JP2887302B2 - カゼインホスホオリゴペプチド混合物、その製造法、及び該混合物を含有する健康食品 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、カルシウム不溶化防止
効果の高いカゼインホスホオリゴペプチド混合物、その
製造法、及びカゼインホスホオリゴペプチド混合物を含
有するカルシウム不溶化防止効果の高い健康食品に関す
る。

【０００２】本明細書において、百分率は特に断りのな
い限り重量によるものである。

【０００３】

【従来の技術】最近、日本人のカルシウム摂取量が不足
しているとの指摘がなされており、特に学童、妊産婦、
中高年齢の女性のカルシウム摂取不足が問題となってい
る。カルシウムの不足は種々の疾患を惹起し、特に骨粗
鬆症に起因する骨折は深刻化している。骨粗鬆症は、カ
ルシウム摂取量が少ないことにも起因しているが、摂取
したカルシウムの消化管における低い吸収性にも原因が
あるとも言われている。カルシウムが吸収される小腸内
のｐＨは中性から弱アルカリ性であり、カルシウムが沈
殿又は不溶化し易い状態にある。

【０００４】一方、カゼインをトリプシンで加水分解し
て得られるカゼインホスホペプチド（以下、ＣＰＰと記
載することがある）が、カルシウムの吸収を促進する作
用を有することは、既に知られている（化学と生物、第
１８巻、第５５１ページ、１９８０年）。 ＣＰＰの製
造法については、特開昭５６ー１２３９２１号公報、特
開昭５９ー１５９７９２号公報、特開昭５９ー１５９７
９３号公報、特開平２ー２５７８５４号公報、特公平２
ー７６１６号公報等に記載されている。従来知られてい
るＣＰＰは、分子量が約３１００、又は約４５００であ
り、比較的分子量が大きく、２０００が下限値であっ
た。

【０００５】ＣＰＰを更に加水分解し、リン酸基が結合
した低分子量のペプチド（以下、このペプチドをカゼイ
ンホスホオリゴペプチドと言い、ＣＰＯＰと記載するこ
とがある）については、従来殆ど知られておらず、リン
カゼインの１価陽イオン塩、またはその誘導体を含有す
るカゼインをベースとした物質を処理する方法（特公平
２ー５１５８０号公報、以下、この公報を文献１と記載
する。）が知られているのみである。文献１において
は、加水分解物を限外濾過し、分子量２０００〜５００
００、望ましくは２０００〜１００００の画分を採取し
ている。

【０００６】一方、ＣＰＰの製造を目的としないカゼイ
ンの加水分解方法は、多数開示されており、枚挙にいと
まがないが、本発明に関して適切と思われる文献には下
記のものがある。

【０００７】特公昭５４ー３６２３５号公報（以下、文
献２と呼ぶ）には、乳酸菌菌体破砕物又は該破砕物から
抽出した蛋白質分解酵素、パンクレアチン、及びアスペ
ルギルス属に属する微生物から得た蛋白質分解酵素、の
３種の酵素混合物を蛋白質溶液に加え、４０〜５５℃に
保持し、全窒素量の少なくとも４０％のアミノ態窒素が
生成するまで蛋白質を加水分解して、苦味及び抗原性の
ない蛋白質分解物の製造方法が開示されている。

【０００８】更に特開平２ー１３８９９１号公報（以
下、文献３と呼ぶ）には、蛋白質を酵素で加水分解し、
分解物を分画し、分子量１０００以下、遊離アミノ酸含
量２０％以下、及び芳香族アミノ酸含量が全アミノ酸含
量の１．０％以下の、抗原性のないペプチド組成物の製
造法が開示されている。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】限外濾過により分画し
た文献１のペプチドは、分子量が２０００以上であり、
文献２の加水分解物は、ＣＰＰとは無関係な食餌アレル
ギーの予防又は治療に有効な蛋白源として利用し得る抗
原性及び苦味のないペプチドであり、文献３のペプチド
は、文献２の加水分解物の浸透圧、風味、消化吸収を改
良したペプチドであって、ペプチドに結合しているリン
含量の多寡及びカルシウム不溶化防止に関しては何等考
慮されていない。

【００１０】本発明の課題は、リン含量が高く、カルシ
ウム不溶化防止効果を有し、抗原性がなく、更に風味が
良好なＣＰＯＰ混合物、その製造法及びＣＰＯＰ混合物
を含有する健康食品を提供することである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明の一局面において
は、カゼインを少なくとも２種の蛋白質分解酵素により
加水分解し、該加水分解物からリン含量が高く，カルシ
ウム不溶化防止効果を有し、抗原性がなく、更に風味が
良好なカゼインホスホオリゴペプチド混合物（分子量が
５００〜１０００の画分）を採取する。それによって得
られたカゼインホスホオリゴペプチド混合物は下記の理
化学的特性を有する。 （ａ） 分子量分布が５００〜１０００である （ｂ） 窒素／リンの分子数比が５．０以下である （ｃ） アミノ酸残基の数が５〜１０であって、グルタ
ミン酸，セリン，アスパラギン酸，イソロイシンを主た
る構成アミノ酸としている （ｄ） カルシウム不溶化防止効果を有する （ｅ） エライザ（ELISA: Enzyme linked immunosorbe
nt assay）抑制試験法（以下、単にエライザ試験法と略
称する）により測定した抗原性残存活性が１０^-5以下で
ある。

【００１２】本発明の他の局面においては、上記カゼイ
ンホスホオリゴペプチド混合物を含有する健康食品が提
供される。

【００１３】本発明の方法においては、カゼインホスホ
オリゴペプチド混合物の原料として各種酸カゼイン、カ
ゼインナトリウム、カゼインカルシウム等の市販品、及
び牛乳，脱脂乳等を用いることができる。

【００１４】牛乳，脱脂乳等は、そのまま蛋白質分解酵
素により加水分解し、原料カゼイン物質は５〜１８％，
望ましくは１０〜１５％濃度の水性溶液として蛋白質分
解酵素により加水分解する。

【００１５】本発明の方法においては、下記の酵素から
選択された少なくとも２種の酵素を組み合わせて用い
る。好ましくは、パンクレアチンとエキソペプチダーゼ
との組み合わせ、パンクレアチンとエキソペプチダーゼ
と他のプロテアーゼとの組み合わせを用いる。使用され
るエキソペプチダーゼとしては、カルボキシペプチダー
ゼ，アスペルギルス・プロテアーゼ，ストレプトコッカ
ス・プロテアーゼ，リゾープス・プロテアーゼ，乳酸菌
プロテアーゼ等があり、その他のプロテアーゼとして
は、例えば、トリプシン，キモトリプシン，ズブチリシ
ン，エラスターゼ，プロリン特異性プロテアーゼ，スタ
フィロコッカス・プロテアーゼ，パパイン，ペプシン，
サーモリシンが含まれる。

【００１６】酵素の使用量は、制限的ではないが、蛋白
質分解酵素の活性単位の総和が蛋白質１ｇ当たり１２０
０〜６０００単位の範囲、望ましくは１５００〜５００
０単位の範囲で用いるのが良い。酵素処理は、制限的で
はないが、ｐＨ５．０〜８．０、望ましくは６．５〜
７．５の範囲で、４０〜５５℃、望ましくは４５〜５２
℃の温度で、１２時間以上、望ましくは１６〜１８時間
保持して行うが、浸透圧の改善の観点から過度の分解を
避けるのが望ましく、酵素反応の停止は加熱により行う
のが良い。

【００１７】得られた加水分解物から、本発明の目的と
する分子量５００〜１０００の画分を分別する方法とし
ては、分子量分画が望ましい。分子量分画には、限外濾
過、ゲル濾過等の方法が採用できるが、目的とする分画
の厳密で効率的な回収の観点からゲル濾過が特に推奨さ
れる。尚、分子量分画は、必要に応じ反復して不要な分
子量のペプチドの除去率を高めることができる。ゲル濾
過は、排除限界分子量１００００以下、望ましくは１０
００以下のゲル濾過剤を使用するが、望ましくは、芳香
族アミノ酸に吸着性を有する疎水性側鎖（例えば、カル
ボキシル基、ブチル基、フェニル基等）又は疎水的部位
を有するゲル濾過剤［例えば、オクチルセファロースＣ
Ｌ−４Ｂ、フェニルセファロースＣＬ−４Ｂ、ブチルセ
ファロース４Ｂ（何れもファルマシア社製）］を使用す
る。溶出液は水又は芳香族アミノ酸に吸着性を高めるた
めに２〜１５％濃度のエタノール溶液を用い、カラム高
１０〜３０ｃｍのカラムで分画する。

【００１８】得られた分画からのＣＰＯＰ混合物の精製
は下記の通りである。得られた分画を陰イオン交換体、
望ましくは弱塩基性陰イオン交換体〔例えば、ＤＥＡＥ
セファデックスＡ−２５（ファルマシア社製）等〕に吸
着させ、１．０〜５．０％、望ましくは２．０〜４．０
％の塩溶液（例えば、食塩水溶液）を通液し、ＣＰＯＰ
混合物を溶出させる。得られた溶出液を公知の方法で脱
塩し、濃縮し、液状のＣＰＯＰ混合物を得る。濃縮後、
公知の方法で乾燥し、粉末状のＣＰＯＰ混合物を得るこ
ともできる。

【００１９】かくて得られたＣＰＯＰ混合物は下記の理
化学的性状を有する。 （１） アミノ酸残基数が５〜１０であり （２） 主たる構成アミノ酸はグルタミン酸、セリン、
アスパラギン酸、イソロイシンであり （３） 分子量分布が５００〜１０００であり （４） 窒素／リンの分子数比が５．０以下であり （５） エライザ試験法で測定した抗原残存活性が１０
^-5以下であり （６） カルシウム不溶化防止効果を有し （７） 従来のＣＰＰの約２倍のリンを含有している
（試験例１〜３を参照）。 本発明のＣＰＯＰを含有する健康食品は、菓子（錠菓、
ドロップ等のキャンデー、ビスケット，クラッカー，ウ
エハース等の焼菓子類、チョコレート、チューインガ
ム、スナック類等）、飲料（牛乳，加工乳，乳飲料，豆
乳，発酵乳，乳酸菌飲料，清涼飲料等）等の外、あらゆ
る食品であって良い。

【００２０】ＣＰＯＰを含有する健康食品を製造する場
合、その食品原料にＣＰＯＰを添加混合し、その食品の
通常の製法に従って製造することができ、また製品に直
接添加，混合することもできる。ＣＰＯＰそのものに苦
味，臭気，抗原性がなく、安全性が高いので、ＣＰＯＰ
の添加量には制限はない。しかし、製造コストの点か
ら、菓子類の場合１〜２０％、飲料の場合１〜１０％の
割合が一応の目安となる。 次に、試験例を示して、本
発明を詳述する。

【００２１】［試験例１］この試験は、カゼイン加水分
解物のカルシウム不溶化防止効果を調べるために行っ
た。

【００２２】（１）試料の調製 試料１：実施例１と同一の方法によりＣＰＯＰ混合物を
調製した。

【００２３】試料２：市販の乳酸カゼイン（ニュージー
ランド産）１ｋｇを１０％の濃度で水に溶解し、ｐＨを
８．５に調整し、豚の結晶トリプシン（ノボインダスト
リー社製）を基質に対して０．１％添加し、５１℃で３
０分間保持した後、８０℃で１０分間加熱して酵素を失
活させ、常法により濃縮し、乾燥して、従来のＣＰＰを
調製した。

【００２４】試料３：試料２と同一の方法で調製した加
水分解物を含有する液（酵素を失活させたもの）から両
イオン交換樹脂（北越炭素社製ＫＳ−３５）で苦味を除
去し、常法により濃縮，乾燥してＣＰＰを調製した。

【００２５】試料４：試料２と同一の方法で調製した加
水分解物を含有する液（酵素を失活させたもの）から不
純物をセライトを用いて濾過除去し、５０％エタノール
の存在下で１％のカルシウムを添加して沈澱を回収し、
乾燥してＣＰＰを調製した。

【００２６】（２）試験方法 次の各種溶液を調製した。 塩化カルシウム溶液：試薬特級の塩化カルシウム（和光
純薬工業社製）を精製水に２０ｍＭの濃度で溶解した。 試料溶液 ：試料１〜４をそれぞれ表１に示すよ
うに０〜１０ｍｇ／ｍｌの割合で精製水に溶液した。 リン酸緩衝液 ：２０ｍＭの濃度（ｐＨ７．０）に調
製した。 希塩酸溶液 ：０．１Ｎの濃度に調製した。

【００２７】塩化カルシウム溶液１ｍｌと試料溶液１ｍ
ｌを試験管に取り、リン酸緩衝液２ｍｌを添加し、３７
℃で２時間保持した。反応液をフィルター（０．４５μ
ｍ）で濾過し、濾液０．５ｍｌに希塩酸溶液０．１ｍｌ
を添加し、濾液のカルシウム量を平沼Ｃａ−Ｍｇカウン
ター（平沼産業社製）で測定した。最初に添加した塩化
カルシウム溶液中のカルシウム量に対する，最初に添加
した塩化カルシウム溶液中のカルシウム量と濾液中のカ
ルシウムの量との差、の百分率を算出し、各試料のカル
シウムの可溶化率を測定した。

【００２８】（３）試験結果 この試験の結果は表１に示すとおりであった。表１から
明らかなように、試料１（本発明のＣＰＯＰ混合物）
は、試料２及び試料３（何れも精製されていない従来の
ＣＰＰ）と比較して、低い濃度において顕著に高いカル
シウム不溶化防止効果（換言すれば高い可溶化率）が認
められ、試料４（高度に精製された従来のＣＰＰ）と比
較しても同等濃度で本発明のＣＰＯＰ混合物の方が高い
カルシウム不溶化防止効果を有することが確認された。

【００２９】

【表１】 ［試験例２］この試験は、ＣＰＯＰ混合物の抗原性を調
べるために行った。

【００３０】（１）試料の調製 試料１ ：実施例１により調製した本発明のＣＰＯＰ混
合物 試料２ ：試験例１の試料４と同一の方法で調製した従
来のＣＰＰ試料 （２）試験方法 抗原残存活性をエライザ試験法により測定した。９６穴
プレート（ヌンク社製）にカゼインをコーティングし、
洗浄し、ウサギ抗カゼイン血清と試料との混合液をプレ
ートの穴に供給して反応させ、洗浄後アルカリホスファ
ターゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ツァイメド・ラボ
ラトリー社製）を反応させた後、洗浄し、ｐ−ニトロフ
ェニルリン酸ナトリウムを添加し、３０分後に５Ｎ水酸
化ナトリウムを添加して反応を停止させ、反応生成物を
マイクロプレートリーダー（ＭＴＰ−３２。コロナ電気
社製）で測定した。

【００３１】（３）試験結果 試料１の抗原残存活性は１０^-5、試料２の抗原残存活性
は１０^-2であった。即ち、本発明のＣＰＯＰ混合物（試
料１）は、実質的に抗原活性がない（極めて低い）こと
が判明した。

【００３２】［試験例３］この試験は、カルシウムの可
溶化率及び抗原残存活性以外のＣＰＯＰ混合物の理化学
的性質を調べるために行った。

【００３３】（１）試料の調製 実施例１と同一の方法により調製したＣＰＯＰ混合物を
試料とした。

【００３４】（２） 試験方法 １）分子量分布 試料の分子量分布を高速液体クロマトグラフィー（宇井
信生等編、「タンパク質・ペプチドの高速液体クロマト
グラフィー」、化学増刊第１０２号、第２４１ページ、
株式会社化学同人、１９８４年）により次の条件で測定
し、分子量５００未満のペプチド画分が全ペプチドに占
める割合を算出した。

【００３５】ポンプ：Ｓｈｉｍａｚｕ ＬＣ７Ａ（島津
製作所社製） 検出器：Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ ＳＥ−６１（昭和電工社
製） カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＳ−３２０（旭化成工業
社製）排除限界分子量：４０００ 温度：室温 流速：０．６５ｍｌ／分 解析機：クロマトパックＣ−Ｒ４ＡＸ（島津製作所社
製）。

【００３６】２）窒素分析 オートアナライザー（ＴＥＣＨＮＩＣＯＮ、ＴＲＡＡｃ
ｓ８００^TM、テクニコン社製）を用い、試料をケルダー
ル分解し、分解液のアンモニウムイオンを比色定量し
た。

【００３７】３）リン分析 常法により原子吸光光度計（日立製作所製Ａ−１８００
型）を用いて分析した。

【００３８】４）アミノ酸組成 ６規定塩酸で１１０℃、２４時間分解し、分解液をアミ
ノ酸分析機（ＨＩＴＡＣＨＩ、８３５Ａｍｉｎｏ Ａｃ
ｉｄ Ａｎａｌｙｚｅｒ、日立製作所製）によりニンヒ
ドリンで発色して比色定量した。

【００３９】（３）試験結果 この試験の結果は、次のとおりであった。

【００４０】 ａ）分子量分布：５００〜１０００ ｂ）窒素／リンの分子数比：４．０ ｃ）アミノ酸組成（モル％） アスパラギン酸 ５．３ スレオニン ３．１ セリン ３１．１ グルタミン酸 ３７．５ グリシン ３．５ アラニン ３．４ バリン ２．７ シスチン ０．３ メチオニン ０．２ イソロイシン ７．２ ロイシン ２．５ チロシン ０ フェニルアラニン ０．１ トリプトファン ０．１ リジン ０．７ ヒスチジン ０．６ アルギニン ０．１ プロリン １．６ この結果から、この試料の分子量分布は５００〜１００
０であり、窒素とリンとの比率は４．０であり、アミノ
酸組成から主たる構成アミノ酸はグルタミン酸、セリ
ン、アスパラギン酸、及びイソロイシンであることが判
明した。

【００４１】［試験例４］この試験は、ＣＰＯＰ混合物
の風味を調べるために行った。

【００４２】（１）試料の調製 試料１：試験例１の試料２と同一の方法で調製したＣＰ
Ｐ（従来品）、 試料２：実施例１と同一の方法で調製したＣＰＯＰ混合
物 試料３：実施例２と同一の方法で調製したＣＰＯＰ混合
物 試料４：実施例３と同一の方法で調製したＣＰＯＰ混合
物 試料５：実施例４と同一の方法で調製したＣＰＯＰ混合
物 上記各試料を、冷水で１％の濃度に溶解した。

【００４３】（２）試験方法 年令２０〜４０才の男女各１０名からなるエキスパート
・パネルにより官能試験を行い、「苦味あり」、「やや
苦味あり」、「苦味ほとんどなし」、及び「苦味なし」
の４段階で評価を行った。

【００４４】（３）試験結果 この試験の結果は、表２に示すとおりであった。表２か
ら明らかなように、試料１（従来のＣＰＰ）と比較して
試料２〜試料５は、何れも苦味がなく、風味が良好であ
った。

【００４５】

【表２】 ［試験例５］この試験は、中性及び弱アルカリ性におけ
るＣＰＯＰ及びＣＰＰのカルシウム可溶化率を調べるた
めに行った。

【００４６】（１）試料の調整 試料１：実施例１と同一の方法により調製したＣＰＯＰ 試料２：試験例１と同一の方法により調製したＣＰＰ （２）試験方法 次の各種溶液を調製した。 試料溶液 ：上記各試料を表３に示す割合で精製
水に溶解し、各試料の溶液を調製した。 塩化カルシウム溶液：試薬特級の塩化カルシウム（和光
純薬工業社製）を精製水に２０ｍＭの濃度で溶解した。 リン酸緩衝液 ：２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０
及び８．０）を夫々調製した。 希塩酸溶液 ：０．１Ｎ塩酸溶液を調製した。

【００４７】塩化カルシウム溶液１ｍｌと試料溶液１ｍ
ｌを試験管に取り、リン酸緩衝液２ｍｌを添加し、３７
℃で２時間保持した。反応液をフィルター（０．４５μ
ｍ）で濾過し、濾液０．５ｍｌに希塩酸溶液０．１ｍｌ
を添加し、濾液のカルシウム量を平沼Ｃａ−Ｍｇカウン
ター（平沼産業社製）で測定した。最初に添加した塩化
カルシウム溶液中のカルシウム量に対する、最初に添加
した塩化カルシウム溶液中のカルシウム量と濾液中のカ
ルシウムの量との差、の百分率を算出し、各試料のカル
シウムの可溶化率を測定した。

【００４８】（３）試験結果 この試験の結果は表３に示すとおりであった。表３から
明らかなように、試料１（本発明のＣＰＯＰ混合物）
は、試料２（精製されていない従来のＣＰＰ）と比較し
て、中性ないし弱アルカリ性において低濃度でも顕著に
高いカルシウム不溶化防止効果（換言すれば高い可溶化
率）が認められ、ｐＨの影響も少なかった。

【００４９】

【表３】 ［試験例６］この試験は、消化酵素のＣＰＯＰ混合物に
及ぼす影響を調べるために行った。 （１）試料の調製 ＣＰＯＰ混合物試料溶液：実施例１と同一の方法により
調製したＣＰＯＰ混合物を５％の濃度で生成水に溶解し
た。

【００５０】人工胃液 ：塩化ナトリウム
２．０ｇ、ペプシン３．２ｇ、１０％塩酸２４０ｍｌに
精製水を加えて１０００ｍｌに調整した（ｐＨ約１．
２）。尚、この人工胃液は、使用時に調製した。

【００５１】人工腸液 ：炭酸水素ナトリウ
ム１５．０ｇ、パンクレアチン２．８ｇに精製水を加え
て１０００ｍｌに調整した（ｐＨ８．３）。尚、この人
工腸液は、使用時に調製した。

【００５２】（２）試験方法 ＣＰＯＰ溶液１ｍｌを試験管に採取し、人工胃液または
人工腸液９ｍｌを添加し、４０℃で２時間又は５時間保
持した後、沸騰水に浸漬して酵素を失活させ、ケイソウ
土で濾過し、濾液１ｍｌを用いて試験例５と同一の方法
によりｐＨ７．０でカルシウムの可溶化度を測定した。

【００５３】（３）試験結果 この試験の結果は表４に示すとおりであった。表４から
明らかなようにＣＰＯＰのカルシウム可溶化能は、人工
胃液または人工腸液によりほとんど影響されないことが
認められた。したがって、本発明のＣＰＯＰは消化管内
での消化酵素の影響を受けないものと判断される。

【００５４】

【表４】 以下に典型的なＣＰＯＰ混合物の製造例を示す。ただし
本発明の方法はこれらの方法に限定するものではない。

【００５５】［参考例１］市販の乳酸カゼイン（ニュー
ジーランド産）２００ｇを１０％水酸化ナトリウム水溶
液に１０％の濃度で加温しながら溶解し、得られた溶液
のｐＨを８．０に調整し、９０℃で１０分間加熱殺菌
し、４５℃に冷却した。このカゼイン溶液にパンクレア
チンＦ（商標、天野製薬社製）１０ｇ、プロテアーゼＮ
アマノ（商標、天野製薬社製）２ｇ及び参考例２と同一
の方法で調製した乳酸菌抽出物４ｇを加え（合計４９
０，０００活性単位）、４５℃で２４時間加水分解した
後、９０℃で５分間加熱して酵素を失活させ、濾過して
沈澱物を除去し、凍結乾燥し、分解物約１７０ｇを得
た。この分解物１８ｇを２０％の濃度で水に溶解し、不
溶物を除去し、セファデックスＧ−１０（ファルマシア
社製）を充填したカラム（１０×１２ｃｍ）に通液して
吸着させ、イオン交換水を用いて１０ｍｌ／分の流速で
溶出し、２００〜５００ｍｌの分画を集め、凍結乾燥
し、低分子量ペプチド粉末約６ｇを得た。

【００５６】尚、上記において用いた乳酸菌抽出物の調
製方法を参考までに記載する。

【００５７】［参考例２］市販のラクトバチルス・ヘル
ベティカスを常法により脱脂乳を用いて培養し、得られ
た培養液を遠心分離して乳酸菌を集めた。培地と等量の
滅菌水に菌体を懸濁し、遠心分離して乳酸菌を集め、こ
の操作を２回反復して菌体を洗浄した。得られた菌体を
滅菌水に２０％の濃度で懸濁し、ダイノミル［商標、ス
イス国、ワイリー・バハンフェン・エンジニアリング・
ワークス（Ｗｉｌｌｙ Ｂａｃｈｎーｆｅｎ Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ Ｗｏｒｋｓ）社製、ＫＤＬ型］を用い
て菌体を破壊し、遠心分離して不溶物を除去し、凍結乾
燥し、粉末の菌体破壊物を得た。この菌体破壊物１ｇ
は、２５，０００単位の蛋白質分解活性をもっていた。
以下に本発明の実施例を示して本発明を更に詳述する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。

【００５８】

【実施例】

［実施例１］参考例１と同一の方法を反復して得られた
低分子量ペプチド粉末７０ｇを、１４％（重量／容量）
の濃度で水に溶解し、ｐＨを８．０に調整し、予め弱塩
基性陰イオン交換体であるＤＥＡＥセファデックスＡ−
２５（ファルマシア社製）１００ｇを膨潤させ、ｐＨを
８．０に調整して充填したカラム（直径１０ｃｍ，高さ
１０ｃｍ）にＳＶ＝２で通液し、ＣＰＯＰ混合物を交換
体に吸着させた後カラムを水洗した。次いで１．８％
（重量／容量）の濃度の食塩水溶液２ｌをＳＶ＝２で通
液し、ＣＰＯＰ以外のペプチドを溶出させ、次いで３．
０％（重量／容量）の食塩水溶液２ｌをＳＶ＝２で通液
し、ＣＰＯＰ混合物を溶出させた。この溶出液を常法に
より電気透析機を用いて脱塩し、濃縮し、凍結乾燥し、
ＣＰＯＰ混合物約９ｇを得た。

【００５９】得られたＣＰＯＰ混合物について前記試験
例と同一の方法で分析，測定した結果は下記の通りであ
った。

【００６０】分子量分布：５００〜１０００ 窒素／リン比：４．１ アミノ酸組成：グルタミン酸、セリン、アスパラギン
酸、アイソロイシンを主たる構成アミノ酸とする５〜１
０のアミノ酸残基からなる 抗原性残存活性：１０^-5。

【００６１】［実施例２］ＤＥＡＥセファデックス（フ
ァルマシア社製）をＤＥＡＥセファセル（ファルマシア
社製）に変更した以外は実施例１と同一の方法によりＣ
ＰＯＰ混合物８．５ｇを得た。

【００６２】得られたＣＰＯＰ混合物について前記試験
例と同一の方法で分析，測定した結果は下記のとおりで
あった。

【００６３】分子量分布：５００〜１０００ 窒素／リン比：４．０ アミノ酸組成：グルタミン酸、セリン、アスパラギン
酸、イソロイシンを主たる構成アミノ酸とする５〜１０
のアミノ酸残基からなる 抗原性残存活性：１０^-5。

【００６４】［実施例３］低分子量ペプチド粉末溶液の
ｐＨを８．５に調整したことを除き、実施例１と同一の
方法によりＣＰＯＰ混合物約８．０ｇを得た。

【００６５】得られたＣＰＯＰ混合物について前記試験
例と同一の方法により分析，測定した結果は下記のとお
りであった。

【００６６】分子量分布：５００〜１０００ 窒素／リン比：３．９ アミノ酸組成：グルタミン酸、セリン、アスパラギン
酸、イソロイシンを主たる構成アミノ酸とする５〜１０
のアミノ酸残基からなる 抗原性残存活性：１０^-5。

【００６７】［実施例４］実施例１と同一の方法により
得たＣＰＯＰ混合物を水に溶解し、実施例１の方法を反
復し、ＣＰＯＰ混合物約３ｇを得た。

【００６８】得られたＣＰＯＰ混合物について前記試験
例と同一の方法で分析，測定した結果は下記のとおりで
あった。

【００６９】分子量分布：５００〜１０００ 窒素／リン比：３．５ アミノ酸組成：グルタミン酸、セリン、アスパラギン
酸、イソロイシンを主たる構成アミノ酸とする５〜１０
のアミノ酸残基からなる 抗原性残存活性：１０^-5。

【００７０】［実施例５］小麦粉１２００ｇ、ショート
ニング２１０ｇ、粉糖２６０ｇ、シラップ３０ｇ、粉乳
３０ｇ、食塩９ｇ、重曹９ｇ、炭酸カルシウム３０ｇ、
及び実施例１と同一の方法により製造したＣＰＯＰ２０
ｇに水２５０ｇを加えて、混練してドウを調製し、以下
常法により焼き上げて、約１９００ｇのビスケットを得
た。尚、原料はＣＰＯＰを除き全て市販品を使用した。

【００７１】［実施例６］砂糖１２５ｇ、水飴１７５
ｇ、練乳１５０ｇ、バター３０ｇ、小麦粉２０ｇ、炭酸
カルシウム１５ｇ、実施例２と同一の方法により調製し
たＣＰＯＰ１０ｇ、少量の食塩、及び少量の香料を均一
に混合し、煮詰め、以下常法により約５００ｇのキャラ
メルを得た。尚、原料はＣＰＯＰを除き全て市販品を使
用した。

【００７２】［実施例７］牛乳４０００ｍｌに砂糖４０
０ｇ、及び実施例３と同一の方法で製造したＣＰＯＰ１
３０ｇを加え、加熱殺菌し、３５℃に冷却し、プレーン
ヨーグルト３００ｇを加えて均一に混合した後、９０ｇ
ずつ容器に充填し、密封し、３５〜４０℃で１０時間保
持し、冷却し、５０個のヨーグルトを得た。尚、原料
は、ＣＰＯＰを除き全て市販品を使用した。

【００７３】［実施例８］牛乳５ｌに水５ｌを加え、加
熱殺菌し、粉末コーヒー１００ｇ、砂糖６００ｇ、及び
実施例３と同一の方法で、製造したＣＰＯＰ１００ｇを
添加，溶解，冷却し、ラクトコーヒー約１０ｌを得た。
尚、原料は、ＣＰＯＰを除き全て市販品を使用した。

【００７４】［実施例９］プレーンヨーグルト４．５ｋ
ｇを二重釜に入れ、撹拌しながら砂糖４．５ｋｇ及び実
施例４と同一の方法で製造したＣＰＯＰ１００ｇを添加
して均一に混合し、８０℃で１０分間撹拌しながら加熱
し、常温に冷却した後、クエン酸７５ｇと水７５ｇの混
合物を撹拌しながら徐々に添加し、さらにレモンエッセ
ンス１０ｍｌを同様に添加し、濃厚乳酸飲料約９ｋｇを
得た。尚、この乳酸飲料は５〜６倍に希釈して飲用す
る。また、原料は、ＣＰＯＰを除き全て市販品を使用し
た。

【００７５】

【発明の効果】本発明によって奏せられる効果は、下記
のとおりである。 １）カルシウム不溶化防止効果の高いＣＰＯＰ混合物が
得られる。 ２）実質的に抗原性のないＣＰＯＰ混合物が得られる。 ３）従来のＣＰＰの約２倍のリンを含有するＣＰＯＰ混
合物が得られる。 ４）カルシウム不溶化防止効果の高い健康食品が得られ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山口 弘子 神奈川県川崎市麻生区百合ケ丘２−７− ４ (56)参考文献 特開 昭61−17522（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−234642（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−138991（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A23L 1/305

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくともパンクレアチン及びエキソペ
   プチダーゼの２種類の酵素によりカゼインを加水分解
   し、該加水分解物をゲル濾過により分子量５００〜１０
   ００の画分を分画し、該画分を弱塩基性陰イオン交換体
   に吸着させ、２．０〜４．０％の塩溶液を通液し、リン
   含量の高い分子量５００〜１０００の画分を溶出し、こ
   れを採取することにより製造され、次の（ａ）〜
   （ｅ）、 （ａ）分子量分布が５００〜１０００であること、 （ｂ）窒素／リンの分子数比が５．０以下であること （ｃ）アミノ酸残基の数が５〜１０であって、グルタミ
   ン酸、セリン、アスパラギン酸、イソロイシンを主たる
   構成アミノ酸とすること、 （ｄ）カルシウム不溶化防止効果を有すること、 （ｅ）エライザ（ＥＬＩＳＡ：Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋ
   ｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）抑制
   試験法により測定した抗原性残存活性が１０^-5以下であ
   ること、 の理化学的性質を有することを特徴とするカルシウム不
   溶化防止効果の高いカゼインホスホオリゴペプチド混合
   物。
2. 【請求項２】 少なくともパンクレアチン及びエキソペ
   プチダーゼの２種類の酵素によりカゼインを加水分解
   し、該加水分解物をゲル濾過により分子量５００〜１０
   ００の画分を分画し、該画分を弱塩基性陰イオン交換体
   に吸着させ、２．０〜４．０％の塩溶液を通液し、リン
   含量の高い分子量５００〜１０００の画分を溶出し、こ
   れを採取することを特徴とする請求項１に記載のカゼイ
   ンホスホオリゴペプチド混合物の製造法。
3. 【請求項３】 請求項１に記載のカゼインホスホオリゴ
   ペプチド混合物を含有する健康食品。