)を用いて、一段目5MPa、二段目50MPaの2段階処理を5回反復して均質化し、液状流動食約92kgを調製した。
液状流動食約11kgを、レトルトパウチ(東洋製罐社製)に200mlずつ充填し、のちレトルト殺菌機(日阪製作所社製)により125℃で10分間殺菌し、アレルギー患者用液状流動食50個を調製した。
得られたアレルギー治療用液状流動食は、乳化性及び風味が良好であり、蛋白質成分の抗原残存活性が極めて低いことから、アレルギー患者用飲食品に好適であった。
【0089】
産業上の利用可能性
本発明の蛋白質加水分解物の製造方法は、原料蛋白質に対する蛋白質加水分解物の回収率を良好に保持して、アレルギー発症の素因を有する者に対して使用可能な低抗原性で乳化性に優れた蛋白質加水分解物を製造することができる。
本発明の蛋白質加水分解物は、良好な乳化性を有し、実質的に抗原性を有さないことから、アレルギー発症の予防及びアレルギー患者のための食品又は飲料へ応用可能である。
本発明の蛋白質加水分解物を含有する飲食品は、乳化性及び風味が良好であり、蛋白質成分の抗原残存活性が極めて低いことから、低抗原性調製乳及び調製粉乳などのアレルギー発症の予防食及びアレルギー患者用蛋白質源として有用である。具体的には、調製粉乳、調製乳、栄養補助食品、病態栄養食、流動食等の各種飲食品を例示することができる。
Claims (7)
- 少なくとも2種類のペプチドを含有する蛋白質加水分解物において、前記蛋白質がカゼインまたは乳清蛋白質であり、蛋白質の分解率が30乃至45%であり、含有されるペプチドの数平均分子量が300以下であり、かつ該数平均分子量に対する重量平均分子量の比が1を超え2以下であることを特徴とする蛋白質加水分解物。
- カゼインまたは乳清蛋白質からなる原料蛋白質を、分解率が30乃至45%の範囲で加水分解する工程と、得られた加水分解物の蛋白質当量1gに対して、2乃至8nmの範囲の平均細孔径、及び20乃至30nmの範囲の平均細孔径を有する2種類のポーラス型合成吸着剤を、それらの表面積の合計が300乃至3000m2の範囲で、同時又は個別に接触させ、非吸着成分を回収する工程とを含むことを特徴とする蛋白質加水分解物の製造方法。
- 前記2乃至8nmの範囲の平均細孔径を有するポーラス型合成吸着剤と前記20乃至30nmの範囲の平均細孔径を有するポーラス型合成吸着剤が、その表面積の比において4:6乃至6:4の範囲で用いられる、請求項2記載の蛋白質加水分解物の製造方法。
- 請求項1記載の蛋白質加水分解物を含有することを特徴とする飲食品。
- 乳由来の蛋白質を原料蛋白質として得られた調製乳又は調製粉乳である、請求項4記載の飲食品。
- アレルギー予防用飲食品又はアレルギー患者用飲食品である、請求項4記載の飲食品。
- アレルギー予防用飲食品若しくはアレルギー患者用飲食品中の、又はその製造における、請求項1記載の蛋白質加水分解物の使用。
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