JP4444450B2 - 蛋白質加水分解物の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛋白質加水分解物の製造方法に関するものである。
詳しくは、本発明は、原料蛋白質に、エンドプロテアーゼにより、分解率が２０乃至３０％の範囲で第一の加水分解を実施し、得られた蛋白質加水分解物を孔径１ｎｍ乃至５μｍの膜を使用して膜分画し、透過画分に、エキソプロテアーゼを含むプロテアーゼにより、分解率を２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率が２５乃至３５％となる範囲で、第二の加水分解を実施することを特徴とする蛋白質加水分解物の製造方法に関するものである。
【０００２】
本明細書において、分解率を除き、百分率は特に断りのない限り、重量による表示である。
本明細書において、蛋白質当量とは、窒素量に６．３８を乗じた値である。
【０００３】
【従来の技術】
食物アレルギーの発生頻度は近年増加する傾向にあり、アレルギーは現代人の疾病の重要な位置を占めるに至っており、アレルギー発症の予防及び治療は、重大な課題となっていた。
【０００４】
従来から前記課題を解決するため、抗原性物質である蛋白質を加水分解し、抗原性を低下させる技術が多数開発されている［特公昭５４−３６２３５号公報（以下、従来技術１と記載する。）、特公昭６２−６１０３９号公報（以下、従来技術２と記載する。）、特公平７−７３５０７号公報（以下、従来技術３と記載する。）、特許第２９５９７４７号公報（以下、従来技術４と記載する。）、及び特開平８−２２８６９２号公報（以下、従来技術５と記載する。）］。
【０００５】
また、アレルギー発症の素因を有する疑いのある者のアレルギー発症の予防には、乳以外に代替食品のない乳児期において重要となるが、蛋白質は高度に加水分解することにより乳化性が低下するため、蛋白質加水分解物の乳化性の改善が、調製粉乳の製造において課題となっていた。
【０００６】
前記課題を解決し、乳化性を改善し、従来技術１乃至従来技術５に比較して、なお一層の抗原性の低減を行うことを目的として、本発明者らは新技術を開発し、既に出願を行った（特願２０００−０６９０２３号。以下、従来技術６と記載する。）。
【０００７】
更に、加水分解を２回実施する蛋白質加水分解物の製造方法として、エンドプロテアーゼにより、第一の加水分解を実施し、続いてエキソプロテアーゼにより、第二の加水分解を実施する方法（特開昭６２−１７１６４５号公報。以下、従来技術７と記載する。）、エンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼを含むプロテアーゼにより、第一の加水分解を実施し、得られた蛋白質加水分解物を膜分画し、不透過画分に、エンドプロテアーゼにより、第二の加水分解を実施し、得られた蛋白質加水分解物を膜分画し、得られた蛋白質加水分解物を膜分画し、得られた透過物を第一の加水分解で得られた透過物と合わせる方法（特表昭６３−５０２００４号公報。以下、従来技術８と記載する。）、並びにエンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼにより、第一の加水分解を実施し、得られた蛋白質加水分解物を瀘過し、未分解物を除去し、エンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼにより、蛋白質加水分解物に、再度加水分解を実施する方法（特公平３−６０４８０号公報。以下、従来技術９と記載する。）等が知られている。
しかしながら、これらの従来技術には、次に記載するとおりの不都合があった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
前記従来の技術に開示されているとおり、抗原性がないか又は抗原残存活性が１０-6以下である蛋白質加水分解物の製造方法が開発されていた。しかしながら、前記従来技術により製造された蛋白質加水分解物を、後記する試験方法に詳細に記載した高感度の抗原残存活性の測定方法であるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法を用いて抗原残存活性を測定すると、後記試験例に示すとおり、抗原残存活性は１０-7以上を示し、抗原性が若干残存していることが認められた。
【０００９】
前記のとおり、アレルギー発症の予防及び治療が、重大な課題となっている現代において、抗原残存活性を限りなくゼロに近似させることは、食物アレルギー発生のリスクを低減し、安全な食品を提供するうえで、極めて重要であり、食品メーカーの社会的使命である。
【００１０】
従って、蛋白質の抗原残存活性をサンドウィッチＥＬＩＳＡ法の検出限界まで低減させることが求められていた。
【００１１】
また、本発明者らは、乳化性を改善し、１０-8まで抗原性を低減した蛋白質加水分解物を製造する方法である従来技術６を開発したが、後記試験例に示すとおり、この製造方法で得られる蛋白質加水分解物は、比較的高い浸透圧を示し、乳糖不耐症等の下痢症状を併発することが多い食物アレルギー患者用としては、浸透圧の改善の必要性があった。
【００１２】
更に、本発明の製造方法と同様に、加水分解を２回実施する蛋白質加水分解物の製造方法が各種知られているが、使用酵素の組み合わせ、分解率、分画膜の条件、工程の順序、及び加水分解対象物等の相違に起因して、これらの製造方法で得られる蛋白質加水分解物は、後記試験例に示すとおり、抗原性が残存しており、比較的高い浸透圧を示すという問題点があった。
【００１３】
本発明者らは、前記従来技術に鑑みて、一層の抗原性の低減及び浸透圧の低減を目的とし、後記する試験例に一部示されるとおり、種々の蛋白質加水分解物の製造方法、特に種々の使用酵素の組み合わせ、分解率、分画膜の条件、工程の順序、及び加水分解対象物、並びに得られた蛋白質加水分解物の特徴について試験した。
【００１４】
その結果、本発明者らは、原料蛋白質に、エンドプロテアーゼにより、分解率が２０乃至３０％の範囲で第一の加水分解を実施し、得られた蛋白質加水分解物を孔径１ｎｍ乃至５μｍの膜を使用して膜分画し、透過画分に、エキソプロテアーゼを含むプロテアーゼにより、分解率を２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率が２５乃至３５％となる範囲で、第二の加水分解を実施することを特徴とする蛋白質加水分解物の製造方法が、従来技術に比較して、抗原性の低減及び浸透圧の低減に優れていることを見い出し、本発明を完成した。
【００１５】
本発明の目的は、下痢症状を併発することが多い食物アレルギー患者に対して使用可能な低抗原性で浸透圧が低い蛋白質加水分解物の製造方法を提供することである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決する本発明は、原料蛋白質であるカゼイン又は乳清蛋白質に、エンドプロテアーゼにより、分解率が２０乃至３０％の範囲で第一の加水分解を実施し、得られた蛋白質加水分解物を孔径１ｎｍ乃至５μｍの膜を使用して膜分画し、透過画分に、エキソプロテアーゼを含むプロテアーゼにより、分解率を２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率が２５乃至３５％となる範囲で、第二の加水分解を実施することを特徴とする蛋白質加水分解物の製造方法である。
また、本発明の蛋白質加水分解物の製造方法は、第二の加水分解を実施した後に、得られた蛋白質加水分解物を、６０００ダルトン以下の分画分子量を有する限外濾過膜を使用して濾過処理し、膜透過画分を回収することが望ましい。
【００１７】
【発明の実施の形態】
次に、本発明について詳述する。
本発明の方法に使用される原料蛋白質は、獣乳、卵、魚肉、畜肉等に由来する動物性蛋白質、大豆、小麦等に由来する植物性蛋白質、カビ、酵母、細菌等に由来する微生物蛋白質、又はこれらの任意の混合物であり、特に限定されるものではない。また、これらの蛋白質を、限外濾過、イオン交換樹脂等の処理により濃縮した蛋白質濃縮物も使用できる。更に、前記蛋白質を予め軽度に加水分解した分解物であって、比較的大きな分子量を有する蛋白質加水分解物を出発原料とすることもできる。
【００１８】
この原料蛋白質を水又は温湯に分散し、溶解する。該溶解液の濃度は格別の制限はないが、通常、５〜１５％程度の蛋白質濃度とすることが効率性及び操作性の点から望ましい。
【００１９】
次いで、前記蛋白質溶液を６５〜９０℃で１〜３０分間程度加熱殺菌することが、雑菌の汚染による腐敗防止の点から望ましい。
【００２０】
本発明の原料蛋白質の第一の加水分解方法に使用されるエンドプロテアーゼ（エンドペプチダーゼ）は、エキソプロテアーゼ活性を有さずエンドプロテアーゼ活性のみを有する蛋白質分解酵素であれば如何なるものであってもよく、動物由来（例えば、トリプシン、キモトリプシン等）、植物由来（例えば、パパイン等）、又は微生物由来（例えば、乳酸菌、酵母、カビ、枯草菌、放線菌等）のエンドプロテアーゼを例示することができる。
【００２１】
尚、第一の加水分解方法に、エキソプロテアーゼ活性を有さずエンドプロテアーゼ活性のみを有する蛋白質分解酵素を使用するのは、後記する試験例からも明らかなとおり、エキソプロテアーゼ活性を有する蛋白質分解酵素を使用した場合には、アミノ酸が遊離し、最終製品である蛋白質加水分解物の回収率が低下し、浸透圧が増加するためである。
【００２２】
本発明の原料蛋白質の第一の加水分解方法は、蛋白質分解酵素としてエンドプロテアーゼを使用し、蛋白質の分解率を２０乃至３０％に調製できる方法であれば特に限定されるものではなく、常法に従って、蛋白質分解酵素法によって行う。具体的には、蛋白質の分解率を２０乃至３０％に調製できる酵素の種類、量、温度、ｐＨ、加水分解時間等の蛋白質分解酵素法による加水分解条件を予備実験で設定し、のち蛋白質加水分解物を調製する。
【００２３】
尚、第一の加水分解の程度の指標として、分解率を使用し、その範囲を２０乃至３０％としたのは、後記する試験例からも明らかなとおり、分解率が２０％未満では、最終製品である蛋白質加水分解物の抗原性が残存するためであり、分解率が３０％を超えるまで加水分解した場合は、最終製品である蛋白質加水分解物の浸透圧が増加するためである。
【００２４】
前記原料蛋白質に対する蛋白質分解酵素の使用量は、基質濃度、酵素力価、反応温度及び反応時間により異なるが、一般的には、原料蛋白質１ｇ当り５０〜１００００活性単位の割合で酵素を単独、又は複数組み合わせて添加することにより加水分解が行われる。尚、酵素の添加は、一括、又は少量若しくは種類毎に分割し、逐次添加することもできる。
【００２５】
また、蛋白質加水分解反応のｐＨは、使用酵素の至適ｐＨに対応して、ｐＨ２〜１０の範囲から選択される。具体的には、前記蛋白質溶液に酵素を添加する前に、使用酵素の種類によりｐＨ２〜１０の範囲内で酸又はアルカリ剤の添加により所望のｐＨに調整することにより実施される。この場合、酸としては塩酸、クエン酸、リン酸等を、また、アルカリ剤としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム等をそれぞれ例示することができる。
【００２６】
蛋白質加水分解反応の温度は、格別の制限はなく、酵素作用の発現する最適温度範囲を含む実用に供せられ得る範囲、即ち、通常３０〜７０℃の範囲から選択される。温度を酵素の至適温度より低温又は高温、例えば５０〜６０℃の範囲に維持することにより蛋白質加水分解反応中の腐敗を防止することもできる。
【００２７】
蛋白質加水分解反応の時間は、使用酵素の種類及び組合せ、反応温度、初発ｐＨ等の反応条件によって進行状態が異なることから、前記のとおり、予備実験で設定された蛋白質の分解率を２０乃至３０％に調製できる範囲で、反応継続時間を決定する必要がある。
【００２８】
酵素反応の停止は、予備実験で設定された加水分解条件に基づいて加水分解の程度が、蛋白質の分解率が２０乃至３０％の範囲内となった時点で、酵素を失活又は除去することにより行う。失活操作は加熱処理（例えば、８５℃で１５分間等）により行うことができる。また、除去操作は限外濾過膜（ウルトラフィルトレーション）等により実施することができる。
【００２９】
得られた中間産物である蛋白質加水分解物を含有する溶液は、そのまま使用することも可能であり、また、必要に応じてこの溶液を逆浸透膜法等の公知の方法により濃縮し、濃縮液として使用することも可能であり、更に、この濃縮液を公知の方法により乾燥して粉末となし、後に行われる膜分画の前に所定濃度で水に溶解して使用することも可能である。
【００３０】
本発明の膜分画工程に使用される膜は、孔径１ｎｍ乃至５μｍの膜であれば如何なるものであってもよく、孔径０．５乃至５μｍの精密濾過膜（マイクロフィルトレーションメンブレン）、孔径１ｎｍ乃至５μｍに相当する１０００乃至１０万ダルトンの分画分子量を有する限外瀘過膜等を例示することができる。
【００３１】
尚、膜分画工程に使用される膜の孔径の範囲を１ｎｍ乃至５μｍとしたのは、後記する試験例からも明らかなとおり、孔径が１ｎｍ未満の膜を使用した場合には、最終製品である蛋白質加水分解物の回収率が低下するためであり、孔径が５μｍを超える膜を使用した場合には、最終製品である蛋白質加水分解物の抗原性が残存するためである。
【００３２】
本発明の膜分画工程は、次のとおり実施する。前記のとおり調製された蛋白質の分解率が２０乃至３０％の範囲内にある中間産物である蛋白質加水分解物を５乃至２０％の濃度の溶液に調整し、前記の孔径１ｎｍ乃至５μｍの膜を使用し、瀘過膜分画処理（いわゆる瀘過処理）を行い、抗原性物質を除去し、膜透過画分を回収することにより実施される。
【００３３】
得られた膜透過画分溶液は、そのまま使用することも可能であり、また、必要に応じてこの溶液を逆浸透膜法等の公知の方法により濃縮し、濃縮液として使用することも可能であり、更に、この濃縮液を公知の方法により乾燥して粉末となし、後に行われる第二の加水分解の前に所定濃度で水に溶解して使用することも可能である。
【００３４】
本発明の第二の加水分解方法に使用されるエキソプロテアーゼ（エキソペプチダーゼ）を含むプロテアーゼは、少なくともエキソプロテアーゼ活性を有する蛋白質分解酵素であれば如何なるものであってもよく、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、若しくは微生物由来（例えば、乳酸菌、アスペルギルス属菌、リゾープス属菌等）のエキソプロテアーゼ、又はエンドプロテアーゼ活性も併せて有するパンクレアチン、ペプシン等を例示することができる。
【００３５】
尚、第二の加水分解方法に、エキソプロテアーゼ活性を有する蛋白質分解酵素を使用するのは、後記する試験例からも明らかなとおり、エキソプロテアーゼ活性を有さずエンドプロテアーゼ活性のみを有する蛋白質分解酵素を使用した場合には、最終製品である蛋白質加水分解物の抗原性が残存するためである。
【００３６】
本発明の第二の加水分解方法は、蛋白質分解酵素としてエキソプロテアーゼを含むプロテアーゼを使用し、蛋白質の分解率を、前記第一の加水分解で得られた分解率に加えて２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率を２５乃至３５％に調製できる方法であれば特に限定されるものではなく、常法に従って、蛋白質分解酵素法によって行う。具体的には、蛋白質の分解率を２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率を２５乃至３５％に調製できる酵素の種類、量、温度、ｐＨ、加水分解時間等の蛋白質分解酵素法による加水分解条件を予備実験で設定し、のち蛋白質加水分解物を調製する。
【００３７】
尚、第二の加水分解の程度の指標として、分解率を使用し、その範囲を２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率を２５乃至３５％としたのは、後記する試験例からも明らかなとおり、増加する分解率が２％未満又は最終的な分解率が２５％未満では、最終製品である蛋白質加水分解物の抗原性が残存するためであり、増加する分解率が８％を超えるか又は最終的な分解率が３５％を超えるまで加水分解した場合は、最終製品である蛋白質加水分解物の浸透圧が増加するためである。
【００３８】
本発明の第二の加水分解方法における蛋白質分解酵素法の各条件は、前記本発明の第一の加水分解方法と同様である。
【００３９】
得られた最終製品である蛋白質加水分解物を含有する溶液は、限外瀘過等の瀘過処理を再度行うことが望ましい。具体的には、６０００ダルトン以下、即ち、市販の１０００乃至６０００ダルトンに分画分子量を有する限外瀘過膜を使用し、瀘過処理を行い、一部残存する可能性のある高分子物質を除去し、膜透過画分を回収することにより実施される。
【００４０】
得られた最終製品である蛋白質加水分解物を含有する溶液は、そのまま使用することもでき、また、必要に応じて、この溶液を逆浸透膜法等の公知の方法により濃縮した濃縮液として使用することもでき、更に、この濃縮液を公知の方法により乾燥し、粉末として使用することもできる。
【００４１】
以上の方法により、蛋白質加水分解物中の抗原性物質を効果的に膜分画除去及び加水分解除去することができ、かつ浸透圧の上昇を抑制して、後記する試験例の結果から明らかなとおり、現時点において全ての従来技術と比較して抗原性が最も低いと考えられる、いわゆる実質的に抗原性を有さず、かつ浸透圧が低い、精製分離されたペプチドとは異なる蛋白質加水分解物を製造することができる。
【００４２】
前記本発明の方法により得られた蛋白質加水分解物は、後記する実施例からも明らかなとおり、低抗原性で浸透圧が低い蛋白質加水分解物である。即ち、本発明の製造方法により得られる蛋白質加水分解物の溶液、その濃縮液又は粉末は、低抗原性で浸透圧が低いことから、下痢症状を併発することが多い食物アレルギー患者の蛋白質源、又は医薬品原料として有用であり、具体的には、アレルギー発症の予防及び治療のための食品又は飲料である調製粉乳、調製乳、栄養補助食品、病態栄養食、流動食等の各種飲食品に応用可能である。
【００４３】
次に、試験例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明においては、次の試験方法を採用した。
【００４４】
（１）蛋白質の分解率算出方法
ケルダール法（日本食品工業学会編、「食品分析法」、第１０２ページ、株式会社光琳、昭和５９年）により試料の全窒素量を測定し、ホルモール滴定法（満田他編、「食品工学実験書」、上巻、第５４７頁、養賢堂、１９７０年）により試料のホルモール態窒素量を測定し、これらの測定値から分解率を次式により算出した。
分解率（％）＝（ホルモール態窒素量／全窒素量）×１００
【００４５】
（２）抗原残存活性の測定方法
サンドウィッチＥＬＩＳＡ法により測定した（松橋直他著、「免疫学実験入門」、第１６０頁、学会出版センター、１９８５年）。
【００４６】
具体的には、抗原蛋白質をウサギに免疫して得たウサギ抗血清から特異ＩｇＧを精製して使用し、これを０．１Ｍ炭酸緩衝液にて希釈してポリスチレン製マイクロプレート（ヌンク社製）の各ウェルに１００μｌずつ分注し、３７℃で２時間静置し、のち０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、PBS-Tween と記載することがある。）により洗浄した。
【００４７】
次いで、１％ゼラチン（バイオラド社製）を含むＰＢＳを１００μｌずつ前記各ウェルに分注し、３７℃で３０分間静置し、のちPBS-Tween により洗浄した。
【００４８】
試料及び標準蛋白質をそれぞれPBS-Tween により希釈し、１００μｌずつ前記各ウェルに分注し、３７℃で１時間静置し、PBS-Tween により洗浄した。
【００４９】
ビオチン化特異ＩｇＧをPBS-Tween により希釈し、１００μｌずつ前記各ウェルに分注し、３７℃で１時間静置後、PBS-Tween により洗浄した。ストレプトアビジン及びビオチン化ぺルオキシダーゼをＰＢＳに溶解し、１００μｌずつ前記各ウェルに分注し、PBS-Tween により洗浄した。
【００５０】
基質としてο−フェレンジアミン溶液を１００μｌずつ前記各ウェルに分注し、室温、暗所にて１０分間反応させ、３Ｍ硫酸を各ウェルに５０μｌずつ添加し、反応を停止した。
【００５１】
次いで、反応生成物をマイクロプレートリーダーを用いて、反応生成物の４９２ｎｍの吸光度を測定し、標準蛋白質の測定値と比較して試料の抗原残存活性を算出した。
【００５２】
（３）浸透圧の測定方法
各試料を１０％濃度で精製水に溶解し、浸透圧測定装置（アドバンスインスツルメンツ社製。アドバンス滲透圧計３Ｄ３。）を使用して浸透圧値（ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ2Ｏ）を測定した。
【００５３】
（４）蛋白質加水分解物の回収率の算出方法
蛋白質加水分解物の回収率（Ａ）は、原料蛋白質の乾燥重量（Ｂ）及び得られた蛋白質加水分解物の乾燥重量（Ｃ）に基づいて、次式により算出した。
Ａ（％）＝（Ｃ／Ｂ）×１００
【００５４】
試験例１
この試験は、従来技術と比較して本発明の蛋白質加水分解物の製造方法が優れていることを示すために行った。
【００５５】
（１）試料の調製
次に示す１０種類の試料を調製した。
試料１：本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料２：従来技術１の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料３：従来技術２の実施例２と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料４：従来技術３の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料５：従来技術４の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料６：従来技術５の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料７：従来技術６の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料８：従来技術７の実施例４と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料９：従来技術８の実施例２と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料10：従来技術９の第５欄、第６欄、及び実施例１の記載に従って、第一及び第二の加水分解の蛋白質分解酵素として、エンドプロテアーゼ活性及びエキソプロテアーゼ活性を共に有するアクチナーゼＡＳ（科研製薬社製）を使用することを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００５６】
（２）試験方法
各試料の蛋白質の分解率、抗原残存活性、及び浸透圧を、いずれも前記の試験方法により試験した。
【００５７】
（３）試験結果
この試験の結果は、表１に示すとおりである。表１から明らかなとおり、従来技術の各試料に比較して本発明の試料１は、抗原残存活性が極めて低く、かつ浸透圧が低い点で優れていることが判明した。
【００５８】
尚、本発明の試料については、原料蛋白質の種類、エンドプロテアーゼの種類、エキソプロテアーゼを含むプロテアーゼの種類、第一の加水分解の分解率を２０乃至３０％の範囲で、膜の種類及び孔径を１ｎｍ乃至５μｍの範囲で、又は第二の加水分解の分解率が、分解率を２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率が２５乃至３５％となる範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００５９】
【表１】
【００６０】
試験例２
この試験は、抗原残存活性及び浸透圧を指標として、各工程の組み合わせ及び順序を調べるために行った。
【００６１】
（１）試料の調製
次に示す６種類の試料を調製した。
試料11：本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料12：膜分画工程を実施しないことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料13：第一の加水分解工程に続いて第二の加水分解工程を実施し、のち膜分画工程を実施したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料14：第二の加水分解工程を最初に実施し、次いで第一の加水分解工程を実施し、のち膜分画工程を実施したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料15：第二の加水分解工程を最初に実施し、次いで第一の加水分解工程を実施し、膜分画工程を実施しないことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料16：第二の加水分解工程を最初に実施し、次いで膜分画工程を実施し、のち第一の加水分解工程を実施したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００６２】
（２）試験方法
各試料の抗原残存活性及び浸透圧を、いずれも前記の試験方法により試験した。
【００６３】
（３）試験結果
この試験の結果は、表２に示すとおりである。表２から明らかなとおり、抗原残存活性が極めて低く、かつ浸透圧が低い蛋白質加水分解物を製造するためには、二つの加水分解工程と膜分画工程の組み合わせが必須であり、エンドプロテアーゼを使用する第一の加水分解工程、次いで膜分画工程、のちエキソプロテアーゼを含むプロテアーゼを使用する第二の加水分解工程の順序で実施することが必要であることが判明した。
【００６４】
尚、本発明の試料については、原料蛋白質の種類、エンドプロテアーゼの種類、エキソプロテアーゼを含むプロテアーゼの種類、第一の加水分解の分解率を２０乃至３０％の範囲で、膜の種類及び孔径を１ｎｍ乃至５μｍの範囲で、又は第二の加水分解の分解率が、分解率を２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率が２５乃至３５％となる範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００６５】
【表２】
【００６６】
試験例３
この試験は、抗原残存活性、浸透圧、及び回収率を指標として、加水分解酵素の種類及びその使用順序を調べるために行った。
【００６７】
（１）試料の調製
次に示す９種類の試料を調製した。
試料17：本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料18：第二の加水分解に使用されるエキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）に変えてエンドプロテアーゼ活性及びエキソプロテアーゼ活性を共に有するアクチナーゼＡＳ（科研製薬社製）を使用したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料19：第二の加水分解に使用されるエキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）に変えてエンドプロテアーゼであるアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボインダストリー社製）を使用したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料20：第一の加水分解に使用されるエンドプロテアーゼであるアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボインダストリー社製）に変えてエキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）を使用したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料21：第一の加水分解に使用されるエンドプロテアーゼであるアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボインダストリー社製）に変えてエキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）を使用し、並びに第二の加水分解に使用されるエキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）に変えてエンドプロテアーゼであるアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボインダストリー社製）を使用したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料22：第一の加水分解に使用されるエンドプロテアーゼであるアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボインダストリー社製）に変えてエキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）を使用し、並びに第二の加水分解に使用されるエキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）に変えてエンドプロテアーゼ活性及びエキソプロテアーゼ活性を共に有するアクチナーゼＡＳ（科研製薬社製）を使用したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料23：第一の加水分解に使用されるエンドプロテアーゼであるアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボインダストリー社製）に変えてエンドプロテアーゼ活性及びエキソプロテアーゼ活性を共に有するアクチナーゼＡＳ（科研製薬社製）を使用したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料24：第一の加水分解に使用されるエンドプロテアーゼであるアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボインダストリー社製）に変えてエンドプロテアーゼ活性及びエキソプロテアーゼ活性を共に有するアクチナーゼＡＳ（科研製薬社製）を使用し、並びに第二の加水分解に使用されるエキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）に変えてエンドプロテアーゼであるアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボインダストリー社製）を使用したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料25：第一の加水分解に使用されるエンドプロテアーゼであるアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボインダストリー社製）に変えてエンドプロテアーゼ活性及びエキソプロテアーゼ活性を共に有するアクチナーゼＡＳ（科研製薬社製）を使用し、並びに第二の加水分解に使用されるエキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）に変えてエンドプロテアーゼ活性及びエキソプロテアーゼ活性を共に有するアクチナーゼＡＳ（科研製薬社製）を使用したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００６８】
（２）試験方法
各試料の抗原残存活性及び浸透圧を、いずれも前記の試験方法により試験した。
【００６９】
（３）試験結果
この試験の結果は、表３に示すとおりである。表３から明らかなとおり、抗原残存活性が極めて低く、かつ浸透圧が低い蛋白質加水分解物を製造するためには、第一の加水分解にはエンドプロテアーゼを使用し、かつ第二の加水分解にはエキソプロテアーゼを含むプロテアーゼを使用することが必要であることが判明した。
【００７０】
尚、本発明の試料については、原料蛋白質の種類、エンドプロテアーゼの種類、エキソプロテアーゼを含むプロテアーゼの種類、第一の加水分解の分解率を２０乃至３０％の範囲で、膜の種類及び孔径を１ｎｍ乃至５μｍの範囲で、又は第二の加水分解の分解率が、分解率を２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率が２５乃至３５％となる範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００７１】
【表３】
【００７２】
試験例４
この試験は、抗原残存活性、浸透圧、及び回収率を指標として、第一の加水分解の適正な分解率を調べるために行った。
【００７３】
（１）試料の調製
酵素反応の停止時期を変更して、表４に示すとおり、第一の加水分解の分解率を段階的に変更したことを除き、実施例１と同一の方法により４種類の試料（試料番号２６〜２９）を調製した。
【００７４】
（２）試験方法
各試料の抗原残存活性、浸透圧、及び回収率を、いずれも前記の試験方法により試験した。
【００７５】
（３）試験結果
この試験の結果は、表４に示すとおりである。表４から明らかなとおり、抗原残存活性が極めて低く、かつ浸透圧が低い蛋白質加水分解物を、６０％以上の高回収率で製造するためには、第一の加水分解の分解率を２０乃至３０％の範囲内とすることが必要であることが判明した。
【００７６】
尚、本発明の試料については、原料蛋白質の種類、エンドプロテアーゼの種類、エキソプロテアーゼを含むプロテアーゼの種類、膜の種類及び孔径を１ｎｍ乃至５μｍの範囲で、又は第二の加水分解の分解率が、分解率を２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率が２５乃至３５％となる範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００７７】
【表４】
【００７８】
試験例５
この試験は、抗原残存活性、浸透圧、及び回収率を指標として、膜分画工程に使用される膜の適正な孔径を調べるために行った。
【００７９】
（１）試料の調製
孔径の異なる各種の市販の膜を使用して、表５に示すとおり、膜分画工程に使用される膜の孔径を段階的に変更したことを除き、実施例１と同一の方法により４種類の試料（試料番号３０〜３３）を調製した。
【００８０】
（２）試験方法
各試料の抗原残存活性、浸透圧、及び回収率を、いずれも前記の試験方法により試験した。
【００８１】
（３）試験結果
この試験の結果は、表５に示すとおりである。表５から明らかなとおり、抗原残存活性が極めて低く、かつ浸透圧が低い蛋白質加水分解物を、６０％以上の高回収率で製造するためには、膜分画工程に使用される膜の孔径を１ｎｍ乃至５μｍの範囲内とすることが必要であることが判明した。
【００８２】
尚、本発明の試料については、原料蛋白質の種類、エンドプロテアーゼの種類、エキソプロテアーゼを含むプロテアーゼの種類、第一の加水分解の分解率を２０乃至３０％の範囲で、膜の種類、又は第二の加水分解の分解率が、分解率を２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率が２５乃至３５％となる範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００８３】
【表５】
【００８４】
試験例６
この試験は、抗原残存活性、浸透圧、及び回収率を指標として、第二の加水分解の適正な分解率を調べるために行った。
【００８５】
（１）試料の調製
酵素反応の停止時期を変更して、表６に示すとおり、第二の加水分解の増加する分解率及び最終的な分解率を段階的に変更したことを除き、実施例１と同一の方法により次に示す１２種類の試料（試料番号３４〜４５）を調製した。
試料34：第一の加水分解の分解率を２０％とし、第二の加水分解の酵素反応を、分解率を４％増加し、かつ最終的な分解率が２４％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料35：第一の加水分解の分解率を２０％とし、第二の加水分解の酵素反応を、分解率を５％増加し、かつ最終的な分解率が２５％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料36：第一の加水分解の分解率を２０％とし、第二の加水分解の酵素反応を、分解率を８％増加し、かつ最終的な分解率が２８％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料37：第一の加水分解の分解率を２０％とし、第二の加水分解の酵素反応を、分解率を９％増加し、かつ最終的な分解率が２９％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料38：第二の加水分解の酵素反応を、分解率を１％増加し、かつ最終的な分解率が２６％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料39：第二の加水分解の酵素反応を、分解率を２％増加し、かつ最終的な分解率が２７％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料40：第二の加水分解の酵素反応を、分解率を８％増加し、かつ最終的な分解率が３３％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料41：第二の加水分解の酵素反応を、分解率を９％増加し、かつ最終的な分解率が３４％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料42：第一の加水分解の分解率を３０％とし、第二の加水分解の酵素反応を、分解率を１％増加し、かつ最終的な分解率が３１％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料43：第一の加水分解の分解率を３０％とし、第二の加水分解の酵素反応を、分解率を２％増加し、かつ最終的な分解率が３２％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料44：第一の加水分解の分解率を３０％とし、第二の加水分解の酵素反応を、分解率を５％増加し、かつ最終的な分解率が３５％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料45：第一の加水分解の分解率を３０％とし、第二の加水分解の酵素反応を、分解率を６％増加し、かつ最終的な分解率が３６％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００８６】
（２）試験方法
各試料の抗原残存活性、浸透圧、及び回収率を、いずれも前記の試験方法により試験した。
【００８７】
（３）試験結果
この試験の結果は、表６に示すとおりである。表６から明らかなとおり、抗原残存活性が極めて低く、かつ浸透圧が低い蛋白質加水分解物を、６０％以上の高回収率で製造するためには、第二の加水分解の分解率は、分解率を２乃至８％の範囲内で増加し、かつ最終的な分解率が２５乃至３５％となる範囲内とすることが必要であることが判明した。
【００８８】
尚、本発明の試料については、原料蛋白質の種類、エンドプロテアーゼの種類、エキソプロテアーゼを含むプロテアーゼの種類、第一の加水分解の分解率を２０乃至３０％の範囲で、又は膜の種類及び孔径を１ｎｍ乃至５μｍの範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００８９】
【表６】
【００９０】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９１】
【実施例】
実施例１
市販の牛乳乳清蛋白質濃縮物１．３ｋｇ（ミライ社製。蛋白質当量として１ｋｇ）を脱イオン水９ｋｇに溶解し、蛋白質濃度約１０％の乳清蛋白質水溶液１０．３ｋｇを調製した。該乳清蛋白質水溶液をプレート式熱交換器を使用して７０℃で１分間加熱殺菌し、液温を５３℃に調整し、１０％水酸化ナトリウム水溶液及び２０％炭酸カリウム水溶液を使用して、ｐＨを９．５に調整し、エンドプロテアーゼであるアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボインダストリー社製）を蛋白質当量１ｇ当たり１０００活性単位の割合で添加し、第一の蛋白質加水分解反応を開始した。１３時間経過し、分解率が２５％となった時点で、プレート式熱交換器を使用して１２０℃で１５秒間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。
【００９２】
この加水分解液を、孔径０．５μｍの限外濾過膜（旭化成工業社製。分画分子量６０００）により膜分画し、透過画分を凍結乾燥し、粉末状の蛋白質加水分解物約１０００ｇ（蛋白質当量として７７０ｇ）を得た。
【００９３】
次いで、得られた蛋白質加水分解物全量を、脱イオン水９０００ｇに溶解し、約１０％濃度の蛋白質加水分解物水溶液１０ｋｇを調製した。該蛋白質加水分解物水溶液の液温を５３℃に調整し、エキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）を蛋白質当量１ｇ当たり５００活性単位の割合で添加し、第二の蛋白質加水分解反応を開始した。８時間経過し、分解率を５％増加し、かつ最終的な分解率が３０％となった時点で、プレート式熱交換器を使用して１２０℃で１５秒間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。
【００９４】
この加水分解液を凍結乾燥し、粉末状の蛋白質加水分解物約９４０ｇ（蛋白質当量として７２０ｇ）を得た。
【００９５】
得られた蛋白質加水分解物を前記試験方法により試験した結果、抗原残存活性は１０-9であって極めて低く、浸透圧は３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ2Ｏであって低く、かつ原料蛋白質に対する蛋白質加水分解物の回収率は７２％と優れていた。
【００９６】
実施例２
市販の牛乳カゼイン１２０ｇ（ニュージーランドデイリーボード製。蛋白質当量として１００ｇ）を蒸留水８８０ｇに分散し、１０％水酸化ナトリウム水溶液を使用して、ｐＨを７．０に調整し、カゼインを完全に溶解し、蛋白質濃度約１０％のカゼイン水溶液約１ｋｇを調製した。該カゼイン水溶液を８５℃で１５分間加熱殺菌し、液温を５０℃に調整し、１０％水酸化カリウム水溶液を使用して、ｐＨを９．５に調整し、エンドプロテアーゼであるビオプラーゼｓｐ−２０（長瀬生化学工業社製）、プロテアーゼＮアマノ（天野製薬社製）、及びＰＴＮ６．０Ｓ（ノボインダストリー社製）をそれぞれ蛋白質１ｇ当たり１２００活性単位、２０００活性単位、及び７０００活性単位の割合で添加し、蛋白質加水分解反応を開始した。１３時間経過し、分解率が３０％となった時点で、９０℃で２０分間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。
【００９７】
この加水分解液を、孔径０．４５μｍの精密濾過膜（ミリポア社製）により膜分画し、透過画分を凍結乾燥し、粉末状の蛋白質加水分解物約８９ｇ（蛋白質当量として７４ｇ）を得た。
【００９８】
次いで、得られた蛋白質加水分解物全量を、脱イオン水８０１ｇに溶解し、約１０％濃度の蛋白質加水分解物水溶液８９０ｇを調製した。該蛋白質加水分解物水溶液の液温を５０℃に調整し、エンドプロテアーゼ活性及びエキソプロテアーゼ活性を共に有するアクチナーゼＡＳ（科研製薬社製）を蛋白質当量１ｇ当たり１５００活性単位の割合で添加し、第二の蛋白質加水分解反応を開始した。４時間経過し、分解率を３％増加し、かつ最終的な分解率が３３％となった時点で、プレート式熱交換器を使用して１２０℃で１５秒間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。
【００９９】
この加水分解液を、ケイソウ土濾過により不溶物を除去し、凍結乾燥し、粉末状の蛋白質加水分解物約７７ｇ（蛋白質当量として６４ｇ）を得た。
【０１００】
得られた蛋白質加水分解物を前記試験方法により試験した結果、抗原残存活性は１０-9であって極めて低く、浸透圧は３００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ2Ｏであって低く、かつ原料蛋白質に対する蛋白質加水分解物の回収率は６４％と優れていた。
【０１０１】
実施例３
市販の牛乳乳清蛋白質濃縮物２．６ｋｇ（ミライ社製。蛋白質当量として２ｋｇ）を脱イオン水１８ｋｇに溶解し、１０％水酸化ナトリウム水溶液を使用して、ｐＨを７．２に調整し、蛋白質濃度約１０％の乳清蛋白質水溶液２０．６ｋｇを調製した。該乳清蛋白質水溶液をプレート式熱交換器を使用して８０℃で６分間加熱殺菌し、液温を５３℃に調整し、１０％水酸化カリウム水溶液を使用して、ｐＨを９．０に調整し、エンドプロテアーゼであるＰＴＮ６．０Ｓ（ノボインダストリー社製）、プロテアーゼＮアマノ（天野製薬社製）、及びアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボインダストリー社製）をそれぞれ蛋白質１ｇ当たり５０００活性単位、２０００活性単位、及び５００活性単位の割合で添加し、蛋白質加水分解反応を開始した。１０時間経過し、分解率が２０％となった時点で、１２０℃で３秒間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。
【０１０２】
この加水分解液を、孔径０．２μｍの限外濾過膜（旭化成工業社製。分画分子量３０００）により膜分画し、透過画分として蛋白質加水分解物水溶液約１８ｋｇを得た。該蛋白質加水分解物水溶液の液温を５５℃に調整し、エキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）を蛋白質当量１ｇ当たり５００活性単位の割合で添加し、第二の蛋白質加水分解反応を開始した。１０時間経過し、分解率を７％増加し、かつ最終的な分解率が２７％となった時点で、プレート式熱交換器を使用して１２０℃で３秒間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。
【０１０３】
この加水分解液を、孔径０．２μｍの限外濾過膜（旭化成工業社製。分画分子量３０００）により不溶物を除去し、透過画分を凍結乾燥し、粉末状の蛋白質加水分解物約１９６０ｇ（蛋白質当量として１５００ｇ）を得た。
【０１０４】
得られた蛋白質加水分解物を前記試験方法により試験した結果、抗原残存活性は１０-9であって極めて低く、浸透圧は３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ2Ｏであって低く、かつ原料蛋白質に対する蛋白質加水分解物の回収率は７５％と優れていた。
【０１０５】
【発明の効果】
以上詳記したとおり、本発明は、蛋白質加水分解物の製造方法に関するものであり、本発明により奏せられる効果は次のとおりである。
１）本発明の蛋白質加水分解物の製造方法は、原料蛋白質に対する蛋白質加水分解物の回収率を良好に保持して、下痢症状を併発することが多い食物アレルギー患者に対して使用可能な低抗原性で浸透圧が低い蛋白質加水分解物を製造することができる。
２）得られた蛋白質加水分解物は、低抗原性で浸透圧が低いことから、下痢症状を併発することが多い食物アレルギー患者の蛋白質源、又は医薬品原料として有用である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛋白質加水分解物の製造方法に関するものである。
詳しくは、本発明は、原料蛋白質に、エンドプロテアーゼにより、分解率が２０乃至３０％の範囲で第一の加水分解を実施し、得られた蛋白質加水分解物を孔径１ｎｍ乃至５μｍの膜を使用して膜分画し、透過画分に、エキソプロテアーゼを含むプロテアーゼにより、分解率を２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率が２５乃至３５％となる範囲で、第二の加水分解を実施することを特徴とする蛋白質加水分解物の製造方法に関するものである。
【０００２】
本明細書において、分解率を除き、百分率は特に断りのない限り、重量による表示である。
本明細書において、蛋白質当量とは、窒素量に６．３８を乗じた値である。
【０００３】
【従来の技術】
食物アレルギーの発生頻度は近年増加する傾向にあり、アレルギーは現代人の疾病の重要な位置を占めるに至っており、アレルギー発症の予防及び治療は、重大な課題となっていた。
【０００４】
従来から前記課題を解決するため、抗原性物質である蛋白質を加水分解し、抗原性を低下させる技術が多数開発されている［特公昭５４−３６２３５号公報（以下、従来技術１と記載する。）、特公昭６２−６１０３９号公報（以下、従来技術２と記載する。）、特公平７−７３５０７号公報（以下、従来技術３と記載する。）、特許第２９５９７４７号公報（以下、従来技術４と記載する。）、及び特開平８−２２８６９２号公報（以下、従来技術５と記載する。）］。
【０００５】
また、アレルギー発症の素因を有する疑いのある者のアレルギー発症の予防には、乳以外に代替食品のない乳児期において重要となるが、蛋白質は高度に加水分解することにより乳化性が低下するため、蛋白質加水分解物の乳化性の改善が、調製粉乳の製造において課題となっていた。
【０００６】
前記課題を解決し、乳化性を改善し、従来技術１乃至従来技術５に比較して、なお一層の抗原性の低減を行うことを目的として、本発明者らは新技術を開発し、既に出願を行った（特願２０００−０６９０２３号。以下、従来技術６と記載する。）。
【０００７】
更に、加水分解を２回実施する蛋白質加水分解物の製造方法として、エンドプロテアーゼにより、第一の加水分解を実施し、続いてエキソプロテアーゼにより、第二の加水分解を実施する方法（特開昭６２−１７１６４５号公報。以下、従来技術７と記載する。）、エンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼを含むプロテアーゼにより、第一の加水分解を実施し、得られた蛋白質加水分解物を膜分画し、不透過画分に、エンドプロテアーゼにより、第二の加水分解を実施し、得られた蛋白質加水分解物を膜分画し、得られた蛋白質加水分解物を膜分画し、得られた透過物を第一の加水分解で得られた透過物と合わせる方法（特表昭６３−５０２００４号公報。以下、従来技術８と記載する。）、並びにエンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼにより、第一の加水分解を実施し、得られた蛋白質加水分解物を瀘過し、未分解物を除去し、エンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼにより、蛋白質加水分解物に、再度加水分解を実施する方法（特公平３−６０４８０号公報。以下、従来技術９と記載する。）等が知られている。
しかしながら、これらの従来技術には、次に記載するとおりの不都合があった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
前記従来の技術に開示されているとおり、抗原性がないか又は抗原残存活性が１０-6以下である蛋白質加水分解物の製造方法が開発されていた。しかしながら、前記従来技術により製造された蛋白質加水分解物を、後記する試験方法に詳細に記載した高感度の抗原残存活性の測定方法であるサンドウィッチＥＬＩＳＡ法を用いて抗原残存活性を測定すると、後記試験例に示すとおり、抗原残存活性は１０-7以上を示し、抗原性が若干残存していることが認められた。
【０００９】
前記のとおり、アレルギー発症の予防及び治療が、重大な課題となっている現代において、抗原残存活性を限りなくゼロに近似させることは、食物アレルギー発生のリスクを低減し、安全な食品を提供するうえで、極めて重要であり、食品メーカーの社会的使命である。
【００１０】
従って、蛋白質の抗原残存活性をサンドウィッチＥＬＩＳＡ法の検出限界まで低減させることが求められていた。
【００１１】
また、本発明者らは、乳化性を改善し、１０-8まで抗原性を低減した蛋白質加水分解物を製造する方法である従来技術６を開発したが、後記試験例に示すとおり、この製造方法で得られる蛋白質加水分解物は、比較的高い浸透圧を示し、乳糖不耐症等の下痢症状を併発することが多い食物アレルギー患者用としては、浸透圧の改善の必要性があった。
【００１２】
更に、本発明の製造方法と同様に、加水分解を２回実施する蛋白質加水分解物の製造方法が各種知られているが、使用酵素の組み合わせ、分解率、分画膜の条件、工程の順序、及び加水分解対象物等の相違に起因して、これらの製造方法で得られる蛋白質加水分解物は、後記試験例に示すとおり、抗原性が残存しており、比較的高い浸透圧を示すという問題点があった。
【００１３】
本発明者らは、前記従来技術に鑑みて、一層の抗原性の低減及び浸透圧の低減を目的とし、後記する試験例に一部示されるとおり、種々の蛋白質加水分解物の製造方法、特に種々の使用酵素の組み合わせ、分解率、分画膜の条件、工程の順序、及び加水分解対象物、並びに得られた蛋白質加水分解物の特徴について試験した。
【００１４】
その結果、本発明者らは、原料蛋白質に、エンドプロテアーゼにより、分解率が２０乃至３０％の範囲で第一の加水分解を実施し、得られた蛋白質加水分解物を孔径１ｎｍ乃至５μｍの膜を使用して膜分画し、透過画分に、エキソプロテアーゼを含むプロテアーゼにより、分解率を２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率が２５乃至３５％となる範囲で、第二の加水分解を実施することを特徴とする蛋白質加水分解物の製造方法が、従来技術に比較して、抗原性の低減及び浸透圧の低減に優れていることを見い出し、本発明を完成した。
【００１５】
本発明の目的は、下痢症状を併発することが多い食物アレルギー患者に対して使用可能な低抗原性で浸透圧が低い蛋白質加水分解物の製造方法を提供することである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決する本発明は、原料蛋白質であるカゼイン又は乳清蛋白質に、エンドプロテアーゼにより、分解率が２０乃至３０％の範囲で第一の加水分解を実施し、得られた蛋白質加水分解物を孔径１ｎｍ乃至５μｍの膜を使用して膜分画し、透過画分に、エキソプロテアーゼを含むプロテアーゼにより、分解率を２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率が２５乃至３５％となる範囲で、第二の加水分解を実施することを特徴とする蛋白質加水分解物の製造方法である。
また、本発明の蛋白質加水分解物の製造方法は、第二の加水分解を実施した後に、得られた蛋白質加水分解物を、６０００ダルトン以下の分画分子量を有する限外濾過膜を使用して濾過処理し、膜透過画分を回収することが望ましい。
【００１７】
【発明の実施の形態】
次に、本発明について詳述する。
本発明の方法に使用される原料蛋白質は、獣乳、卵、魚肉、畜肉等に由来する動物性蛋白質、大豆、小麦等に由来する植物性蛋白質、カビ、酵母、細菌等に由来する微生物蛋白質、又はこれらの任意の混合物であり、特に限定されるものではない。また、これらの蛋白質を、限外濾過、イオン交換樹脂等の処理により濃縮した蛋白質濃縮物も使用できる。更に、前記蛋白質を予め軽度に加水分解した分解物であって、比較的大きな分子量を有する蛋白質加水分解物を出発原料とすることもできる。
【００１８】
この原料蛋白質を水又は温湯に分散し、溶解する。該溶解液の濃度は格別の制限はないが、通常、５〜１５％程度の蛋白質濃度とすることが効率性及び操作性の点から望ましい。
【００１９】
次いで、前記蛋白質溶液を６５〜９０℃で１〜３０分間程度加熱殺菌することが、雑菌の汚染による腐敗防止の点から望ましい。
【００２０】
本発明の原料蛋白質の第一の加水分解方法に使用されるエンドプロテアーゼ（エンドペプチダーゼ）は、エキソプロテアーゼ活性を有さずエンドプロテアーゼ活性のみを有する蛋白質分解酵素であれば如何なるものであってもよく、動物由来（例えば、トリプシン、キモトリプシン等）、植物由来（例えば、パパイン等）、又は微生物由来（例えば、乳酸菌、酵母、カビ、枯草菌、放線菌等）のエンドプロテアーゼを例示することができる。
【００２１】
尚、第一の加水分解方法に、エキソプロテアーゼ活性を有さずエンドプロテアーゼ活性のみを有する蛋白質分解酵素を使用するのは、後記する試験例からも明らかなとおり、エキソプロテアーゼ活性を有する蛋白質分解酵素を使用した場合には、アミノ酸が遊離し、最終製品である蛋白質加水分解物の回収率が低下し、浸透圧が増加するためである。
【００２２】
本発明の原料蛋白質の第一の加水分解方法は、蛋白質分解酵素としてエンドプロテアーゼを使用し、蛋白質の分解率を２０乃至３０％に調製できる方法であれば特に限定されるものではなく、常法に従って、蛋白質分解酵素法によって行う。具体的には、蛋白質の分解率を２０乃至３０％に調製できる酵素の種類、量、温度、ｐＨ、加水分解時間等の蛋白質分解酵素法による加水分解条件を予備実験で設定し、のち蛋白質加水分解物を調製する。
【００２３】
尚、第一の加水分解の程度の指標として、分解率を使用し、その範囲を２０乃至３０％としたのは、後記する試験例からも明らかなとおり、分解率が２０％未満では、最終製品である蛋白質加水分解物の抗原性が残存するためであり、分解率が３０％を超えるまで加水分解した場合は、最終製品である蛋白質加水分解物の浸透圧が増加するためである。
【００２４】
前記原料蛋白質に対する蛋白質分解酵素の使用量は、基質濃度、酵素力価、反応温度及び反応時間により異なるが、一般的には、原料蛋白質１ｇ当り５０〜１００００活性単位の割合で酵素を単独、又は複数組み合わせて添加することにより加水分解が行われる。尚、酵素の添加は、一括、又は少量若しくは種類毎に分割し、逐次添加することもできる。
【００２５】
また、蛋白質加水分解反応のｐＨは、使用酵素の至適ｐＨに対応して、ｐＨ２〜１０の範囲から選択される。具体的には、前記蛋白質溶液に酵素を添加する前に、使用酵素の種類によりｐＨ２〜１０の範囲内で酸又はアルカリ剤の添加により所望のｐＨに調整することにより実施される。この場合、酸としては塩酸、クエン酸、リン酸等を、また、アルカリ剤としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム等をそれぞれ例示することができる。
【００２６】
蛋白質加水分解反応の温度は、格別の制限はなく、酵素作用の発現する最適温度範囲を含む実用に供せられ得る範囲、即ち、通常３０〜７０℃の範囲から選択される。温度を酵素の至適温度より低温又は高温、例えば５０〜６０℃の範囲に維持することにより蛋白質加水分解反応中の腐敗を防止することもできる。
【００２７】
蛋白質加水分解反応の時間は、使用酵素の種類及び組合せ、反応温度、初発ｐＨ等の反応条件によって進行状態が異なることから、前記のとおり、予備実験で設定された蛋白質の分解率を２０乃至３０％に調製できる範囲で、反応継続時間を決定する必要がある。
【００２８】
酵素反応の停止は、予備実験で設定された加水分解条件に基づいて加水分解の程度が、蛋白質の分解率が２０乃至３０％の範囲内となった時点で、酵素を失活又は除去することにより行う。失活操作は加熱処理（例えば、８５℃で１５分間等）により行うことができる。また、除去操作は限外濾過膜（ウルトラフィルトレーション）等により実施することができる。
【００２９】
得られた中間産物である蛋白質加水分解物を含有する溶液は、そのまま使用することも可能であり、また、必要に応じてこの溶液を逆浸透膜法等の公知の方法により濃縮し、濃縮液として使用することも可能であり、更に、この濃縮液を公知の方法により乾燥して粉末となし、後に行われる膜分画の前に所定濃度で水に溶解して使用することも可能である。
【００３０】
本発明の膜分画工程に使用される膜は、孔径１ｎｍ乃至５μｍの膜であれば如何なるものであってもよく、孔径０．５乃至５μｍの精密濾過膜（マイクロフィルトレーションメンブレン）、孔径１ｎｍ乃至５μｍに相当する１０００乃至１０万ダルトンの分画分子量を有する限外瀘過膜等を例示することができる。
【００３１】
尚、膜分画工程に使用される膜の孔径の範囲を１ｎｍ乃至５μｍとしたのは、後記する試験例からも明らかなとおり、孔径が１ｎｍ未満の膜を使用した場合には、最終製品である蛋白質加水分解物の回収率が低下するためであり、孔径が５μｍを超える膜を使用した場合には、最終製品である蛋白質加水分解物の抗原性が残存するためである。
【００３２】
本発明の膜分画工程は、次のとおり実施する。前記のとおり調製された蛋白質の分解率が２０乃至３０％の範囲内にある中間産物である蛋白質加水分解物を５乃至２０％の濃度の溶液に調整し、前記の孔径１ｎｍ乃至５μｍの膜を使用し、瀘過膜分画処理（いわゆる瀘過処理）を行い、抗原性物質を除去し、膜透過画分を回収することにより実施される。
【００３３】
得られた膜透過画分溶液は、そのまま使用することも可能であり、また、必要に応じてこの溶液を逆浸透膜法等の公知の方法により濃縮し、濃縮液として使用することも可能であり、更に、この濃縮液を公知の方法により乾燥して粉末となし、後に行われる第二の加水分解の前に所定濃度で水に溶解して使用することも可能である。
【００３４】
本発明の第二の加水分解方法に使用されるエキソプロテアーゼ（エキソペプチダーゼ）を含むプロテアーゼは、少なくともエキソプロテアーゼ活性を有する蛋白質分解酵素であれば如何なるものであってもよく、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、若しくは微生物由来（例えば、乳酸菌、アスペルギルス属菌、リゾープス属菌等）のエキソプロテアーゼ、又はエンドプロテアーゼ活性も併せて有するパンクレアチン、ペプシン等を例示することができる。
【００３５】
尚、第二の加水分解方法に、エキソプロテアーゼ活性を有する蛋白質分解酵素を使用するのは、後記する試験例からも明らかなとおり、エキソプロテアーゼ活性を有さずエンドプロテアーゼ活性のみを有する蛋白質分解酵素を使用した場合には、最終製品である蛋白質加水分解物の抗原性が残存するためである。
【００３６】
本発明の第二の加水分解方法は、蛋白質分解酵素としてエキソプロテアーゼを含むプロテアーゼを使用し、蛋白質の分解率を、前記第一の加水分解で得られた分解率に加えて２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率を２５乃至３５％に調製できる方法であれば特に限定されるものではなく、常法に従って、蛋白質分解酵素法によって行う。具体的には、蛋白質の分解率を２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率を２５乃至３５％に調製できる酵素の種類、量、温度、ｐＨ、加水分解時間等の蛋白質分解酵素法による加水分解条件を予備実験で設定し、のち蛋白質加水分解物を調製する。
【００３７】
尚、第二の加水分解の程度の指標として、分解率を使用し、その範囲を２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率を２５乃至３５％としたのは、後記する試験例からも明らかなとおり、増加する分解率が２％未満又は最終的な分解率が２５％未満では、最終製品である蛋白質加水分解物の抗原性が残存するためであり、増加する分解率が８％を超えるか又は最終的な分解率が３５％を超えるまで加水分解した場合は、最終製品である蛋白質加水分解物の浸透圧が増加するためである。
【００３８】
本発明の第二の加水分解方法における蛋白質分解酵素法の各条件は、前記本発明の第一の加水分解方法と同様である。
【００３９】
得られた最終製品である蛋白質加水分解物を含有する溶液は、限外瀘過等の瀘過処理を再度行うことが望ましい。具体的には、６０００ダルトン以下、即ち、市販の１０００乃至６０００ダルトンに分画分子量を有する限外瀘過膜を使用し、瀘過処理を行い、一部残存する可能性のある高分子物質を除去し、膜透過画分を回収することにより実施される。
【００４０】
得られた最終製品である蛋白質加水分解物を含有する溶液は、そのまま使用することもでき、また、必要に応じて、この溶液を逆浸透膜法等の公知の方法により濃縮した濃縮液として使用することもでき、更に、この濃縮液を公知の方法により乾燥し、粉末として使用することもできる。
【００４１】
以上の方法により、蛋白質加水分解物中の抗原性物質を効果的に膜分画除去及び加水分解除去することができ、かつ浸透圧の上昇を抑制して、後記する試験例の結果から明らかなとおり、現時点において全ての従来技術と比較して抗原性が最も低いと考えられる、いわゆる実質的に抗原性を有さず、かつ浸透圧が低い、精製分離されたペプチドとは異なる蛋白質加水分解物を製造することができる。
【００４２】
前記本発明の方法により得られた蛋白質加水分解物は、後記する実施例からも明らかなとおり、低抗原性で浸透圧が低い蛋白質加水分解物である。即ち、本発明の製造方法により得られる蛋白質加水分解物の溶液、その濃縮液又は粉末は、低抗原性で浸透圧が低いことから、下痢症状を併発することが多い食物アレルギー患者の蛋白質源、又は医薬品原料として有用であり、具体的には、アレルギー発症の予防及び治療のための食品又は飲料である調製粉乳、調製乳、栄養補助食品、病態栄養食、流動食等の各種飲食品に応用可能である。
【００４３】
次に、試験例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明においては、次の試験方法を採用した。
【００４４】
（１）蛋白質の分解率算出方法
ケルダール法（日本食品工業学会編、「食品分析法」、第１０２ページ、株式会社光琳、昭和５９年）により試料の全窒素量を測定し、ホルモール滴定法（満田他編、「食品工学実験書」、上巻、第５４７頁、養賢堂、１９７０年）により試料のホルモール態窒素量を測定し、これらの測定値から分解率を次式により算出した。
分解率（％）＝（ホルモール態窒素量／全窒素量）×１００
【００４５】
（２）抗原残存活性の測定方法
サンドウィッチＥＬＩＳＡ法により測定した（松橋直他著、「免疫学実験入門」、第１６０頁、学会出版センター、１９８５年）。
【００４６】
具体的には、抗原蛋白質をウサギに免疫して得たウサギ抗血清から特異ＩｇＧを精製して使用し、これを０．１Ｍ炭酸緩衝液にて希釈してポリスチレン製マイクロプレート（ヌンク社製）の各ウェルに１００μｌずつ分注し、３７℃で２時間静置し、のち０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、PBS-Tween と記載することがある。）により洗浄した。
【００４７】
次いで、１％ゼラチン（バイオラド社製）を含むＰＢＳを１００μｌずつ前記各ウェルに分注し、３７℃で３０分間静置し、のちPBS-Tween により洗浄した。
【００４８】
試料及び標準蛋白質をそれぞれPBS-Tween により希釈し、１００μｌずつ前記各ウェルに分注し、３７℃で１時間静置し、PBS-Tween により洗浄した。
【００４９】
ビオチン化特異ＩｇＧをPBS-Tween により希釈し、１００μｌずつ前記各ウェルに分注し、３７℃で１時間静置後、PBS-Tween により洗浄した。ストレプトアビジン及びビオチン化ぺルオキシダーゼをＰＢＳに溶解し、１００μｌずつ前記各ウェルに分注し、PBS-Tween により洗浄した。
【００５０】
基質としてο−フェレンジアミン溶液を１００μｌずつ前記各ウェルに分注し、室温、暗所にて１０分間反応させ、３Ｍ硫酸を各ウェルに５０μｌずつ添加し、反応を停止した。
【００５１】
次いで、反応生成物をマイクロプレートリーダーを用いて、反応生成物の４９２ｎｍの吸光度を測定し、標準蛋白質の測定値と比較して試料の抗原残存活性を算出した。
【００５２】
（３）浸透圧の測定方法
各試料を１０％濃度で精製水に溶解し、浸透圧測定装置（アドバンスインスツルメンツ社製。アドバンス滲透圧計３Ｄ３。）を使用して浸透圧値（ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ2Ｏ）を測定した。
【００５３】
（４）蛋白質加水分解物の回収率の算出方法
蛋白質加水分解物の回収率（Ａ）は、原料蛋白質の乾燥重量（Ｂ）及び得られた蛋白質加水分解物の乾燥重量（Ｃ）に基づいて、次式により算出した。
Ａ（％）＝（Ｃ／Ｂ）×１００
【００５４】
試験例１
この試験は、従来技術と比較して本発明の蛋白質加水分解物の製造方法が優れていることを示すために行った。
【００５５】
（１）試料の調製
次に示す１０種類の試料を調製した。
試料１：本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料２：従来技術１の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料３：従来技術２の実施例２と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料４：従来技術３の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料５：従来技術４の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料６：従来技術５の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料７：従来技術６の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料８：従来技術７の実施例４と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料９：従来技術８の実施例２と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料10：従来技術９の第５欄、第６欄、及び実施例１の記載に従って、第一及び第二の加水分解の蛋白質分解酵素として、エンドプロテアーゼ活性及びエキソプロテアーゼ活性を共に有するアクチナーゼＡＳ（科研製薬社製）を使用することを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００５６】
（２）試験方法
各試料の蛋白質の分解率、抗原残存活性、及び浸透圧を、いずれも前記の試験方法により試験した。
【００５７】
（３）試験結果
この試験の結果は、表１に示すとおりである。表１から明らかなとおり、従来技術の各試料に比較して本発明の試料１は、抗原残存活性が極めて低く、かつ浸透圧が低い点で優れていることが判明した。
【００５８】
尚、本発明の試料については、原料蛋白質の種類、エンドプロテアーゼの種類、エキソプロテアーゼを含むプロテアーゼの種類、第一の加水分解の分解率を２０乃至３０％の範囲で、膜の種類及び孔径を１ｎｍ乃至５μｍの範囲で、又は第二の加水分解の分解率が、分解率を２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率が２５乃至３５％となる範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００５９】
【表１】
試験例２
この試験は、抗原残存活性及び浸透圧を指標として、各工程の組み合わせ及び順序を調べるために行った。
【００６１】
（１）試料の調製
次に示す６種類の試料を調製した。
試料11：本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料12：膜分画工程を実施しないことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料13：第一の加水分解工程に続いて第二の加水分解工程を実施し、のち膜分画工程を実施したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料14：第二の加水分解工程を最初に実施し、次いで第一の加水分解工程を実施し、のち膜分画工程を実施したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料15：第二の加水分解工程を最初に実施し、次いで第一の加水分解工程を実施し、膜分画工程を実施しないことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料16：第二の加水分解工程を最初に実施し、次いで膜分画工程を実施し、のち第一の加水分解工程を実施したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００６２】
（２）試験方法
各試料の抗原残存活性及び浸透圧を、いずれも前記の試験方法により試験した。
【００６３】
（３）試験結果
この試験の結果は、表２に示すとおりである。表２から明らかなとおり、抗原残存活性が極めて低く、かつ浸透圧が低い蛋白質加水分解物を製造するためには、二つの加水分解工程と膜分画工程の組み合わせが必須であり、エンドプロテアーゼを使用する第一の加水分解工程、次いで膜分画工程、のちエキソプロテアーゼを含むプロテアーゼを使用する第二の加水分解工程の順序で実施することが必要であることが判明した。
【００６４】
尚、本発明の試料については、原料蛋白質の種類、エンドプロテアーゼの種類、エキソプロテアーゼを含むプロテアーゼの種類、第一の加水分解の分解率を２０乃至３０％の範囲で、膜の種類及び孔径を１ｎｍ乃至５μｍの範囲で、又は第二の加水分解の分解率が、分解率を２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率が２５乃至３５％となる範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００６５】
【表２】
試験例３
この試験は、抗原残存活性、浸透圧、及び回収率を指標として、加水分解酵素の種類及びその使用順序を調べるために行った。
【００６７】
（１）試料の調製
次に示す９種類の試料を調製した。
試料17：本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料18：第二の加水分解に使用されるエキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）に変えてエンドプロテアーゼ活性及びエキソプロテアーゼ活性を共に有するアクチナーゼＡＳ（科研製薬社製）を使用したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料19：第二の加水分解に使用されるエキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）に変えてエンドプロテアーゼであるアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボインダストリー社製）を使用したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料20：第一の加水分解に使用されるエンドプロテアーゼであるアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボインダストリー社製）に変えてエキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）を使用したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料21：第一の加水分解に使用されるエンドプロテアーゼであるアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボインダストリー社製）に変えてエキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）を使用し、並びに第二の加水分解に使用されるエキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）に変えてエンドプロテアーゼであるアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボインダストリー社製）を使用したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料22：第一の加水分解に使用されるエンドプロテアーゼであるアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボインダストリー社製）に変えてエキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）を使用し、並びに第二の加水分解に使用されるエキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）に変えてエンドプロテアーゼ活性及びエキソプロテアーゼ活性を共に有するアクチナーゼＡＳ（科研製薬社製）を使用したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料23：第一の加水分解に使用されるエンドプロテアーゼであるアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボインダストリー社製）に変えてエンドプロテアーゼ活性及びエキソプロテアーゼ活性を共に有するアクチナーゼＡＳ（科研製薬社製）を使用したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料24：第一の加水分解に使用されるエンドプロテアーゼであるアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボインダストリー社製）に変えてエンドプロテアーゼ活性及びエキソプロテアーゼ活性を共に有するアクチナーゼＡＳ（科研製薬社製）を使用し、並びに第二の加水分解に使用されるエキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）に変えてエンドプロテアーゼであるアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボインダストリー社製）を使用したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料25：第一の加水分解に使用されるエンドプロテアーゼであるアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボインダストリー社製）に変えてエンドプロテアーゼ活性及びエキソプロテアーゼ活性を共に有するアクチナーゼＡＳ（科研製薬社製）を使用し、並びに第二の加水分解に使用されるエキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）に変えてエンドプロテアーゼ活性及びエキソプロテアーゼ活性を共に有するアクチナーゼＡＳ（科研製薬社製）を使用したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００６８】
（２）試験方法
各試料の抗原残存活性及び浸透圧を、いずれも前記の試験方法により試験した。
【００６９】
（３）試験結果
この試験の結果は、表３に示すとおりである。表３から明らかなとおり、抗原残存活性が極めて低く、かつ浸透圧が低い蛋白質加水分解物を製造するためには、第一の加水分解にはエンドプロテアーゼを使用し、かつ第二の加水分解にはエキソプロテアーゼを含むプロテアーゼを使用することが必要であることが判明した。
【００７０】
尚、本発明の試料については、原料蛋白質の種類、エンドプロテアーゼの種類、エキソプロテアーゼを含むプロテアーゼの種類、第一の加水分解の分解率を２０乃至３０％の範囲で、膜の種類及び孔径を１ｎｍ乃至５μｍの範囲で、又は第二の加水分解の分解率が、分解率を２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率が２５乃至３５％となる範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００７１】
【表３】
試験例４
この試験は、抗原残存活性、浸透圧、及び回収率を指標として、第一の加水分解の適正な分解率を調べるために行った。
【００７３】
（１）試料の調製
酵素反応の停止時期を変更して、表４に示すとおり、第一の加水分解の分解率を段階的に変更したことを除き、実施例１と同一の方法により４種類の試料（試料番号２６〜２９）を調製した。
【００７４】
（２）試験方法
各試料の抗原残存活性、浸透圧、及び回収率を、いずれも前記の試験方法により試験した。
【００７５】
（３）試験結果
この試験の結果は、表４に示すとおりである。表４から明らかなとおり、抗原残存活性が極めて低く、かつ浸透圧が低い蛋白質加水分解物を、６０％以上の高回収率で製造するためには、第一の加水分解の分解率を２０乃至３０％の範囲内とすることが必要であることが判明した。
【００７６】
尚、本発明の試料については、原料蛋白質の種類、エンドプロテアーゼの種類、エキソプロテアーゼを含むプロテアーゼの種類、膜の種類及び孔径を１ｎｍ乃至５μｍの範囲で、又は第二の加水分解の分解率が、分解率を２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率が２５乃至３５％となる範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００７７】
【表４】
試験例５
この試験は、抗原残存活性、浸透圧、及び回収率を指標として、膜分画工程に使用される膜の適正な孔径を調べるために行った。
【００７９】
（１）試料の調製
孔径の異なる各種の市販の膜を使用して、表５に示すとおり、膜分画工程に使用される膜の孔径を段階的に変更したことを除き、実施例１と同一の方法により４種類の試料（試料番号３０〜３３）を調製した。
【００８０】
（２）試験方法
各試料の抗原残存活性、浸透圧、及び回収率を、いずれも前記の試験方法により試験した。
【００８１】
（３）試験結果
この試験の結果は、表５に示すとおりである。表５から明らかなとおり、抗原残存活性が極めて低く、かつ浸透圧が低い蛋白質加水分解物を、６０％以上の高回収率で製造するためには、膜分画工程に使用される膜の孔径を１ｎｍ乃至５μｍの範囲内とすることが必要であることが判明した。
【００８２】
尚、本発明の試料については、原料蛋白質の種類、エンドプロテアーゼの種類、エキソプロテアーゼを含むプロテアーゼの種類、第一の加水分解の分解率を２０乃至３０％の範囲で、膜の種類、又は第二の加水分解の分解率が、分解率を２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率が２５乃至３５％となる範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００８３】
【表５】
試験例６
この試験は、抗原残存活性、浸透圧、及び回収率を指標として、第二の加水分解の適正な分解率を調べるために行った。
【００８５】
（１）試料の調製
酵素反応の停止時期を変更して、表６に示すとおり、第二の加水分解の増加する分解率及び最終的な分解率を段階的に変更したことを除き、実施例１と同一の方法により次に示す１２種類の試料（試料番号３４〜４５）を調製した。
試料34：第一の加水分解の分解率を２０％とし、第二の加水分解の酵素反応を、分解率を４％増加し、かつ最終的な分解率が２４％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料35：第一の加水分解の分解率を２０％とし、第二の加水分解の酵素反応を、分解率を５％増加し、かつ最終的な分解率が２５％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料36：第一の加水分解の分解率を２０％とし、第二の加水分解の酵素反応を、分解率を８％増加し、かつ最終的な分解率が２８％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料37：第一の加水分解の分解率を２０％とし、第二の加水分解の酵素反応を、分解率を９％増加し、かつ最終的な分解率が２９％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料38：第二の加水分解の酵素反応を、分解率を１％増加し、かつ最終的な分解率が２６％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料39：第二の加水分解の酵素反応を、分解率を２％増加し、かつ最終的な分解率が２７％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料40：第二の加水分解の酵素反応を、分解率を８％増加し、かつ最終的な分解率が３３％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料41：第二の加水分解の酵素反応を、分解率を９％増加し、かつ最終的な分解率が３４％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料42：第一の加水分解の分解率を３０％とし、第二の加水分解の酵素反応を、分解率を１％増加し、かつ最終的な分解率が３１％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料43：第一の加水分解の分解率を３０％とし、第二の加水分解の酵素反応を、分解率を２％増加し、かつ最終的な分解率が３２％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料44：第一の加水分解の分解率を３０％とし、第二の加水分解の酵素反応を、分解率を５％増加し、かつ最終的な分解率が３５％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
試料45：第一の加水分解の分解率を３０％とし、第二の加水分解の酵素反応を、分解率を６％増加し、かつ最終的な分解率が３６％となった時点で停止したことを除き、本発明の実施例１と同一の方法により製造した蛋白質加水分解物
【００８６】
（２）試験方法
各試料の抗原残存活性、浸透圧、及び回収率を、いずれも前記の試験方法により試験した。
【００８７】
（３）試験結果
この試験の結果は、表６に示すとおりである。表６から明らかなとおり、抗原残存活性が極めて低く、かつ浸透圧が低い蛋白質加水分解物を、６０％以上の高回収率で製造するためには、第二の加水分解の分解率は、分解率を２乃至８％の範囲内で増加し、かつ最終的な分解率が２５乃至３５％となる範囲内とすることが必要であることが判明した。
【００８８】
尚、本発明の試料については、原料蛋白質の種類、エンドプロテアーゼの種類、エキソプロテアーゼを含むプロテアーゼの種類、第一の加水分解の分解率を２０乃至３０％の範囲で、又は膜の種類及び孔径を１ｎｍ乃至５μｍの範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００８９】
【表６】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９１】
【実施例】
実施例１
市販の牛乳乳清蛋白質濃縮物１．３ｋｇ（ミライ社製。蛋白質当量として１ｋｇ）を脱イオン水９ｋｇに溶解し、蛋白質濃度約１０％の乳清蛋白質水溶液１０．３ｋｇを調製した。該乳清蛋白質水溶液をプレート式熱交換器を使用して７０℃で１分間加熱殺菌し、液温を５３℃に調整し、１０％水酸化ナトリウム水溶液及び２０％炭酸カリウム水溶液を使用して、ｐＨを９．５に調整し、エンドプロテアーゼであるアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボインダストリー社製）を蛋白質当量１ｇ当たり１０００活性単位の割合で添加し、第一の蛋白質加水分解反応を開始した。１３時間経過し、分解率が２５％となった時点で、プレート式熱交換器を使用して１２０℃で１５秒間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。
【００９２】
この加水分解液を、孔径０．５μｍの限外濾過膜（旭化成工業社製。分画分子量６０００）により膜分画し、透過画分を凍結乾燥し、粉末状の蛋白質加水分解物約１０００ｇ（蛋白質当量として７７０ｇ）を得た。
【００９３】
次いで、得られた蛋白質加水分解物全量を、脱イオン水９０００ｇに溶解し、約１０％濃度の蛋白質加水分解物水溶液１０ｋｇを調製した。該蛋白質加水分解物水溶液の液温を５３℃に調整し、エキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）を蛋白質当量１ｇ当たり５００活性単位の割合で添加し、第二の蛋白質加水分解反応を開始した。８時間経過し、分解率を５％増加し、かつ最終的な分解率が３０％となった時点で、プレート式熱交換器を使用して１２０℃で１５秒間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。
【００９４】
この加水分解液を凍結乾燥し、粉末状の蛋白質加水分解物約９４０ｇ（蛋白質当量として７２０ｇ）を得た。
【００９５】
得られた蛋白質加水分解物を前記試験方法により試験した結果、抗原残存活性は１０-9であって極めて低く、浸透圧は３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ2Ｏであって低く、かつ原料蛋白質に対する蛋白質加水分解物の回収率は７２％と優れていた。
【００９６】
実施例２
市販の牛乳カゼイン１２０ｇ（ニュージーランドデイリーボード製。蛋白質当量として１００ｇ）を蒸留水８８０ｇに分散し、１０％水酸化ナトリウム水溶液を使用して、ｐＨを７．０に調整し、カゼインを完全に溶解し、蛋白質濃度約１０％のカゼイン水溶液約１ｋｇを調製した。該カゼイン水溶液を８５℃で１５分間加熱殺菌し、液温を５０℃に調整し、１０％水酸化カリウム水溶液を使用して、ｐＨを９．５に調整し、エンドプロテアーゼであるビオプラーゼｓｐ−２０（長瀬生化学工業社製）、プロテアーゼＮアマノ（天野製薬社製）、及びＰＴＮ６．０Ｓ（ノボインダストリー社製）をそれぞれ蛋白質１ｇ当たり１２００活性単位、２０００活性単位、及び７０００活性単位の割合で添加し、蛋白質加水分解反応を開始した。１３時間経過し、分解率が３０％となった時点で、９０℃で２０分間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。
【００９７】
この加水分解液を、孔径０．４５μｍの精密濾過膜（ミリポア社製）により膜分画し、透過画分を凍結乾燥し、粉末状の蛋白質加水分解物約８９ｇ（蛋白質当量として７４ｇ）を得た。
【００９８】
次いで、得られた蛋白質加水分解物全量を、脱イオン水８０１ｇに溶解し、約１０％濃度の蛋白質加水分解物水溶液８９０ｇを調製した。該蛋白質加水分解物水溶液の液温を５０℃に調整し、エンドプロテアーゼ活性及びエキソプロテアーゼ活性を共に有するアクチナーゼＡＳ（科研製薬社製）を蛋白質当量１ｇ当たり１５００活性単位の割合で添加し、第二の蛋白質加水分解反応を開始した。４時間経過し、分解率を３％増加し、かつ最終的な分解率が３３％となった時点で、プレート式熱交換器を使用して１２０℃で１５秒間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。
【００９９】
この加水分解液を、ケイソウ土濾過により不溶物を除去し、凍結乾燥し、粉末状の蛋白質加水分解物約７７ｇ（蛋白質当量として６４ｇ）を得た。
【０１００】
得られた蛋白質加水分解物を前記試験方法により試験した結果、抗原残存活性は１０-9であって極めて低く、浸透圧は３００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ2Ｏであって低く、かつ原料蛋白質に対する蛋白質加水分解物の回収率は６４％と優れていた。
【０１０１】
実施例３
市販の牛乳乳清蛋白質濃縮物２．６ｋｇ（ミライ社製。蛋白質当量として２ｋｇ）を脱イオン水１８ｋｇに溶解し、１０％水酸化ナトリウム水溶液を使用して、ｐＨを７．２に調整し、蛋白質濃度約１０％の乳清蛋白質水溶液２０．６ｋｇを調製した。該乳清蛋白質水溶液をプレート式熱交換器を使用して８０℃で６分間加熱殺菌し、液温を５３℃に調整し、１０％水酸化カリウム水溶液を使用して、ｐＨを９．０に調整し、エンドプロテアーゼであるＰＴＮ６．０Ｓ（ノボインダストリー社製）、プロテアーゼＮアマノ（天野製薬社製）、及びアルカラーゼ２．４Ｌ（ノボインダストリー社製）をそれぞれ蛋白質１ｇ当たり５０００活性単位、２０００活性単位、及び５００活性単位の割合で添加し、蛋白質加水分解反応を開始した。１０時間経過し、分解率が２０％となった時点で、１２０℃で３秒間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。
【０１０２】
この加水分解液を、孔径０．２μｍの限外濾過膜（旭化成工業社製。分画分子量３０００）により膜分画し、透過画分として蛋白質加水分解物水溶液約１８ｋｇを得た。該蛋白質加水分解物水溶液の液温を５５℃に調整し、エキソプロテアーゼであるプロテアーゼＡアマノ（天野製薬社製）を蛋白質当量１ｇ当たり５００活性単位の割合で添加し、第二の蛋白質加水分解反応を開始した。１０時間経過し、分解率を７％増加し、かつ最終的な分解率が２７％となった時点で、プレート式熱交換器を使用して１２０℃で３秒間加熱して酵素を失活させ、酵素反応を停止し、１０℃に冷却した。
【０１０３】
この加水分解液を、孔径０．２μｍの限外濾過膜（旭化成工業社製。分画分子量３０００）により不溶物を除去し、透過画分を凍結乾燥し、粉末状の蛋白質加水分解物約１９６０ｇ（蛋白質当量として１５００ｇ）を得た。
【０１０４】
得られた蛋白質加水分解物を前記試験方法により試験した結果、抗原残存活性は１０-9であって極めて低く、浸透圧は３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ2Ｏであって低く、かつ原料蛋白質に対する蛋白質加水分解物の回収率は７５％と優れていた。
【０１０５】
【発明の効果】
以上詳記したとおり、本発明は、蛋白質加水分解物の製造方法に関するものであり、本発明により奏せられる効果は次のとおりである。
１）本発明の蛋白質加水分解物の製造方法は、原料蛋白質に対する蛋白質加水分解物の回収率を良好に保持して、下痢症状を併発することが多い食物アレルギー患者に対して使用可能な低抗原性で浸透圧が低い蛋白質加水分解物を製造することができる。
２）得られた蛋白質加水分解物は、低抗原性で浸透圧が低いことから、下痢症状を併発することが多い食物アレルギー患者の蛋白質源、又は医薬品原料として有用である。
Claims (2)
- 原料蛋白質であるカゼイン又は乳清蛋白質に、エンドプロテアーゼにより、分解率が２０乃至３０％の範囲で第一の加水分解を実施し、得られた蛋白質加水分解物を孔径１ｎｍ乃至５μｍの膜を使用して膜分画し、透過画分に、エキソプロテアーゼを含むプロテアーゼにより、分解率を２乃至８％増加し、かつ最終的な分解率が２５乃至３５％となる範囲で、第二の加水分解を実施することを特徴とする蛋白質加水分解物の製造方法。
- 第二の加水分解を実施した後に、得られた蛋白質加水分解物を、６０００ダルトン以下の分画分子量を有する限外濾過膜を使用して濾過処理し、膜透過画分を回収することを特徴とする請求項１に記載の蛋白質加水分解物の製造方法。
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