CN117224652A - 最新鉴定出的用于诱导幼年哺乳动物口服耐受性的肽 - Google Patents

最新鉴定出的用于诱导幼年哺乳动物口服耐受性的肽 Download PDF

Info

Publication number
CN117224652A
CN117224652A CN202310924448.1A CN202310924448A CN117224652A CN 117224652 A CN117224652 A CN 117224652A CN 202310924448 A CN202310924448 A CN 202310924448A CN 117224652 A CN117224652 A CN 117224652A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
peptides
combination
milk
composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310924448.1A
Other languages
English (en)
Inventor
C·布兰卡特
S·努特恩
A·潘乔德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Societe des Produits Nestle SA
Original Assignee
Societe des Produits Nestle SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Societe des Produits Nestle SA filed Critical Societe des Produits Nestle SA
Priority to CN202310924448.1A priority Critical patent/CN117224652A/zh
Publication of CN117224652A publication Critical patent/CN117224652A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/001—Preparations to induce tolerance to non-self, e.g. prior to transplantation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/40—Complete food formulations for specific consumer groups or specific purposes, e.g. infant formula
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7032—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a polyol, i.e. compounds having two or more free or esterified hydroxy groups, including the hydroxy group involved in the glycosidic linkage, e.g. monoglucosyldiacylglycerides, lactobionic acid, gangliosides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/733—Fructosans, e.g. inulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/736—Glucomannans or galactomannans, e.g. locust bean gum, guar gum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/745—Bifidobacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/01—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/01—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof
    • A61K38/012—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals
    • A61K38/018—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals from milk
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/577—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 tolerising response

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pediatric Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及最新鉴定出的肽，所述肽能够诱导对牛乳、尤其是对β‑乳球蛋白的耐受性。所述肽可施用于哺乳动物，尤其是对牛乳蛋白有变态反应风险的幼小婴儿，以诱导对牛乳的口服耐受性；所述肽也可施用于对牛乳有变态反应的儿童或成人，以允许发生对变应原性乳蛋白、尤其是β‑乳球蛋白的“脱敏”。所述肽也可用于诱导对山羊和水牛乳蛋白、尤其是β‑乳球蛋白的耐受性。所述肽能够调节哺乳动物对变应原的免疫应答。

Description

最新鉴定出的用于诱导幼年哺乳动物口服耐受性的肽
本申请是申请日为2013年12月16日的、发明名称为“最新鉴定出的用于诱导幼年哺乳动物口服耐受性的肽”的中国专利申请201380081636.7(PCT/EP2013/076643)的分案申请。
技术领域
本发明涉及最新鉴定出的β-乳球蛋白肽，这些肽具备低变应原性，但仍保留诱导对天然蛋白的耐受性的能力。可将这些肽施用于所有婴儿，尤其是有牛乳蛋白(具体为β-乳球蛋白)变态反应风险的婴儿。这些肽能够调节婴儿对变应原的免疫应答。
背景技术
牛乳变态反应(CMA)累及所有婴儿的大约2.5％，被认为是该年龄组最为常见的食物变态反应[Sicherer SH et al.(2010),Food allergy,Sampson HA,J.AllergyClin.Immunol.(125)(Sicherer SH等人，2010年，“食物变态反应”，Sampson HA，《变态反应与临床免疫学杂志》，第125卷)]。大约85％的儿童对牛乳的变态反应随着成长而逐渐消失，在2至3岁之前不再出现。因此，CMA对其他年龄组的影响不太普遍。
对牛乳和适宜满足婴儿需求的含牛乳配方食品的变态反应是由于这样的事实：牛乳的蛋白质不同于母乳的蛋白质，因而可构成变应原。
除母乳喂养外，预防CMA的主要建议是使用部分水解的低变应原性配方食品，推荐给特应性父母所生的“高风险”无症状婴儿服用这种配方食品。
与用于婴儿的标准牛乳配方食品相比，低变应原性配方食品中的牛乳蛋白已被水解，潜在变应原性降低。现已证实这种方法能有效地预防配方食品中存在的天然(全长)蛋白(尽管含量比非水解配方食品中的低得多)的致敏作用。
水解产物可被表征为“部分水解的”或“充分水解的”，具体取决于水解反应进行的程度。世界变态反应组织(WAO)有关CMA的指南中所称“充分水解产物”，目前还没有约定的法律/临床定义，但已达成共识的是正如WAO所称，现已证实经水解的配方食品是可用于罹患CMA的婴儿、也被广泛用于这类婴儿的蛋白质来源。在本发明中，部分水解产物的定义是：其中60％的蛋白质/肽群体的分子量小于1000道尔顿的水解产物；充分水解产物的定义是：其中至少95％的蛋白质/肽群体的分子量小于1000道尔顿的水解产物。这些定义目前用于本行业。
目前市面上有许多基于酪蛋白或乳清、还具备低变应原性的部分或充分水解配方食品，例如雀巢公司(Nestlé)出品的NAN-HATM(亦称BEBA-HATM)、AlfareTM、AltéraTM，以及辉瑞公司(Pfizer)出品的S26-HATM。
对于已表现CMA症状的婴儿而言，非变应原性代乳配方食品例如基于游离氨基酸的配方食品(例如，雀巢公司(Nestlé)出品的VivonexTM)或基于大豆的配方食品(例如纽约辉瑞公司(Pfizer,New York)出品的S-26SoyTM、NURSOYTM，以及雀巢公司(Nestlé)出品的Good/> )可为牛乳标准配方食品或低变应原性配方食品的合适替代品。
因此，截至目前在向发生牛乳变态反应的儿童提供营养方面的主要关注点，一直是寻找不会诱发变态反应的制品，也就是提供非变应原性配方。向婴儿施用非变应原性配方食品(包含游离氨基酸、基于大豆的乳品或充分水解的牛乳蛋白)的缺点之一是，虽然此类配方使对牛乳有变态反应的婴儿得以避免变态反应，但它们无法使这些儿童产生对牛乳蛋白变应原的口服耐受性，所以这些儿童日后无法继续饮用未改变的乳制品。
口服耐受性是指事先经口服途径施用抗原，而特异性抑制细胞和/或体液对抗原的免疫反应。这是出生后前几个月免疫系统发育的重要组成部分，可使婴儿在吃东西时不出现不良反应。若未能建立口服耐受性，便引起变态反应。口服耐受性的产生与正常的免疫系统教育(减弱对食物抗原的反应)有关。
现已鉴定出了影响口服耐受性的诱导和维持的若干因素，这些因素包括食物蛋白质的结构、抗原施用的剂量和频率，以及宿主的免疫状态。
据信，可特别存在于部分水解婴儿配方食品中的一些肽能够与免疫系统相互作用，因而诱导口服耐受性。
已经发现，部分水解的乳配方不仅具有降低的变应原性，还可诱导对乳蛋白的免疫耐受性(EP 0827 679)。
因此，欧洲专利申请EP 2 332 428公开了一种配方，其包含能够诱导口服耐受性的含牛乳肽的水解产物。所讨论的肽被鉴定为源自牛酪蛋白。
WO 00/42863描述了鉴定β-乳球蛋白(主要牛乳变应原之一)的多种致耐受性肽的方法，这些致耐受性肽能够诱导口服耐受性，证据是与未接触所讨论的肽的小鼠相比，先前接触过所讨论的肽的小鼠对该天然蛋白的免疫应答(IgE)减弱。在该专利申请中，作者提到了EP 0 629 350，其中公开了非变应原性乳清蛋白水解产物的用途，据称非变应原性乳清蛋白水解产物能够诱导牛乳蛋白耐受性。WO 00/42863的作者指出，尽管EP 0 629 350中表明了基本上不含变应原性蛋白的乳清蛋白水解产物可用于在有牛乳变态反应风险的儿童体内诱导牛乳蛋白耐受性，但他们在分析其他非变应原性乳清蛋白水解产物后发现，非变应原性不一定体现为诱导牛乳蛋白耐受性的能力。他们还表示，甚至一些表现出最高程度非变应原性的配方，也被发现不适于诱导牛乳蛋白耐受性。
此外，已知的是，充分水解的配方食品失去了诱导长期口服耐受性的能力，也就是说，水解以某种方式充分修饰了蛋白的性质，导致该蛋白不再被免疫系统识别。这造成关键有益效果损失。
因此，需要进一步鉴定可影响口服耐受性的诱导的因素。非常希望提供低变应原性或非变应原性组合物，这些组合物可用作母乳的补充或替代品，还能够诱导婴儿的口服耐受性。
需要提供可缓解(尤其是婴儿的)变态反应发展的合成营养液。需要诱导对多种变应原(包括乳变应原和乳蛋白)的耐受性。
还需要设计和制备营养干预(尤其是利用合成成分或成分的组合)，这些营养干预可在生命早期施用于婴儿，降低以后生活中呈现或发生变态反应或变态反应发展的可能性或严重程度。
一般婴儿群体以及体质易发生变态反应或发生过已公布变态反应的婴儿亚群都有该需求。
普遍需要缓解变态反应或变态反应症状，还需要开发诱导(尤其是儿童和婴儿)对常见变应原例如乳变应原的耐受性的方法。
发明内容
本发明提供了最新鉴定出的β-乳球蛋白(BLG)的肽，即SEQ ID No.1至SEQ IDNo.5，这些肽用于在有蛋白变态反应风险的个体以及已发生变态反应的个体中诱导对乳蛋白的耐受性。最新鉴定出的肽SEQ ID No.1-5被HLA-DR(人白细胞抗原-DR)所识别并结合于其上。因此，这些肽每一者都包含HLA表位，该HLA表位有利于被免疫细胞识别，还有利于诱导哺乳动物对乳蛋白(尤其是β-乳球蛋白(BLG))的口服耐受性。乳蛋白可来自奶牛、绵羊、山羊或水牛。
因此，本发明涉及肽或肽的组合，所述肽具有五至十二个氨基酸的氨基酸长度并包含选自SEQ ID No.1-5的序列，用于诱导哺乳动物对来自奶牛、绵羊、水牛或山羊的乳蛋白的口服耐受性。人类婴儿尤其受到关注。
为增强致耐受性效应，可将具有五至十二个氨基酸的长度并包含表1中的序列a、b和c之一的一种或多种肽，与上一段落中所述的基于SEQ ID No.1-5的肽或肽的组合联合施用。
这些肽可按其纯形式施用；稀释于合适的液体中施用；或按药物组合物、营养组合物或营养补充剂的形式施用。
根据本发明的一个实施方案，这些肽为如下形式：(i)水解含BLG的蛋白类物质所得的分离的肽级分，和/或(ii)以合成方式制备的肽。
这些肽的主要优点是，可诱导哺乳动物对奶牛、绵羊、水牛或山羊乳蛋白(尤其是β-乳球蛋白)的口服耐受性。这些哺乳动物可为幼年哺乳动物，特别是人类婴儿，他们要么因父母至少一方或至少一个同胞对牛乳有变态反应，而有发展牛乳变态反应的“高风险”，要么没有“高风险”。因此，本发明的肽有益于幼年哺乳动物的一般群体。可受益于施用本发明的肽的另一组，是已对牛乳有变态反应的成年哺乳动物。因此，有变态反应的成年哺乳动物在接触本发明的致耐受性肽之后，可对天然变应原“脱敏”。所以可将这些肽中的一种或多种(两种、三种、四种或所有五种)施用于哺乳动物，以诱导对乳蛋白(尤其是BLG)的口服耐受性。
可将这些肽施用于宠物，例如狗和猫。
这些肽与之前从BLG鉴定出的肽(参见表1中的肽a、b、c)(参见WO 0042863)相比占有优势。接触BLG后，与之前鉴定出的肽a、b和c(参见图1)相比，肽2-5更大程度下调了IgE的表达(参见图1)。
在一个优选的实施方案中，所述肽或肽的组合为肽级分的形式，其包含肽SEQ IDNo.1至SEQ ID No.5中的至少一种。可将所述肽或肽的组合以0.4-50μmol/kg体重/天、优选0.9-40μmol/kg体重/天的剂量施用于幼年哺乳动物或成年哺乳动物。可每天施用一次、每隔一天施用一次、每隔两天施用一次，或每周施用一次并至少持续两周，优选至少持续一个月，更优选至少持续三个月。可持续施用更长时间，例如最多三年。
对未接触过BLG的受试者来说，“一次”施用便可有效诱导对BLG的口服耐受性。
这些肽可按组合物的形式施用，该组合物为干品时，每克包含25至250μg肽，优选50至150μg肽。可将这些肽加入基础组合物中，该基础组合物为1段婴儿配方食品(starterinfant formula)或较大婴儿配方食品(follow-up infant formula)或成长乳(growingup milk)。所述基础组合物可为“非变应原性”或低变应原性组合物。
这些肽可按组合物的形式施用，所述组合物包含另外的成分或益生元，优选地选自菊粉、低聚果糖(FOS)、短链低聚果糖(短链FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、神经节苷脂、部分水解的瓜尔豆胶、阿拉伯树胶、大豆胶或它们的混合物。
这些肽可按组合物的形式施用，所述组合物包含另外的成分或益生菌，优选地选自副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、乳杆菌(Lactobacillus)GG、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)以及短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)。
附图说明
图1：强饲天然β-乳球蛋白(nBLG)或合成肽、接着以实验方式致敏的小鼠体内的β-乳球蛋白(BLG)特异性体液免疫应答。
给小鼠强饲nBLG或合成肽，接着以实验方式用nBLG致敏小鼠。定量测定第30天采集的单独血清中的BLG特异性IgE(A)抗体浓度。使用Kruskall-Wallis和Dunn多重比较事后检验，结果显示了指定组之间的统计显著性(*p<0.05，**0.01<p<0.001，***p<0.001)。
具体实施方式
在本发明中，术语“耐受性”应被理解为特异性免疫无应答性的状态。免疫应答的体液(抗体)途径和细胞介导(淋巴细胞等)途径都可受到耐受性诱导的抑制。口服耐受性受破坏被认为是食物变态反应的根本原因。
术语“变应原”应被理解为能够引发哺乳动物、尤其是“高风险”幼年哺乳动物(包括婴儿或乳婴)的变态反应的蛋白或巨肽。如果父母至少一方或至少一个同胞为特应性体质，则幼小婴儿被认为有蛋白变态反应的“高风险”。
术语“致耐受性肽”应被理解为这样的蛋白片段，其对应于天然蛋白的一部分，大小为200至6000Da(3至50个氨基酸)，优选为500至3000Da，更优选为500至1400Da，并能够诱导对天然蛋白的特异性口服耐受性。
术语“非变应原性”基础组合物应被理解为氮源包含均衡的氨基酸组成的组合物。“非变应原性”对于乳蛋白而言，被定义为单独乳清蛋白不超过1ppm的残余变应原性，以及总酪蛋白不超过10ppm的残余变应原性。
术语“致敏”意指变应原特异性IgG1和/或IgE抗体的诱导/发展。
本发明涉及多种最新鉴定出的肽，以及使用这些肽诱导幼年哺乳动物的一般群体(包括被认为有发展CMA的“高风险”的群体和没有发展CMA的“高风险”的群体)以及对牛乳有变态反应的成年哺乳动物产生对牛乳蛋白(尤其是对β-乳球蛋白)的口服耐受性。最新鉴定出的肽也可诱导对来自绵羊、山羊或水牛的BLG的口服耐受性，因为这些肽也存在于绵羊乳、山羊乳和水牛乳中。
本发明的肽具有五至十二个氨基酸的氨基酸长度，并包含选自SEQ ID No.1-5(参见表1)的序列。所述肽因而具有特定长度(5至12个氨基酸)。
短于五聚物(长度为五个氨基酸)的肽可能无法提供致耐受性效应，而长于12聚物的肽被认为具有增大的变应原性风险。
因此，所述肽可为包含选自SEQ ID No.1-5的序列中任一者的5聚物、6聚物、7聚物、8聚物、9聚物、10聚物、11聚物或12聚物。因此，所述肽可为任一种这样的肽：其为包含序列IIAEK(SEQ ID No.1)、IVTQTM(SEQ ID No.1)、KGLDIQK(SEQ ID No.2)、DAQSAPLR(SEQ IDNo.3)、VEELKPTPE(SEQ ID No.4)或IIAEK(SEQ ID No.5)的5聚物、6聚物、7聚物、8聚物、9聚物、10聚物、11聚物或12聚物。
相似地，在与基于序列SEQ ID No.1-5的上述肽一起施用时可提供增强效果的肽是任一种这样的肽：其为5聚物、6聚物、7聚物、8聚物、9聚物、10聚物、11聚物或12聚物，并包含选自表1中的a、b和c的序列中任一者。
因此，本发明的肽诱导哺乳动物对来自奶牛、绵羊、水牛或山羊的乳蛋白的口服耐受性。
肽的制备和表征
根据本发明的一个实施方案，可采用技术人员已知的标准方法，以合成方式制备分离的肽。另选地，根据本发明的另一个实施方案，这些肽可从天然来源例如乳(如牛乳)或乳级分浓缩、提取和/或分离，所述天然来源优选地经过改性、处理，以便例如产生或浓缩这些肽。可采用本领域已知的方法生成其中乳蛋白已由酶或其他方式水解的乳水解产物。从乳水解产物中提取、分离和鉴定包含本发明肽的肽级分的方法也是技术人员已知的。本发明的肽可通过这些方法生成。
例如，本发明的肽可使用US 5039532A中公开的方法制备。酶水解过程包含一个分为两步的水解反应，在该水解反应的两个步骤之间有一个热变性步骤，用于确保最终水解产物基本上不含完整的变应原性蛋白。例如，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶可用于这些方法，这两种酶可以是提取猪胰脏制备的制品、或利用重组DNA技术在细菌中制备的制品。
例如，可使用包含乳清蛋白的任一种乳清原料进行酶水解。该原料可以是来自奶酪制作过程的乳清，特别是甜乳清(例如用凝乳酶凝固酪蛋白得到的甜乳清)、用酸凝固酪蛋白得到的酸乳清、或酸化发酵剂，甚至是在酸和凝乳酶共同作用下凝固得到的混合乳清。该原料可以是通过离子交换和/或通过电渗析脱除了矿质的乳清。该乳清可以是最多只含一点乳糖的乳清蛋白浓缩物，其是例如通过超滤、任选地之后进行渗析而获得的。该原料甚至可为上述原料与乳糖的组合。该原料可为真正的水溶液或胶态水溶液的形式，或者粉末的形式。若为粉末的形式，则粉末溶解于优选被脱除了矿质的水中，以形成水溶液。
使用在碱性和中性范围内有活性的混合或纯化的蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胰酶)，按已知的方式对该原料进行酶水解。该初步水解可使用少量酶(例如占水解所用总量的10％)进行相对短的时间，优选5至35分钟，例如10分钟。这能节省酶的用量。在这种情况下，水解仅部分完成。该水解过程可在反应器内进行，或另选地在管内进行。
如果待水解的底物在热处理期间可能趋于凝固，则可将螯合剂(例如柠檬酸钙或柠檬酸镁)加入该底物，如例如美国专利No.4,748,034中指出的那样。在6至8的pH值下，80℃至100℃热处理水解产物3至10分钟。热处理时间和温度无疑是相关的，温度下限对应时间上限，反之亦然。现已证实，在工业热交换器中使用大约90℃的温度和5分钟左右的停留时间，便足以使微量蛋白质变性。实际上已发现，这些蛋白质变性后更易接受后续的酶降解处理。宜提及的是，热处理使酶失活。
然后将水解产物冷却到40℃至60℃，优选冷却到大约55℃，55℃是保证水解活性的最适温度。优选的是，通过添加碱的水溶液，将pH值调节至大约7.5。第二次水解的条件可能有变。例如，可在恒温控制的釜式反应器中以分批方式不连续地进行。添加蛋白水解酶(选自胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰酶，或者胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶的混合物)水溶液之后，水解60至180分钟。
否则，第二次水解可在构成紊流状态反应器的管中连续进行1至60分钟，优选2至20分钟。采用这种变型时，在管中反应要获得待水解产物的生产量所要求的一段时间，具体时间量取决于管的长度。因此，必须将酶连续泵送到驻留管的入口。所得的高紊流状态导致酶与底物迅速而剧烈地接触。不论选用何种模式(分批或连续)执行第二次水解，都对水解产物进行热处理，使酶失活。该热处理包括将水解产物预热到75℃或75℃以上，接着在该温度下(优选在75℃至85℃下)保持约5分钟以促进酶自身消化，有利的是在该处理之后灭菌，优选以注入蒸汽方式或在热交换器中，在超高温度下(例如125℃至135℃下)灭菌2至3分钟。然后，可例如通过喷雾干燥法或冷冻干燥法干燥水解产物，以用于不同应用，或者甚至可对水解产物进行后续处理。在后一种情况下，酶可在后续处理期间失活。
肽的鉴定和表征
在实施例1中详述的一组实验中，本发明人鉴定出了负责诱导对乳蛋白(尤其是BLG)的口服耐受性的BLG肽序列。在第一步中，使用基于细胞的测定法，将雀巢公司(Nestlé)出品的部分水解婴儿配方食品NAN HATM(另称作BEBE HATM)与表达主要组织相容性复合体(MHC)II类受体HLA-DR的人类细胞一起温育。作为诱导口服耐受性的第一步，HLA受体将肽序列呈递给T细胞，从而诱导耐受性。因此，耐受性的产生很大程度上取决于MHC对肽序列的识别。
MHC的肽结合区域识别由平均十个氨基酸、最少五个氨基酸构成的肽序列或肽装配物。实际上，这些五肽可包含在更长的肽序列(甚至蛋白质)中，因为这些肽序列在胃肠道中会被消化，而得到这种5至18个氨基酸的较小肽尺寸。这部分解释了游离氨基酸、二肽、三肽和四肽所构成的充分水解产物无法诱导口服耐受性的原因。
因此在本发明中，在存在NAN-HATM配方食品(经证实对细胞无毒)的情况下培养表达HLA-DR的人类细胞，利用免疫沉淀法分离结合于HLA受体的肽，然后通过质谱和氨基酸测序进行鉴定。
最新鉴定出的肽来自BLG，列于表1中。
还通过该方法鉴定出了肽a即IDALNENK、肽b即VLDTDY和肽c即EVDDEALEK。这些肽之前在WO 20042863中被鉴定为口服耐受性的诱导物。这些肽在后一文献中被鉴定为较长肽序列的一部分。因此，这些已知的肽充当本实验中的阳性对照。
证实这些肽在体内具有致耐受性
利用BLG致敏实验小鼠模型，进一步评估了这些肽序列在体内诱导口服耐受性的能力(参见实施例2和图1)。
该动物模型之前已用于展示天然BLG在强饲后诱导耐受性的功效[Patient,Ketet al.,(2011).Oral tolerance and Treg cells are induced in BALB/c mice aftergavage with bovineβ-lactoglobulin.Allergy,66(10),1312-1321(Patient,Ket等人，2011年，“强饲牛β-乳球蛋白后在BALB/c小鼠中诱导口服耐受性和Treg细胞”，《变态反应》，第66卷，第10期，第1312-1321页)]。有趣的是，在后一文章中，已展示经过胰蛋白酶水解的BLG不会诱导口服耐受性。
小鼠模型用于测量全长天然BLG以及与牛BLG的序列(84-106)和(25-107)对应的两种BLG合成肽诱导口服耐受性的水平。在第1天、第2天、第3天、第8天、第9天和第10天采用强饲法，给小鼠喂食天然BLG或者合成肽(84-106)或(25-107)。然后在第14天通过腹膜内施用天然BLG，使这些小鼠致敏。在第30天与第33天之间测量血清IgE水平。
从图1可以看出，强饲天然BLG有效诱导了耐受性，从而防止在用BLG致敏后进一步诱导BLG特异性IgE生成。肽(25-107)包含本发明的序列2、3、4、5，以及之前已知的肽a，其与对照(PBS)相比导致血清IgE水平下降(p＝0.04)。肽(84-106)包含序列5、a、b和c，其与PBS相比，展示出导致IgE水平下降的趋势。
本发明人推断，与来源于序列(84-106)的肽(a、b和c)相比，来源于序列(25-107)的肽1-5在该小鼠模型中诱导口服耐受性方面更为有效。这些较长的肽序列(25-107)和(84-106)一旦被强饲给小鼠，就自然而然地被胰酶和蛋白酶加工，从而产生较小的肽，包括含有序列SEQ ID No.1-5及序列a、b和c的肽。
该实验展示，最新鉴定出的肽1-5被HLA-DR识别并结合于其上。然后这些肽可被呈递给T细胞。该过程允许诱导对包含这些序列的变应原性蛋白(即BLG)的口服耐受性。现已基于诱导口服耐受性的能力，筛选了根据本发明的肽或肽1-5的组合。
根据本发明的一个实施方案，为诱导口服耐受性而施用的肽或肽的组合选自序列SEQ ID No.1-5。
据推测，与选自表1中的已知肽a、b和c的一种或多种肽联合施用时，肽所产生的致耐受性效应得到加强。与肽组a、b、c或1-5单独服用时所诱导的效应相比较，预期该组合在诱导对BLG的口服耐受性方面提供增强的效应。
因此，根据本发明的一个实施方案，将选自SEQ ID No.1-5的肽或肽组合与肽a、b和c联合施用。
序列SEQ ID No.1-5已被鉴定为在如下物种的BLG中是高度保守的(序列同一性为100％)：奶牛、水牛、家山羊、绵羊和摩弗伦羊。因此，据信包含这些序列的这些乳源中的任一种都可诱导对牛乳的口服耐受性，反之亦然。所以本发明人推测，本发明人鉴定出的肽可诱导对来自这些源中任一源的BLG的口服耐受性。在许多国家，山羊乳和绵羊乳被用来替代牛乳，或用来补充牛乳。市面上已有使用山羊乳乳清作为蛋白质来源的婴儿配方食品。因此，将本发明的成果应用于来自除奶牛之外物种的乳可能很有价值。
根据本发明的一个实施方案，以足以诱导对牛BLG的口服耐受性(优选诱导对牛BLG的完全口服耐受性)的量施用所述肽或肽的组合。BLG也可来自绵羊或山羊。完全口服耐受性指的是，在用牛乳(特别是牛BLG)进行DBPCFC(双盲安慰剂对照食物激发试验)后未观察到变态反应。
根据本发明的一个实施方案，这些肽的含量可为总蛋白的0.01％至5％，优选0.1％至0.5％。
根据本发明的一个实施方案，这些肽的组合包含一种或两种或三种或四种或更多种肽。
所述肽或肽的组合可被单独地(以其纯的形式，或稀释于例如水或母乳中)或作为组合物直接经口施用于幼年哺乳动物，所述组合物为婴儿乳品配方食品或食物补充剂(例如人乳强化剂)。所述肽或肽的组合也可在营养性喂养期间所用的任何乳载体、非乳基婴儿配方食品、婴孩米粉或酸奶、婴孩餐奶酪布丁、乳制品或果汁饮料、冰沙、小吃、饼干或其他烘焙食品中施用。所述肽或肽的组合可被以饮料、食物或食物补充剂的形式施用于成人。所述肽或肽的组合也可以在宠物食物和饮料(例如任何干燥食物或粗磨食物、湿润食物或罐装食物、或者补充剂)中施用。
合成肽和/或由人工方法浓缩的肽可为人造婴儿配方食品、人造水解婴儿配方食品(部分或充分水解)或一般性人造营养组合物的一部分。此类组合物可为本发明的实施方案。
此类组合物可按指示的剂量用作营养液或药物，以诱导尤其是对乳蛋白的口服耐受性。可将此类组合物施用于婴儿，或呈现变态反应症状或变态反应易感性的婴儿亚群。这样诱导口服耐受性，可在中期(治疗期间或在治疗后1、6、12或18个月内)缓解变态反应。另选地或此外，所诱导的口服耐受性在以后生活中(例如，治疗后24、36、48、72个月)，尤其是在免疫系统已成熟后，可能有积极的效果。
剂量
根据本发明的一个实施方案，这些肽的剂量在0.4至50μmol/kg体重/天的范围内，优选在0.9至40μmol/kg体重/天的范围内。例如，如果这些肽作为粉末状婴儿配方食品的一部分施用，则这些肽在该配方食品中的浓度可为50至150μg/g粉末。供婴儿食用的婴儿配方食品的典型剂量是：对五个月大的婴孩来说，每天三瓶，每瓶七勺粉末；对六个月大或六个月以上的婴孩来说，每天两瓶，每瓶七勺粉末。所述剂量以下列婴孩平均体重为基础：六个月大时，约8千克；十二个月大时，约9.5千克。
施用时间
本发明的肽的施用时间可为连续的或不连续的。要获得更持久的效果，优选连续施用。然而，据推测，不连续模式(例如，在每月某一周内每日施用，或者每施用一周(每日施用)停用一周)可为幼年哺乳动物或成年哺乳动物带来积极效果。
根据本发明的一个实施方案，对尚未接触BLG的幼年哺乳动物(“初治受试者”)来说，据推测，本发明的肽或肽组合的“一次剂量”可足以诱导对BLG的口服耐受性。更一般地说，建议采用更长的持续时间，例如，在一至三周内每天施用。
在已接触BLG的幼年哺乳动物中，优选地采用更长的施用时间。一般来讲，虽然预计采用相对较短的施用持续时间(例如，在一至四周内每天施用)就能得到积极效果，但据信更长的持续时间能使效果增强(例如，对人类来说三至六个月的持续时间，以及对其他哺乳动物来说相对应的时间)。
对于已对BLG有变态反应的成年哺乳动物而言，可能需要至少一个月的施用时间才能实现“脱敏”。
优选地，施用方式为每日服用(每日服用一次或两次)或每周服用(每周服用四次或三次或两次或一次)。
与其他化合物一起施用
这些肽可单独地施用(以其纯形式施用，或稀释于例如水或乳(包括人乳)中)，或与其他化合物(诸如膳食补充剂、营养补充剂、药物、载体、调味剂、易消化或不易消化的成分)混合施用。
这些肽可例如作为组合物的一部分施用给幼小婴儿，该组合物为人乳强化剂或其他营养补充剂。如果要将这些肽施用给成人，则这些肽可作为食物、饮料或膳食补充剂的一部分施用。这些肽也可在药物组合物中施用给所有受试者(幼年哺乳动物或成年哺乳动物等)。
根据本发明的一个实施方案，这些肽可加入到或包含在基础组合物中，该基础组合物为用于哺乳动物、特别是人类和宠物的低变应原性组合物。因此，其中添加有或可含有这些肽的基础配方食品可为低变应原性(HA)配方食品或非变应原性配方食品，在低变应原性(HA)配方食品中，乳蛋白被部分水解，而在非变应原性配方食品中，乳蛋白被充分水解，或被替换为游离氨基酸或牛乳替代品诸如基于大豆的乳品。这种基础配方食品可例如为用于具有特定生理/病理状态的儿童的婴儿配方食品、较大婴儿配方食品或营养组合物。
在一个实施方案中，基础配方食品是元素性婴儿配方食品，并且该基础配方食品不包含肽或蛋白质，而仅包含氨基酸。在一个实施方案中，基础配方食品的蛋白质部分地或完全地来源于已去除cGMP的甜乳清。在这方面可参见EP880902，其中的一种工艺允许去除牛乳清中几乎所有酪蛋白糖巨肽(富含苏氨酸且色氨酸含量很低的级分)，从而提高α-乳白蛋白比例(色氨酸非常丰富的级分)。通过将该改性甜乳清级分与脱脂乳相结合，同时加入一些游离L-组氨酸和L-精氨酸(以便达到EC指令所要求的这些氨基酸的最小量)，使得根据本发明的配方具有更接近人乳的氨基酸分布，其特征具体地讲在于具有相当的色氨酸和苏氨酸水平，从而允许将其蛋白质含量调整为人乳的蛋白质含量。
当与上述优化的蛋白质分布一起施用时，应当理解，这些肽可与优化的蛋白质协同地作用，从而不仅实现口服耐受性的诱导，同时还提供优化的蛋白质营养价值(这可通过以最适定量方式满足蛋白质需求来增强这些肽的效果)。
当与元素性氨基酸一起施用时，应当理解，这些肽的效果不会因存在潜在变态反应诱导性蛋白质而被隐匿或抑制。
可将这些肽例如作为婴儿配方食品的一部分以每克粉末中50μg-150μg肽的浓度施用。
其中加有这些肽的基础低变应原性组合物可包含作为氮源的肽或游离氨基酸，尤其是来自奶牛或山羊或绵羊的乳蛋白，诸如乳清蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白酸、酪蛋白酸盐、或α、β、κ-酪蛋白。氮源可提供总能量的至少7％至25％。
维生素和矿物质是典型膳食补充剂的示例。在一个优选的实施方案中，该组合物与其他化合物一起施用，所述其他化合物能增强对幼年哺乳动物或有变态反应的成年哺乳动物的免疫力的所述效果。此类化合物可以是协同地或单独地影响婴儿的免疫应答并且/或者增强这些肽的效果的其他活性化合物，诸如益生菌和益生元。
已知的益生菌化合物的示例是芽孢杆菌属(Bacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterum)、乳杆菌属(Lactobacillus)、酵母属(Saccharomyce)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、屎肠球菌(E.Faecium)、大肠杆菌(E.Coli)Nissle。具体地讲，益生菌和非复制型益生菌，诸如乳杆菌属、双歧杆菌属或它们的组合，例如副干酪乳杆菌、乳杆菌GG、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、乳双歧杆菌、短双岐杆菌或它们的组合，以及这些细菌的应用。
已知的益生元化合物的示例是选自如下物质的碳水化合物：菊粉、低聚果糖(FOS)、短链低聚果糖(短链FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、神经节苷脂、部分水解的瓜尔豆胶(PHGG)、阿拉伯树胶、大豆胶或它们的混合物。可存在其他碳水化合物，诸如与第一碳水化合物协同作用的第二碳水化合物，其选自低聚木糖(XOS)胶、阿拉伯树胶、淀粉、部分水解的瓜尔豆胶或它们的混合物。所述一种或多种碳水化合物可以约1g至约20g存在，或者以占组合物日剂量的1％至80％或20％至60％存在。另选地，碳水化合物以干燥组合物的10％至80％存在。
在一个实施方案中，根据WO2007/090894(一般教导内容，特别是实施例1)，基础配方食品或最终营养组合物包含低聚糖的混合物。其可特别地与GOS联合使用。基础配方食品可提供低聚糖混合物，该低聚糖混合物包含5重量％-70重量％的选自GalNAcα1,3Galβ1,4Glc和Galβ1,6GalNAcα1,3Galβ1,4Glc的至少一种N-乙酰化低聚糖、20重量％-90重量％的选自Galβ1,6Gal、Galβ1,6Galβ1,4Glc Galβ1,6Galβ1,6Glc、Galβ1,3Galβ1,3Glc、Galβ1,3Galβ1,4Glc、Galβ1,6Galβ1,6Galβ1,4Glc、Galβ1,6Galβ1,3Galβ1,4Glc Galβ1,3Galβ1,6Galβ1,4Glc和Galβ1,3Galβ1,3Galβ1,4Glc的至少一种中性低聚糖，以及5重量％-50重量％的选自NeuAcα2,3Galβ1,4Glc和NeuAcα2,6Galβ1,4Glc的至少一种唾液酸化低聚糖。
在一个实施方案中，基础配方食品的混合物或最终营养组合物的混合物包含10重量％-70重量％的指定N-乙酰化低聚糖、20重量％-80重量％的指定中性低聚糖以及10重量％-50重量％的指定唾液酸化低聚糖。更优选地，该混合物包含15重量％-40重量％的N-乙酰化低聚糖、40重量％-60重量％的其他中性低聚糖以及15重量％-30重量％的唾液酸化低聚糖。特别优选的混合物包含30重量％的N-乙酰化低聚糖、50重量％的中性低聚糖以及20重量％的唾液酸化低聚糖。
另选地，该混合物可适宜地包含5重量％-20重量％的指定N-乙酰化低聚糖、60重量％-90重量％的指定中性低聚糖以及5重量％-30重量％的指定唾液酸化低聚糖。
本发明的低聚糖混合物可由一种或多种动物乳制备。所述乳可得自任何哺乳动物，特别是得自奶牛、山羊、水牛、马、大象、骆驼或绵羊。
另选地，低聚糖混合物可通过购买并混合单独的组分来制备。例如，合成的低聚半乳糖诸如Galβ1,6Galβ1,4Glc Galβ1,6Galβ1,6Glc、Galβ1,3Galβ1,4Glc、Galβ1,6Galβ1,6Galβ1,4Glc、Galβ1,6Galβ1,3Galβ1,4Glc和Galβ1,3Galβ1,6Galβ1,4Glc以及它们的混合物可以商标和/>商购获得。低聚糖的其他供应商为Dextra实验室(DextraLaboratories)、西格玛奥德里奇化学有限责任公司(Sigma-Aldrich Chemie GmbH)和协和发酵工业株式会社(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。另选地，可使用特定糖基转移酶(例如半乳糖基转移酶)来生产中性低聚糖。
可通过将氨基葡糖苷酶和/或氨基半乳糖苷酶作用于N-乙酰基葡萄糖和/或N-乙酰基半乳糖来制备N-乙酰化低聚糖。同样地，N-乙酰基-半乳糖基转移酶和/或N-乙酰基-半乳糖基转移酶也可用于此目的。N-乙酰化低聚糖还可通过发酵技术使用相应的酶(重组酶或天然酶)和/或微生物发酵制得。在后一种情况下，微生物可表达其天然酶和底物，或者可被工程改造成能够产生相应的底物和酶。可使用单一微生物培养物或混合培养物。可以最初具有任意聚合度(DP)的受体底物为起始物，逐步聚合(从DP＝1开始)形成N-乙酰化低聚糖。另一种选择是将游离的己酮糖或与低聚糖(如，乳酮糖)结合的己酮糖(如，果糖)化学转化成N-乙酰己糖胺或包含N-乙酰己糖胺的低聚糖，如Wrodnigg,T.M.；Stutz,A.E.(1999)Angew.Chem.Int.Ed.38:827-828(Wrodnigg,T.M.、Stutz,A.E.，1999年，《德国应用化学》，第38卷，第827-828页)中所述。
可通过层析或过滤技术从天然来源例如动物乳中分离唾液酸化低聚糖，即3`唾液酸化乳糖和6`唾液酸化乳糖。另选地，也可通过利用特异性唾液酸转移酶的生物技术方法，通过基于酶的发酵技术(重组酶或天然酶)或微生物发酵技术来制备唾液酸化低聚糖。在后一种情况下，微生物可表达其天然酶和底物，或者可被工程改造成能够产生相应的底物和酶。可使用单一微生物培养物或混合培养物。可以最初具有任意聚合度(DP)的受体底物为起始物，逐步聚合(从DP＝1开始)形成唾液酸化低聚糖。
在本发明的一个优选方面，将上述低聚糖混合物掺入食物产品中。在本发明的上下文中，术语“食物产品”旨在涵盖任何可食用的物质。因此，“食物产品”可为旨在供人类食用的产品，特别是婴儿配方食品、较大婴儿配方食品、婴孩食物诸如婴儿米粉等等。具体地讲，可将本发明的低聚糖混合物掺入婴儿配方食品、脱水奶粉或米粉混合物中。
上述低聚糖以某种方式呈现出增强受试者免疫状态(上调或下调)的有利效果，使得受试者更易接收这些肽对口服耐受性的诱导。该增强效果可直接作用于免疫系统或炎症途径，或可通过由低聚糖选择性地促进的肠益生菌介导。
该组合物中可包含一种或多种必需长链脂肪酸(LC-PUFA)。可添加的LC-PUFA的示例为二十二碳六烯酸(DHA)和花生四烯酸(AA)。可将LC-PUFA以一定浓度加入，使得它们占该组合物中存在的脂肪酸的0.01％以上。
如果需要，可在营养组合物中包含一种或多种食品级乳化剂；例如，二乙酰基酒石酸单和双甘油酯、卵磷脂及单和双甘油酯，或它们的混合物。相似地，可包含合适的盐和/或稳定剂。可将调味剂加入该组合物中。
这些肽可掺入到或存在于如下组合物中：该组合物为适用于未足月产下的婴儿或在出生时体重低的婴儿的婴儿“早产儿配方食品”、“1段婴儿配方食品”或“较大婴儿配方食品”。在实施例3中给出了此类1段婴儿配方食品的示例。
实施例1：分离和鉴定能够诱导对BLG的口服耐受性的肽
细胞培养
为了评估两种不同人类单核细胞(U937和Thp1)中的MHC受体表达情况，在冰上用APC缀合的抗HLA-DR(Santa Cruz Biotechnologies(圣克鲁斯生物技术公司)，cloneL243)对细胞染色30分钟，用补充有0.5％FCS(Amimed，Bioconcept(百康特公司))的冷PBS1X(Sigma(西格玛公司))洗涤两次，然后在流动分析仪BD Fortessa(BD(碧迪公司))上进行分析。
为了评估BEBA-HA婴儿配方食品对U937和Thp1细胞系的毒性，将细胞与在完全RPMI1640培养基中复原的各种浓度的BEBA-HA产品(在10mg至1ng的范围内)一起温育。将细胞以1×106个细胞/mL的浓度接种于24孔板中，在存在5％ CO2的情况下以37℃温育24h。将细胞离心沉降下来，并用补充有0.5％ FCS的PBS1X洗涤两次，然后用PE膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒I(BD Pharmingen(碧迪医药公司))进行染色。最后，在BD Fortessa(BD(碧迪公司))上通过流式细胞术对细胞进行分析。结果表明，在实验所用的剂量下，BEBA-HA对细胞是无毒的。
将Thp1和U937细胞以1×106个细胞/mL的浓度接种于T175cm2(Falcon)中含L-谷氨酰胺(Sigma(西格玛公司))且补充有10％热灭活FCS(Amimed，Bioconcept(百康特公司))和青霉素/链霉素(Sigma(西格玛公司))的20mL RPMI-1640培养基中，在存在5％ CO2的情况下以37℃温育24小时，所述培养基分别加有1μg/mL和100μg/mL的BEBA-HA(Nestlé(雀巢公司)，批号L02680742AP)。将细胞离心沉降下来，并收集用于进行MHC-肽复合体的免疫沉淀。
蛋白质裂解物和免疫沉淀
简而言之，对于所测试的每种条件(对于两种细胞系，均不在对照中加入BEBA-HA，而在样品中加入BEBA-HA)，均将2×107个细胞重悬于冰冷TBS中并洗涤三次。然后将细胞沉淀物重悬于包含1％ CHAPS和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中。在裂解后，收集上清液，并与抗体-PAS微珠混合，该抗体-PAS微珠事先通过如下方式制备：将60μl的PAS微珠与50μg对HLA-DR分子具有特异性的MHC II单克隆抗体(Clone L243)一起温育。在4℃下伴随轻柔振荡过夜温育裂解物和Ab-微珠。在亲和捕获后，将微珠离心沉降下来，并弃去上清液。分别使用如下条件进行若干次洗涤：1×1mL 1％ CHAPS缓冲液，1×1mL 20mM Tris/50mM NaCl，1×1mL 20mM Tris pH 8.0。洗涤后，将200μl的10％乙酸溶液加入微珠中，温和地涡旋，然后在70℃下温育15min。将微珠在14000g下离心5min沉降下来。重复该步骤一次。将两次的上清液合并，然后使用10kDa截留分子量的超滤管(Amicon Ultra，Millipore(密理博公司))进行过滤。将渗余物(主要包含HLA-DR抗体和HLA-DR分子)和滤液(包含HLA-DR呈递肽)保持在20℃下，以用于进一步的LC-MS/MS分析。
MS分析
在MS分析之前，使用反相C18(The Nest group,USA(美国雀巢集团))或混合模式OASIS(Waters,USA(美国沃特世公司))脱盐柱，按照制造商手册中所述的方法，对HLA-DR肽进行脱盐。脱盐后，使用与Orbitrap XL仪器连接的用于肽分离(2-35％乙腈/0.1％甲酸，在30分钟内)的内部Magic C18柱(150×0.075mm)，通过纳米级LC-MSMS分析肽。使用每次全扫描含量最高的五种离子的数据依赖性采集技术，选择肽进行碎片化。开启动态排除，排除持续时间为30秒。使用碰撞诱导解离(CID)以35％碰撞能量进行碎片化。最后通过对牛乳数据库进行Sequest数据库搜索，对肽进行鉴定，并且基于光谱质量和得分进行手动验证。
实施例2：强饲nBLG或合成肽、接着以实验方式致敏的小鼠体内的BLG特异性体液 免疫应答
小鼠
将无特定病原(SPF)的BALB/cJ小鼠(3至4周龄雌鼠，Centre d’Elevage RenéJanvier,Le Genest Saint-Isle,France(法国勒热内斯圣伊斯尔的勒内·让维耶畜牧中心))圈养在过滤饲养笼中，处于正常SPF饲养条件下(高压灭菌的垫料和无菌水)，驯化两周后进行实验。用适当饮食饲养这些小鼠，所述饮食去除了动物蛋白质，并且使用专门的夹心免疫测定法未在其中检出BLG。所有动物实验根据欧共体动物管理规定进行，并且获得了French Veterinary Services(法国兽医局)的授权91-368。所有实验均由(VeterinaryInspection Department of Essonne,France(法国埃松省兽医检查部门))的协议No.2009-DDSV-074(2009年10月29日)涵盖。
施用BLG和合成肽的效果
给各组小鼠(每组6只或7只)施用4mg的天然牛BLG，或等量(即，0.22μmol)的分离的合成BLG肽。施用与牛BLG序列编号84-106(MW 2731Da)对应的0.6mg的合成肽(84-106)或者与牛BLG序列编号25-107(MW 9440Da)对应的2mg的合成肽(25-107)(n＝7/组)。九只对照小鼠接受PBS。将合成肽(25-107)和(84-106)稀释于PBS中。使用动物喂养针(Popper&sons,NY(纽约波普父子公司))以胃内强饲的方式在第1、2、3、8、9和10天进行施用。对照小鼠接受PBS(阴性对照小鼠，n＝16)。然后在第14天通过腹膜内施用5μg吸附到明矾上的天然牛BLG(铝胶3％，Superfos,Danemark(丹麦舒珀弗斯公司)，1mg/小鼠)，使所有小鼠致敏。
通过如下方式评估小鼠致敏的效力：在第30-33天之间对处于浅麻醉(异氟烷，Baxter(百特公司))状态的小鼠从眼窝后静脉丛采集单独血清样品，对该样品的BLG特异性IgE抗体进行定量测量。非特异性结合是使用来自10只初次实验的小鼠的单独血清来确定，并且根据用免疫血清测得的吸光度值来推断的。
使用非配对t检验及Welch校正进行统计分析，分析表明接受肽(25-107)的小鼠和PBS组的BLG特异性IgE抗体浓度之间存在显著性差异(p＝0.04)(参见图1)。
统计分析
所有统计分析均使用适用于Windows的GraphPad Prism版本4.00(GraphPadSoftware,San Diego,CA,USA(美国加利福尼亚州圣地亚哥GraphPad软件公司))进行。首先使用Shapiro-Wilk正态性检验检查正态分布，之后再用单因素方差分析和Tukey多重比较事后检验进行统计显著性的分析。当数据不呈正态分布时，使用Kruskal-Wallis检验，然后使用Dunn多重比较检验(DMCT)，来进行非参数检验。当p<0.05时，则视为各组之间存在显著差异。使用非配对t检验对两个特定组进行比较，并且对对数转换数据进行Welch校正，从而获得可比较的变异性。
实施例3：
下面给出了根据本发明使用的婴儿配方食品的组成的实施例。该组成仅以举例的方式给出。
/>

Claims (19)

1.用于诱导哺乳动物对来自奶牛、绵羊、水牛或山羊的乳蛋白的口服耐受性的肽或所述肽的组合，所述肽具有五至十二个氨基酸的氨基酸长度并且包含选自SEQ ID No.1-5的序列。
2.根据权利要求1所述的肽或肽的组合，其中所述肽或肽的组合还与具有五至十二个氨基酸的氨基酸长度并且包含选自a、b和c的序列的一种或多种肽相组合。
3.根据权利要求1或2所述的肽或肽的组合，其中所述哺乳动物为人类婴儿。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的肽的组合，其中所述组合由两种、或三种、或四种、或更多种肽组成。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的肽或肽的组合，其中所述一种或多种肽来源于乳，特别是来源于β-乳球蛋白。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的肽或所述肽的组合，其中所述肽或肽的组合以如下形式存在：(i)水解包含变应原性蛋白，特别是β-乳球蛋白的蛋白质类物质所得的分离的肽级分，和/或(ii)合成制备的一种或多种肽。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的肽或所述肽的组合，其中在事先、同时或后续用β-乳球蛋白致敏时，所述肽或肽的组合下调哺乳动物中的IgE表达。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的肽或所述肽的组合，其中所述肽或肽的组合以0.4-50μmol/kg体重/天、优选地0.9-40μmol/kg体重/天的剂量施用。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的肽或所述肽的组合，其中所述肽或肽的组合每天施用一次，或每隔一天施用一次，或每隔两天施用一次，或每周施用一次，并持续至少一周的时间，优选地至少一个月，更优选地至少三个月。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的肽或所述肽的组合，其中所述肽或肽的组合施用于对牛乳有变态反应风险的婴儿或儿童，或对牛乳有变态反应的成人。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的肽或所述肽的组合，其中所述肽或肽的组合施用于伴侣动物。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的肽或所述肽的组合，其中所述肽或肽的组合以其纯形式施用，或稀释于水或人乳中，或加入到或包含于作为营养补充剂、人乳强化剂或婴儿配方食品的组合物中施用。
13.根据权利要求12所述的肽或所述肽的组合，其中所述组合物为“非变应原性”或低变应原性组合物。
14.根据权利要求13所述的肽或所述肽的组合，其中所述“非变应原性”或低变应原性组合物为1段婴儿配方食品(starter infant formula)、或较大婴儿配方食品(follow-upinfant formula)或成长乳(growing up milk)。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的肽或所述肽的组合，其中所述肽或肽的组合在组合物中施用，所述组合物包含25-250μg肽/克干燥组合物，优选地50-150μg肽/克干燥组合物。
16.根据权利要求12至15中任一项的所述肽或肽的组合，其中所述组合物包含另外的成分或益生元，优选地选自菊粉、低聚果糖(FOS)、短链低聚果糖(短链FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、神经节苷脂、部分水解的瓜尔豆胶、阿拉伯树胶、大豆胶或它们的混合物。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的肽或所述肽的组合，其中所述组合物包含另外的成分或益生菌，优选地选自副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、乳杆菌(Lactobacillus)GG、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)以及短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)。
18.包含选自序列SEQ ID No.1-5的至少一种肽的组合物用于诱导哺乳动物对奶牛、水牛或山羊乳蛋白的口服耐受性。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述奶牛、水牛或山羊乳蛋白为β-乳球蛋白。
CN202310924448.1A 2013-12-16 2013-12-16 最新鉴定出的用于诱导幼年哺乳动物口服耐受性的肽 Pending CN117224652A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310924448.1A CN117224652A (zh) 2013-12-16 2013-12-16 最新鉴定出的用于诱导幼年哺乳动物口服耐受性的肽

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2013/076643 WO2015090347A1 (en) 2013-12-16 2013-12-16 Newly identified peptides for use in the induction of oral tolerance in young mammals
CN201380081636.7A CN105828830A (zh) 2013-12-16 2013-12-16 最新鉴定出的用于诱导幼年哺乳动物口服耐受性的肽
CN202310924448.1A CN117224652A (zh) 2013-12-16 2013-12-16 最新鉴定出的用于诱导幼年哺乳动物口服耐受性的肽

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380081636.7A Division CN105828830A (zh) 2013-12-16 2013-12-16 最新鉴定出的用于诱导幼年哺乳动物口服耐受性的肽

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117224652A true CN117224652A (zh) 2023-12-15

Family

ID=49841652

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310924457.0A Pending CN117018181A (zh) 2013-12-16 2013-12-16 最新鉴定出的用于诱导幼年哺乳动物口服耐受性的肽
CN201380081636.7A Pending CN105828830A (zh) 2013-12-16 2013-12-16 最新鉴定出的用于诱导幼年哺乳动物口服耐受性的肽
CN202310924448.1A Pending CN117224652A (zh) 2013-12-16 2013-12-16 最新鉴定出的用于诱导幼年哺乳动物口服耐受性的肽

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310924457.0A Pending CN117018181A (zh) 2013-12-16 2013-12-16 最新鉴定出的用于诱导幼年哺乳动物口服耐受性的肽
CN201380081636.7A Pending CN105828830A (zh) 2013-12-16 2013-12-16 最新鉴定出的用于诱导幼年哺乳动物口服耐受性的肽

Country Status (13)

Country Link
US (1) US10092633B2 (zh)
EP (1) EP3082842B1 (zh)
CN (3) CN117018181A (zh)
AU (1) AU2013407963B2 (zh)
BR (1) BR112016012701B1 (zh)
ES (1) ES2918577T3 (zh)
MX (1) MX2016007714A (zh)
MY (1) MY186968A (zh)
PH (1) PH12016501114A1 (zh)
PT (1) PT3082842T (zh)
RU (1) RU2668155C1 (zh)
WO (1) WO2015090347A1 (zh)
ZA (1) ZA201604931B (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016148562A1 (en) * 2015-03-18 2016-09-22 N.V. Nutricia Method for inducing oral tolerance via administration of beta-lactoglobulin derived peptide in combination with probiotic
WO2016198630A1 (en) * 2015-06-12 2016-12-15 Nestec S.A. Combination of tolerogenic peptides and tfg-b for use in the induction and maintenance of oral tolerance in young mammals
CN108314704B (zh) * 2018-01-25 2020-03-17 海普诺凯营养品有限公司 一种羊乳清蛋白免疫调节肽、其制备方法及其应用
WO2019212329A1 (en) 2018-04-30 2019-11-07 N.V. Nutricia Formula with specific beta-lactoglobulin peptides
WO2019212330A1 (en) 2018-04-30 2019-11-07 N.V. Nutricia Formula with a specific beta-lactoglobulin peptide
WO2021091369A1 (en) 2019-11-07 2021-05-14 N.V. Nutricia Extensive whey protein hydrolysate with tolerogenic peptides
CN113311155B (zh) * 2021-04-09 2022-11-29 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心） 一种牛乳蛋白和水牛乳蛋白二联检测卡的制备方法及应用

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1200416A (en) 1983-05-13 1986-02-11 Societe Des Produits Nestle S.A. Food process
EP0321603A1 (fr) 1987-12-23 1989-06-28 Societe Des Produits Nestle S.A. Procédé de préparation d'un hydrolysat de protéines de lactosérum et d'un aliment hypoallergéniques
GB9312369D0 (en) 1993-06-16 1993-07-28 Sandoz Nutrition Ltd Organic compounds
US5620348A (en) 1995-05-12 1997-04-15 Timex Corporation Method of manufacturing electroluminescent lamps having surface designs and lamps produced thereby
EP0880902A1 (fr) 1997-05-27 1998-12-02 Nestlé Produkte AG Procédé de traitement d'une matiére première lactosérique
MY129566A (en) * 1999-01-19 2007-04-30 Nestle Sa A hypoallergenic composition containing tolerogenic peptides inducing oral tolerance
JP3441411B2 (ja) * 1999-10-12 2003-09-02 明治乳業株式会社 コレステロール低減化ペプチド
RU2192884C2 (ru) 2000-11-09 2002-11-20 Государственное учреждение Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН Вакцина для стимуляции противоопухолевого иммунитета
US20040007700A1 (en) 2002-07-01 2004-01-15 Hazel Danny G. Non-snagging protective guide for fish tapes
US20060286208A1 (en) * 2005-06-01 2006-12-21 Nagendra Rangavajla Methods for producing protein partial hydrolysates and infant formulas containing the same
US20100056458A1 (en) * 2005-06-30 2010-03-04 Campina Nederland Holding B.V. Peptides Inhibiting Angiotensin-Converting Enzyme
BRPI0707620A2 (pt) 2006-02-10 2011-05-10 Nestec Sa mistura de oligossacarÍdeo
EP2332428B1 (en) 2009-12-04 2014-08-20 MJN U.S. Holdings LLC Nutritional Formulation comprising a cow's milk peptide-containing hydrolysate and/or peptides derived thereof for tolerance induction
WO2011150949A1 (en) * 2010-06-04 2011-12-08 N.V. Nutricia Non-digestible oligosaccharides for oral induction of tolerance against dietary proteins
WO2012075570A1 (en) * 2010-12-09 2012-06-14 Mcgill University Bioactive peptides and proteins containing bioactive peptides, their uses and processes for making the same
US20130344042A1 (en) * 2012-06-20 2013-12-26 Gretchen Tanbonliong Dietary management of celiac disease and food allergy

Also Published As

Publication number Publication date
MX2016007714A (es) 2017-02-28
US10092633B2 (en) 2018-10-09
PH12016501114B1 (en) 2016-07-11
EP3082842A1 (en) 2016-10-26
US20160375114A1 (en) 2016-12-29
BR112016012701A2 (pt) 2017-09-26
PH12016501114A1 (en) 2016-07-11
AU2013407963B2 (en) 2019-10-10
PT3082842T (pt) 2022-06-17
WO2015090347A1 (en) 2015-06-25
BR112016012701B1 (pt) 2022-11-16
RU2016128923A (ru) 2018-01-23
RU2668155C1 (ru) 2018-09-26
EP3082842B1 (en) 2022-04-13
CN117018181A (zh) 2023-11-10
ZA201604931B (en) 2020-01-29
MY186968A (en) 2021-08-26
ES2918577T3 (es) 2022-07-19
CN105828830A (zh) 2016-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1146794B1 (en) A hypoallergenic composition containing tolerogenic peptides inducing oral tolerance
EP3082842B1 (en) Newly identified peptides for use in the induction of oral tolerance
AU2016247052B2 (en) Milk-based protein hydrolysates and infant formulae and nutritional compositions made thereof
KR101277047B1 (ko) 저-락토스의 부분적으로 가수분해된 유아용 조제유
AU2013407963A1 (en) Newly identified peptides for use in the induction of oral tolerance in young mammals
KR102661055B1 (ko) 어린 포유류에서 경구 관용의 유도 및 유지에 사용하기 위한 관용원성 펩티드 및 tfg-β의 조합물
Sgarbieri Impact of Bovine Milk Whey Proteins and Peptides on Gastrointestinal, Immune, and Other Systems
CZ22359U1 (cs) Hypoalergenní mléčný přípravek pro dospívající a dospělou populaci
Akın Development of functional food ingredient as a solution for protein-energy malnutrition; an amino acid source with low-phenylalanine content
CN110267549A (zh) 具有部分水解的蛋白质的用于诱导接近于用人乳观察到的葡萄糖和/或胰岛素反应的葡萄糖和/或胰岛素反应的营养组合物
Saini et al. Antigenicity of caseinophosphopeptides prepared from buffalo casein
MXPA01007225A (en) A hypoallergenic composition containing tolerogenic peptides inducing oral tolerance

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination