JPS60130393A - ヒトウロガストロン遺伝子，対応する組換えプラズミド及び組換え体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■　発明の背景 本発明はヒトウロカストロン遺伝子、対応４−る組換え
プラスミド及び組換え体に関する。更に具体的Ｉこは本
発明は化学的に合成した直接発現型ヒトウロカストロン
ｉ伝子に拠し　その直接発現型ヒトウロカストロン遺伝
子を含有する組換えプラスミドに関し、直接発現型ヒト
ウロカストロン遺伝子を含有づる組換えプラスミドを保
持する組換え体に関する。

ウロカストロンハ通常のヒトの十二指腸及び唾液腺で合
成されるポリペプチドホルモンであり（例えはＨｅ１ｔ
ｚら、Ｃｕｔ　１９４０８〜４１　Ｂ　（１９７８）ε
照）、下記の配列で示される５３個のアミノ酸からなる
事が知られている（例えはＧ　ｒｅｇｏｒｙ及びＩ’ｒ
ｅｓｔｏｎ　。

Ｉｎｔ、　Ｊ　、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　
Ｒｅｓ　、、　９１０７〜１１８（１９７７）参照ン。

Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　ＣｙｓＰｒ
ｏ　Ｌｅｕ　５ｅｒＨｉｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　
Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　ＨｉＳＡｓｐ　ＧｌｙＶａｌ　Ｃｙｓ
　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　ｌｉｅ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　
ＡｓｐＬｙｓ　］’ｙｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｃ
ｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　＋；ｌｙｉ’ｙｒ　ｌｌｅ　Ｇ
ｌｙ　Ｇｌｕ　ＡｒｇＣｙｓ　Ｇｌｎ　′ｌ”ｙｒ　Ａ
ｒｇＡｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　’ｌ’
ｒｐ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇウロカストロンは胃酸の
分泌を抑制し、細胞の生長を促進する作用を有するので
（例えはＥｌｄｅｒら、Ｇｕｔ　１６８８７〜８９８（
１９７５）参照） 潰瘍の治療や錫の治療等に利用する事ができる。ウロガ
ストロンはヒト尿中に微鳳排池されるのでそこから単離
する事ができるが医療を目的とする工業的生産の要求を
−ずには効率が悪く実用的ではない。

本発明は組換えＤＮＡ技術により、安価にしかも多嵐に
純粋なウロガストロンを生産する事を可能にしたもので
ある。

合成ウロガストロン遺伝子を用いて組換えＤＮＡ技術に
よりウロガストロンを製造する方法は後により詳しく記
述するが、基本的には ■、遺伝子の設計 ２、遺伝子の化学合成 ３　適当な発現用ベクターへの遺伝子の組込み ４、得られた組換えプラズミドに依る適当な宿主の形質
転換 ５、形質転換体の培養によるウロガストロンの産生（こ
れを発現と呼ぶ）及び回収という工程より成る。

遺伝子の設計において、ウロガストロンのアミノ酸配列
からそれに対応する遺伝子のヌクレオチド配列（本文で
は以下これを構造遺伝子と呼ぷンを決定するにあたって
は、大部分のアミノ酸に関してはそれに対応する遺伝子
暗号（コドン）が２個以上存在するので５８個のアミノ
酸より成る配列に対して極めて多数のヌクレオチド配列
を考える事が可能である。

この多数の可能性の中から望ましい配列を決定するに当
っての判断基準として、例えは、使用すべき宿主細胞に
於いて多頻度に使用されているコドンを使用すべきであ
ること、構造遺伝子を含む配列の両端および内部に適当
な制限酵素認識部位を持たせてブラズミドへの挿入、解
析を行う事を容易にすること、化学合成の過程に於いて
遺伝子断片の集合及び連結が容易にできる様に各構成１
ｉｆｔ片間で不必要な相互作用か最小になる様にコドン
を選択することなどがあげられるが、これらの条件が相
反する場合があり、自明な論理による推論によって望ま
しい配列に到達できるのではなく、試行錯誤を含む池々
の宙齢丙鯰汀＋１．弘萌ア太２さて、所望の構造遺伝子
を設計合成したとして、次にこれを宿主細胞内で発現さ
せるためには大別して２つの方法があり、本文ではそれ
らをキメラ発現法及び直接発現法と呼ぶことにする。こ
こでいうキメラ発現法とは、用いる宿主の内在性遺伝子
（その宿主の野性株に本来存在する遺伝子）に所望の遺
伝子を接続させた遺伝子（これをキメラ遺伝子と呼ぶ）
を作製し、このキメラ遺伝子を適当なベクターに組込み
、次に宿主を形質転換して発現させる方法であり、発現
された産物は対応する内在性のポリペプチドと所望の遺
伝子にコードされたボリプチドが融合した形で生産され
る（これをキメラボリブチドと呼ぶ）。

キメラ発現法は、内在性遺伝子の発現機構を用いて発現
させるので、外来遺伝子を比較的容易に発現させること
ができる場合が多いが所望のポリペプチドのみを単離す
る為にはキメラポリペプチド不什蛍的　Ｍ素的に処理し
て、所望のポリ、ペプチドを特異的に切り出し精製Ｊる
ことが必要であり製造工程がより長く複雑になるという
欠点を有している。

一方もう一つの発現法である直接発現法とは、所望の構
造遺伝子を翻訳開始信号（通ｍＡＴＧ　）の直後に接続
し、得られた配列を発現用ベクターの転写及び翻訳を支
配する領域の適切な位置に挿入した組換えプラスミドを
作成し、次にその組換えプラスミドを用いて宿主を形質
転換して発現させる方法であり、外来ポリペプチドは単
独の完成した分子として産生されるのでキメラ発現法に
比し製造工程がより単純であり実用的に有利である。

しかしながら、発現されたポリペプチドの鎖長が短い場
合には、宿主細胞に内在する蛋白分解酵素等に依ってす
みゃかに分解され産物として単離することができない場
合があると報告されてカリ（例えばＩ　ｔａｋｕｒａら
、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９８　１０５６〜１０６８（１
９’ｉ’ｉ　）参照）ウロガストロンの場合その分子量
からいって蛋白分解酵素等に依る分解に対する安定性に
疑念のさしはさまれるところであった。従って直接発現
法によるウロガストロンの産生には問題が予想させる所
であり、しかも直接発現法の場合、外来遺伝子を効率良
く発現させるためには発現用ベクター内の転写と翻訳を
支配している領域（以下５′端の非翻訳領域と呼ぶ）の
適切な位置に外来遺伝子を挿入する必要があるがこの５
′端の非翻訳領域の望ましい化学構造（即ちヌクレオチ
ド配列）は所与の構造遺伝子によって異なるものである
事が知られて来つつあり、任意の構造遺伝子に対して望
ましい非翻訳領域の構造を予知する事は困難であって、
試行錯誤的に最適構造を探索しなければならないという
困難さを伴っているっ 本発明者らはこの様な状況の中で、ウロガストロンの直
接発現法による生産を目的として、構造遺伝子の設計、
５′端の非翻訳領域等に詳細な工夫を重ね研究を続けた
結果、本発明化合物であるウロガストロン遺伝子を用い
れはウロガストロンを高レベルで直接発現させる事が可
能である事を確認し、本発明を完成するに至った。

合成ウロガストロン遺伝子及びそれを用いたウロガスト
ロンの製造法等に閃しては特開昭６７−１２２０９６に
公開された文献かある。しかしなから同文献に開示され
ている合成ウロガストロン遺伝子のヌクレオチド配列は
本発明遺伝子のヌクレオチド配列と極めて異なっている
のみならす、同文献はキメラ発現法によるウロガストロ
ンの製造法を島示したものであって直接発現法に関して
は何ら具体的記述が示されていない。

■・　発明の概要 要　旨 本発明はウロガストロン構造遺伝子及び構造遺伝子にリ
ボゾーム結合部位を含む５′端非翻訳領域の適当な長さ
のヌクレオチド配列を連結した直接発現型ウロガスロ／
遺伝子の化学合成が可能であること、この遺伝子を適当
な発現用ベクターに組込む事が可能であること、その組
換えプラスミドに依る適当な宿主細胞の形質転換が可能
であること、形質転換体の培養によるヒトウロガストロ
ンの産生及び回収が可能であることを確認する事によっ
て完成されたものである。

本発明は下記の又クレオチド配列式＋１＋、ヌクレオチ
ド配列式（２）またはヌクレオチド配列式（３）で表わ
される事を特徴とする直接発現型ヒトウロガストロン遺
伝子及びそれらの遺伝子を含有する事を特徴とする組換
えプラスミド、及びそれらの組換えプ゛ラズミドを保持
するニジエリシア・コリー （Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　（：０１　ｉ　）である仝ヌ
クレオチド配列式＋１．１ ヌクレオチド配列式（２） ％式％ ヌクレオチド配列式（３） 効　果 天然ヒトウロガストロンの抽出精製の場合に認められる
コスト及び鳳的制限の問題は、本発明による組換えＤＮ
Ｋ法に依れはこれを解決できる。

また、キメラ発現法の場合に認められるキメラポリペプ
チドからウロガストロンを効率良く、特異的に切り出す
という困難で煩雑な問題は本発明の直接発現法によれは
これを回避できる。　８ ■　発明の詳細な説明 ■）遺伝子の取得 本発明の直接発現型ヒトウロガストロ ン遺伝子は通常用いられているヌクレオチド合成法によ
って取得される。宿主細胞によって穐々の条件が考慮さ
れ得るが、通常膜も一般的に用いられている大腸菌（Ｅ
、ｃｏｌｉ）　の場合について述べれば下記の通りであ
る。

（１）　遺伝子の設計 １）構造遺伝子 ヒトウロガストロンを構成するアミ ノ酸を指定するいくつかのコドンのう ちから下記の条件を論ずものを選んで ＤＮＡを合成する。

（Ａ）Ｇ−Ｃ塩基対に富む領域に続いてＡ−Ｔ塩基対に
富む領域が続かない 様にする。

（Ｂ）　後記する各々の合成フラグメントか分子内ある
いは分子間で望まない 相補性塩基配列を持たない様にする。

また翻訳を開始終結せしめるため構造 遺伝子の５′端に翻訳開始信号を８′端に翻訳終止信号
を付は加える。

１１）リボゾーム結合部位を含む５′端非翻訳領域 リボゾーム結合部位（以下ＳＤ配列 と称す）を含む５′端非翻訳領域のＤＮＡを下記の条件
を満す様に合成する。

囚　プロモーターから適当な距離をお いてＳＤ配列が配置される様にするつ （Ｂｌ　合成ＳＤ配列は天然に存在するＳＤ配列と共通
な塩基配列を有する部 分を持ちかつ適当な長さのヌクレオ チド配列である様にする。

（Ｃ）ＳＤ配列から適当な距離をおいて翻訳開始信号が
配置される様にする。

山）遺伝子全体 ＳＤ配列を含む５′端非翻訳領域及び 翻訳開始、翻訳終止信号を含む構造遺 包子からなるウロガストロン遺伝子は （５）　ブラズミドへの組込み、プラズミドからの切り
出しを容易にするため ５′、３′両端に制限酵素認識配列をもたせる。

（ＢＪ　形質−転換体の検索を容易にするため遺伝子内
に一つ又は二つ以上の制 限酵素認識配列をもたせる。

（Ｃ）　翻訳開始信号から始まる構造遺伝子部分のみの
利用も可能にするため 翻訳開始信号の直前で遺伝子を切断 できる様に制限酵素認識配列をもた せるっ ことが望ましい。

この様にして設計された直接発現型ヒ トウロカストロン遺伝子の一具体例は前記のヌクレオチ
ド配列式ｆ＋）て表わされる遺伝子であり、同遺伝子を
適当な発現ベクターに組込む事により翻訳終結信号 （１”ＡＡ又は′ｒＧＡ又ｉ、ｉ　′Ｉ″ＡＧ）を付加
する事、及び遺伝子の５′及び８′端に制限酵素認識配
列をもたせる事が可能である。

前記のヌクレオチド配列式［＋）で表わされる遺伝子に
翻訳終結信号（ＴＡＡ及び’１’ＧＡ）を付加した一列
が前記のヌクレオチド配列式（２）で表わされる遺伝子
であり同遺伝子は翻訳終結信号を自らの内に含んでいる
ため使用し得る発現ベクターの制限がより少なくなる。

また適当な発現ベクターに組込む事により遺伝子の５′
及び８′端に制限酵素認識配列をもたせる事も可能であ
る。前記のヌクレオチド配列式（２）で表わされる遺伝
子に制限酵素認識配列を付加した好ましい一列が前記の
ヌクレオチド配列式（３）で表わされる遺伝子であり同
遺伝子は自らの内に翻訳終結信号及び５’、８’両端に
制限酵素認識配列を含んでいるため使用し得る発現ベク
ターの制限はさらに少なくなっている。

（２（遺伝子の合成 上に、のように設計した遺伝子を合成するには、士、−
両鎖のそれぞわについて、これをいくつかのフラグメン
トに分けて、それらを化学的に合成し、各々のフラグメ
ントを連結する方法によれは良い。２鎖は２１〜２５塩
基からなり、各々が７〜１８塩基づつ重なる様に１６個
程度のフラグメントに分けるのが好ましい。

１）フラグメントの合成 各フラグメントの合成法としてはジエステル法（例えは
５ｃｉｅｎｃｅ、２０８，６１４．（１９７９）参照）
、トリエステル（例えはＮｕｃｌｅｊｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、。

８．５４９Ｈ１９８０参照）及びフォスファイト法（例
えは”ｌ’ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２
１　、７１９　（１９８０）参照）があり、それぞれに
ついて固相法（例えはＮａｔｕｒｅ、　２８１．１８（
１９７９）参照）液相法あるいは酵素を用いる方法（例
えはＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、↓、　１６
６５（１９７４）参照９がある。合成時間、収率、精製
及び操作の簡便さなどの点がら固相法を採用し、縮合方
法としては著遍的なトリエステル法を採用した。合成の
具体的小項に関しては上記文献及び後記実施例を参照さ
れたい。

１１）精製 オリゴヌクレオチドを化学合成した場合、一般式に鎮長
か長くなるにしたかって最終合成品の分離精製がしたい
に困難となってくる。特に固相法に於いて適当に保護さ
れたオリゴヌクレオチドフロックを段階的に縮合させて
いくため、従来技術、例えはゲル濾過、イオン交換クロ
マトグラフィー、ゲル電気泳動、順相カラムによる高速
液体クロマトグラフィーなきては精製は容易で　−ない
。ところで逆相分配カラムではオリ−ｉ　５ｔ、　））
　レオチドに新油性の保護基が一つついているか否かで
その保持時間は大きく変化する。

そこで他の保護基をはずす条件下で安 定な別の保護基を持つオリゴヌクレオチドフロックを最
終縮合段階に用い、適当な脱保護操作を行えは目的の最
終産物にのみその保護基のついたオリゴヌクレオチドの
混合物が得られるのでその保護基の親油性を利用して逆
相カラムで目的とする最終産物を他の未反応混合物から
分離する事が可能である。ついでその保護基をはずせは
目的とするオリゴヌクレオチドをｆ’Ｊ、る事ができる
。この方法により、合成し　２）たオリゴヌクレオチド
を未反応混合物の　（１）中から効率よく分離精製する
ことが可能である。

１１１）リン酸化及びフラグメントの連結こうして得た
合成フラグメントをＤＮ Ａ　ＩＪガーゼを用いていっきよに連結してウロガスト
ロン遺伝子を合成するわけであるが合成フラグメントを
この酵素の基質とするためにはフラグメントの５′−水
酸基をリン酸化しておく必要があり、この目的のために
はポリヌクレオチドキナ−セが用いられる。

また合成フラグメントを連結してウロ ガストロン遺伝子を合成する方法としては、フラグメン
トをいくつかのブロックに分けて連結した後それらのブ
ロックを連結する方法をとる事ももちろん可能である。

組換えプラズミドの調製 ウロガストロン遺伝子のプラズミド ベクター−への導入 前記の様にして合成したウロガスト ロン遺伝子を宿主内で増殖可能なプラ ズミドベクター又は宿主内で増殖、発 現が可能な様に構成されたプラズミド ベクターの適当な挿入部位に組込む。

組込み操作そのものは分子生物学の 分野で公知の常法に従って行うことが できる。具体的な方法については後記 の実施例を参照されたい。

本発明によるウロガストロン遺伝子 の増殖はｐＢＲ８２２，ｐＡＴ１５Ｂ（例えはＴｗｉｇ
ｇら、　Ｎａｔｕｒｅ　、罎３８，２１６〜２１８（１
９８０）参照）等の公知の種々のブラズミドヘクターを
用いて行う事 ができる。また、プラズミドＤＮＡの 単離精製も分子生物学の分野で公知の 常法に従って行う事ができる。

本発明遺伝子によるウロガストロン の直接発現は、宿主細胞によって適宜 の方法をとり得るか、大腸菌に於いて は、ｌａｃプロモーター（例えばＦｕｌｌｅｒ。

Ｇｅｎｅ　、　１９．４８〜６４（１９８２）参照）１
、ｔｒｐ　プロモーター（例えばＷ　１ｎｄａｓｓら、
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　ｌ　０　、
６６８９〜６６６７（１９８２）参照）、ｔａｃプロモ
ーター（例えばＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、　
Ａｃａｄ　。

Ｓｃｉ　、ＵＳＡ　、８０．２１〜２５（１９８Ｂ）参
照）、ＰＲプロモーター（例えはｄｅＨａｓｅ山ら、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｉｃｅｓ、、　１１　、７
７８〜７８７、（１９８８）参照）、Ｐｒプロモーター
（例えばＬＩｅｒｏｍら、Ｇｅｎｅ　、　１７　。

４５〜６４　、（１９８２）参照及びＬｐｐプロモータ
ー（例えはＮａｋａｍｕｒａら、ＥＭＢＯＪ　ｌ　７７
１〜７７５（１９８２）参照等を有する公知の種々の発
現ベクタ ー（例えは中村、化学と生物２０．４７〜５８（１９８
２）及びＭａｎｉａｔｉｓらＭｏ　ｌｅｃｕｌｃｅｒＣ
１ｏｎｉｎｇ４０Ｂ　〜４８８（１９８２）参照）を用
いて杓うことができる。

これらの発現ベクターのうち好まし い具体例は、本発明の目的にかなうよ うに特別に工夫された９８Ｍ９００１である。

９８Ｍ９００１はｐｌＮ−ＩＡｔ（例えはＮａｋａｍｕ
ｒａらＥＭＢＯＪ、上７７■〜７７５（１９８２）参照
）及びｐＭｃＲ７８５から造成すル事カテき、ｐ　Ｍ　
ＣＲ７８５（ＤＸｈｏｌ及びＨｉｎｄ　ｍ部位間の小断
片をｐＩＮ−１−ＡＩのＨａｅＩｌｌ最長断片（約１．
　ｄ　ｋｂｐ）と置換える事によって造成する事かで きる。具体的には実施例及び図面２を 参照されたい。

ｐＭＣＲ７８５は、ｐＫＮ４１０　Ｃ例えばＯｈ　Ｉ　
ｉｎ　ら、Ｇｅｎｅ　６９１−１０６　（１９７９）参
照）をＥｃｏ　ＲＩ　て処理して得られる約７．５ｋｂ
ｐのブラズミドのＨｈａ　Ｉ部位に、ｐＢＲ８２５（例
えばＢｏｌｉｖａｒ　。

Ｇｅｎｅ　４１２１　（１９７８）参照）クロラムフェ
ニコール耐性遺伝子を含む約１．８ｋｂｐのＨｈａ　Ｉ
断片を挿入して得られた約６．８ｋｂｐのプラズミドの
Ａｖａ　ＩＩ部位に、さらにｐＭＩ、２１（例えはＨｅ
１ｓｆ　１ｅｌｄら、　Ｊ　、Ｈａｃｔｅｒｉｏｌ　１
２６４４７（１９７６）参照うのカナマイシン耐性遺伝
子を含 む約１．１　ｋｂｐのＡｖａ　１１断片を挿入して造成
することができる（三木、遺伝子 組換え実用化技術用４％　１０７〜１１６（１９８Ｂ）
参照）。

（２）方向性の判定 プラズミドに組込まれたクロ。カスト ロン遺伝子の方向性の判定は遺伝子内 に含まれる特定の塩基配列を認識する 制限酵素（例えはＣ１ａ　Ｉ　、　Ｈｉｎｆ　Ｉ　等で
あり図面ｌを参照されたい）でその 部位を切断し、遺伝子外の特定部位を 別の制限酵素を用いて切断して得られ た断片のサイズをアガロースゲル電気 泳動等の通常用いられている方法で分 析する事により行う事ができる。

３）　形質転換 （Ｎ　宿主菌 ウロガストロン遺伝子を組込んだ組 換えプラスミドを用いて病質転換させ る宿主細胞の大腸菌での一興体函は。

Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢ　ｌ　０１　（例えはＢｏｙｅｒら
、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ　４１４５９〜４７２　（１９
６９）参照）及びＥ、ｃｏｌｉ　２９４　（例えはＢａ
ｃｋｍａｎ　、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　ＵＳＡ７８’４１７４〜４１７８（１９７６）
参照）である。

ウロガストロン遺伝子を組込んだ組 換えプラズミドによる形質転換は上記 の宿主に限定されるものではなく、公 知の種々のＥ、　ｃｏｌｉＫ−１２株誘導体（例えばＢ
ａｃｈｍａｎｎ　、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　Ｒｅｖ。

■　５２５〜５５７（１９７２）参照）を使用すること
かできる。

これらのＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ−１２株誘導体の多くのも
のは公認の微生物機関、例え ばＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ
１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）　、に寄託されておりそ
こから分譲が可能である（例えばＡ　Ｔ　ＣＣカタログ
参照）。

また分子生物学の分野で公知の如く 適当なベクターを選べばより広範囲の 細菌種より適当な宿主を選択する事も 可能である。

（２）　形質転換 形質転換操作そのものは分子生物学 の分野で公知の常法に従って行う事が （１９７２）及びＭａｎｉａｔｉｓらＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ　、２４９〜２５Ｂ（１９８２）参照
）。

（３）形質転換体 形質転換体の一興体例は、Ｅ、ｃｏｌｉＨＢＩＯＩを９
５Ｍ９００２で又Ｅ、　ｃｏｌｉ　２９４を９５Ｍ９０
０Ｂで形質転換させて得た形質転換体であって、本発明
ではそれらをＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢｌｏｌ（９５Ｍ９００
２）及びＥ、ｃｏｌｉ。

２９４　（９５Ｍ９００Ｂ　）と命名した。

４）ウロガストロンの生産 この様にして得た形質転換体を、分子 生物学及び醗酵学の分野で公知の常法に従って培養すれ
ば、ウロガストロンが生産される。ウロガストロンは公
知のラジオイムノアッセイ（例えばＨｉｒａｔａら、Ｊ
。

Ｃｌ１ｎ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　、　Ｍｅｔａｂ、　
４８６７８〜６７９（１９７９）参照）、ラジオリセプ
ターアッセイ（例えば０−Ｋｅｅｆｅら、Ａｒｃｈ　。

Ｂｉｏｃｈｅｍ　、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　１６エ５１８
−５２６（１９７４）参照）等を用いて検出、定量する
ことができる。

また生産したウロガストロンは、庄化学及び腕酵学の分
野で公知の常法を適宜組合せて回収精製することかでき
る。具体的方法については後記の実施例を参照されたい
。

５）実施例 ウロガストロン遺伝子の設計 下記の表１に示した塩基配列の遺伝子 を設計した。設＃１の手順は下記の通りである。

（１）　コドンの選定 ウロカストロン構造遺伝子のコドン を表１に示した通りに選ぶ。

（２）構造遺伝子の５′端に翻訳開始コドンＡＴＧを付
加し８′端に２個の翻訳終止コドン（”ｌ’ＡＡ及び１
’　Ｇ　Ａ　）を相加する。

ｆ３１ＡＴＧの上流にｒｎ　ＲＮ　Ａのリポゾーム結合
部位に対応する配列を含み、同時 に翻訳開始コドンＡＴＧの直前にＣ１ａｌ認識配列が配
置される様な配列ＧＴＡＧＴＴ（、ＡＡＧＧＡＧＴ］Ｔ
ＡＡＴｃＧ　を付加する。

ｆ４）　ＢａｍＨＩ認識配列の粘着末端に相当する配列
を５′端にＢｃｌＩＸｌ？識配列の粘着末端に相当する
配列を８′端に４−Ｊ加するっ以上の様にして設計され
た遺伝子は、 構造遺伝子内部にＨｉｎｆＩ　、　ＴａｇＩ　、　Ａｌ
ｕＩ。

Ｈｐｈｌ、　Ｎａｕｌ、及び”Ｉ゛ｈａＩ　認識配列を
含むものである。

＼ フラグメントの化学合成 ｎｄ記の様にして設計したウロガストロン遺伝子は下記
の表２に示した様に１６個のフラグメントに分けて合成
するっ これらのオリゴヌクレオチドフラグメ ントは公知の合成法によって合成する （例えは、Ｅｄｇｅら＋−Ｎａｔｕｒｅ　２９２　７６
６〜７６２（１９８１）及びｐａｔｅｌら、　Ｎｕｃｌ
ｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、　１０　６６０５〜５６
２０　（１９８２）参照）。

３′−〇−サクミナミド結合を介して所望の５’　−０
−ジメトキシトリチル−２１−チオキシヌクレオミドで
置換したポリジメチルアクリルアミド樹脂（１００−ｖ
、＠換基数〜２６μモル）をジメチルホルムアミド中で
彰潤させ、フェニルイソシアネートで処理した後、保護
基をつけたジヌクレオチド（又はモノヌクレオチド）単
位を次の様なサイクルの繰返しに付則させる。

上記の樹脂を次の順序で洗浄する；ピ リジン（５回）、クロロボルム／メタノール（７：８，
６回）、クロロホルム／メタノール（７：８）に溶解し
た５％ペンセンスルホンＭ（２〜５回）、ジメチルホル
ムアミド（４回）、ピリジン（８回）各洗浄には約６ｍ
ｅの溶媒を用いる。

樹脂を加水ビＩＪジン１ｍｆと共に蒸発乾燥した後、４
　ｍｅの無水ピリジンに溶解したジヌクレオチド（又は
モノヌクレオチド）（１００〜、約８当星をピリジンと
の共蒸発で乾燥さゼたもの）、及Ｑ・カップリンク剤と
し７てのメシチレン−８−ニトロ−１，２，４−トリア
ゾール（６０〜、約８当ＭＬ　）又は２，４．６−ドリ
インプロビルペンセンスルホニルテトラソール（７０〜
、約８当聞）と混合し１〜１．５時間反応を行う。

所定のソヌクレオチド（又はモノヌク レオチド）を用いて上記操作を所望の長さのオリゴ又ク
レオチドが得られるまで繰返す。

最終縮合反応後、樹脂を５倍量のジメ チルホルムアミド、２塩化メチレジ、ニー　７　／ｌｚ
の順で洗浄し、ついてジオキサン／水（１：１．２ｖり
に溶解した０、　８　Ｍ＋、１，４．４−テトラメチル
グアニジニウム−４−二トロペンズアルドキシメートト
ｕｆｆｉｌテロ　０時間反応させてオリゴヌクレオチド
を遊離させる。オリゴヌクレオチドをアンモニア水て５
０　’Ｃ５時間、８０％（ｖ／’ｖ　）酢酸で室温８０
分間処理して脱保護する。

精　製 脱保護したオリコヌクにオチトをピリ ジン（００５町ｆ）とエタノール／水（８：ち２〜４−
）に溶かしパルティシル１゜−８ＡＸ（ワットマン社製
）を用いた高速液体クロマトグラフィーにか＋ｊ、ｌ　
ｒｒ＋Ｍから０．４　Ｍの濃度勾配をもたせたリン酸カ
リウム、ｐＨ６，８の５％エタノール液又はｐＨ５，５
の同上の緩衝液の３０％エタノール液で溶出する。保持
時間の最も長いピークを集め蒸発乾固した後５　ｍｅの
水ニ再溶解し、マイクロポンタパック（７１８（ウォー
ターズ社製）逆相カラムにがけ０．１Ｍ酢酸アンモニウ
ムで洗ｆｉｌ　Ｌだ後、１０〜２５％の０．１Ｍ酢酸ア
ンモニウム／アセトニトリル（１：ｌ）の濃度勾酸て溶
出する。

オリゴヌクレオチドを含む両分に過剰 のトリエチルアミンを加えた後、凍結乾燥し、ついて水
に溶解して保存する。

リン酸化 上記の化学合成した１６個のフラグメ ントについて、それぞれを下記の条件テリン酸化する。

オリコヌクレオチド（約４０ｐｍｏ＋）を１−０単位の
Ｔ　４−ポリヌクレオチドキナーゼ、４０ｐｍｏｌ　Ｃ
７−ＰＩ］ＡＴＰ（８，５Ｃｉ　７ｍ　ｍｏ　ｌ　）、
Ｏ，ｌ　ｍ　Ｍスペルミジニ・、２０ｍ　Ｍシナオスレ
イトール、■（）ｍへｌ　ＭｇＣ１２，５０ｒｎＭＴｒ
ｉｓ、　ＨＣｅ（ｐ）］　９．０　）及び０．１　ｍ　
ＭＥ　Ｌ）　ｉ　Ａを含む２５μＩの反応液中１３７°
Ｃ１８０分間加温した後４０　ｐｍｏｌのＡ　′ｌ’　
Ｐを加えさらに８７°Ｃｌ２Ｏ分間加温してリン酸化し
、オリゴヌクレオチドをエタノールで沈澱させて回１［
Ｖ、　′？ｌ乙。

フラグメントの連結反応 １６（ｉのリン酸化したオリコヌクレオチド（各々約４
ｐｍｏｌ）を５０μｅの水に溶解混合し、１００”Ｃ，
５分間加熱した後室ゐ［まで除冷する。

次にこれを減圧乾固した後、３０単位 のｉ’　４　Ｄ　Ｎ　Ａリカーゼ＋　７４　ｍム（′Ｙ
ｒｉｓ。

ＨＣＩ　ｐＨ７，６、６，６ｍＭＭｇ（４／ｚ　、　ｌ
　ＯｍＭシチチオスレイトール、８ｔｎＭＡＴＰ、１．
６ｍＭ２−メルカプトエタノール及Ｏ・１．６μｇ牛血
清アルブミンを含む反応液２０μ−中で２２°Ｃ１２４
時聞加温して連結させる。

反応の進５は５％ポリアクリルアミド ゲル電気泳動又Ｖｉ２％アカロースゲル電気泳動で確認
する。

反応終了後フェノール抽出、ニーデル 抽出を行いＤＮＡをエタノールで沈澱させ回収する。

回収したＤＮＡを５％ポリアクリルア ミドゲル電気泳動で分離し、所望の大きさく　１９２１
）　ｐ　）　のバンドを含むゲルを切り出して細片化し
た後緩衝液（１０ｍλ１１”ｒ　ｉ　ｓ　、ＨＣ１！　
ｐ　Ｈ７，５，Ｊｒｒ１ＭＥＤＴＡＫ抽出する。

抽出液をＤｋＡＥセルロースカラムζこかけ、ｌ　Ｍ　
ＮａＣ１を含有する上記緩衝液で溶出してウロガストロ
ン遺伝子を得る。

クローニング プラズミドｐＡＴ１５Ｂ約７／ｊｇを１０ｍＭＴｒｉｓ
、ＨＣｌ（ｐＨ７，４）　、　５０ｍＭ　ＮａＣ＃　、
　ｌ　０ｍＭＭｇＳＯ４，１ｍＭＤＴＴ及び２０単位の
ＢａｍＨＩを含む３０μｌの反応液中で３７℃、６０分
間インキュベートした後フェノール抽出エタノール沈澱
を行う。次にこのＤＮＡをｌ　Ｍ　Ｔｒｉｓ　、ＨＣｌ
（ｐＨ８，０）及びアルカリ性フォスファターゼを含む
８０μｌの反応液中で６０℃、８．０分間インキュベー
トした後フェノール抽出、エタノール沈澱を行う。

このＤＮＡと先に得た１９２　ｂｐの合成遺伝子を、２
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ＨＣ＃　（ｐＨ７，６）　、１０ｍ
Ｍ　ＭｇＣ６ｚ、１０ｍＭＤＴＴ、５ｍＭＡＴＰ及び５
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む３０μｌの反応液中で
１５℃、１６時間インキユベートシて連結させる。

次に、この反応液を用いて大腸菌Ｅ、ｃｏ目ＨＢＩＯＩ
株を形質転換し、アンピシリン１抵抗性（８０μｇ／ｍ
ｔ）、テトラサイクリン感受性（１０μｇ／ｓｚ）、の
形質転換体を得る。これらの形質転換体よりプラズミド
ＤＮＡを調製し制限酵素囲裂パターンの分析をわって　
ｐ’ＡＴ１５３のＢａｍＨＩ　部位に合成ウロガストロ
ン遺伝子が図面■で示される様に挿入された組換えプラ
ズミド（以下このプラズミドをｐＵＧ１２と呼ぶ）を含
む形質転換体を選び出す。

組換プラズミドｐＵＧ１２の挿入Ｓａｕ　８ＡＩフラグ
メント（１９２ｂｐ）　が目的とする合成ウロガストロ
ン遺伝子である事を確認するため、そのヌクレオチド配
列をＭａｘａｍ　−Ｇ１１ｂｅｒｔ法（例えばＰｒｏｃ
　。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉ、　ＬＩＳＡ、　７４　、
５６０．（１９７７）参照）で解析したつ その結果、ｐＵＧ１２のＳａｕ　８　Ａ　Ｉ　ｌ　９２
　ｂｐフラグメントは表１に示した計画通りのヌクレオ
チド配列を有している小が確認され発現ベクターの調製 プラズミドｐＨＮ−１−ＡｒＦ−２０μｌｇを１０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ　、　ＨＣＩ　ｐＨ７，４、ｌ　ＯｍＭ　Ｍ
ｇＳＯ４゜１　ｍ　Ｍ　Ｄ　Ｔ　Ｔ及び４０単位の制限
酵素Ｈａｅ■を含む４０μｌの反応液中で８−７℃。

２時間消化した後、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行って約１．８Ｋｂｐの断片を得た。

プラズミドｐＭＣＲ７８５２０ｐｇを５’０　ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ　、　ＨＤ／ｊ　ｐＨ７，４、ｌ　ＯｍＭ　Ｍｇ
ＳＯ４゜１００ｍＭ　ＮａＣ１，８０単位の制限酵素Ｈ
ｉｎｄｌｌｌ及び４０単位の制限酵素ＸｈｏＩを含む４
０μｌ　の反応液中で３７℃、２時間消化した後１％ア
ガロースゲル電気泳動を行って小断片を除去した。次に
このＤＮＡを６．７ｍＭＴｒｉｓ、　ＨＣ（ｊ　ｐＨ８
，８、６，７ｍＭＭｇｃＡ！ｚ　、　１０ｍＭ　２−メ
ルカプトエタノール、６．７　μＭＥＤＴＡ　、１６．
６　ｍＭ　（Ｎ　Ｈ４）２ＳＯ４，８８０μＭｄＮＴＰ
（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ。

ｄＣＴＰ及ｉＪ　ｄＴＴＰ）及び５単位（７）　Ｔ　４
ＤＮＡポリメラーゼを含む３０μｌ　の反応液中で８７
℃、１時間反応させた後フェノール抽出、エタノール沈
澱を行った。

さらにこのＤＮＡを１　ＭＴｒｉｓ、Ｈ（Ｊ’　ｐＨ８
，０及び２単位のアルカリ性７オスフアターゼを含む８
０μｌ反応液中で６０℃、１時間反応させた後フェノー
ル抽出、エタノール沈澱を行った。

上記の処理番施したｐＭｃＲ７８５及びｐＩＮ−（−Ａ
、ζ１’、８Ｋｂｐ断片を２０ｍＭＴｒｉｄＨＣｌｐＨ
’７．６　、　ｌ　０ｍＭＭｇＣ１ｚ　、　ｌ　ＯｍＭ
ＤＴＴ５ｍＭＡＴＰ及び５単位のＴ４ＤＮＡリカーゼを
含む８０μｌの反応液中で室温２０時間インキュベート
して連結させた。

次にこの反応液を用いて大腸菌Ｅ、Ｃｏ１１ＨＢＩＯＩ
株を形質転換し、クロラムフェニコール抵抗性（２６μ
ｇ／ｄ）、カナマイシン感受性（６０μｇ／ｍ　）の形
質転換体を得り。コレらの形質転換体よりプラズミドＤ
ＮＡを調製し、制限酵素開裂パターンの分析を行って図
面２に示される様な発現ベクターｐｓＭ９００１　を含
む形質転換体を選び出した。

発現用組換え体の作成 プラスミドｐｓＭ９００１２０μｇを１０ｍＭＴｒｒｓ
、ＨＣｌ１　ｐＨ７，４、５０ｍＭＮ　ａ　Ｃ１ｌ　、
　１０ｍＭＭｇＳＯ４，１ｍＭＤＴＴ及び４０単位の制
限酵素ＢａｍＨＩを含む４０μｌの反応液中で８７℃、
２時間インキュベートした後エタノール沈澱を行った。

次にこのＤＮＡをｌ　Ｍ　Ｔｒｉｓ、Ｈ（Ｊ’　ｐ）（
８，０及びアルカリ性フォスファタ４を含む８０μｌの
反応液中で６０℃、１時間インキュベートした後フェノ
ール抽出、エタノール沈澱を行った。プラスミドｐＵＧ
１２２００ｆｉｇをｌ　ＯｍＭＴｒｉｓ、ＨＣ６ｐＨ７
，４。

５０ｍＭＮａ（Ｊ’、１０ｍＭｇ５０４，１ｍＭＬｌＴ
Ｔ及び２００単位の制限酵素５ａｕ８ＡＩを含む２００
μｌの反応液中で８７℃、２時間インキュベートした後
５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い１９２ｂｐ
のウロガストロン遺伝子を回収した。

上記ｐＳＭ９’００１２μｇ及びウロガストロン遺伝予
約４００ｎｇを２０ｍＭＴｒｉｓ　。

ＨＣｌｐＨ７，６、ｌ　ＯｍＭＭｇＣ＃ｚ　、　ｌ　Ｏ
ｍＭ　ＤＴＴ　、５ｍＭＡＴＰ及び５単位のＴ４ＤＮＡ
リガーセを含む８０μｌの反応液中で４°Ｃ１■６時間
インキュベートして連結させた。

次にこの反応液を用いて大腸菌Ｅ　、　ｃｏｌｉＨＢＩ
ＯＩ株を形質転換し、クロラムフェニコール抵抗性（２
５μｇ　／　ｍｅ　）の形質転換体を得た。

これらの形質転換体よりプラスミドＤ ＮＡを調製し、制限酵素開裂パターンの分析を行って図
面２に示される様な組換えプラスミドｐｓＭ９００２　
を含む形質転換体を選び出した。この形質転換体を Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ（９５Ｍ９００２）　と命名
した。

プラスミドｐＩＮ−Ｉ−Ａｔ１を用いて、上記と全く同
様にしてそ０：２　ＢａｍＨＩ　部位にウロガストロン
遺伝子を挿入しＥ、　ｃｏｌｉ２９４株を形質転換した
。得られたアンピシリン抵抗性の形質転換体よりプラス
ミドＤＮＡを調製し、制限酵素開裂パターンの解析を行
って、ウロガストロン遺伝子が９５Ｍ９００２　のそれ
と同一方向に挿入された組換えプラスミドを選ひ出した
。この形質転換体をＥ、ｃｏｌｉ　２９４（ｐｓＭ９０
０Ｂ）と命名した。

ウロガストロンの発現 （ｐＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢｌｏｌ（９５Ｍ９００２）を５
ｍｔ　ノＬ培地（クロラムフェニコール２５μｇ　／　
ｍｅ金含有に接種し、８０℃で一夜培養した。培養液４
−を新たな上記培地 １００ｍ’に加え８０℃で１〜４時間培養した後３７〜
４２°Ｃでさらに１〜１０時間培養を継続した。

＠Ｅ、ｃｏｌｉ　２９４（ｐｓＭ９００８）を５−のし
培地（アンピシリン８０μｇ／ＩＩＩｅ含有）に接種し
、３７℃で一夜培養した。培養後１　ｍｅを新たな上記
培地１００−に加え、り菌体を遠心分離して１００μｌ
のリゾチーム溶液（６ＯｍＭＴｒｉｓ、ＨＣｎ　ｐＨ８
，０、１ＯｍＭＥＤＴＡ　、　２５％５ｕｃｒｏｓｅ　
、　３ｑリゾチーム／−）を加えて０℃、３０分間イン
キュベートした。

次に１００μｌの界面活性剤溶液（５０ｍＭＴｒｉｓ、
Ｈｃｎ　ｐＨ８，０、ｌ　ＯｍＭＥＤＴＡ　、　１％Ｔ
ｒｉｔｏｎ　Ｘ　ｌ　００　、０．４％デオキシコール
酸ナトリウム）、２μｌの１００ｍＭフェニルメタンス
ルホニルクロリド及び２μｌの１００ｍＭオルトフェナ
ンスロリンを加え０°Ｃ，１０分間インキュベートした
後２ｐｌのＤＮａｓｅＩ溶液（ｌＯ１ｌＩ／ｄ）及び１
０　ｐｌ　（７）　’Ｉ　ＭＭｇＣ６２を加え室温で１
〜２分間インキュベートした。遠心分離した上清を後述
のラジオリセプターアッセイに供した。

発現産物のアッセイ 大腸菌で発現されたウロガストロンの 検出、定量は公知のラジオリセプターアッセイ法に従っ
て行った。リセプタ−は下記の方法で調製した。

雄のＳｐｒａｇｕｅ　−Ｄａｗｌｅｙ　ラット５匹より
肝臓を取り出し、２５０　ｍｅの冷却した上清を１２，
０００こ孟゛、８０分間、４℃の遠心分離を行い約２０
０　ｍｅの上清を得た。上清に２　ＭＮａＣｌｌ　、　
４　ｍＭ　Ｍｇ　Ｓ０４を最終濃度が０．１　ＭＮａＣ
ｎ　、０．２ｍＭ　ＭｇＳＯ４になる様にＪ− 添加し、た後４０，０００寸、４０分間、４℃の遠心分
離を行った。得られた沈澱物をの遠心分離を行い、沈澱
物を再度同じ操作を繰返えした。ｔ＠られた沈澱物を２
０ｍの０．０５　Ｍ　Ｔｒ　ｉｓ　、Ｈ（Ｊ！　ｐ　Ｈ
７，４にケンダクし少斌づつ分注して一８０℃で保存し
た。

得られたりセプター蛋白の蛋白尿を牛血清アルブミンを
対照にしてＢｉｏ　−ＲａｄＰｒｏｔｅｉｎ　Ａｓ５ａ
ｙ　Ｋｉｔを用いて測定した新約２００〜であった。

１、５．、ｍｅのプラスティクチューブに、リセプター
蛋白溶液０．　ｌ　ｍｊ　（約１００μｇの蛋白質）、
１２５１で標識されたマウス上皮細胞成長促進因子（以
下ｍＥＧＦと略記する）０．１１１ｅ（５Ｘ１０’ｃｐ
ｍ）及び既知濃度のｍＥＧＦ溶液又は測定用サンプル（
０，１％の牛血溝アルブミンを含む５０ｍＭ ］’ｒｉｓ、ＨＣｆｆ　ｐＨ７，４で適当に希釈したも
の）０、１　ｄを加え混合した後２５℃、１時間インキ
ュベートした。

反応終了後１０，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を
行ってリセプター蛋白を沈澱セシめ、ｌ　ｍｅの０１％
牛血清アルブミンを含む５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ、）ＩＣ
＃　ｐＨ７，４で洗浄した。リセプタ−に結合した１２
５１　１ｍＥＧＦ量をカニ／マーカウンターを用いて測
定し、既知濃度のｍ　Ｅ　Ｇ　Ｆを用いて作成した検量
線からウロガストロンｆｆｉ（ｍＧＥＦ換算量）を計算
した。

アッセイ結果の一例をあげれは下記の 通りである。

ン ＝二 Ｅ、ｃｏｌｉＨ１３１０１（ｐＨ９００２）　８７℃　
２時間　用分子／Ｃｅ１１Ｅ、ｃｏｌｉ２９４（ｐｓＭ
９００８）　８７°Ｃ２時間　１　区号ｂ℃ｅ　ｌ　Ｉ
■　微生物の寄託 ウロガストロン遺伝子を含有する組換えプラズミドｐｓ
Ｍ９００２　及びｐｓＭ９００８による形負転換体であ
るＥ、ｃｏｌｉ　ｌｊＢ　ｌ　０１　（ｐＨ９００２）
　及びＥ、ｃｏｌｉ　２９４　（ｐｓＭ９００８）は、
機工研に寄託の甲請をしたところ受託を拒否された。

【図面の簡単な説明】

図面［は合成ウロガストロン遺伝子のクローニングを示
したものである。 図面２は発現用ベクターｐｓＲ１９００１及び発現用組
換えプラズミドｐｓＭ９００２　の作成法を示したもの
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ）下記のヌクレオチド配列で表わされることを特徴と
   する直接発現型ヒトウロガストロン遺伝子 こ または ＬＪ　し１１ＡｔａｙＬＪｔｙしＩｊＡＬＡＧＡＧ１’
   にＣ”ｌ’ＧＣＣＡＡ”ｌ’ＡＡＣＧＧＡＣＧＴＡＧＡ
   ＴＧＧ”ｌ’Ｇ　ＴＴＴＧＴＡＴＧ７１ＡＴＡＴＣＧＡ
   ＡＧＣ１ＣＴＧＧＡＣＡＡＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＡＣＡ
   ＴＡＣＡＴＡ］ＡＧＣＴＴＣＧＡＧＡＣＣＴＧＴ１丁Ａ
   ＴＡＣＧＡＡＣＧ　１ＴＧＡＣＡ（、ＡＡＣＡＡＣＣＡ
   Ａ”ｌＧ１’ＡＧＣＣＡＣ１’Ｃ−ＧＣＡＡＣＧＧ”１
   ＣＡＴＡＧＣＧ（、ＴＧＧＡＣ１ＴＴＡＣＣＡＣＣＣＴ
   ＴＧＡＣＣＧ７ｒ１’ＡＡｌＧＡ ＧＣＡＡＴ”ｌ’ＡＵｒ または ＧＡＴＣＣＧ］ＡＧ′１ＴＧＡＡＧＧＡら１１丁ＡＡ］
   ’ＣＧＡＴＧＡＡＣＴＣＧＣＡ１ＣＡＡＣ”１ＴＣＣ′
   １ＣＡＡＡ１”ｌ″ＡＧＣＴＡＣＴＴＧＡＧＡＣ７１’
   ＧＡＧＧＣ１ＴＡＣＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧＣ１’
   ＧＣＣＡＡＴＡＡＣＧＧＡＣＧＴＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡ
   ＡＣＡＴＡＣＡＴＡＴＡＧＣ１ＴＣＧＡＧＡＣＣＴＧＴ
   ｌＴＡｒＡＣＧＡＡＣＧＴｌ　ＧＡＣＡＣＡＡＣＡＡＣ
   ＣＡＡＴＧＴＡＣＧＧ１’ＧＡＧＣＧ’ｒ］’ＧＣＣＡ
   ＧＴＡＴＣＧＣＧＡＣＣＴ（、’ＡＡＡ１　ＧＧ１’Ｇ
   ＧＣＣＡＣ１’ＣＧＣＡＡＣＧＧ′ｌ’ＣＡ”ｌ’ＡＧ
   ＣＧＣ１”（、ＧＡＣ′ロアｒＡＣＣＡＣ２）下記のヌ
   クレオチド配列で表わされる直接発現型ヒトウロガスト
   ロン遺伝子を含有することを特徴とする組換えプラズミ
   ド。 ＧＴＡＧＴＴＧＡＡＧＧＡＧｉＴＴＡＡｉ’ｃＧＡｌ’
   ＧＡＡＣＴＣＴＧＡＣ”Ｉ’ＣＣＣＡＴＣＡＡＣ１−Ｔ
   ＣＣ′ｌ’ｃＡＡＡ”１１’ＡＧＣ１ＡＣＴｌ’ＧＡＧ
   ＡＣ’１ＧＡＧＧＣ”ｌ”ｒＡＣＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡ
   Ｇ′Ｖ（、’ＣＴＧＣＣＡＡＴＡＡＣＧＧＡＣＧＴＡＣ
   ＴＡＣＣＡＣＡＡＡＣＡＴＡＣＡＴＡ１’ＡＧＣＴＴＣ
   ＧＡＧＡＣＣ１Ｇ　１ＴＴＡＴＡＣＣ１’１’Ｇ　ＣＡ
   ＡＣｌ”Ｇｉ　（、ＴＴＧ’ｌ”ｒＧＧ’ｒＴＡＣＡ′
   ｌ’ＣＧＧ　ＴＧＡにＣＣ’ｎ’ＧＣＧＡＡＣＧＴＴＧ
   ＡＣＡＣＡＡＣＡＡＣＣＡＡＴＧ１’ＡＧＣＣＡＣ１Ｃ
   ＧＣＡＡＣＧＣＡＧ′ｌ’Ａ’ＦＣＧＣＧΔＣＣＴＧＡ
   ＡＡ′Ｉ’ＧＧ′１’ＧＧＧＡＡｃ′Ｉ’ＧｃＧＴＧ′
   ｒＣＡ’ｒＡＧＣＧＣ１”Ｇ（、ＡＣ１′ＩＴＡＣＣＡ
   ＣＣ（，１”ｌ’ＧＡｃＧＣＡまたは ＣＡ　ＴＣＡＡＣ１ＴＣＣＴＣＡＡＡＴＩ’ＡＧＣ１’
   ＡＣ’ｌ’″ｌ’ＧＡＧＡｃＴＧＡＧＧＧ　ＡＡＴＣ；
   　ＣＣ（ｉＧ　Ｃ′ｌ’Ｇ１’　Ｃ１’ＣＡ　ＣＧＡＣ
   ＧＧＴｉ’ＡＴｌ”Ｇ　ＣＣ１’Ｇ　ＣＡＴＧＡＣ１丁
   ＡＣＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧｉ’ＧＣ１ＧＣＣＡＡｌ’
   ＡＡＣＧＧＡＣＧＴＡＣＴＡＣＣＡＣＡＡＡＣＡＴＡＣ
   Ａ’ｌ’ＡＴＡ（、’Ｃ１′１−ＣＧＡＧＡＣＣ′ｒＧ
   ｉ−ｎ’Ａ′ｒＡｃＣＴ′ｌ’Ｇ　ＣＡＡＣ′ｒＧＴＧ
   Ｔ７１　ＧＴＴＧ　ＧＴｌ’ＡＣＡＴＣＧＧ　ｉ’ＧＡ
   Ｇ　ＣＧ′１］’ＧＣ（、ＡＡＣＧ１’ｉ’ＧＡＣＡＣ
   ＡＡＣＡＡ（てＡＡｉＧ１’ＡＧＣＣＡＣ１−ＣＧＣＡ
   ＡＣＧ′Ｉ′ または ＡＣＴＣＣＧＡＡ”ｌ’ＧＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＣＡＣ
   ＧＡＣＧＧＴＴＡＴＴＧＣＣＴＧ３）ベクターとしてｐ
   ｌＮ−Ｉ−Ａ、を用いた特許請求の範囲第２項記載の組
   換えプラスミド ４）ベクタ〜として９５Ｍ９００１を用いた特許請求の
   範囲第２項記載の組換えプラスミド ５）下記のヌクレオチド配列で表わされることを特徴と
   する直接発現型ヒトウロカストロン遺伝子を含有する組
   換えプラスミドを保持するニジエリシャーコリー（Ｅｓ
   ｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ） ＣＧＡＡ’ｌ”Ｇ　ＣＣ２ＣＧ　ＣＴＧ′ｒＣ１’ＣＡ
   ＣＧＡＣＧＧ′Ｉ”］　Ａ”１丁Ｇ　ＣＣ”ｌ’Ｇ　Ｃ
   Ａ１”Ｃ′ＦＡＣＣＡＣＡＡＡＣＡ′ｌ’ＡＣ；Ａ′ｒ
   Ａ１’ＡＧＣ’ｎ’ＣＧＡＧＡＣＣ１Ｇ”Ｉ”Ｆ１’Ａ
   ＡＡＣＧＧ１’ＣＡ′ｌ’ＡＧＣＧＣ′ｒＧＧＡＣ１丁
   １’Ａｔ、：ＣＡＣＣＣ１’ＴＧＡＣＧＣＡまたは ＧＴＡＧ１丁＋；ＡＡＧＧＡＧ’ｒ１１’ＡＡｉ”ＣＧ
   ＡＴ（ＪＡＡＣ１’ＣＴＧＡＣＴＣＣＡＴＣＡＡＣＴＴ
   ＣＣ１’ＣＡＡＡ’ｒｌ’ＡにＣ１’ＡＣ１ＴＧＡＧＡ
   ＣＴＧＡＧＣＴＡＣＣＡ　ＣＡＡＡＣＡｉ’ＡＣＡＩ’
   Ａ′ｒＡＧ　（、’ｌ−１’ＣＧＡＧ　ＡＣＣｌ　Ｇｉ
   　’ＴＩ’ＡＡＴＧＣｎ　’Ｃ；　ＣＡＡＣＩ　ＧＴＧ
   ＴｒＧｉ”１　ＧＧｉ　ＴＡＣＡｉ　ＣＧＧＴＧ　ＡＧ
   　ＣＧ１’ＡＣＧＡＡＣＧＴｌ’ＧＡＣＡＣＡＡＣＡＡ
   ＣＣＡＡＴＧ’ｌ’ＡＧＣＣＡＣ１’ＣＧＣＴｒＧＣＣ
   ＡＧ”ｌ’Ａ”ｌ’ＣＧＣＧＡＣＣ１ＧＡＡＡ′ｒＧＧ
   ＴＧＧＧＡＡＣ’ｌ　ＧＣＧＴＡＡＣＧＧ７ＦＣＡ１Ａ
   ＧＣ（、Ｃ１ＧＧＡＣＴＴＴＡＣＣＡＣＣＣＴ′ｌ’Ｇ
   ＡＣＧＣＡ１、八ＡＴＧＡ ＴＴＡＣＴ または ”１ＧＣＡｉＧＡＴＧＧＴＧ］］丁ＧＴＡｉＧｉ−八］
   ’Ａｉ’ＣＧＡＡＧＣ１ＣＴＧＧＡＩ（らＣＡＡＣＧＧ
   Ｉ（二Ａｉ’ＡＧＣ（ｉＣＴＧＧＡＣｌ−１’−１’Ａ
   ｃｃＡｃｃｃ１丁ＧＡＣＣＧｉ’ＴＡＡｉ ＧＣＡＡｌ”ｌ’Ａｃ１ＡＧ