JPH055840B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH055840B2 JPH055840B2 JP60055514A JP5551485A JPH055840B2 JP H055840 B2 JPH055840 B2 JP H055840B2 JP 60055514 A JP60055514 A JP 60055514A JP 5551485 A JP5551485 A JP 5551485A JP H055840 B2 JPH055840 B2 JP H055840B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- igf
- fused
- gene
- formula
- peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 claims description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims description 7
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 5
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N oxalonitrile Chemical compound N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical group O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 dimethoxytrityl Chemical group 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 2
- 125000002103 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)(C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H])C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000005426 adeninyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1N)* 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
この発明はヒトインスリン様成長因子（以下
IGF−と略称する）の製造法に関する。 ところで、ヒトインスリン様成長因子は、あ
る種のホルモンにより刺激されたヒトの組織、肝
および腎において主として合成される蛋白ホルモ
ンであつて、ヒト血清中に見出される。 IGF−は、インスリン様の活性および軟骨に
よる硫酸塩取込みを刺激する活性を有するととも
に細胞内での蛋白およびDNAの合成を増強する
ことが、知られている。 従つて、それは成長の促進に有用であり、また
糖尿病の臨床治療においても有用でありうる。 IGF−はヒト血清中に分泌される量がわずか
であり、数トンのヒト血清から数mgしか単離でき
ない。なお、IGF−産生細胞から純粋な形で単
離され、IGF−が上記の生物学的性質を有する
ことが見出され、そのアミノ酸配列が文献に報告
されている。 しかしながら、IGF−のより実行可能な商業
的製造法が必要であり、かかる必要性が本発明の
完成に対する刺激となつた。 組換えDNA（遺伝子組換え）技術ならびに関連
技術の適用が、最も有効なIGF−の大量製造法
となると考えられた。 IGF−は、次の配列の70個のアミノ酸からな
ることが知られている。
IGF−と略称する）の製造法に関する。 ところで、ヒトインスリン様成長因子は、あ
る種のホルモンにより刺激されたヒトの組織、肝
および腎において主として合成される蛋白ホルモ
ンであつて、ヒト血清中に見出される。 IGF−は、インスリン様の活性および軟骨に
よる硫酸塩取込みを刺激する活性を有するととも
に細胞内での蛋白およびDNAの合成を増強する
ことが、知られている。 従つて、それは成長の促進に有用であり、また
糖尿病の臨床治療においても有用でありうる。 IGF−はヒト血清中に分泌される量がわずか
であり、数トンのヒト血清から数mgしか単離でき
ない。なお、IGF−産生細胞から純粋な形で単
離され、IGF−が上記の生物学的性質を有する
ことが見出され、そのアミノ酸配列が文献に報告
されている。 しかしながら、IGF−のより実行可能な商業
的製造法が必要であり、かかる必要性が本発明の
完成に対する刺激となつた。 組換えDNA（遺伝子組換え）技術ならびに関連
技術の適用が、最も有効なIGF−の大量製造法
となると考えられた。 IGF−は、次の配列の70個のアミノ酸からな
ることが知られている。
【表】
【表】
この発明の発明者らは、以下の諸必須工程を用
いて大量のIGF−を製造することに成功した。 工程１ IGF−をコードする遺伝子を製造するプロセ
ス。このプロセスに続いて、保護ペプチドをコー
ドする遺伝子を、IGF−をコードする遺伝子
（以下、IGF−遺伝子と呼ぶ）と、該IGF−
遺伝子の上流にリンカーを用いるかまたは用いな
いで連結することからなるところの、保護ペプチ
ドと融合したIGF−（以下、融合IGF−と呼
ぶ）をコードする遺伝子を製造するプロセスを設
ける。 適当な「リンカー」には、IGF−遺伝子の上
流に保護ペプチドを連結するための適当な制限酵
素認識部位をもち、数個のアミノ酸をコードする
遺伝子が包含され得て、「リンカー」自身が該保
護ペプチドを構成する。 とくに好ましい「リンカー」は後記の実施例中
で例示されているごときものである。 適当な「融合IGF−、すなわち保護ペプチド
と融合したIGF−」は、後記の実施例において
説明、例示されるごときものである。 工程２ プロモーター遺伝子および融合IGF−をコー
ドする遺伝子をプラスミド中に挿入することから
なる発現ベクター製造プロセス。 とくに適当な「発現ベクター」には、プラスミ
ドpLHSdMmtrpなどが含まれうる。 とくに適当な「プラスミド」には、pBR322な
どが含まれうる。 工程３ 前記発現ベクターで宿主生物を形質転換するこ
とからなる形質転換体製造プロセス。 適当な「宿主生物」には、エシエリキア・コリ
（Escherichia coli）（たとえばエシエリキア・コ
リHB101など）などが含まれうる。 工程４ 前記の形質転換体を適当な培地中で培養するこ
とからなる融合IGF−製造プロセス。 工程５ 宿主生物の細胞から融合IGF−を単離するプ
ロセス。 工程 ６ 前記融合IGF−を保護ペプチド脱離反応に付
すことからなるIGF−製造プロセス。 「融合IGF−、すなわち保護ペプチドと融合
したIGF−」なる表現における「保護ペプチ
ド」は、宿主生物細胞中でのプロテアーゼによる
分解に対してIGF−を保護するために使用さ
れ、該融合IGF−Ｉの脱離反応によつて除去され
る。 すなわち、該融合IGF−は、脱離反応によつ
てIGF−を調製するための中間体であり、従つ
て該保護ペプチドは、天然または合成の蛋白、天
然または合成のペプチド、あるいはそれらの断片
から誘導された任意の脱離可能な保護ペプチドで
ありうる。 適当な「融合IGF−」には、蛋白ペプチドの
メチオニンを介してその蛋白ペプチドと融合した
IGF−がふくまれる。 この脱離反応に使用される適当な試薬には臭化
シアンが含まれる。 この工程では、蛋白ペプチドがそれぞれのメチ
オニンを介してIGF−と融合している場合に
は、融合IGF−は、臭化シアンを用いる脱離反
応によつて高収率でIGF−に転化できる。 本脱離反応は、反応に悪影響を及ぼさない通常
の溶媒中で緩和な条件下に実施できる。 上記IGF−のアミノ酸配列から、いくつかの
特定の非自明の基準に従つて、対応するヌクレオ
チド配列を発明した。IGF−遺伝子を、クロー
ニングベクターとしての既知のプラスミドに挿入
することによつて、クローン化した。組換えプラ
スミドからIGF−遺伝子を切出し、つぎに、プ
ロモーターによる制御下でのIGF−遺伝子の発
現を極大ならしめるように特にデザインされたプ
ラスミド中にIGF−遺伝子を挿入した。さら
に、保護ペプチドをコードする構造遺伝子を前記
IGF−遺伝子の上流にかつそれを隣接して挿入
した。 以下に、本発明をより詳しく説明するが、本発
明はそれらに限定されるものではない。 〔1〕 IGF−遺伝子の調製とクローニング： (1) IGF−遺伝子の調製： 遺伝暗号の多様性のため、上記アミノ酸配
列から、IGF−をコードする多数のヌクレ
オチド配列を予言することが可能である。 多数の可能性のうちから最適の配列を本発
明に従つて決定するに当つて、いくつかの自
明でない基準に従つた。まず、使用する予定
の宿主生物に受容れられうるトリヌクレオチ
ドコドンを使用すべきである。第二に、その
配列は、所望通りの配置でプラスミド中へ挿
入できるよう、分子の末端に種々の制限酵素
認識部位をもつことが望ましい。さらに、周
知のクローニングベクターの使用が可能とな
るような部位を選択するようにすべきであ
る。第三に、合成が不必要に複雑であつては
ならず、また、遺伝子の組立てを容易にすべ
く、誤まつた交差ハイブリツド化を極少にし
て、不可逆的なオフダイアゴナル（off−
diagonal）な相互反応をできるだけ避けるよ
うにすべきである。 IGF−遺伝子部分をコードするために選
んだ好ましい配列を一例を以下に示すことが
できる：
いて大量のIGF−を製造することに成功した。 工程１ IGF−をコードする遺伝子を製造するプロセ
ス。このプロセスに続いて、保護ペプチドをコー
ドする遺伝子を、IGF−をコードする遺伝子
（以下、IGF−遺伝子と呼ぶ）と、該IGF−
遺伝子の上流にリンカーを用いるかまたは用いな
いで連結することからなるところの、保護ペプチ
ドと融合したIGF−（以下、融合IGF−と呼
ぶ）をコードする遺伝子を製造するプロセスを設
ける。 適当な「リンカー」には、IGF−遺伝子の上
流に保護ペプチドを連結するための適当な制限酵
素認識部位をもち、数個のアミノ酸をコードする
遺伝子が包含され得て、「リンカー」自身が該保
護ペプチドを構成する。 とくに好ましい「リンカー」は後記の実施例中
で例示されているごときものである。 適当な「融合IGF−、すなわち保護ペプチド
と融合したIGF−」は、後記の実施例において
説明、例示されるごときものである。 工程２ プロモーター遺伝子および融合IGF−をコー
ドする遺伝子をプラスミド中に挿入することから
なる発現ベクター製造プロセス。 とくに適当な「発現ベクター」には、プラスミ
ドpLHSdMmtrpなどが含まれうる。 とくに適当な「プラスミド」には、pBR322な
どが含まれうる。 工程３ 前記発現ベクターで宿主生物を形質転換するこ
とからなる形質転換体製造プロセス。 適当な「宿主生物」には、エシエリキア・コリ
（Escherichia coli）（たとえばエシエリキア・コ
リHB101など）などが含まれうる。 工程４ 前記の形質転換体を適当な培地中で培養するこ
とからなる融合IGF−製造プロセス。 工程５ 宿主生物の細胞から融合IGF−を単離するプ
ロセス。 工程 ６ 前記融合IGF−を保護ペプチド脱離反応に付
すことからなるIGF−製造プロセス。 「融合IGF−、すなわち保護ペプチドと融合
したIGF−」なる表現における「保護ペプチ
ド」は、宿主生物細胞中でのプロテアーゼによる
分解に対してIGF−を保護するために使用さ
れ、該融合IGF−Ｉの脱離反応によつて除去され
る。 すなわち、該融合IGF−は、脱離反応によつ
てIGF−を調製するための中間体であり、従つ
て該保護ペプチドは、天然または合成の蛋白、天
然または合成のペプチド、あるいはそれらの断片
から誘導された任意の脱離可能な保護ペプチドで
ありうる。 適当な「融合IGF−」には、蛋白ペプチドの
メチオニンを介してその蛋白ペプチドと融合した
IGF−がふくまれる。 この脱離反応に使用される適当な試薬には臭化
シアンが含まれる。 この工程では、蛋白ペプチドがそれぞれのメチ
オニンを介してIGF−と融合している場合に
は、融合IGF−は、臭化シアンを用いる脱離反
応によつて高収率でIGF−に転化できる。 本脱離反応は、反応に悪影響を及ぼさない通常
の溶媒中で緩和な条件下に実施できる。 上記IGF−のアミノ酸配列から、いくつかの
特定の非自明の基準に従つて、対応するヌクレオ
チド配列を発明した。IGF−遺伝子を、クロー
ニングベクターとしての既知のプラスミドに挿入
することによつて、クローン化した。組換えプラ
スミドからIGF−遺伝子を切出し、つぎに、プ
ロモーターによる制御下でのIGF−遺伝子の発
現を極大ならしめるように特にデザインされたプ
ラスミド中にIGF−遺伝子を挿入した。さら
に、保護ペプチドをコードする構造遺伝子を前記
IGF−遺伝子の上流にかつそれを隣接して挿入
した。 以下に、本発明をより詳しく説明するが、本発
明はそれらに限定されるものではない。 〔1〕 IGF−遺伝子の調製とクローニング： (1) IGF−遺伝子の調製： 遺伝暗号の多様性のため、上記アミノ酸配
列から、IGF−をコードする多数のヌクレ
オチド配列を予言することが可能である。 多数の可能性のうちから最適の配列を本発
明に従つて決定するに当つて、いくつかの自
明でない基準に従つた。まず、使用する予定
の宿主生物に受容れられうるトリヌクレオチ
ドコドンを使用すべきである。第二に、その
配列は、所望通りの配置でプラスミド中へ挿
入できるよう、分子の末端に種々の制限酵素
認識部位をもつことが望ましい。さらに、周
知のクローニングベクターの使用が可能とな
るような部位を選択するようにすべきであ
る。第三に、合成が不必要に複雑であつては
ならず、また、遺伝子の組立てを容易にすべ
く、誤まつた交差ハイブリツド化を極少にし
て、不可逆的なオフダイアゴナル（off−
diagonal）な相互反応をできるだけ避けるよ
うにすべきである。 IGF−遺伝子部分をコードするために選
んだ好ましい配列を一例を以下に示すことが
できる：
【表】
【表】
この明細書における配列の表示において、
Ａ、Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれ次の式を意
味する：
Ａ、Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれ次の式を意
味する：
【式】
【式】
また、5′−末端のＡ、Ｇ、ＣおよびＴは、そ
れぞれ次式を意味する：
れぞれ次式を意味する：
【式】
そして、3′−末端のＡ、Ｇ、ＣおよびＴは、
それぞれ次式を意味する：
それぞれ次式を意味する：
【式】
【式】
【式】
上記の諸基準、とくに上記第二の基準を考慮
に入れるとき、次の少しく長い配列を選択す
ることができる。 実際、この発明の適当な実施態様として、
EcoRIおよびBamHI部位を選択して、それ
ぞれ5′末端および3′末端に導入することがで
きる。 さらに、メチオニンコドン（ATG）を、
IGF−のＮ末端アミノ酸コドンの上流に、
これに隣接して、挿入し、２種の停止コドン
（TGAおよびTAG）を、Ｃ末端コドンの下
流に、これに隣接して、挿入した。
に入れるとき、次の少しく長い配列を選択す
ることができる。 実際、この発明の適当な実施態様として、
EcoRIおよびBamHI部位を選択して、それ
ぞれ5′末端および3′末端に導入することがで
きる。 さらに、メチオニンコドン（ATG）を、
IGF−のＮ末端アミノ酸コドンの上流に、
これに隣接して、挿入し、２種の停止コドン
（TGAおよびTAG）を、Ｃ末端コドンの下
流に、これに隣接して、挿入した。
【表】
【表】
本発明は、相当する多数のオリゴヌクレオチ
ドブロツクのハイブリツド化およびライゲー
シヨンからなることを特徴とする、前記のご
とき遺伝子の製造方法にも関するものであ
る。 (i) オリゴヌクレオチド類の合成： 実際、30種の合成オリゴヌクレオチドを
作成することによつて、上記の拡張された
配列を有する分子を合成することとした。
それら合成オリゴヌクレオチドを所定の段
階でハイブリツド化し、ライゲートすると
き、上記の二重鎖ヌクレオチド配列を与え
るものである。 この明細書におけるオリゴヌクレオチド
類の合成に関する記載においては、次の略
号を用いる。 Ap、Gp、CpおよびTpは、それぞれ次
式を意味する：
ドブロツクのハイブリツド化およびライゲー
シヨンからなることを特徴とする、前記のご
とき遺伝子の製造方法にも関するものであ
る。 (i) オリゴヌクレオチド類の合成： 実際、30種の合成オリゴヌクレオチドを
作成することによつて、上記の拡張された
配列を有する分子を合成することとした。
それら合成オリゴヌクレオチドを所定の段
階でハイブリツド化し、ライゲートすると
き、上記の二重鎖ヌクレオチド配列を与え
るものである。 この明細書におけるオリゴヌクレオチド
類の合成に関する記載においては、次の略
号を用いる。 Ap、Gp、CpおよびTpは、それぞれ次
式を意味する：
【式】
【式】
また、3′末端のＡ、Ｇ、ＣおよびＴは、そ
れぞれ次式を意味する：
れぞれ次式を意味する：
【式】
【式】
【式】
ABzpo、GiBpo、CBzpo、TpoおよびACUpo
は、それぞれ次式を意味する。 DMTrはジメトキシトリチルであり、Ｂ
はアデニニル、グアニニル、シトシニルお
よびチミニル（便宜上、保護基は示さな
い）、 Ｕはウラシルであり、 Acはアセチルであり、 ｍは１または２なる整数であり、 ｎは１〜12の整数である。 オリゴヌクレオチド類は次の通りであ
る：
は、それぞれ次式を意味する。 DMTrはジメトキシトリチルであり、Ｂ
はアデニニル、グアニニル、シトシニルお
よびチミニル（便宜上、保護基は示さな
い）、 Ｕはウラシルであり、 Acはアセチルであり、 ｍは１または２なる整数であり、 ｎは１〜12の整数である。 オリゴヌクレオチド類は次の通りであ
る：
【表】
【表】
その逐次カツプリング反応を第１表に示
す。 モノ（またはジ、あるいはトリ）マー
（）は、広瀬の方法（T.Hirose、蛋白
質・核酸、酵素ISSN、25、225（1980）、日
本で発行）によつて調製でき、カツプリン
グはリン酸トリエステル法〔R.Creaら、
Nucleic Acids Research、８、2331
（1980）およびM.L.Duckworthら、
Nucleic Acids、Research、９、1691
（1981）〕により、セルロース担体上で実施
できる。 とくに、実施例１に記載したヘキサデカ
ヌクレオチド
HOApApApCpCpGpApCpCpGpGpCpTp
ＡｐＴｐＧＯＨ（Ｇ１）の合成に関して、合成
法を説明することとする。ヘキサデカヌク
レオチドG1合成のフローチヤートを第２
表に示す。
す。 モノ（またはジ、あるいはトリ）マー
（）は、広瀬の方法（T.Hirose、蛋白
質・核酸、酵素ISSN、25、225（1980）、日
本で発行）によつて調製でき、カツプリン
グはリン酸トリエステル法〔R.Creaら、
Nucleic Acids Research、８、2331
（1980）およびM.L.Duckworthら、
Nucleic Acids、Research、９、1691
（1981）〕により、セルロース担体上で実施
できる。 とくに、実施例１に記載したヘキサデカ
ヌクレオチド
HOApApApCpCpGpApCpCpGpGpCpTp
ＡｐＴｐＧＯＨ（Ｇ１）の合成に関して、合成
法を説明することとする。ヘキサデカヌク
レオチドG1合成のフローチヤートを第２
表に示す。
【表】
↓
DMTrOCＢｚpoCＢｚpoGｉＢpoAＢｚpoCＢｚpoCＢｚpoG
ｉＢpoGｉＢpoCＢｚpoTpoAＢｚpoTpoGｉＢpoＡｃUpo〓c
ellulose
↓
HOCＢｚpoCＢｚpoGｉＢpoAＢｚpoCＢｚpoCＢｚpo
GｉＢpoGｉＢpoCＢｚpoTpoAＢｚpoTpoGｉＢpoＡｃUpo〓
cellulose
DMTrOAＢｚpoAＢｚpoAＢｚpo〓CE
DMTrOCＢｚpoCＢｚpoGｉＢpoAＢｚpoCＢｚpoCＢｚpoG
ｉＢpoGｉＢpoCＢｚpoTpoAＢｚpoTpoGｉＢpoＡｃUpo〓c
ellulose
↓
HOCＢｚpoCＢｚpoGｉＢpoAＢｚpoCＢｚpoCＢｚpo
GｉＢpoGｉＢpoCＢｚpoTpoAＢｚpoTpoGｉＢpoＡｃUpo〓
cellulose
DMTrOAＢｚpoAＢｚpoAＢｚpo〓CE
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 保護ペプチドが最終のアミノ酸としてメチオ
ニンを有する蛋白ペプチドであつて、その蛋白ペ
プチドの該メチオニンを介してインスリン様成長
因子と融合している保護ペプチド融合インスリ
ン様成長因子を臭化シアンを用いた脱離反応に
付すことを特徴とするインスリン様成長因子の
製造法。 ２ 保護ペプチド融合インスリン様成長因子が
次のアミノ酸配列をもつ特許請求の範囲１記載の
インスリン様成長因子の製造法。 【表】 【表】
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB848407044A GB8407044D0 (en) | 1984-03-19 | 1984-03-19 | Producing human insulin |
| GB8424197 | 1984-09-25 | ||
| GB8407044 | 1984-09-25 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4153492A Division JPH07108229B2 (ja) | 1984-03-19 | 1992-06-12 | 保護ペプチド融合インスリン様成長因子ｉ遺伝子 |
| JP4153493A Division JPH0713080B2 (ja) | 1984-03-19 | 1992-06-12 | 保護ペプチド融合インスリン様成長因子ｉ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS611396A JPS611396A (ja) | 1986-01-07 |
| JPH055840B2 true JPH055840B2 (ja) | 1993-01-25 |
Family
ID=10558294
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5551485A Granted JPS611396A (ja) | 1984-03-19 | 1985-03-18 | インスリン様成長因子ｉの製造法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS611396A (ja) |
| GB (1) | GB8407044D0 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0759598B2 (ja) * | 1986-02-14 | 1995-06-28 | 藤沢薬品工業株式会社 | ヒトインスリン様成長因子▲ｉ▼の製造法 |
| WO2016051752A1 (ja) * | 2014-09-29 | 2016-04-07 | 国立大学法人東北大学 | プロテアーゼの基質ペプチド及びプロテアーゼの活性測定方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54163600A (en) * | 1977-11-08 | 1979-12-26 | Genentech Inc | Microbiological polypeptide expression method and means |
| JPS56145221A (en) * | 1980-03-24 | 1981-11-11 | Genentech Inc | Bacteria polypeptide development using tryptophan promotor operator |
-
1984
- 1984-03-19 GB GB848407044A patent/GB8407044D0/en active Pending
-
1985
- 1985-03-18 JP JP5551485A patent/JPS611396A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54163600A (en) * | 1977-11-08 | 1979-12-26 | Genentech Inc | Microbiological polypeptide expression method and means |
| JPS56145221A (en) * | 1980-03-24 | 1981-11-11 | Genentech Inc | Bacteria polypeptide development using tryptophan promotor operator |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB8407044D0 (en) | 1984-04-26 |
| JPS611396A (ja) | 1986-01-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0155655B1 (en) | Process for production of insulin-like growth factor i | |
| CA2304254C (en) | Trimerising module | |
| AU638277B2 (en) | Fusion proteins, their preparation and use | |
| EP0046039B2 (en) | Synthetic urogastrone gene, corresponding plasmid recombinants, transformed cells, production thereof and urogastrone expression | |
| EP0305481B1 (en) | Leader sequences for the production of recombinant proteins | |
| WO1985000831A1 (en) | Microbial expression of insulin-like growth factor | |
| US4745179A (en) | 59 Valine insulin-like growth factor I and process for production thereof | |
| JPS6229600A (ja) | 融合タンパク質、その生産方法及びその用途 | |
| EP0119621A1 (en) | Interleukin-2 | |
| US5028531A (en) | IGF-I fusion proteins; protection of IGF-I from degradation by host cell; and processes for the production thereof | |
| NL8501880A (nl) | Nieuw beta-urogastron-gen, overeenkomstige recombinerende plasmiden, overeenkomstige transformerende produkten, hun bereiding en die van beta-urogastron. | |
| JPH0632624B2 (ja) | 生長ホルモン放出因子ｇｒｆコ−ド構造遺伝子を含有する二本鎖ポリデオキシニユクレオチド | |
| US20030170811A1 (en) | Process for the production of alpha-human atrial natriuretic polypeptide | |
| JPS63304987A (ja) | アンギオゲニン類の遺伝子工学産生方法 | |
| JPH055840B2 (ja) | ||
| EP0207165A1 (en) | Polypeptide secretion-causing vector, microorganisms transformed by said vector, and process for preparing polypeptide using said microorganisms | |
| HU202281B (en) | Process for producing selectable and independently replicable recombinant dna expression vectors | |
| JP2568383B2 (ja) | ポリペプチドをコード化するｄｎａ配列 | |
| EP0335400B1 (en) | Processes for production of human epidermal growth factor by genetic engineering | |
| EP0176916A2 (en) | Process for production of gamma-interferon | |
| KR960010951B1 (ko) | 신규한 인간 상피세포 성장인자 유전자 | |
| JP2561060B2 (ja) | 改良型ｒｎアーゼｔ１ | |
| KR900007867B1 (ko) | 합성유전자에 의한 효모세포로부터 인간 γ-인터페론의 제조방법 | |
| EP0197558A2 (en) | Process for production of somatostatin | |
| JPS611397A (ja) | ５９バリンインスリン様成長因子１およびその製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |