JPS6192574A - γ‐インターフエロンの製造法 - Google Patents
γ‐インターフエロンの製造法Info
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- JPS6192574A JPS6192574A JP60211654A JP21165485A JPS6192574A JP S6192574 A JPS6192574 A JP S6192574A JP 60211654 A JP60211654 A JP 60211654A JP 21165485 A JP21165485 A JP 21165485A JP S6192574 A JPS6192574 A JP S6192574A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
この発明は７−インターフェロン（以下、ＩＦＮと略称
する）の製造法に関するものであり、医薬製造分野で利
用される。
する）の製造法に関するものであり、医薬製造分野で利
用される。
［従来の技術］
ＩＦＮは、次の配列の１４６個のアミノ酸からなること
が知られている。
が知られている。
Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔ
ｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａ １ ａ−Ｇｌｕ−
Ａｓ ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−
Ａｓ ｎ−Ａ １ ａ−Ｇ １ ｙ−Ｈｉ ５−５ｅｒ
−Ａｓｐ−Ｖａ １−Ａ １ ａ−Ａｓｐ−Ａｓ ｎ−
Ｇ １ｙ−Ｉｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅ ｕ−Ｇ １
ｙ−Ｉ １ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌ
ｙ ｓ−Ｇ １ｕ−Ｇｌ ｕ−５ｅｒ−Ａｓ ｐ−Ａｒ
ｇ−Ｌｙ ｓ −Ｉ ｌｅ−Ｍｅｔ−Ｇ １ｎ−５ｅｒ
−Ｇｌ ｎ−Ｉ １ｅ−Ｖａ １−５ｅｒ−Ｐｈ ｅ−
Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａ
ｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓ ｐ−Ａ ｓ ｐ−Ｇ １
ｎ−５ｅｒ−Ｉ １ ｅ−Ｇ １ｎ−Ｌｙｓ−５ｅｒ
−Ｖａ １−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉ １ ｅ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈ
ａ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｖ
ａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌ
ｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ
−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−
Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌ
ｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒ
ｇ−５ｅｒ−Ｇ １ ｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇ
１ ｎ−Ｇ ｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−５ｅｒ
−Ｇｌｎ ＩＦＮはマイトジェン、同種抗原およびその他の物質に
よりリンパ球中に誘導することができ、また特異抗原に
より感作リンパ球中に誘導することができる。生物学的
には、ＩＦＮは重要な免疫調節機能を有するきわめて興
味深いリンホカインである。さらに、ＩＦＮはマウス肉
腫に対し強力な抗腫瘍活性を示すことが明らかにされて
いる。
ｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａ １ ａ−Ｇｌｕ−
Ａｓ ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−
Ａｓ ｎ−Ａ １ ａ−Ｇ １ ｙ−Ｈｉ ５−５ｅｒ
−Ａｓｐ−Ｖａ １−Ａ １ ａ−Ａｓｐ−Ａｓ ｎ−
Ｇ １ｙ−Ｉｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅ ｕ−Ｇ １
ｙ−Ｉ １ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌ
ｙ ｓ−Ｇ １ｕ−Ｇｌ ｕ−５ｅｒ−Ａｓ ｐ−Ａｒ
ｇ−Ｌｙ ｓ −Ｉ ｌｅ−Ｍｅｔ−Ｇ １ｎ−５ｅｒ
−Ｇｌ ｎ−Ｉ １ｅ−Ｖａ １−５ｅｒ−Ｐｈ ｅ−
Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａ
ｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓ ｐ−Ａ ｓ ｐ−Ｇ １
ｎ−５ｅｒ−Ｉ １ ｅ−Ｇ １ｎ−Ｌｙｓ−５ｅｒ
−Ｖａ １−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉ １ ｅ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈ
ａ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｖ
ａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌ
ｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ
−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−
Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌ
ｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒ
ｇ−５ｅｒ−Ｇ １ ｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇ
１ ｎ−Ｇ ｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−５ｅｒ
−Ｇｌｎ ＩＦＮはマイトジェン、同種抗原およびその他の物質に
よりリンパ球中に誘導することができ、また特異抗原に
より感作リンパ球中に誘導することができる。生物学的
には、ＩＦＮは重要な免疫調節機能を有するきわめて興
味深いリンホカインである。さらに、ＩＦＮはマウス肉
腫に対し強力な抗腫瘍活性を示すことが明らかにされて
いる。
［発明が解決しようとする問題点コ
しかしながら、ウィルス疾患および癌の治療試験は、そ
の入手がきわめて限られているため、非常に制限されて
いる。
の入手がきわめて限られているため、非常に制限されて
いる。
ＩＦＮの商業的製造が必要であり、かかる必要性がこの
発明の完成に対する刺激となっている。
発明の完成に対する刺激となっている。
組換えＤＮＡならびに関連技術の適用が最も有効なＩＦ
Ｎの大量製造法となると考えられた。
Ｎの大量製造法となると考えられた。
［問題点を解決するための手段］
この発明の発明者らは、以下の諸必須工程を用いて定量
のＩＦＮを製造することに成功した。
のＩＦＮを製造することに成功した。
工程Ｉ
ＩＦＮの左手（以下、ＩＦＮ ＬＨと称する）をコー
ドする遺伝子をＩＦＮの右手（以下、ＩＦＮ ＲＨと
称する）をコードする遺伝子と連結することからなるＩ
ＦＮをコードする遺伝子（以下、ＩＦＮ遺伝子と称する
）の製造プロセス。
ドする遺伝子をＩＦＮの右手（以下、ＩＦＮ ＲＨと
称する）をコードする遺伝子と連結することからなるＩ
ＦＮをコードする遺伝子（以下、ＩＦＮ遺伝子と称する
）の製造プロセス。
’ ＩＦＮ遺伝子」における適当な遺伝子配列としては
後記において例示されるものが含まれる。
後記において例示されるものが含まれる。
工程２
プロモーター遺伝子およびＩＦＮ遺伝子をプラスミド中
に挿入することからなる発現ベクターの製造プロセス。
に挿入することからなる発現ベクターの製造プロセス。
適当な１発現ベクター」には、プラスミドＰ７ｔＦ／’
などが含まれる。
などが含まれる。
適当な「プラスミド」には、ｐＢＲ３２２などが含まれ
る。
る。
工程３
前記発現ベクターで宿主生物を形質転換することからな
る形質転換体製造プロセス。
る形質転換体製造プロセス。
適当な１宿主生物」には、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ） （以下、エシェリキ
ア、・コリをＥ、ｃｏｌｉと記す）（例えば、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ ＨＢＩＯＩ など）などが含まれる。
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ） （以下、エシェリキ
ア、・コリをＥ、ｃｏｌｉと記す）（例えば、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ ＨＢＩＯＩ など）などが含まれる。
工程４
前記形質転換体を適当な培地中で培養することからなる
ＩＦＮ製造プロセス。
ＩＦＮ製造プロセス。
上記ＩＦＮのアミノ酸配列から、いくつかの特定の非自
明の基準に従って、ＩＦＮ遺伝子の対応するヌクレオチ
ド配列を発明した。
明の基準に従って、ＩＦＮ遺伝子の対応するヌクレオチ
ド配列を発明した。
ＩＦＮ遺伝子は二つの部分にわ（プて構築された。
一つはＩＦＮ ＬＨ遺伝子であり、もう一つはＩＦＮ
ＲＨ遺伝子である。ＩＦＮ Ｉ、Ｈ遺伝子は、ク
ローニングベクターとしての既知のプラスミドに挿入す
ることによってクローン化し、宿主生物を形質転換し、
この宿主生物からＩＦＮ ＬＨ遺伝子を有するプラス
ミドを単離した。このようにして得たＩＦＮＬＨ遺伝子
を有するプラスミドをＩＦＮ ＲＨ遺伝子のクローニ
ングベクターとして使用する。即ち、ＩＦＮ ＲＨ遺
伝子をＩＦＮ ＬＨ遺伝子の下流にかつそれに隣接し
て挿入し、宿主生物を形質転換し、この宿主生物からＩ
ＦＮ遺伝子を有するプラスミドを単離する。ＩＦＮ遺伝
子ばこのＩＦＮ遺伝子を有するプラスミド中翼 伝子を、プロモーターによる制御下でのＩＦＮ遺伝子の
発現を極大ならしめるように特にデザインされたプラス
ミド中に挿入する。
ＲＨ遺伝子である。ＩＦＮ Ｉ、Ｈ遺伝子は、ク
ローニングベクターとしての既知のプラスミドに挿入す
ることによってクローン化し、宿主生物を形質転換し、
この宿主生物からＩＦＮ ＬＨ遺伝子を有するプラス
ミドを単離した。このようにして得たＩＦＮＬＨ遺伝子
を有するプラスミドをＩＦＮ ＲＨ遺伝子のクローニ
ングベクターとして使用する。即ち、ＩＦＮ ＲＨ遺
伝子をＩＦＮ ＬＨ遺伝子の下流にかつそれに隣接し
て挿入し、宿主生物を形質転換し、この宿主生物からＩ
ＦＮ遺伝子を有するプラスミドを単離する。ＩＦＮ遺伝
子ばこのＩＦＮ遺伝子を有するプラスミド中翼 伝子を、プロモーターによる制御下でのＩＦＮ遺伝子の
発現を極大ならしめるように特にデザインされたプラス
ミド中に挿入する。
以下にこの発明の詳細な説明するが、この発明はそれら
に限定されるものではない。
に限定されるものではない。
［１］ＩＦＮ遺伝子の調製とクローニング：（１）ＬＦ
Ｎ ＬＨ遺伝子およびＩＦＮ ＲＨ遺伝子の調製遺
伝暗号の多様性のため、前記アミノ酸配列から、ＩＦＮ
ＬＨ遺伝子またはＩＦＮ ＲＨ遺伝子をコードす
る多数のヌクレオチド配列を予言することが可能である
。
Ｎ ＬＨ遺伝子およびＩＦＮ ＲＨ遺伝子の調製遺
伝暗号の多様性のため、前記アミノ酸配列から、ＩＦＮ
ＬＨ遺伝子またはＩＦＮ ＲＨ遺伝子をコードす
る多数のヌクレオチド配列を予言することが可能である
。
多数の可能性のうちから最適の配列を本発明に従って決
定するにあたって、いくつかの自明でない基準に従った
。まず、使用する予定の宿主生物に受は容れられうるト
リヌクレオチドコドンを使用すべきである。第二に、そ
の配列は、所望通りの配置でプラスミド中へ挿入できる
よう、分子の末端に種々の制限酵素認識部位をもつこと
が望ましい。さらに、既知のクローニングベクターの使
用が可能となるような部位を選択するようにすべきであ
る。第三に、合成が不必要に複雑であってはならず、ま
た、遺伝子の組立てを容易にすべく、誤った交叉ハイブ
リッド化を極小にして、安定なオフダイアゴナル（ｏｆ
ｆ−ｄｉａｇｏｎａｌ ）な相互反応をできるだけ避け
るようにすべきである。
定するにあたって、いくつかの自明でない基準に従った
。まず、使用する予定の宿主生物に受は容れられうるト
リヌクレオチドコドンを使用すべきである。第二に、そ
の配列は、所望通りの配置でプラスミド中へ挿入できる
よう、分子の末端に種々の制限酵素認識部位をもつこと
が望ましい。さらに、既知のクローニングベクターの使
用が可能となるような部位を選択するようにすべきであ
る。第三に、合成が不必要に複雑であってはならず、ま
た、遺伝子の組立てを容易にすべく、誤った交叉ハイブ
リッド化を極小にして、安定なオフダイアゴナル（ｏｆ
ｆ−ｄｉａｇｏｎａｌ ）な相互反応をできるだけ避け
るようにすべきである。
上記基準、特に上記第二の基準を考慮に入れるとき、少
し長い配列を選択することができる。
し長い配列を選択することができる。
ＩＦＮ ＬＨ遺伝子の構造：
ＩＦＮ ＬＨ遺伝子はＩＦＮの１番目から７３番目の
アミノ酸をコードする。
アミノ酸をコードする。
この発明の適当な一実施態様として、ＥｃｏＲＩおよび
Ｂａｍ）（Ｉ部位を選択して、それぞれ、ＩＦＮ Ｌ
Ｈ遺伝子の５′末端および３′末端に導入した。さらに
、１ｉｎｄ ｍ部位を選択して、リジン（５８番目のア
ミノ酸）およびロイシン（５９番目のアミノ酸）をミノ
酸の上流に、これに隣接して挿入し、３種の停止コドン
（ＴＡＡ、 ＴＧＡおよびＴＡＧ ）を、Ｃ末端コドン
の下流に、これに隣接して挿入した。 ＩＦＮＬＨ遺伝
子部分をコードするために選んだ好ましい配列の一例を
以下に示す。
Ｂａｍ）（Ｉ部位を選択して、それぞれ、ＩＦＮ Ｌ
Ｈ遺伝子の５′末端および３′末端に導入した。さらに
、１ｉｎｄ ｍ部位を選択して、リジン（５８番目のア
ミノ酸）およびロイシン（５９番目のアミノ酸）をミノ
酸の上流に、これに隣接して挿入し、３種の停止コドン
（ＴＡＡ、 ＴＧＡおよびＴＡＧ ）を、Ｃ末端コドン
の下流に、これに隣接して挿入した。 ＩＦＮＬＨ遺伝
子部分をコードするために選んだ好ましい配列の一例を
以下に示す。
ＥｃｏＲＩ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｙｓ Ｃｙｓ Ｇｌｎ
コードする鎖： ５°−ＡＡＩＴＣ−ＡＴＧ−ＩＧＴ−
ＴＡＣ−ＴＧＣ−ＣＡＧ−コードしない鎖： ３’
−Ｇ（ＡＣ−ＡＣＡ−ＡＴＧ−ＡＣＧ−ＧＴＣ−Ａｓｐ
Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ ＬｙｓＧＡＣ−ＣＣＡ−ＴＡ
Ｔ−ＧＴＡ−ＡＡＡ−ＧＡＡ−ＧＣＡ−ＧＡＡ−ＡＡＣ
−ＣＴＴ−ＡＡＧ−ＣＴＧ−ＧＧＴ−ＡＴＡ−ＣＡＴ−
ＴＴＴ−ＣＴＴ−ＣＧＴ−ＣＴＴ−ＴＴＧ−ＧＡＡ−Ｔ
ＴＣ−Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌ
ｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｔ ＡｌａＡＡＡ−
ＴＡＣ−ＴＴＴ−ＡＡＩ−ＧＣＡ−ＧＧＴ−ＣＡＩ−Ｔ
ＣＡ−ＧＡＩ−ＧＴＡ−ＧＣＧ−ＴＴＴ−ＡＴＧ−ＡＡ
Ａ−ＴＴＡ−ＣＧＩ−ＣＣＡ−ＧＴＡ−ＡＧＴ−ＣＴＡ
−ＣＡＩ−ＣＧＣ−Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｌ
ｙｓＧＡＴ−ＡＡＴ−ＧＧＡ−ＡＣＴ−ＣＴＴ−ＴＴＣ
−ＴＴＡ−ＧＧＣ−ＡＴＴ−ＴＴＧ−ＡＡＧ−ＣＩＡ−
ＴＴＡ−ＣＣＴ−ＴＧＡ−ＧＡＡｌＡＡＧ−ＡＡＴ−Ｃ
ＣＧ−ＴＡＡ−ＡＡＣ−ＴＴＣ−Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｙ
ｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ ＭｅｔＡＡＴ−ＴＧＧ−ＡＡＡ−ＧＡＧ−Ｇ
ＡＧ−ＡＧＴ−ＧＡＣ−ＡＧＡ−ＡＡＡ−ＡＴＡ−ＡＴ
Ｇ−ＴＴＡ−ＡＣＣ−ＴＴＴ−ＣＴＣ−ＣＴＣ−ＴＣＡ
−ＣＴＧ−ＴＣＴ−ＴＴＴ−ＴＡＴ−ＴＡＣ−Ｇｉｎ
Ｓｅｒ Ｇｌｎ ｌｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔ
ｙｒ ＰｈｅＣＡＧ’−ＡＧＣ−ＣＡＡ−ＡＴＴ−ＧＴ
Ｃ−ＴＣＣ−ＩＩＴ−ＩＡＣ−ＩＴＣ−ＧＴＣ−ＩＣＧ
−ＧＴＩ−ＴＡＡ−ＣＡＧ−ＡＧＧ−ＡＡＡ−ＡＴＧ−
ＡＡＧ−Ｂｉｎｄｌ［Ｉ ６０ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌ
ｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｎ ５ｅｒＡＡＧ−ＣＴＴ
−ＴＴＣ−ＡＡＡ−ＡＡＣ−ＴＴＴ−ＡＡＧ−ＧＡＩ−
ＧＡＣ−ＣＡＧ−ＡＧＣ−ＴＴＣ−ＧＡＡ−ＡＡＧ−Ｔ
ＴＴ−ＴＴＧ−ＡＡＡ−ＴＴＣ−ＣＴＡ−ＣＴＧ−ＧＴ
Ｃ−ＩＣＧ−１１ｅ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ｓｔ、ｏｐ ５ｔｏｐ ＢａｍＨＩＡＴＣ−ＣＡＡ−
ＡＡＧ−ＡＧＴ−ＧＴＧ−ＴＡＡ−ＴＧＡ−ＴＡＧＴＡ
Ｇ−ＧＴＴ−ＴＴＣ−ＴＣＡ−ＣＡＣ−ＡＴｒ−ＡＣＴ
−ＡＩＣＣＴＡＧＩＦＮ ＲＨ遺伝子の構造： ＩＦＮ ＲＨ遺伝子はＩＦＮの６０番目から１４６４
６番目ミノ酸をコードする。この発明の適当な実施態様
として、Ｈｉｎｄｌ［［およびＢａｍＨＩ部位を選択し
て、そ＋−＋１にζ′ 中狸セトｒｇ Ｑ ’ 中地
Ｌ９道１１ 徳山コドン（ＩＡＡ）をＣ末端コドンの
下流に、これに隣接して挿入した。
コードする鎖： ５°−ＡＡＩＴＣ−ＡＴＧ−ＩＧＴ−
ＴＡＣ−ＴＧＣ−ＣＡＧ−コードしない鎖： ３’
−Ｇ（ＡＣ−ＡＣＡ−ＡＴＧ−ＡＣＧ−ＧＴＣ−Ａｓｐ
Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ ＬｙｓＧＡＣ−ＣＣＡ−ＴＡ
Ｔ−ＧＴＡ−ＡＡＡ−ＧＡＡ−ＧＣＡ−ＧＡＡ−ＡＡＣ
−ＣＴＴ−ＡＡＧ−ＣＴＧ−ＧＧＴ−ＡＴＡ−ＣＡＴ−
ＴＴＴ−ＣＴＴ−ＣＧＴ−ＣＴＴ−ＴＴＧ−ＧＡＡ−Ｔ
ＴＣ−Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌ
ｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｔ ＡｌａＡＡＡ−
ＴＡＣ−ＴＴＴ−ＡＡＩ−ＧＣＡ−ＧＧＴ−ＣＡＩ−Ｔ
ＣＡ−ＧＡＩ−ＧＴＡ−ＧＣＧ−ＴＴＴ−ＡＴＧ−ＡＡ
Ａ−ＴＴＡ−ＣＧＩ−ＣＣＡ−ＧＴＡ−ＡＧＴ−ＣＴＡ
−ＣＡＩ−ＣＧＣ−Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｌ
ｙｓＧＡＴ−ＡＡＴ−ＧＧＡ−ＡＣＴ−ＣＴＴ−ＴＴＣ
−ＴＴＡ−ＧＧＣ−ＡＴＴ−ＴＴＧ−ＡＡＧ−ＣＩＡ−
ＴＴＡ−ＣＣＴ−ＴＧＡ−ＧＡＡｌＡＡＧ−ＡＡＴ−Ｃ
ＣＧ−ＴＡＡ−ＡＡＣ−ＴＴＣ−Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｙ
ｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ ＭｅｔＡＡＴ−ＴＧＧ−ＡＡＡ−ＧＡＧ−Ｇ
ＡＧ−ＡＧＴ−ＧＡＣ−ＡＧＡ−ＡＡＡ−ＡＴＡ−ＡＴ
Ｇ−ＴＴＡ−ＡＣＣ−ＴＴＴ−ＣＴＣ−ＣＴＣ−ＴＣＡ
−ＣＴＧ−ＴＣＴ−ＴＴＴ−ＴＡＴ−ＴＡＣ−Ｇｉｎ
Ｓｅｒ Ｇｌｎ ｌｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔ
ｙｒ ＰｈｅＣＡＧ’−ＡＧＣ−ＣＡＡ−ＡＴＴ−ＧＴ
Ｃ−ＴＣＣ−ＩＩＴ−ＩＡＣ−ＩＴＣ−ＧＴＣ−ＩＣＧ
−ＧＴＩ−ＴＡＡ−ＣＡＧ−ＡＧＧ−ＡＡＡ−ＡＴＧ−
ＡＡＧ−Ｂｉｎｄｌ［Ｉ ６０ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌ
ｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｎ ５ｅｒＡＡＧ−ＣＴＴ
−ＴＴＣ−ＡＡＡ−ＡＡＣ−ＴＴＴ−ＡＡＧ−ＧＡＩ−
ＧＡＣ−ＣＡＧ−ＡＧＣ−ＴＴＣ−ＧＡＡ−ＡＡＧ−Ｔ
ＴＴ−ＴＴＧ−ＡＡＡ−ＴＴＣ−ＣＴＡ−ＣＴＧ−ＧＴ
Ｃ−ＩＣＧ−１１ｅ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ｓｔ、ｏｐ ５ｔｏｐ ＢａｍＨＩＡＴＣ−ＣＡＡ−
ＡＡＧ−ＡＧＴ−ＧＴＧ−ＴＡＡ−ＴＧＡ−ＴＡＧＴＡ
Ｇ−ＧＴＴ−ＴＴＣ−ＴＣＡ−ＣＡＣ−ＡＴｒ−ＡＣＴ
−ＡＩＣＣＴＡＧＩＦＮ ＲＨ遺伝子の構造： ＩＦＮ ＲＨ遺伝子はＩＦＮの６０番目から１４６４
６番目ミノ酸をコードする。この発明の適当な実施態様
として、Ｈｉｎｄｌ［［およびＢａｍＨＩ部位を選択し
て、そ＋−＋１にζ′ 中狸セトｒｇ Ｑ ’ 中地
Ｌ９道１１ 徳山コドン（ＩＡＡ）をＣ末端コドンの
下流に、これに隣接して挿入した。
Ｈｉｎｄｌｌ［Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅコード
する鎖： ５’−ＡＧ−ＣＴＴ−ＴＴＣ−ＡＡＡ−
ＡＡＣ−ＴＴＴ−コードしない鎖： ３’−Ａ
−ＡＡＧ−ＴＴＴ−ＴＴＧ−ＡＡＡ−Ｌｙｓ Ａｓｐ
Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｇｉｎ Ｌｙｓ Ｓ
ｅｒ Ｖａｌ ＧｌｕＡＡ Ｇ−ＧＡＴ−ＧＡＣ−ＣＡ
Ｇ−ＡＧＣ−ＡＴＣ−ＣＡＡ−ＡＡＧ−ＡＧＴ−ＧＴＧ
−ＧＡＧ−ＴＴ Ｃ−ＣＴＡ−ＣＴＧ−ＧＴＣ−ＴＣＧ
−ＴＡＧ−ＧＴＴ−ＴＴＣ−ＴＣＡ−ＣＡＣ−ＣＴＣ−
Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａ
ｓｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ ＰｈｅＡＣＣ−ＡＩＣ
−ＡＡＧ−ＧＡＡ−ＧＡＣ−ＡＩＧ−ＡＡＴ−ＧＴＣ−
ＡＡＧ（ＴＩ −ＩＩ Ｃ−ＴＧＧ−ＴＡＧ−ＴＴＣ−
ＣＴＴ−ＣＴＧ−ＴＡＣ−ＴＴＡ−ＣＡＧ−ＩＴＣ−Ａ
ＡＡ−ＡＡＧ−Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｌｙ
ｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ
ＡＡＩ−ＡＧＣ−ＡＡＣ−ＡＡＡ−ＡＡＧ−ＡＡＡ−Ｃ
ＧＴ−ＧＡＩ−ＧＡＣ−ＴＩＣ−ＧＡＡ−ＴＴＡ−ＴＣ
Ｇ−ＴＴＧ−ＴＴＩ−ＴＴＣ−ＩＴＴ−ＧＣＡ−ＣＴＡ
−ＣＴＧ−ＡＡＧ−ＣＴＴ−Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌ
ｅｕ ＡｓｎＡＡＧ−ＣＩＧ−ＡＣＴ−ＡＡＴ−ＩＡＩ
−ＩＣＧ−ＧＴＡ−ＡＣＩ−ＧＡＣ−ＴＴＧ−ＡＡＩ−
工ＩＣ−ＧＡＣ−ＴＧＡ−工ＩＡ−ＡＩＡ−ＡＧＣ−Ｃ
ＡＴ−ＴＧＡ−ＣＩＧ−ＡＡＣ−ＴＴＡ−Ｖａｌ Ｇｌ
ｎ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ ＧｌｎＧＴＣ−ＣＡＡ−ＣＧＣ−Ａ
ＡＡ−ＧＣＡ−ＡＩＡ−ＣＡＴ−ＧＡＡ−ＣＩＣ−ＡＴ
Ｃ−ＣＡＡ−ＣＡＧ−ＧＴＩ−ＧＣＧ−ＩＩＩ−ＣＧニ
ーＩＡＩ−ＧＴＡ−ＣＴＩ−ＧＡＧ−ＴＡＧ−ＧＴＴ−
Ｖａｌ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐ
ｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ ＴｈｒＧＴＧ−ＡＴＧ
−ＧＣＴ−ＧＡＡ−ＣＴＧ−■ＣＧ−ＣＣＡ−ＧＣＡ−
ＧＣＴ−ＡＡＡ−ＡＣＡ−ＣＡＣ−ＴＡＣ−ＣＧＡ−Ｃ
ＩニーＧＡＣ−ＡＧＣ−ＧＧＴ−ＣＧＴ−ＣＧＡ−ＴＩ
Ｔ−ＴＧＴ−Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ
Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｐｈｅ ＧｉｎＧ
ＧＧ−ＡＡＧ−ＣＧＡ−ＡＡＡ−ＣＧＴ−ＡＧＴ−ＣＡ
Ｇ−ＡＩＧ−ＣＴＧ−１１Ｔ−ＣＡＡ−ＣＣＣ−ＴＴＣ
−ＧＣＴ−ＴＴＴ−ＧＣＡ−ＴＣＡ−ＧＩＣ−ＩＡＣ−
ＧＡＣ−ＡＡＡ−ＧＴＴ−Ｇｌｙ Ａｒｇ ＡｒｇＡｌ
ａ Ｓｅｒ Ｇｌｎ ５ｔｏｐ Ｂａｍ）ＩＩＧＧＴ−
ＣＧＡ−ＡＧＡ−ＧＣＡ−ＴＣＣ−ＣＡＧ−ＴＡＡ−Ｇ
ＣＣＡ−ＧＣＴ−ＴＣＴ−ＣＧＴ−ＡＧＧ−ＧＴＣ−Ａ
ＴＴ−ＣＣＴＡＧこの明細書における配列において、５
′末端および３′末端以外のＡ％Ｇ、ＣおよびＴは・そ
れぞれ次式を意味し、 ５′末端のＡ、Ｇ、ＣおよびＴはそれぞれ次式を意味し
、 また、３′末端のＡ、Ｇ％ＣおよびＴはそれぞれ次式を
意味する。
する鎖： ５’−ＡＧ−ＣＴＴ−ＴＴＣ−ＡＡＡ−
ＡＡＣ−ＴＴＴ−コードしない鎖： ３’−Ａ
−ＡＡＧ−ＴＴＴ−ＴＴＧ−ＡＡＡ−Ｌｙｓ Ａｓｐ
Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｇｉｎ Ｌｙｓ Ｓ
ｅｒ Ｖａｌ ＧｌｕＡＡ Ｇ−ＧＡＴ−ＧＡＣ−ＣＡ
Ｇ−ＡＧＣ−ＡＴＣ−ＣＡＡ−ＡＡＧ−ＡＧＴ−ＧＴＧ
−ＧＡＧ−ＴＴ Ｃ−ＣＴＡ−ＣＴＧ−ＧＴＣ−ＴＣＧ
−ＴＡＧ−ＧＴＴ−ＴＴＣ−ＴＣＡ−ＣＡＣ−ＣＴＣ−
Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａ
ｓｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ ＰｈｅＡＣＣ−ＡＩＣ
−ＡＡＧ−ＧＡＡ−ＧＡＣ−ＡＩＧ−ＡＡＴ−ＧＴＣ−
ＡＡＧ（ＴＩ −ＩＩ Ｃ−ＴＧＧ−ＴＡＧ−ＴＴＣ−
ＣＴＴ−ＣＴＧ−ＴＡＣ−ＴＴＡ−ＣＡＧ−ＩＴＣ−Ａ
ＡＡ−ＡＡＧ−Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｌｙ
ｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ
ＡＡＩ−ＡＧＣ−ＡＡＣ−ＡＡＡ−ＡＡＧ−ＡＡＡ−Ｃ
ＧＴ−ＧＡＩ−ＧＡＣ−ＴＩＣ−ＧＡＡ−ＴＴＡ−ＴＣ
Ｇ−ＴＴＧ−ＴＴＩ−ＴＴＣ−ＩＴＴ−ＧＣＡ−ＣＴＡ
−ＣＴＧ−ＡＡＧ−ＣＴＴ−Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌ
ｅｕ ＡｓｎＡＡＧ−ＣＩＧ−ＡＣＴ−ＡＡＴ−ＩＡＩ
−ＩＣＧ−ＧＴＡ−ＡＣＩ−ＧＡＣ−ＴＴＧ−ＡＡＩ−
工ＩＣ−ＧＡＣ−ＴＧＡ−工ＩＡ−ＡＩＡ−ＡＧＣ−Ｃ
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Ｌｅｕ Ｉｌｅ ＧｌｎＧＴＣ−ＣＡＡ−ＣＧＣ−Ａ
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ＣＧＡ−ＡＧＡ−ＧＣＡ−ＴＣＣ−ＣＡＧ−ＴＡＡ−Ｇ
ＣＣＡ−ＧＣＴ−ＴＣＴ−ＣＧＴ−ＡＧＧ−ＧＴＣ−Ａ
ＴＴ−ＣＣＴＡＧこの明細書における配列において、５
′末端および３′末端以外のＡ％Ｇ、ＣおよびＴは・そ
れぞれ次式を意味し、 ５′末端のＡ、Ｇ、ＣおよびＴはそれぞれ次式を意味し
、 また、３′末端のＡ、Ｇ％ＣおよびＴはそれぞれ次式を
意味する。
この発明は、相当する多数のオリゴヌクレオチドブロッ
クのハイブリッド化およびライゲーションからなること
を特徴とする、前記のごとき遺伝子の製造方法にも関す
るものである。
クのハイブリッド化およびライゲーションからなること
を特徴とする、前記のごとき遺伝子の製造方法にも関す
るものである。
前記のごとき配列のサブユニット、例えば、ＩＦＮ
ＬＨ遺伝子またはＩＦＮ ＲＨ遺伝子のコードする部
分もこの発明の一面をなす。
ＬＨ遺伝子またはＩＦＮ ＲＨ遺伝子のコードする部
分もこの発明の一面をなす。
ａ〉オリゴヌクレオチド類の合成：
６２種の合成オリゴヌクレオチド類ド製することによっ
て、上記の拡張された配列を有する分子を合成した。そ
れら合成オリゴヌクレオチドを所定の段階でハイブリッ
ド化し、ライゲートすることにより、上記の二重鎖ヌク
レオチド配列が得られる。
て、上記の拡張された配列を有する分子を合成した。そ
れら合成オリゴヌクレオチドを所定の段階でハイブリッ
ド化し、ライゲートすることにより、上記の二重鎖ヌク
レオチド配列が得られる。
この明細書におけるオリゴヌクレオチド類の合成に関す
る記載中の各略号について以下に説明する。
る記載中の各略号について以下に説明する。
Ａｐ％ｃｐ、ｃｐおよびＴｐは、それぞれ次式を意味す
る。
る。
３′末端のＡ、Ｇ、ＣおよびＴは、それぞれ次（Ｃ）
（Ｔ） Ａ ”ｐｏ、 Ｇ １Ｂｐｏ、 ＣＢ２ｐｏ、 Ｔ
ｐｏおよびＡｃ Ｕｐ。
（Ｔ） Ａ ”ｐｏ、 Ｇ １Ｂｐｏ、 ＣＢ２ｐｏ、 Ｔ
ｐｏおよびＡｃ Ｕｐ。
は 、それぞれ次式を意味する。
Ｃ１
また、ＤＭＴｒはジメトキシトリチルであり、Ｂはアデ
ニニル、グアニニル、シトシニルおよびチミニルから選
ばれた塩基（便宜上、保護基は、示さない）であり、 Ｕはウラシルであり、 Ａｃはアセチルであり、 ｍは１または２なる整数であり、 ｎは１〜１２の整数である。
ニニル、グアニニル、シトシニルおよびチミニルから選
ばれた塩基（便宜上、保護基は、示さない）であり、 Ｕはウラシルであり、 Ａｃはアセチルであり、 ｍは１または２なる整数であり、 ｎは１〜１２の整数である。
オリゴヌクレオチド類は次の通りである：（１） ＨＯ
ＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＩｐＧｐＴｐＴＯＨ
（ＡＩ）（２） ＨＯＡｐＣｐＴｌ）ＧｐＣｐＣｐＡｐ
ＧｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴＯＨ（Ａ２）（３）
ＨＯＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＧ
ｐＣｐＡｐＧＯＨ（Ａ３）（４） ＨＯＴｐＧｐＧｐＣ
ｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＩｐＧＯＨ（
Ａ４＞（５） ＨＯＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐＴｐＡｐ
ＴｐＧｐＧｐＧｐＴｐＣｐＣＯＨ（Ａ５）（６） ＨＯ
ＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＴ
ｐＴｐＣｐＴＯＨ（Ａ６）（７） ＨＯＡｐＡｐＡｐＡ
ｐＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯ
Ｈ（Ｂｌ）（８） ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐ
ＧｐＣｐＡｐＧｐＧｐＴｐＣｐＡＯｌ（（Ｂ２）（９）
ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＧ
ｐＣｐＧｐＧｐＡＯＨ（Ｂ３）＜１０） ＨＯＡｐＴ
ｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＴｐＩｐＴｐＣｐＴｐ
ＴＯＨ（Ｂ４＞（１１） ＨＯＡｐＩＰＣｐＴｐＧｐＡ
ｐＡｐＴｐＧｐＡｌ＞ＣＰＣｐＴｐＧｐＣＯＨ（ＢＳ）
（１２） ＨＯＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡｐＴｐ
ＣｐＣｐＧｐＣｐＴｐＡｐＣＯＨ（Ｂ６〉 （１３） ＨＯＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＣｐ
ＴｐＣｐτｐＴｐＴｐＴｐｃＯＨ（Ｃ１） （１４） ＨＯＩｐＴｐＡｐＧｐＧｐＣｐＡｌ）Ｔｐ工
ｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧＯＨ（Ｃ２）（１５） ＨＯ
ＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧｐＧ
ｐＡｐＧＯＨ（Ｃ３）（１６） ＨＯＴｐＧｐＣｐＣｐ
ＩｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ（Ｃ
４）（１７） ＨＯＩｐＣｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐ
ＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ（Ｃ５）（１８） Ｈ
ＯＣｐＩｐＧｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐ
ＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（Ｃ６） （１９） ＨＯＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＧｐＡｐ
ＡｐＡｐＡｐＡｐＩｐＡＯｌ（（Ｄｉ）（２０） ＨＯ
ＡｐＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡ
ｐＴｐＩＯＨ（Ｂ２）＜２１） ＨＯＧＰＩｐＣｐＩＩ
）ＣＩ）ＣＩ）ＴｐＴｐＴｐＩｐＡｐＣｐＴｐｆｆＯＨ
（Ｂ３）（２２） ＨＯＣｐＴｐＣｐｌｐＧｐＣｐＡｐ
ＩｐｌｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（Ｂ４）（２３）
ＨＯＡｐＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐ
ＴｐＧｐＧＯ）１ （Ｂ５）（２４） ＨＯＡｐＡｐ
ＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡ
ＯＨ（Ｂ６）（２５） ＨＯＣｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐ
ｒｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ（Ｅｌ）（２
６） ＨＯＣｐＴｐｒｐＴｐＡｐＡｐＧｐＧｐＡｐＴｐ
ＧｐＡｐＣｐＣｐＡＯＨ（Ｈ２）（２７） ＨＯＧｐＡ
ｐＧｐＣｐＡｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡＩ）ＡｐＡｐＧｐＡ
ｐＧＯＨ（Ｈ３）（２８） ＨＯＣｐＣｐＩｐＴｐＡｐ
ＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＴｐＩｐＩｐＧｐＡＯＨ（Ｈ４）
（２９） ＨＯＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣｐＩｐ
ＧｐＧｐＩｐＣｐＡｐＴＯＨ（Ｈ５）（３０） ＨＯＩ
ｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴｐ
ＩｐＩＯＨ（Ｈ６）（３１） ＨＯＴｐＧｐＴｐＧｐＧ
ｐＡｐＧｐＡｐＣｐＣｐＡｐＴｐＣｐＡｐＡＯＨ（Ｆｌ
）（３２） ＨＯＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＴ
ｐＧｐＡｐＡｐＩｐＧｐＴＯＨ（Ｆ２）（３３） Ｈ
ＯＣｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＩｐＣｐＡｐＡｐ
ＴｐＡｐＧＯＨ（Ｆ３）（３４） ＨＯＴｐＧｐＴｐＣ
ｐＴｐＴｐＣｐＣｐＴｐＩｐＧｐＡｐＴｐＧｐＧＯｌ（
（Ｆ４）（３５） ＨＯＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐ
ＧｐＡｐＣｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ（Ｆ５）（３６）
ＨＯＴｐＴｐＩｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＣｐＴｐＡｐ
ＴｐＩｐＧｐＡＯＨ（Ｆ６）（３７） ＨＯＣｐＡｐＡ
ｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＧＯ
Ｈ（Ｇｌ）／ ＱＱ Ｘ １１／’Ｉ〒−ｒ−Ａ−Ｔｍ
ｒｉＡｍ（”ＰＩＴ ｈＴｎｃｎｌ’：ｎΔｎΔｎＡｎ
八Ｏ）Ｉ へＧ２）（３９） ＨＯＧｐＣｐＩｐＧｐ
ＡｐＣｐＴｐＡｐＡｐＴｐＴｐＡりＴｐＴｐＣＯＨ（Ｇ
３）（４０） ＨＯＡｐＧｐＴｐＣｐＡｐＴｐＣｐＡｐ
ＣｐＧｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｏＨ（Ｇ４＞（４１） Ｈ
ＯＴｐＡｐＧｐＴｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＣｐＧｐＡＯＨ（Ｇ５）（４２） ＨＯＣｐＡｐＧｐＩ
ｐＴｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＡｐＴｐＡｐＡｐＴＯＨ（
Ｇ６）（４３） ＨＯＧｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣｐＴｐＧ
ｐＡｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡＯＨ（Ｈｌ）（４４）
ＨＯＴｐＧｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡ
ｐＡｐＧｐＣＯＨ（Ｈ２）（４ｓ） ＨＯＡｐＡｐＴｐ
ＡｐＣｐＡｐＴｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＡｐＴｐＣ
ＯＨ（Ｈ３） ＜４６） ＨＯＧｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＣｐＡｐＴｐ
ＴｐＣｐＡｐＡｐＧｐＴＯＨ（Ｈ４＞（４７） ＨＯＣ
ｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＴｐＴｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐ
ＧｐＣＯＨ（）＋５）（４８） ＨＯＡｐＴｐＣｐＡｐ
ＣｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＩｐＧｐＡｐＧｐＴｐＴＯＨ
（Ｈ６） （４９） ＨＯＣｐＡｐＡｐＧｐＩｐＧｐＡｐＴｐＧｐ
ＧｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡＯＨ（Ｉｌ）（５０） ＨＯＣ
ｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＡｐＧｐ
ＣｐＴＯＨ（Ｉ２）（５１） ）ＩＯＡｐＡｐＡｐＡ
ｐＣｐＡｐＧｐＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＣｐＧｐＡＯＨ（
＋３）（５２） ＨＯＧｐＧｐＣｐＧｐＡｐＣｐＡｐＧ
ｐＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＣｐＣＯＨ（Ｉ４）（５３）
ＨＯＣｐＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＧｐＣｐＴ
ｐＧｐＣｐＴＯＨ（＋５）（５４） ＨＯＣｐＴｐＡｐ
ＣｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＧｐＣｐＴｐＴｐＣＯＨ
（＋６）（５５） ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＧｐＴｐＡｐ
ＧｐＴｐＣｐＡｐＧｐＡｐＴｐＧｐＣＯＨ（Ｊｌ） ＜５６） ＨＯＴｐＧｐＴｐＩｐＴｐＣｐＡｐＡｐＧｐ
ＧｐＴｐＣｐＧｐＡｐＡＯＨ０２）＜５７） ＨＯＧｐ
ＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＣｐＣｐＣｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡ
ｐＧＯＨ（Ｊ３）（５８） ＨＯＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐ
ＣｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＣｐＴｐＧｐＡＯＨ０４）（
５９） ＨＯＧｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐｌｐＣ
ｐＧｐＡｐＣｐＣｐＴＯＨ（Ｊ５）（６０） ＨＯＧ
ｐＡｐ■ｐＣｐＣｐＩｐＴｐＡｐＣｐＴｐＧｐＧＯＨ（
Ｊ６）（６１） ＨＯＴｐＧｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐ
ＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（Ｌｌ）（６２） ＨＯ
ＴｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴ
ＯＨ（Ｌ２）（６３） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐ
ＡｐｌｐＣｐＡｐＴＯＨ（Ｌ３）より小きいユニットか
ら遂次カップリング反応によってオリゴヌクレオチド類
を構成する方法における遂次カップリング反応を第１表
に示す。
ＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＩｐＧｐＴｐＴＯＨ
（ＡＩ）（２） ＨＯＡｐＣｐＴｌ）ＧｐＣｐＣｐＡｐ
ＧｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐＴＯＨ（Ａ２）（３）
ＨＯＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＧ
ｐＣｐＡｐＧＯＨ（Ａ３）（４） ＨＯＴｐＧｐＧｐＣ
ｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＩｐＧＯＨ（
Ａ４＞（５） ＨＯＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐＴｐＡｐ
ＴｐＧｐＧｐＧｐＴｐＣｐＣＯＨ（Ａ５）（６） ＨＯ
ＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐＣｐＴ
ｐＴｐＣｐＴＯＨ（Ａ６）（７） ＨＯＡｐＡｐＡｐＡ
ｐＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯ
Ｈ（Ｂｌ）（８） ＨＯＣｐＴｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐ
ＧｐＣｐＡｐＧｐＧｐＴｐＣｐＡＯｌ（（Ｂ２）（９）
ＨＯＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＧ
ｐＣｐＧｐＧｐＡＯＨ（Ｂ３）＜１０） ＨＯＡｐＴ
ｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＴｐＩｐＴｐＣｐＴｐ
ＴＯＨ（Ｂ４＞（１１） ＨＯＡｐＩＰＣｐＴｐＧｐＡ
ｐＡｐＴｐＧｐＡｌ＞ＣＰＣｐＴｐＧｐＣＯＨ（ＢＳ）
（１２） ＨＯＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡｐＴｐ
ＣｐＣｐＧｐＣｐＴｐＡｐＣＯＨ（Ｂ６〉 （１３） ＨＯＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＣｐ
ＴｐＣｐτｐＴｐＴｐＴｐｃＯＨ（Ｃ１） （１４） ＨＯＩｐＴｐＡｐＧｐＧｐＣｐＡｌ）Ｔｐ工
ｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧＯＨ（Ｃ２）（１５） ＨＯ
ＡｐＡｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧｐＧ
ｐＡｐＧＯＨ（Ｃ３）（１６） ＨＯＴｐＧｐＣｐＣｐ
ＩｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ（Ｃ
４）（１７） ＨＯＩｐＣｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐ
ＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ（Ｃ５）（１８） Ｈ
ＯＣｐＩｐＧｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＣｐＣｐ
ＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（Ｃ６） （１９） ＨＯＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＧｐＡｐ
ＡｐＡｐＡｐＡｐＩｐＡＯｌ（（Ｄｉ）（２０） ＨＯ
ＡｐＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡ
ｐＴｐＩＯＨ（Ｂ２）＜２１） ＨＯＧＰＩｐＣｐＩＩ
）ＣＩ）ＣＩ）ＴｐＴｐＴｐＩｐＡｐＣｐＴｐｆｆＯＨ
（Ｂ３）（２２） ＨＯＣｐＴｐＣｐｌｐＧｐＣｐＡｐ
ＩｐｌｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（Ｂ４）（２３）
ＨＯＡｐＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐ
ＴｐＧｐＧＯ）１ （Ｂ５）（２４） ＨＯＡｐＡｐ
ＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡ
ＯＨ（Ｂ６）（２５） ＨＯＣｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐ
ｒｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ（Ｅｌ）（２
６） ＨＯＣｐＴｐｒｐＴｐＡｐＡｐＧｐＧｐＡｐＴｐ
ＧｐＡｐＣｐＣｐＡＯＨ（Ｈ２）（２７） ＨＯＧｐＡ
ｐＧｐＣｐＡｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡＩ）ＡｐＡｐＧｐＡ
ｐＧＯＨ（Ｈ３）（２８） ＨＯＣｐＣｐＩｐＴｐＡｐ
ＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＴｐＩｐＩｐＧｐＡＯＨ（Ｈ４）
（２９） ＨＯＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣｐＩｐ
ＧｐＧｐＩｐＣｐＡｐＴＯＨ（Ｈ５）（３０） ＨＯＩ
ｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴｐ
ＩｐＩＯＨ（Ｈ６）（３１） ＨＯＴｐＧｐＴｐＧｐＧ
ｐＡｐＧｐＡｐＣｐＣｐＡｐＴｐＣｐＡｐＡＯＨ（Ｆｌ
）（３２） ＨＯＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＴ
ｐＧｐＡｐＡｐＩｐＧｐＴＯＨ（Ｆ２）（３３） Ｈ
ＯＣｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＩｐＣｐＡｐＡｐ
ＴｐＡｐＧＯＨ（Ｆ３）（３４） ＨＯＴｐＧｐＴｐＣ
ｐＴｐＴｐＣｐＣｐＴｐＩｐＧｐＡｐＴｐＧｐＧＯｌ（
（Ｆ４）（３５） ＨＯＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐ
ＧｐＡｐＣｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ（Ｆ５）（３６）
ＨＯＴｐＴｐＩｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＣｐＴｐＡｐ
ＴｐＩｐＧｐＡＯＨ（Ｆ６）（３７） ＨＯＣｐＡｐＡ
ｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＧＯ
Ｈ（Ｇｌ）／ ＱＱ Ｘ １１／’Ｉ〒−ｒ−Ａ−Ｔｍ
ｒｉＡｍ（”ＰＩＴ ｈＴｎｃｎｌ’：ｎΔｎΔｎＡｎ
八Ｏ）Ｉ へＧ２）（３９） ＨＯＧｐＣｐＩｐＧｐ
ＡｐＣｐＴｐＡｐＡｐＴｐＴｐＡりＴｐＴｐＣＯＨ（Ｇ
３）（４０） ＨＯＡｐＧｐＴｐＣｐＡｐＴｐＣｐＡｐ
ＣｐＧｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴｏＨ（Ｇ４＞（４１） Ｈ
ＯＴｐＡｐＧｐＴｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＣｐＧｐＡＯＨ（Ｇ５）（４２） ＨＯＣｐＡｐＧｐＩ
ｐＴｐＡｐＣｐＣｐＧｐＡｐＡｐＴｐＡｐＡｐＴＯＨ（
Ｇ６）（４３） ＨＯＧｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣｐＴｐＧ
ｐＡｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡＯＨ（Ｈｌ）（４４）
ＨＯＴｐＧｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡ
ｐＡｐＧｐＣＯＨ（Ｈ２）（４ｓ） ＨＯＡｐＡｐＴｐ
ＡｐＣｐＡｐＴｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＡｐＴｐＣ
ＯＨ（Ｈ３） ＜４６） ＨＯＧｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＣｐＡｐＴｐ
ＴｐＣｐＡｐＡｐＧｐＴＯＨ（Ｈ４＞（４７） ＨＯＣ
ｐＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＴｐＴｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐ
ＧｐＣＯＨ（）＋５）（４８） ＨＯＡｐＴｐＣｐＡｐ
ＣｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＩｐＧｐＡｐＧｐＴｐＴＯＨ
（Ｈ６） （４９） ＨＯＣｐＡｐＡｐＧｐＩｐＧｐＡｐＴｐＧｐ
ＧｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡＯＨ（Ｉｌ）（５０） ＨＯＣ
ｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＡｐＧｐ
ＣｐＴＯＨ（Ｉ２）（５１） ）ＩＯＡｐＡｐＡｐＡ
ｐＣｐＡｐＧｐＧｐＧｐＡｐＡｐＧｐＣｐＧｐＡＯＨ（
＋３）（５２） ＨＯＧｐＧｐＣｐＧｐＡｐＣｐＡｐＧ
ｐＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＣｐＣＯＨ（Ｉ４）（５３）
ＨＯＣｐＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＧｐＣｐＴ
ｐＧｐＣｐＴＯＨ（＋５）（５４） ＨＯＣｐＴｐＡｐ
ＣｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＧｐＣｐＴｐＴｐＣＯＨ
（＋６）（５５） ＨＯＡｐＡｐＡｐＣｐＧｐＴｐＡｐ
ＧｐＴｐＣｐＡｐＧｐＡｐＴｐＧｐＣＯＨ（Ｊｌ） ＜５６） ＨＯＴｐＧｐＴｐＩｐＴｐＣｐＡｐＡｐＧｐ
ＧｐＴｐＣｐＧｐＡｐＡＯＨ０２）＜５７） ＨＯＧｐ
ＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＣｐＣｐＣｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡ
ｐＧＯＨ（Ｊ３）（５８） ＨＯＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐ
ＣｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＣｐＴｐＧｐＡＯＨ０４）（
５９） ＨＯＧｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣｐＴｐｌｐＣ
ｐＧｐＡｐＣｐＣｐＴＯＨ（Ｊ５）（６０） ＨＯＧ
ｐＡｐ■ｐＣｐＣｐＩｐＴｐＡｐＣｐＴｐＧｐＧＯＨ（
Ｊ６）（６１） ＨＯＴｐＧｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐ
ＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（Ｌｌ）（６２） ＨＯ
ＴｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴ
ＯＨ（Ｌ２）（６３） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐ
ＡｐｌｐＣｐＡｐＴＯＨ（Ｌ３）より小きいユニットか
ら遂次カップリング反応によってオリゴヌクレオチド類
を構成する方法における遂次カップリング反応を第１表
に示す。
モノ（またはジ、あるいはトリ）マー（Ｉ）は、広瀬の
方法［Ｔ、 ）ｌｉｒｏｓｅ、蛋白質・核酸・酵素ｌ５
ＳＮ、翻、２２５（１９８０） ］によって調製でき、
カップリングはリン酸トリエステ°ル法［Ｒ，Ｃｒｅａ
ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
８．２３３１（１９８０）およびＭ、 Ｌ、 Ｄｕ
ｃｋｗｏｒｔｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ。
方法［Ｔ、 ）ｌｉｒｏｓｅ、蛋白質・核酸・酵素ｌ５
ＳＮ、翻、２２５（１９８０） ］によって調製でき、
カップリングはリン酸トリエステ°ル法［Ｒ，Ｃｒｅａ
ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
８．２３３１（１９８０）およびＭ、 Ｌ、 Ｄｕ
ｃｋｗｏｒｔｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ。
且、１６９１ （１９８１）コにより、セルロース上で
実施することができる。
実施することができる。
とくに、実施例１に記載したヘキサデカヌクレオチドＨ
ＯＡｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐ
ＡｐＧｐＴｐＴ ０Ｈ（Ｈ６）の合成に関して、合成法
を説明することとする。ヘキサデカヌクレオチドＨ６合
成のフローチャートを第２表に示す。
ＯＡｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐ
ＡｐＧｐＴｐＴ ０Ｈ（Ｈ６）の合成に関して、合成法
を説明することとする。ヘキサデカヌクレオチドＨ６合
成のフローチャートを第２表に示す。
（ｂ）化学合成オリゴヌクレオチドのハイブリッド化と
ライゲージ５ン （ｉ ）ＩＦＮ ＬＨ遺伝子 所望しない相互反応の可能性を最小にするために、第１
図に示した一連の工程を用いてオリゴヌクレオチド類を
ハイブリッド化し、ライゲートする。第１図では、オリ
ゴヌクレオチドを−または計−一（・、は５′−ホスホ
リル化末端を意味する）で表わし、ブロックされたオリ
ゴヌクレオチド類は、例えば、←−−−（はライゲーシ
ョンの位置を意味する）で表わしである。ライゲーショ
ンはτ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で行われる。
ライゲージ５ン （ｉ ）ＩＦＮ ＬＨ遺伝子 所望しない相互反応の可能性を最小にするために、第１
図に示した一連の工程を用いてオリゴヌクレオチド類を
ハイブリッド化し、ライゲートする。第１図では、オリ
ゴヌクレオチドを−または計−一（・、は５′−ホスホ
リル化末端を意味する）で表わし、ブロックされたオリ
ゴヌクレオチド類は、例えば、←−−−（はライゲーシ
ョンの位置を意味する）で表わしである。ライゲーショ
ンはτ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で行われる。
オリゴヌクレオチドＡ１〜Ａ６；Ｂｌ〜Ｂ６；Ｃ１〜Ｃ
６、ＤＩ、Ｄ２、Ｄ４およびＤ５．Ｄ３、Ｅｌ、Ｅ２、
Ｄ６、Ｅ４およびＥ５；Ｅ３、Ｌｌ、Ｌ２およびＬ３を
ハイブリッド化し、ライゲートして、それぞれブロック
１．２．３．４．５．６を得た。ブロック２と３：およ
び４と５をハイブリッド化し、ライゲートして、それぞ
れブロック７および８を得た。ブロック１と７、および
６と８をハイブリッド化し、ライゲートして目的とする
ポリヌクレオチドＩＦＮ ＬＨ遺伝子を得た。
６、ＤＩ、Ｄ２、Ｄ４およびＤ５．Ｄ３、Ｅｌ、Ｅ２、
Ｄ６、Ｅ４およびＥ５；Ｅ３、Ｌｌ、Ｌ２およびＬ３を
ハイブリッド化し、ライゲートして、それぞれブロック
１．２．３．４．５．６を得た。ブロック２と３：およ
び４と５をハイブリッド化し、ライゲートして、それぞ
れブロック７および８を得た。ブロック１と７、および
６と８をハイブリッド化し、ライゲートして目的とする
ポリヌクレオチドＩＦＮ ＬＨ遺伝子を得た。
（ｉ ）ＩＦＮ ＲＨ遺伝子
ＩＦＮ ＲＨ遺伝子はＩＦＮ ＬＨ遺伝子と同様に
して調製される。すなわち、ＩＦＮ ＬＨ遺伝子の場
合と同様にして、オリゴヌクレオチドＤ３．Ｄ６、Ｅ１
〜Ｅ６、Ｆ１〜Ｆ６．０１〜Ｇ６、Ｈ１〜Ｈ６、■１〜
Ｉ６．１１〜Ｊ６をハイブリッド化し、ライゲートする
。このようにして得たライゲーション生成物をＨｉｎｄ
ＤＩで切断して、目的とするポリヌクレオチドＩＦＮ
ＲＨ遺伝子を得た。このプロセスは第２図に示す。
して調製される。すなわち、ＩＦＮ ＬＨ遺伝子の場
合と同様にして、オリゴヌクレオチドＤ３．Ｄ６、Ｅ１
〜Ｅ６、Ｆ１〜Ｆ６．０１〜Ｇ６、Ｈ１〜Ｈ６、■１〜
Ｉ６．１１〜Ｊ６をハイブリッド化し、ライゲートする
。このようにして得たライゲーション生成物をＨｉｎｄ
ＤＩで切断して、目的とするポリヌクレオチドＩＦＮ
ＲＨ遺伝子を得た。このプロセスは第２図に示す。
（２）ＩＦＮ遺伝子の分子クローニングＩＦＮ遺伝子の
クローニングのプロセスを第３図に示す。
クローニングのプロセスを第３図に示す。
ＩＦＮ ＬＨ遺伝子のクローニングのため、これを、
ＩＦＮ ＬＨ遺伝子を挿入できる適当な酵素認識部位
を有する適切なプラスミド、即ち、クローニングベクタ
ーに挿入する。
ＩＦＮ ＬＨ遺伝子を挿入できる適当な酵素認識部位
を有する適切なプラスミド、即ち、クローニングベクタ
ーに挿入する。
この発明の適当な実施態様として、旦、竺具での発現の
ため合成したＩＦＮ ＬＨ遺伝子をＥ、ｃｏｌｉ由来
のプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２など）に挿入し、
クローニングを行った。
ため合成したＩＦＮ ＬＨ遺伝子をＥ、ｃｏｌｉ由来
のプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２など）に挿入し、
クローニングを行った。
例えば、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位を有するプラ
スミドｐＢＲ３２２を使用した場合には、第３図に示す
ように、このプラスミドをＥＣ０ＲＩおよびＢａｍＨＩ
で切断した。この場合には、そのプラスミドは、Ｅｃｏ
ＲＩおよびＢａｍＨＩで切断したときの長い方の断片上
に、アンピシリン耐性のコード（Ａｍｐで示す）を有し
、テトラサイクリン耐性のコード（Ｔｅｔで示す）は、
ＢａｍＨＩ部位切断の結果消失する。 ＥｃｏＲＩ −
Ｂａｍ）１１で切断したプラスミドｐＢＲ３２２の長い
方の断片を電気泳動により精製し、１４ ＤＮＡリガー
ゼを用いて大過剰のＩＦＮ ＬＨ遺伝子とハイブリッ
ド化し、ライゲートした。かくして得た混合物を用いて
Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩを形質転換した。得られたい
くつかのアンピシリン耐性でテトラサイクリン感受性の
形質転換体の一つからプラスミドを単離し、制限酵素に
よる消化および電気泳動によって、ＩＦＮＬＨ遺伝子を
含有することを確認した。このようにして得たプラスミ
ドをプラスミドｐＬＨ１０７と名付ける。
スミドｐＢＲ３２２を使用した場合には、第３図に示す
ように、このプラスミドをＥＣ０ＲＩおよびＢａｍＨＩ
で切断した。この場合には、そのプラスミドは、Ｅｃｏ
ＲＩおよびＢａｍＨＩで切断したときの長い方の断片上
に、アンピシリン耐性のコード（Ａｍｐで示す）を有し
、テトラサイクリン耐性のコード（Ｔｅｔで示す）は、
ＢａｍＨＩ部位切断の結果消失する。 ＥｃｏＲＩ −
Ｂａｍ）１１で切断したプラスミドｐＢＲ３２２の長い
方の断片を電気泳動により精製し、１４ ＤＮＡリガー
ゼを用いて大過剰のＩＦＮ ＬＨ遺伝子とハイブリッ
ド化し、ライゲートした。かくして得た混合物を用いて
Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩを形質転換した。得られたい
くつかのアンピシリン耐性でテトラサイクリン感受性の
形質転換体の一つからプラスミドを単離し、制限酵素に
よる消化および電気泳動によって、ＩＦＮＬＨ遺伝子を
含有することを確認した。このようにして得たプラスミ
ドをプラスミドｐＬＨ１０７と名付ける。
次に、このプラスミドｐＬＨ１０７をＨｉｎｄ ■およ
びＢａｍＨＩで切断した。この場合、そのプラスミドは
、１ｉｎｄｌｌＩおよびＢａｍＨＩで切断したときの長
い方の断片上にアンピシリン耐性コードを有する。
びＢａｍＨＩで切断した。この場合、そのプラスミドは
、１ｉｎｄｌｌＩおよびＢａｍＨＩで切断したときの長
い方の断片上にアンピシリン耐性コードを有する。
）！１ｎｄｌｌＩ −ＢａｍＨＩで切断したプラスミド
ｐＬＨ１０７の長い方の断片を電気泳動により精製し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて大過剰のＩＦＮ ＲＨ遺
伝子とハイブリッド化し、ライゲートした。かくして得
られた混合物を用い旦臼旦ＨＢＩＯＩを形質転換した。
ｐＬＨ１０７の長い方の断片を電気泳動により精製し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて大過剰のＩＦＮ ＲＨ遺
伝子とハイブリッド化し、ライゲートした。かくして得
られた混合物を用い旦臼旦ＨＢＩＯＩを形質転換した。
得られたいくつかのアンピシリン耐性でテトラサイクリ
ン感受性の形質転換体の一つからプラスミドを単離し、
制限酵素による消化および電気泳動によって、ＩＦＮ遺
伝子を含有することを確認した。このようにして得たプ
ラスミドを９７Ｆ−３と名付ける。
ン感受性の形質転換体の一つからプラスミドを単離し、
制限酵素による消化および電気泳動によって、ＩＦＮ遺
伝子を含有することを確認した。このようにして得たプ
ラスミドを９７Ｆ−３と名付ける。
［２］プロモーター遺伝子の調製とクローニング：宿主
生物からＩＦＮを得るため、ある種の構造遺伝子を有す
るプロモーター遺伝子を設計した。
生物からＩＦＮを得るため、ある種の構造遺伝子を有す
るプロモーター遺伝子を設計した。
かかる基準で得たプロモーター遺伝子をプラスミド中に
挿入し、次いでＩＦＮ遺伝子をそれに挿入し、該プロモ
ータ遺伝子が該ＩＦＮ遺伝子の上流にかつそれに隣接す
る位置をとるようにする。
挿入し、次いでＩＦＮ遺伝子をそれに挿入し、該プロモ
ータ遺伝子が該ＩＦＮ遺伝子の上流にかつそれに隣接す
る位置をとるようにする。
（１）ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子の調製とクローニン
グ： ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子の構造： この発明の適当な一実施態様として、次のタイプのプロ
モーター（以下、ｔｒｐプロモーターＩと称する）を設
計した。
グ： ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子の構造： この発明の適当な一実施態様として、次のタイプのプロ
モーター（以下、ｔｒｐプロモーターＩと称する）を設
計した。
ＥｃｏＲＩ
５−ＡＡＴＴＴＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡＴＡＡＣＧＧＩＩ
ＣＴＧＧＣＡＡＡＩＡＩＩＣＴＧＡＡ−３’−ＡＣＧＧ
ＣＴＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＧＴＴＴＡｒ
ＡＡＧＡＣＴＴ−Ａ Ｔ Ｇ Ａ ＧＣＴＧＴＴＧＡＣ
Ａ ＡＴＴＡ ＡＩ ＣＡ ＩＣＧＡ ＡＣＴＡＧＩＴ
ＡＡＣＴＡＧＴ ＡＣＧ−Ｔ Ａ ＣＴＣＧ ＡＣＡＡ
ＣＴ ＧＴＩ ＡＡＴＴＡＧＴＡＧＣＩＴＧＡＩ ＣＡ
ＡＩ ＴＧＡＴＣＡＴＧＣ−ＥｃｏＲＩ ＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＩＣＧ−
３’ＧＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＩＩＴＴＴＣＣＣＡＴＡＧ
ＣＴＴＡ−５”ｔｒｐプロモーター■の調製とクローニ
ング：上記ｔｒｐプロモーター■をプラスミドに正しい
方向で挿入するため、ｔｒｐプロモーターＩのＥｃｏＲ
Ｉ部位の次に、ある長さの塩基封鎖をもち、３′末端に
ＢａｍＨＩ部位をもつ、次のタイプの合成プロモーター
（以下、ｔｒｐプロモーター■と称する）を調製した。
ＣＴＧＧＣＡＡＡＩＡＩＩＣＴＧＡＡ−３’−ＡＣＧＧ
ＣＴＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＧＴＴＴＡｒ
ＡＡＧＡＣＴＴ−Ａ Ｔ Ｇ Ａ ＧＣＴＧＴＴＧＡＣ
Ａ ＡＴＴＡ ＡＩ ＣＡ ＩＣＧＡ ＡＣＴＡＧＩＴ
ＡＡＣＴＡＧＴ ＡＣＧ−Ｔ Ａ ＣＴＣＧ ＡＣＡＡ
ＣＴ ＧＴＩ ＡＡＴＴＡＧＴＡＧＣＩＴＧＡＩ ＣＡ
ＡＩ ＴＧＡＴＣＡＴＧＣ−ＥｃｏＲＩ ＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＩＣＧ−
３’ＧＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＩＩＴＴＴＣＣＣＡＴＡＧ
ＣＴＴＡ−５”ｔｒｐプロモーター■の調製とクローニ
ング：上記ｔｒｐプロモーター■をプラスミドに正しい
方向で挿入するため、ｔｒｐプロモーターＩのＥｃｏＲ
Ｉ部位の次に、ある長さの塩基封鎖をもち、３′末端に
ＢａｍＨＩ部位をもつ、次のタイプの合成プロモーター
（以下、ｔｒｐプロモーター■と称する）を調製した。
実際には、２２種のオリコヌクレオチドブロックを作成
し、−末鎖オーバーラソピングにより組み合せ、完全な
二本鎖ヌクレオチド配列を得ることによって、１６３ｂ
ｐを有する分子を合成した。
し、−末鎖オーバーラソピングにより組み合せ、完全な
二本鎖ヌクレオチド配列を得ることによって、１６３ｂ
ｐを有する分子を合成した。
ＥｃｏＲＩ
５−ＡＡＴＴＩＧＣＣＧＡＣＡＩＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴ
ＣＴＧＧＣＡＡＡＴＡＩＴＣＴＧＡＡ−３’−ＡＣＧＧ
ＣＴＧＴＡＧＴＡｒＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＧＴＴＴＡＴ
ＡＡＧＡＣＴＴ−ＡＩＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴ
ＡＡＩ：ＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧｒＴＡＡＣＴＡＧＴＡ
ＣＧ−Ｔ Ａ ＣＴＣＧ ＡＣＡＡＣＴ ＧＴ ＴＡ
ＡＴＴＡＧＴ ＡＧＣＩ ＴＧＡＴＣＡ ＡＴＴＧ Ａ
Ｔ ＣＡＴＧＣ−Ｃ０ＲＩ ＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡ
ＡＩＴＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＧＩＡＡ−ＧＴＴＣＡＡ
ＧＴＧＣＡ工丁ＴＴＴＣＣＣＡＴＡＧＣＴＴＡＡＧＴＡ
ＣＣＧＡＣＣＡＡＣＡＴｒ−ａｖｎＨＩ ＧＡＡＣＴＴＣＴＴＴＴＧＧＡＡＧＡＣＴＴＴＣＡＣＴ
ｒＣＧＴＧＴｒＧＡＴＡＧ−３’ＣＩＴＧＡＡＧＡＡＡ
ＡＣＣＴＴＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＣＡＣＡＡＣＩＡ
ＴＣＣＴＡＧ−５゜（ａ）オリゴヌクレオチドの合成： 次に列記する２２種のオリゴヌクレオチドをさらに合成
した。
ＣＴＧＧＣＡＡＡＴＡＩＴＣＴＧＡＡ−３’−ＡＣＧＧ
ＣＴＧＴＡＧＴＡｒＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＧＴＴＴＡＴ
ＡＡＧＡＣＴＴ−ＡＩＧＡＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴ
ＡＡＩ：ＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧｒＴＡＡＣＴＡＧＴＡ
ＣＧ−Ｔ Ａ ＣＴＣＧ ＡＣＡＡＣＴ ＧＴ ＴＡ
ＡＴＴＡＧＴ ＡＧＣＩ ＴＧＡＴＣＡ ＡＴＴＧ Ａ
Ｔ ＣＡＴＧＣ−Ｃ０ＲＩ ＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡ
ＡＩＴＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＧＩＡＡ−ＧＴＴＣＡＡ
ＧＴＧＣＡ工丁ＴＴＴＣＣＣＡＴＡＧＣＴＴＡＡＧＴＡ
ＣＣＧＡＣＣＡＡＣＡＴｒ−ａｖｎＨＩ ＧＡＡＣＴＴＣＴＴＴＴＧＧＡＡＧＡＣＴＴＴＣＡＣＴ
ｒＣＧＴＧＴｒＧＡＴＡＧ−３’ＣＩＴＧＡＡＧＡＡＡ
ＡＣＣＴＴＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＣＡＣＡＡＣＩＡ
ＴＣＣＴＡＧ−５゜（ａ）オリゴヌクレオチドの合成： 次に列記する２２種のオリゴヌクレオチドをさらに合成
した。
（１） ＨＯＡｐＡｐＩｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＧｐＡ
ｐＣｐＡＯＨ（Ａ）（２） ＨＯＣｐＧｐＴｐＴｐＡｐ
ＴｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡＯＨ（Ｂ
）（３） ＨＯＴｐＣｐＡｐＴｐＡｐ７ｐＣｐＧｐＧｐ
ＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｃ）（４） ＨＯ
ＧｐＡｐＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧ
ｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｄ）（５） ＨＯＡｐＡｐＡｐＴｐ
’ＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡＯ
Ｈ（Ｅ）（６） ＨＯＩｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣ
ｐＴｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ（Ｆ）（７）
ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐ
ＴｐＴｐＡｐＡｐＴＯＨ（Ｇ）（８） ＨＯＧｐＩｐＴ
ｐＣｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＩｐＡｐＡｐＴｐｌｐ
ＧＯＨ（Ｈ）（９） ＨＯＣｐＡｐＩｐＣｐＧｐＡｐＡ
ｐＣｐＩｐＡｐＧｐＴｐＴｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｉ）（１
０） ＨＯＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＣｐＩｐＡｐＧｐｒｐ
ＴｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡＯＨＵ＞（１１） ＨＯＴｐＡ
ｐＧｐＴｐＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡｐＧｐ工ｐＴｐＣｐ
ＡｐＣＯＨ（Ｋ）〈１２ン ＨＯＣｐｒｐｒｐＴｐＴｐ
ＴｐＡｐＣｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ（Ｌ
）（１３） ＨＯＧｐＩｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧ
ｐＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧＯＨ（Ｍ）（１４） ）ＩＯ
ＡｐＡｐｌｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴＰＡｐＣｐＣＯＨ（Ｎ
）（１５） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧ
ｐＣｐＴＯＨ（５Ａ）（１６） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐ
ＧｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＩＯＨ
（ＳＢ） （１７） ＨＯＴｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡＩ）ＡｐＧｐＡ
ｐＣｐＴｐＴｐＴＯＨ（ＳＣ）（１８） ＨＯＣｐＡｐ
ＣｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡ
ｐＧＯＨ（ＳＤ） （１９） ＨＯＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐ
ＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（ＳＥ）（２０） ＨＯＣ
ｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＣＯ
Ｈ（ＳＦ）（２１） ＨＯＣｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＧ
ｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（ＳＧ）＜２２
） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＡ
ｐＣｐＡＯＨ（ＳＨ）これらの合成法は、前記へキサデ
カヌクレオチドＨＯＡｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐＴｐＧｐ
ＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＧｐＴｐＴＯＨ（Ｈ６）の合成法
と実質的に同様である。
ｐＣｐＡＯＨ（Ａ）（２） ＨＯＣｐＧｐＴｐＴｐＡｐ
ＴｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡＯＨ（Ｂ
）（３） ＨＯＴｐＣｐＡｐＴｐＡｐ７ｐＣｐＧｐＧｐ
ＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｃ）（４） ＨＯ
ＧｐＡｐＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧ
ｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｄ）（５） ＨＯＡｐＡｐＡｐＴｐ
’ＡｐＴｐＴｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡＯ
Ｈ（Ｅ）（６） ＨＯＩｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣ
ｐＴｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ（Ｆ）（７）
ＨＯＧｐＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐ
ＴｐＴｐＡｐＡｐＴＯＨ（Ｇ）（８） ＨＯＧｐＩｐＴ
ｐＣｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＩｐＡｐＡｐＴｐｌｐ
ＧＯＨ（Ｈ）（９） ＨＯＣｐＡｐＩｐＣｐＧｐＡｐＡ
ｐＣｐＩｐＡｐＧｐＴｐＴｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｉ）（１
０） ＨＯＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＣｐＩｐＡｐＧｐｒｐ
ＴｐＡｐＡｐＣｐＴｐＡＯＨＵ＞（１１） ＨＯＴｐＡ
ｐＧｐＴｐＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡｐＧｐ工ｐＴｐＣｐ
ＡｐＣＯＨ（Ｋ）〈１２ン ＨＯＣｐｒｐｒｐＴｐＴｐ
ＴｐＡｐＣｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴＯＨ（Ｌ
）（１３） ＨＯＧｐＩｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＧ
ｐＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧＯＨ（Ｍ）（１４） ）ＩＯ
ＡｐＡｐｌｐＴｐＣｐＧｐＡｐＴＰＡｐＣｐＣＯＨ（Ｎ
）（１５） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧ
ｐＣｐＴＯＨ（５Ａ）（１６） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐ
ＧｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＩＯＨ
（ＳＢ） （１７） ＨＯＴｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡＩ）ＡｐＧｐＡ
ｐＣｐＴｐＴｐＴＯＨ（ＳＣ）（１８） ＨＯＣｐＡｐ
ＣｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡ
ｐＧＯＨ（ＳＤ） （１９） ＨＯＴｐＴｐＡｐＣｐＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐ
ＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＨ（ＳＥ）（２０） ＨＯＣ
ｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＣＯ
Ｈ（ＳＦ）（２１） ＨＯＣｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＧ
ｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（ＳＧ）＜２２
） ＨＯＧｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＡ
ｐＣｐＡＯＨ（ＳＨ）これらの合成法は、前記へキサデ
カヌクレオチドＨＯＡｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐＴｐＧｐ
ＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＧｐＴｐＴＯＨ（Ｈ６）の合成法
と実質的に同様である。
（ｂ）化学合成オリゴヌクレオチド類のライゲーション
： オリゴヌクレオチドＡ−Ｎおよび５Ａ−５Ｈを、第４図
に示すように、ＩＦＮ ＬＨ遺伝子の場合と同様のや
り方に従ってハイブリッド化し、ライゲートした。
： オリゴヌクレオチドＡ−Ｎおよび５Ａ−５Ｈを、第４図
に示すように、ＩＦＮ ＬＨ遺伝子の場合と同様のや
り方に従ってハイブリッド化し、ライゲートした。
（Ｃ）ｔ、ｒｐプロモーター■遺伝子のクローニング：
ｔｒｐプロモーター■遺伝子をプラスミドに挿入した。
ｔｒｐプロモーター■遺伝子をプラスミドに挿入した。
この発明の適当な実施態様として、ｔｒｐプロモーター
■遺伝子をプラスミドｐＢＲ３２２に、第５図に示すよ
うに、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによってその部位を
切断することにより、挿入した。こうして得たプラスミ
ド（ｔｒｐプロモーター■ベクター）をプラスミドｐＴ
ｒｐＥＢ７と名付ける。
■遺伝子をプラスミドｐＢＲ３２２に、第５図に示すよ
うに、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩによってその部位を
切断することにより、挿入した。こうして得たプラスミ
ド（ｔｒｐプロモーター■ベクター）をプラスミドｐＴ
ｒｐＥＢ７と名付ける。
［３］ＩＦＮ遺伝子発現ベクターの構築ＩＦＮ遺伝子発
現ベクターの構築のプロセスを第６図に示す。
現ベクターの構築のプロセスを第６図に示す。
ＩＦＮ遺伝子を、プロモーター遺伝子を含有するプラス
ミドに挿入し、組み換えプラスミドを用いて宿主生物を
形質転換する。
ミドに挿入し、組み換えプラスミドを用いて宿主生物を
形質転換する。
この発明の適当な一実施態様として、次の組み換えプラ
スミドを、Ｅ、ｃｏｌｉ中でＩＦＮ遺伝子を発現させる
べく構築した。
スミドを、Ｅ、ｃｏｌｉ中でＩＦＮ遺伝子を発現させる
べく構築した。
ｔｒｐプロモーター■プラスミドｐｒｒｐＥＢ７をＥｃ
ｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、生じた大きい断片（
４，１ｋｂｐ ）をアガロースゲル電気泳動で分離した
。一方、ＩＦＮ遺伝子をプラスミド９７Ｆ−３から単離
し、上記プロモーターベクター（４，１ｋｂｐ ）とラ
イゲートした。混合物を用いてＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯ
Ｉを形質転換した。得られたアンピシリン耐性でテトラ
サイクリン感受性形質転換体の一つからプラスミドを単
離し、制限酵素による消化と電気泳動とによって、ＩＦ
Ｎ遺伝子を含有していることを確認した。
ｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、生じた大きい断片（
４，１ｋｂｐ ）をアガロースゲル電気泳動で分離した
。一方、ＩＦＮ遺伝子をプラスミド９７Ｆ−３から単離
し、上記プロモーターベクター（４，１ｋｂｐ ）とラ
イゲートした。混合物を用いてＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯ
Ｉを形質転換した。得られたアンピシリン耐性でテトラ
サイクリン感受性形質転換体の一つからプラスミドを単
離し、制限酵素による消化と電気泳動とによって、ＩＦ
Ｎ遺伝子を含有していることを確認した。
このようにして得たプラスミドを、プラスミドｐ７ｔｒ
ｐと名付ける。
ｐと名付ける。
ＩＦＮをコードする遺伝子は次の通りである：ＥｃｏＲ
Ｉ Ｍｅｔ Ｃｙｓ 工ｙｒ Ｃｙｓ Ｇｕｎコードす
る鎖 ５°−ＡＡＴＩＣ−ＡＩＧ−ＴＧＴ−ＴＡＣ（Ｇ
Ｃ−ＣＡＧ−コードしない鎖 ３ ’ −Ｇ−ＴＡＣ
−ＡＣＡ−ＡＴＧ−ＡＣＧ−ＧＴＣ−Ａｓｐ Ｐｒｏ
Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａ
ｓｎ Ｌｅｕ ＬｙｓＧＡＣ−ＣＣＡ−ＩＡＴ−ＧＴＡ
−ＡＡＡ−ＧＡＡ−ＧＣＡ−ＧＡＡ−ＡＡＣ−ＣＩニー
ＡＡＧ−ＣＴＧ−ＧＧＴ−ＡＴＡ−ＣＡＴ−ＴＴＴ−Ｃ
ＴＴＴＣＧＴ−ＣＩＴ−ＴＴＧ−ＧＡＡ−ＴＴＣＬｙｓ
Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ
Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ ＡｌａＡＡＡ−ＴＡＣ−ＴＴ
ニーＡＡＴ−ＧＣＡ−ＧＧＴ−ＣＡＴ−ＴＣＡ−ＧＡＴ
−ＧＴＡ−ＧＣＧ−ＴＴＴ−ＡＴＧ−ＡＡＡ−ＴＴＡ−
ＣＧＴ−ＣＣＡ−ＧＴＡ−ＡＧＴ−ＣＴＡ−ＣＡＩ−Ｃ
ＧＣ−Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｕｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈ
ｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｅｕ ＬｙｓＧＡｒ−
ＡＡＴ−ＧＧＡ−ＡＣＴ−ＣＴＴ−ＴＴＣ−ＩＩＡ−Ｇ
ＧＣ−ＡτニーＴＴＧ−ＡＡＧ−ＣＴＡ−ＴＴＡ−ＣＣ
Ｔ−ＴＧＡ−ＧＡＡ−ＡＡＧ−ＡＡＩ−ＣＣＧ−ＴＡＡ
−ＡＡＣ−ＴＴＣ−Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ
Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｍ
ｅｔＡＡＩ−ＴＧＧ−ＡＡＡ−ＧＡＧ−ＧＡＧ−ＡＧＴ
−ＧＡＣ−ＡＧＡ−ＡＡＡ−ＡＴＡ−ＡＴＧ−τＴＡ−
ＡＣＣ−ＴＴＴ−ＣＴＣ−ＣＩＣ−ＴＣＡ−ＣＴＧ（Ｃ
Ｔ−ＴＴＩ−ＴＡＩ−丁ＡＣ−５０Ｈｉｎｄｌ［［ Ｇｉｎ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐ
ｈｅ Ｔｙｒ Ｐｂｅ Ｌｙｓ ＬｅｕＣＡＧ−ＡＧＣ
−ＣＡＡ−ＡＴＴ−ＧＴＣ−４ＣＣ−ＴＩＴ−ＴＡＣ−
ＴＴＣ−ＡＡＧ−ＣＴＴ−ＧＴＣ−ＩＣＧ−ＧＴＴ−Ｔ
ＡＡ−ＣＡＧ−ＡＧＧ−ＡＡＡ−ＡＴＧ−ＡＡＧ−ＴＴ
Ｃ−ＧＡＡ−Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ
Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｉｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ ＧｉｎＴ
ＴＣ−ＡＡＡ−ＡＡＣ−ＴＴＴ−ＡＡＧ−ＧＡＩ−ＧＡ
Ｃ−ＣＡＧ−ＡＧＣ−ＡＴＣ−ＣＡＡ−ＡＡＧ−ＴＴＴ
−ＴＴＧ−ＡＡＡ−ＴＴＣ−ＣＴＡ−ＣＴＧ−ＧＴＣ−
ＴＣＧ−ＴＡＧ−ＧＴｒ−Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇ
ｌｕ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｍｅ
ｔ ＡｓｎＡＡＧ−ＡＧＴ−ＧＴＧ−ＧＡＧ−ＡＣＣ−
ＡＩＣ−ＡＡＧ−ＧＡＡ−ＧＡＣ−ＡＴＧ−ＡＡＴ−Ｔ
ＴＣ−τＣＡ−ＣＡＣ−ＣＴＣ−ＩＧＧ−ＴＡＧ−ＴＴ
Ｃ−ＣＩＴ−ＣＴＧ−ＴＡＣ−ＴＴＡ−Ｖａｌ Ｌｙｓ
Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｓｉｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ
Ｌｙｓ Ｌｙｓ ＡｒｇＧＴ Ｃ−ＡＡＧ−ＩＩＩ −
ＴＴＣ−ＡＡＴ−ＡＧＣ−ＡＡＣ−ＡＡＡ−ＡＡＧ−Ａ
ＡＡ−ＣＧＴ−ＣＡＧ−ＴＴＣ−ＡＡＡ−ＡＡＧ−ＴＴ
Ａ−ＴＣＧ−ＴＴＧ−ＴＴＴ−ＴＴＣ−ＴＩＩ−ＧＣＡ
−Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｓｅｒ ＶａｌＧＡＩ−ＧＡ
Ｃ−ＴＴＣ−ＧＡＡ−ＡＡＧ−ＣＴＧ−ＡＣＴ−ＡＡＴ
−ＴＡＴ−ＴＣＧ−ＧＩＡ−ＣＴＡ−ＣＴＧ−ＡＡＧ−
ＣＴＴ−ＴＴＣ−ＧＡＣ−ＴＧＡ−ＴＴＡ−ＡＴＡ−Ａ
ＧＣ−ＣＡＩ−Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｖａ
ｔ Ｇｉｎ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｈｉｓ
ＡＣニーＧＡＣ−ＴＴＧ−ＡＡＴ−ＧＴＣ−ＣＡＡ−Ｃ
ＧＣ−ＡＡＡ−ＧＣＡ−ＡＴＡ−ＣＡＴ−ＴＧＡ−ＣＴ
Ｇ−ＡＡＣ−ＴＴＡ−ＣＡＧ−ＧＴＴ−ＧＣＧ−ＩＴＴ
−ＣＧＴ−ＴＡＴ−ＧＴＡ−Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｇｉｎ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ｐｒ。
Ｉ Ｍｅｔ Ｃｙｓ 工ｙｒ Ｃｙｓ Ｇｕｎコードす
る鎖 ５°−ＡＡＴＩＣ−ＡＩＧ−ＴＧＴ−ＴＡＣ（Ｇ
Ｃ−ＣＡＧ−コードしない鎖 ３ ’ −Ｇ−ＴＡＣ
−ＡＣＡ−ＡＴＧ−ＡＣＧ−ＧＴＣ−Ａｓｐ Ｐｒｏ
Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａ
ｓｎ Ｌｅｕ ＬｙｓＧＡＣ−ＣＣＡ−ＩＡＴ−ＧＴＡ
−ＡＡＡ−ＧＡＡ−ＧＣＡ−ＧＡＡ−ＡＡＣ−ＣＩニー
ＡＡＧ−ＣＴＧ−ＧＧＴ−ＡＴＡ−ＣＡＴ−ＴＴＴ−Ｃ
ＴＴＴＣＧＴ−ＣＩＴ−ＴＴＧ−ＧＡＡ−ＴＴＣＬｙｓ
Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ
Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ ＡｌａＡＡＡ−ＴＡＣ−ＴＴ
ニーＡＡＴ−ＧＣＡ−ＧＧＴ−ＣＡＴ−ＴＣＡ−ＧＡＴ
−ＧＴＡ−ＧＣＧ−ＴＴＴ−ＡＴＧ−ＡＡＡ−ＴＴＡ−
ＣＧＴ−ＣＣＡ−ＧＴＡ−ＡＧＴ−ＣＴＡ−ＣＡＩ−Ｃ
ＧＣ−Ａｓｐ Ａｓｎ Ｇｕｙ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈ
ｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｅｕ ＬｙｓＧＡｒ−
ＡＡＴ−ＧＧＡ−ＡＣＴ−ＣＴＴ−ＴＴＣ−ＩＩＡ−Ｇ
ＧＣ−ＡτニーＴＴＧ−ＡＡＧ−ＣＴＡ−ＴＴＡ−ＣＣ
Ｔ−ＴＧＡ−ＧＡＡ−ＡＡＧ−ＡＡＩ−ＣＣＧ−ＴＡＡ
−ＡＡＣ−ＴＴＣ−Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ
Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｍ
ｅｔＡＡＩ−ＴＧＧ−ＡＡＡ−ＧＡＧ−ＧＡＧ−ＡＧＴ
−ＧＡＣ−ＡＧＡ−ＡＡＡ−ＡＴＡ−ＡＴＧ−τＴＡ−
ＡＣＣ−ＴＴＴ−ＣＴＣ−ＣＩＣ−ＴＣＡ−ＣＴＧ（Ｃ
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ＡＡ−ＣＡＧ−ＡＧＧ−ＡＡＡ−ＡＴＧ−ＡＡＧ−ＴＴ
Ｃ−ＧＡＡ−Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ
Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｉｎ Ｓｅｒ Ｉｌｅ ＧｉｎＴ
ＴＣ−ＡＡＡ−ＡＡＣ−ＴＴＴ−ＡＡＧ−ＧＡＩ−ＧＡ
Ｃ−ＣＡＧ−ＡＧＣ−ＡＴＣ−ＣＡＡ−ＡＡＧ−ＴＴＴ
−ＴＴＧ−ＡＡＡ−ＴＴＣ−ＣＴＡ−ＣＴＧ−ＧＴＣ−
ＴＣＧ−ＴＡＧ−ＧＴｒ−Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇ
ｌｕ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｍｅ
ｔ ＡｓｎＡＡＧ−ＡＧＴ−ＧＴＧ−ＧＡＧ−ＡＣＣ−
ＡＩＣ−ＡＡＧ−ＧＡＡ−ＧＡＣ−ＡＴＧ−ＡＡＴ−Ｔ
ＴＣ−τＣＡ−ＣＡＣ−ＣＴＣ−ＩＧＧ−ＴＡＧ−ＴＴ
Ｃ−ＣＩＴ−ＣＴＧ−ＴＡＣ−ＴＴＡ−Ｖａｌ Ｌｙｓ
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Ｌｙｓ Ｌｙｓ ＡｒｇＧＴ Ｃ−ＡＡＧ−ＩＩＩ −
ＴＴＣ−ＡＡＴ−ＡＧＣ−ＡＡＣ−ＡＡＡ−ＡＡＧ−Ａ
ＡＡ−ＣＧＴ−ＣＡＧ−ＴＴＣ−ＡＡＡ−ＡＡＧ−ＴＴ
Ａ−ＴＣＧ−ＴＴＧ−ＴＴＴ−ＴＴＣ−ＴＩＩ−ＧＣＡ
−Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｓｅｒ ＶａｌＧＡＩ−ＧＡ
Ｃ−ＴＴＣ−ＧＡＡ−ＡＡＧ−ＣＴＧ−ＡＣＴ−ＡＡＴ
−ＴＡＴ−ＴＣＧ−ＧＩＡ−ＣＴＡ−ＣＴＧ−ＡＡＧ−
ＣＴＴ−ＴＴＣ−ＧＡＣ−ＴＧＡ−ＴＴＡ−ＡＴＡ−Ａ
ＧＣ−ＣＡＩ−Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｖａ
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ＡＣニーＧＡＣ−ＴＴＧ−ＡＡＴ−ＧＴＣ−ＣＡＡ−Ｃ
ＧＣ−ＡＡＡ−ＧＣＡ−ＡＴＡ−ＣＡＴ−ＴＧＡ−ＣＴ
Ｇ−ＡＡＣ−ＴＴＡ−ＣＡＧ−ＧＴＴ−ＧＣＧ−ＩＴＴ
−ＣＧＴ−ＴＡＴ−ＧＴＡ−Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｇｉｎ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
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ＧＡＡ−ＣＴＣ−ＡＴＣ−ＣＡＡ−ＧＴＧ−ＡＴＧ−Ｇ
ＣＴ−ＧＡＡ−ＣＩＧ−ＴＣＧ−ＣＣＡ−ＣＴＴ−ＧＡ
Ｇ−ＴＡＧ−ＧＴＴ−ＣＡＣ−ＴＡＣ−ＣＧＡ−ＣＴＴ
−ＧＡＣ−ＡＧＣ−ＧＧＴ−Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｙｓ ＡｒｇＳｉ
ｒ ＧｌｎＧＣＡ−ＧＣＴ−ＡＡＡ−ＡＣＡ−ＧＧＧ−
ＡＡＧ−ＣＧＡ−ＡＡＡ−ＣＧＩ−ＡＧＩ−ＣＡＧ−Ｃ
ＧＴ−ＣＧＡ−ＴＴＴ−ＴＧＴ−ＣＣＣ−ＴＴＣ−ＧＣ
Ｔ−ＩＴＴ−ＧＣＡ−ＴＣＡ−ＧＴＣ−Ｍｅｔ Ｌｅｕ
Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ
５ｅｒＡＩＧ−ＣＴＧ−ＴＴＴ−ＣＡＡ−ＧＧＩ−ＣＧ
Ａ−ＡＧＡ−ＧＣＡ−ＴＣＣ−ＴＡＣ−ＧＡＣ−ＡＡＡ
−ＧＴＴ−ＣＣＡ−ＧＣ’Ｉ−ＩＣＩ−ＣＧＴ−ＡＧＧ
−Ｇｌｎ ５ｔｏｐ ＢａｍＨＩ ＣＡＧ−ＴＡＡ−Ｇ ＧＴＣ−ＡＴＴ−ＣＣＴＡＧ ［４コＩＦＮ遺伝子の配列決定： Ｍ１３−ジデオキシ法を用いることができる。
ＣＴ−ＧＡＡ−ＣＩＧ−ＴＣＧ−ＣＣＡ−ＣＴＴ−ＧＡ
Ｇ−ＴＡＧ−ＧＴＴ−ＣＡＣ−ＴＡＣ−ＣＧＡ−ＣＴＴ
−ＧＡＣ−ＡＧＣ−ＧＧＴ−Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｙｓ ＡｒｇＳｉ
ｒ ＧｌｎＧＣＡ−ＧＣＴ−ＡＡＡ−ＡＣＡ−ＧＧＧ−
ＡＡＧ−ＣＧＡ−ＡＡＡ−ＣＧＩ−ＡＧＩ−ＣＡＧ−Ｃ
ＧＴ−ＣＧＡ−ＴＴＴ−ＴＧＴ−ＣＣＣ−ＴＴＣ−ＧＣ
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Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ
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Ａ−ＡＧＡ−ＧＣＡ−ＴＣＣ−ＴＡＣ−ＧＡＣ−ＡＡＡ
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−Ｇｌｎ ５ｔｏｐ ＢａｍＨＩ ＣＡＧ−ＴＡＡ−Ｇ ＧＴＣ−ＡＴＴ−ＣＣＴＡＧ ［４コＩＦＮ遺伝子の配列決定： Ｍ１３−ジデオキシ法を用いることができる。
プラスミドｐｙｔｒｐ中のＩＦＮ遺伝子の配列＝ＩＦＮ
遺伝子の配列はＦ、サンガーら［Ｆ、Ｓａｎｇｅｒ。
遺伝子の配列はＦ、サンガーら［Ｆ、Ｓａｎｇｅｒ。
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ、
７４．５４６３ （１９７７） ］によって開発された
Ｍ１３−ジデオキシ法を用いて決定した。
７４．５４６３ （１９７７） ］によって開発された
Ｍ１３−ジデオキシ法を用いて決定した。
配列決定のため、ｐ７ｔｒｐのＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨ
Ｉ消化にた。得られたプラスミドを用いてＥ、ｃｏｌｉ
ＪＭ１０３を形質転換して、Ｘｇａｌ（５−ブロモ−
４−クロロインドリルガラクトシド）を含有するプレー
ト上に白色プラークを生じせしめた。この単一白色プラ
ークを培養して菌体を集め、ファージ粒子を得た。
Ｉ消化にた。得られたプラスミドを用いてＥ、ｃｏｌｉ
ＪＭ１０３を形質転換して、Ｘｇａｌ（５−ブロモ−
４−クロロインドリルガラクトシド）を含有するプレー
ト上に白色プラークを生じせしめた。この単一白色プラ
ークを培養して菌体を集め、ファージ粒子を得た。
このファージ粒子からＩＦＮ遺伝子を含有する一本鎖Ｄ
ＮＡ （５ｓＤＮＡ ）を得、次いでＭ１３ジデオキシ
法の手順に従って分析した。 ＩＦＮ遺伝子の配列決定
を行った結果は設計したＩＦＮ遺伝子と一致した。
ＮＡ （５ｓＤＮＡ ）を得、次いでＭ１３ジデオキシ
法の手順に従って分析した。 ＩＦＮ遺伝子の配列決定
を行った結果は設計したＩＦＮ遺伝子と一致した。
［５コ宿主生物中でのＺＦＮ遺伝子の発現。
ＩＦＮ遺伝子を発現させるため、こうして得たプロモー
ター遺伝子とＩＦＮ遺伝子とを有するプラスミドを用い
て宿主生物を形質転換しいつぎにそのプラスミドを有す
る宿主生物を適当な培地中で培養する。生じた培養プロ
ス中にＩＦＮの特徴が現われる。
ター遺伝子とＩＦＮ遺伝子とを有するプラスミドを用い
て宿主生物を形質転換しいつぎにそのプラスミドを有す
る宿主生物を適当な培地中で培養する。生じた培養プロ
ス中にＩＦＮの特徴が現われる。
（１）プラスミドｐ７ｔｒｌ）を用いての５．臼卦中で
のＩＦＮ遺伝子の発現 ｐ７ｔｒｐ含有５．臼旦ＨＢ１０１をＬブロス中で一夜
培養したものをトリプトファン不含Ｍ９培地で希釈し、
菌体を、β−インドールアクリル酸を用いた誘発によっ
て、３７℃で３時間インキュベートした。 ＩＦＮ産生
の検出はバイオアッセイ法（抗ウィルス活性）を用いて
行った。
のＩＦＮ遺伝子の発現 ｐ７ｔｒｐ含有５．臼旦ＨＢ１０１をＬブロス中で一夜
培養したものをトリプトファン不含Ｍ９培地で希釈し、
菌体を、β−インドールアクリル酸を用いた誘発によっ
て、３７℃で３時間インキュベートした。 ＩＦＮ産生
の検出はバイオアッセイ法（抗ウィルス活性）を用いて
行った。
［６コＩＦＮのバイオアッセイ
ＩＦＮ活性は、国際標品Ｌｅｕｌ（ｕＩＦＮ （１（国
立予防衛生研究所）を対照として用い、細胞変性作用（
ＣＰＥ）阻止法により測定した。
立予防衛生研究所）を対照として用い、細胞変性作用（
ＣＰＥ）阻止法により測定した。
［，７］ＩＦＮの単離：
培養液を遠心分離して、湿潤細胞ペーストを得て、細胞
を超音波処理によって破壊した。懸濁混合物を遠心分離
し、上清を抗ウィルス活性のバイオアッセイによって調
べ、ＩＦＮの活性を検出した。 ＩＦＮはＳＤＳ −Ｐ
ＡＧＥで正規の位置に検出きれた。
を超音波処理によって破壊した。懸濁混合物を遠心分離
し、上清を抗ウィルス活性のバイオアッセイによって調
べ、ＩＦＮの活性を検出した。 ＩＦＮはＳＤＳ −Ｐ
ＡＧＥで正規の位置に検出きれた。
得られたＩＦＮの活性は酸性条件（ｐ）１２．０ ）で
は消失した。上記がＩＦＮ産生の特徴であった。
は消失した。上記がＩＦＮ産生の特徴であった。
このようにして得られたＩＦＮは次の通りである：Ｃｙ
ｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（ｙｒ−
Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ａ １ ａ−Ｇ １ ｕ−Ａ
ｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓ
ｎ−Ａ １ ａ−Ｇｌｙ−Ｈｉ ５−５ｅｒ−Ａｓｐ−
Ｖａ １− Ａｌ ａ−Ａｓ ｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔ
ｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅ ｕ −Ｇ １ ｙ−Ｉ
１ｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ（ｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ａ ｓ ｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉ
１ｅ−Ｍｅｔ−Ｇ ｕｎ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｉ １ｅ−
１／ａ １−５ｅｒ−Ｐｈ ｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙ
ｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ
−Ａｓｐ−Ａｓ ｐ−Ｇ １ｎ−５ｅｒ−１１ｅ−Ｇｉ
ｎ−Ｌｙｓ −５ｅｒ−Ｖａ １−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉ
１ ｅ−Ｌｙ ｓ −Ｇ ｌｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａ
ｓｎ−Ｖａ １−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−５
ｅｔ−Ａｓ ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ
ｓｐ−Ａｓ ｐ−Ｐｈａ−Ｇｌｕ−Ｌｙ ５−Ｌｅｕ−
工ｈ ｒ−Ａｓ ｎ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｖａ １−”Ｔ
ｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓ ｎ−Ｖａ １−Ｇ １
ｎ−Ａｒｇ−Ｌｙ ｓ−Ｊｋｌ ａ−Ｉ １ａ−ｔｌｉ
ｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｉ ｌｅ−Ｇ １ ｎ−Ｖａ １
−Ｍｅｊ−Ａ １ ａ −Ｇ １ｕ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−
Ｐｒｏ−Ａ １ ａ−Ａｌ ａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｇｉｎ
−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−
Ａｒｇ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｇｌｎ ［実施例］ 以下、実施例を示し、この発明をさらに詳細に説明する
。
ｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（ｙｒ−
Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ａ １ ａ−Ｇ １ ｕ−Ａ
ｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓ
ｎ−Ａ １ ａ−Ｇｌｙ−Ｈｉ ５−５ｅｒ−Ａｓｐ−
Ｖａ １− Ａｌ ａ−Ａｓ ｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔ
ｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅ ｕ −Ｇ １ ｙ−Ｉ
１ｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ（ｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ａ ｓ ｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉ
１ｅ−Ｍｅｔ−Ｇ ｕｎ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｉ １ｅ−
１／ａ １−５ｅｒ−Ｐｈ ｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙ
ｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ
−Ａｓｐ−Ａｓ ｐ−Ｇ １ｎ−５ｅｒ−１１ｅ−Ｇｉ
ｎ−Ｌｙｓ −５ｅｒ−Ｖａ １−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉ
１ ｅ−Ｌｙ ｓ −Ｇ ｌｕ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａ
ｓｎ−Ｖａ １−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−５
ｅｔ−Ａｓ ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ
ｓｐ−Ａｓ ｐ−Ｐｈａ−Ｇｌｕ−Ｌｙ ５−Ｌｅｕ−
工ｈ ｒ−Ａｓ ｎ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｖａ １−”Ｔ
ｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓ ｎ−Ｖａ １−Ｇ １
ｎ−Ａｒｇ−Ｌｙ ｓ−Ｊｋｌ ａ−Ｉ １ａ−ｔｌｉ
ｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｉ ｌｅ−Ｇ １ ｎ−Ｖａ １
−Ｍｅｊ−Ａ １ ａ −Ｇ １ｕ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−
Ｐｒｏ−Ａ １ ａ−Ａｌ ａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｇｉｎ
−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−
Ａｒｇ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｇｌｎ ［実施例］ 以下、実施例を示し、この発明をさらに詳細に説明する
。
実施例１
）１０ＡｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐｒｐＧｐＧｐＡｐＴｐ
ＧｐＡｐＧｐＴｐＴＯＨ（）１６）の合成 （１）ＤＭＴｒＯＡ”ｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏＴｐｏ”Ｕ
ｐｏ−セルロースの合成： ｉ ） ）ＩＯＴｐｏ”Ｕｐｏ−セルロースの調製：Ｄ
ＭＴｒＯＴｐｏ”Ｕｐｏ−セルａ −ス（８４，Ｏｍｇ
、３．５７Ｈｍｏｌｅ” ） （Ｒ，Ｃｒｅａの方法１
）により調製）のメタノール／クロロホルム（１： ９
ｖ／ｖ、５．ＯｍＱ）中懸濁液にＩＣＡ／りｔｆｆｏホ
ルム（２二８ｗ／ｖ、５．ＱｍＱ）を水冷下に加え、混
合物を０℃で１０分間攪拌した。
ＧｐＡｐＧｐＴｐＴＯＨ（）１６）の合成 （１）ＤＭＴｒＯＡ”ｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏＴｐｏ”Ｕ
ｐｏ−セルロースの合成： ｉ ） ）ＩＯＴｐｏ”Ｕｐｏ−セルロースの調製：Ｄ
ＭＴｒＯＴｐｏ”Ｕｐｏ−セルａ −ス（８４，Ｏｍｇ
、３．５７Ｈｍｏｌｅ” ） （Ｒ，Ｃｒｅａの方法１
）により調製）のメタノール／クロロホルム（１： ９
ｖ／ｖ、５．ＯｍＱ）中懸濁液にＩＣＡ／りｔｆｆｏホ
ルム（２二８ｗ／ｖ、５．ＱｍＱ）を水冷下に加え、混
合物を０℃で１０分間攪拌した。
クロロホルム（２ｍＢおよびメタノール（６，ＯｍＱ）
で順次洗浄後、フィルター上でセルロース付加物（ＨＯ
ＴｐｏＡＣｐｏ−セルロース）を乾燥させた。この際、
水はピリジン（２ｍＡ）との共＋ｉｌ！ｉ混合物として
分離した。
で順次洗浄後、フィルター上でセルロース付加物（ＨＯ
ＴｐｏＡＣｐｏ−セルロース）を乾燥させた。この際、
水はピリジン（２ｍＡ）との共＋ｉｌ！ｉ混合物として
分離した。
＊この値は、クロロホルム洗液の吸光度を５０７ｎｍで
測定して算出した。
測定して算出した。
１） Ｒ，Ｃｒｅａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、、旦、２３３１（１９８０）。
Ｒｅｓ、、旦、２３３１（１９８０）。
ｊ ） ＤＭＴｒＯＡＢ２ｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏ−の調
製：ＤＭｒｒＯＡ”２′ｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏ−ＣＥ
（３９，１ｍｇ、２１．４１１ ｍｏｌｅ ）をトリエ
チルアミン−アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ、５ ｍＱ
）で室温で１時間処理した。こうして得られたホスホ
ジエステルトリマー（ＤＭＩｒＯＡＢ２ｐｏＧｉＢｐｏ
Ｔｐｏ−）を乾燥させた。水はピリジンとの共沸混合物
（０，５賊、２ｘ１ｍｕ）として分離した。
製：ＤＭｒｒＯＡ”２′ｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏ−ＣＥ
（３９，１ｍｇ、２１．４１１ ｍｏｌｅ ）をトリエ
チルアミン−アセトニトリル（１：１ｖ／ｖ、５ ｍＱ
）で室温で１時間処理した。こうして得られたホスホ
ジエステルトリマー（ＤＭＩｒＯＡＢ２ｐｏＧｉＢｐｏ
Ｔｐｏ−）を乾燥させた。水はピリジンとの共沸混合物
（０，５賊、２ｘ１ｍｕ）として分離した。
ｉ）カップリング
トリマー（ＤＭＩｒＯＡＢ２ｐｏＧ” Ｂｐｏｌｐｏ
）をセルロース付加物（ＨＯＴｐｏＡｃＩＪｐｏ−セル
ロース）とｌＱｍＱ容丸底フラスコ中で混合した。混合
物を乾燥させ、水はピリジンとの共沸混合物（２Ｘ １
ｍｘ ）として分離し、最後に無水ピリジン（Ｉｍｉ
＋）に再懸濁きせた。メシチレンスルホニルニトロトリ
アゾリド（ＭＳＮＴ） （８０，０ｍｇ、 ２７０μｍ
ｏｌｅ）をこの懸濁液に加え、混合物を室温で１時間攪
拌した。次いでピリジンを反応容器に加え、セルロース
付加物を遠心分１ｍ （３，ＱＯＯｒｐｍ、 ２分間）
により回収シタ。
）をセルロース付加物（ＨＯＴｐｏＡｃＩＪｐｏ−セル
ロース）とｌＱｍＱ容丸底フラスコ中で混合した。混合
物を乾燥させ、水はピリジンとの共沸混合物（２Ｘ １
ｍｘ ）として分離し、最後に無水ピリジン（Ｉｍｉ
＋）に再懸濁きせた。メシチレンスルホニルニトロトリ
アゾリド（ＭＳＮＴ） （８０，０ｍｇ、 ２７０μｍ
ｏｌｅ）をこの懸濁液に加え、混合物を室温で１時間攪
拌した。次いでピリジンを反応容器に加え、セルロース
付加物を遠心分１ｍ （３，ＱＯＯｒｐｍ、 ２分間）
により回収シタ。
Ｎ）未反応５′ ヒドロキシ基のアセチル化：前記セル
ロース付加物をピリジン−無水酢酸溶液（１０：ｌｖ／
ｖ、５．５ｍｕ）に懸濁し、室温で３０分間攪拌した。
ロース付加物をピリジン−無水酢酸溶液（１０：ｌｖ／
ｖ、５．５ｍｕ）に懸濁し、室温で３０分間攪拌した。
ピリジン（５ｍＱ）中で反復遠心分離（３，００Ｏｒｐ
ｍ、 ２分間）し、メタノール（１５ｍＱ）で洗浄、室
温で３０分間真空乾燥することにより、セルロース生成
物（５６，０ｍｇ ）を得た。このセルロース付加物（
ＤＭＴｒＯＡ”’ｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏＴｐｏ”Ｌｌｐ
ｏ−セルロース）は次のカップリング工程に使用できる
。
ｍ、 ２分間）し、メタノール（１５ｍＱ）で洗浄、室
温で３０分間真空乾燥することにより、セルロース生成
物（５６，０ｍｇ ）を得た。このセルロース付加物（
ＤＭＴｒＯＡ”’ｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏＴｐｏ”Ｌｌｐ
ｏ−セルロース）は次のカップリング工程に使用できる
。
（２）ＤＭＩｒＯＡ””ｐｏＴｐｏＧｉＢｐｏＡ””ｐ
ｏＧｉＢｐｏＴｐｏＩｐｏＡｃＵｐｏ −セルロースの
合成： ＤＭＴｒＯＡ”ｐｏＴｐｏＧｉＢｐｏＡＢ７′ｐｏＧｉ
ＢｐｏＴｐｏｌｐｏＡｃＵｐｏ −セルロースは、ＤＭ
ＴｒＯＡ”ｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏＴｐｏ”Ｌｌｐｏ−セ
ルロース（１３１，０ｍｇ）とＤＭＴｒＯＡ”ｐｏｒｐ
ｏＧｉＢｐｏ−ＣＥ（３９，１ｍｇ ）から前記と同様
の条件により合成した。
ｏＧｉＢｐｏＴｐｏＩｐｏＡｃＵｐｏ −セルロースの
合成： ＤＭＴｒＯＡ”ｐｏＴｐｏＧｉＢｐｏＡＢ７′ｐｏＧｉ
ＢｐｏＴｐｏｌｐｏＡｃＵｐｏ −セルロースは、ＤＭ
ＴｒＯＡ”ｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏＴｐｏ”Ｌｌｐｏ−セ
ルロース（１３１，０ｍｇ）とＤＭＴｒＯＡ”ｐｏｒｐ
ｏＧｉＢｐｏ−ＣＥ（３９，１ｍｇ ）から前記と同様
の条件により合成した。
（３）ＤＭＴｒＯＩｐｏＧｉＢｐｏＧｉＢｐｏＡＢ２ｐ
ｏＴｐｏＧｉＢｐｏＡＢ”ｐｏＧｉＢｌ）ＯＩｐｏＴｐ
ｏＡｏＵｐｏ−セルロースノ合成：ＤＭＴｒＯＩｐｏＧ
ｐｏＧ ｐｏＡ ｐｏＴｐｏＧ ｐｏＡ
ｐｏＧ ｐｏ−ＴｐｏＴｐｏＡｏＵｐｏ−セルロース
（１０５，８ｍｇ）はＤＭＴｒＯＡＢ”ｐｏＴｐｏＧｉ
ＢｐｏＡＢ２ｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏＴｐｏＡｃＵｐｏ−
セルロース（１２３，０ｍｇ）とＤＭＴｒＯＴｐｏＧ
ｐｏＧ ｐｏ−ＣＥ （３８，７ｍｇ ）から、同
様の条件により合成した。
ｏＴｐｏＧｉＢｐｏＡＢ”ｐｏＧｉＢｌ）ＯＩｐｏＴｐ
ｏＡｏＵｐｏ−セルロースノ合成：ＤＭＴｒＯＩｐｏＧ
ｐｏＧ ｐｏＡ ｐｏＴｐｏＧ ｐｏＡ
ｐｏＧ ｐｏ−ＴｐｏＴｐｏＡｏＵｐｏ−セルロース
（１０５，８ｍｇ）はＤＭＴｒＯＡＢ”ｐｏＴｐｏＧｉ
ＢｐｏＡＢ２ｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏＴｐｏＡｃＵｐｏ−
セルロース（１２３，０ｍｇ）とＤＭＴｒＯＴｐｏＧ
ｐｏＧ ｐｏ−ＣＥ （３８，７ｍｇ ）から、同
様の条件により合成した。
（４）Ｄｔ４１ ｒＯＡ”ｐｏＣ” ｐｏＴｐｏＴｐｏ
ＧｉＢｐｏＧ ”’ｐｏ Ａ””ｐｏＴｐｏ −ＧｉＢ
ｐｏＡ”ｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏＴｐｏ”１Ｊｐｏ−セル
ロースの合成： ＤＭＩｒＯＡ”２ｐｏＣ”ｐｏＩｐｏＴｐｏＧｉＢｐｏ
ＧｉＢｐｏＡＢ２ｐｏＴｐｏＧｉＢｐｏＡＢ２ｐｏＧｉ
ＢｐｏＴｐｏＴｐｏＡ０Ｕｐｏ−セルロース（１０１３
ｍｇ） は、 ＤＭＴｒＯＴｐｏＧ ｐｏＧ
ｐｏＡ ｐｏＩｐｏｃ ｐｏＡｐｏＧｉＢｐ
ｏＴｐｏｌｐｏＡｃＵｐｏ−セルロース（１１６，４ｍ
ｇ ）とＤＭＴｒＯＡＢ７′ｐｏＣ”ｐｏｌｐｏ−ＣＥ
（３８，９ｍｇ ）から、同様の条件により合成した
。
ＧｉＢｐｏＧ ”’ｐｏ Ａ””ｐｏＴｐｏ −ＧｉＢ
ｐｏＡ”ｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏＴｐｏ”１Ｊｐｏ−セル
ロースの合成： ＤＭＩｒＯＡ”２ｐｏＣ”ｐｏＩｐｏＴｐｏＧｉＢｐｏ
ＧｉＢｐｏＡＢ２ｐｏＴｐｏＧｉＢｐｏＡＢ２ｐｏＧｉ
ＢｐｏＴｐｏＴｐｏＡ０Ｕｐｏ−セルロース（１０１３
ｍｇ） は、 ＤＭＴｒＯＴｐｏＧ ｐｏＧ
ｐｏＡ ｐｏＩｐｏｃ ｐｏＡｐｏＧｉＢｐ
ｏＴｐｏｌｐｏＡｃＵｐｏ−セルロース（１１６，４ｍ
ｇ ）とＤＭＴｒＯＡＢ７′ｐｏＣ”ｐｏｌｐｏ−ＣＥ
（３８，９ｍｇ ）から、同様の条件により合成した
。
（５）ＤＭＴ ｒＯＡＢ”ｐｏ’ｒｐｏｃＢ２ｐｏＡＢ
２ｐａｃ””ｐｏＴｐｏＴｐｏＧ １Ｂｐｏ −Ｇ １
ＢｐｏＡ”ｐｏＴｐｏＧｉＢｐｏＡ”ｐｏＢｉＢｐｏＩ
ｐｏＴｐｏＡｏｌＪｐｏ −セルロースの合成： ＤＭＴｒＯＡ””ｐｏＴｐｏＣ””ｐｏＡＢ２ｐｏＣ”
２ｐｏＴｐｏＴｐｏＧｉＢｐｏＧ”ｐｏＡＢ２ｐｏＩｐ
ｏＧｉＢｐｏＡＢｚｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏＴｐｏ”ＬＪ
ｐｏ−セルロース（９４，６ｍｇ ）は、ＤＭＴｒＯＡ
””ｐｏＣＢ”ｐｏＴｐｏＴｐｏＧｉＢ、。ＧｉＢ、。
２ｐａｃ””ｐｏＴｐｏＴｐｏＧ １Ｂｐｏ −Ｇ １
ＢｐｏＡ”ｐｏＴｐｏＧｉＢｐｏＡ”ｐｏＢｉＢｐｏＩ
ｐｏＴｐｏＡｏｌＪｐｏ −セルロースの合成： ＤＭＴｒＯＡ””ｐｏＴｐｏＣ””ｐｏＡＢ２ｐｏＣ”
２ｐｏＴｐｏＴｐｏＧｉＢｐｏＧ”ｐｏＡＢ２ｐｏＩｐ
ｏＧｉＢｐｏＡＢｚｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏＴｐｏ”ＬＪ
ｐｏ−セルロース（９４，６ｍｇ ）は、ＤＭＴｒＯＡ
””ｐｏＣＢ”ｐｏＴｐｏＴｐｏＧｉＢ、。ＧｉＢ、。
ＡＢｚｐＯＴｐｏＧｉＢ、。ＡＢｚｐｏＧｉＢ、。Ｔｐ
ｏＴｐｏＡＣＵｐ。−セルロース（ｉｏｌ、 ３ｍｇ）
とＤＭＴｒＯＡＢ２ｐｏＴｐｏＣＢ”ｐｏ−σ（３８，
９ｍｇ ）から、同様の条件下に合成した。この最終プ
ロセスでは、未反応５′ ヒドロキシ基はアセチル基で
保護する必要はなかった。
ｏＴｐｏＡＣＵｐ。−セルロース（ｉｏｌ、 ３ｍｇ）
とＤＭＴｒＯＡＢ２ｐｏＴｐｏＣＢ”ｐｏ−σ（３８，
９ｍｇ ）から、同様の条件下に合成した。この最終プ
ロセスでは、未反応５′ ヒドロキシ基はアセチル基で
保護する必要はなかった。
（６）ＨＯＡｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐ
ＴｐＧｐＡｐＧｐＴｐＴＯ）ｌの合成： ＤＭＴｒＯＡ””ｐｏＩｐｏｃ”２ｐｏＡ””ｐｏＣ”
”ｐｏＴｐｏＴｐｏＧｉＢｐｏＧｔｈＢｐｏＡ”２ｐｏ
ＴｐｏＧｉＢｐｏＡＢ２ｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏＴｐｏＡ
ｃＬｌｐｏ−セルロース（９４，６ｍｇ ）を０．５回
目、Ｎ、Ｎ’ −Ｎ’ −テトラメチルグアニジニウム
ビリジンアルドキシマート［ジオキサン−水（１：１ｖ
／ｖ、１賊）中］と封管中、２０℃で２０時間処理した
。反応混合物に２８％（ｗｈｒ）アンモニア水（１２１
ｄ ）を加え、６０°Ｃで２時間加熱した。固形セルロ
ースを濾別し、水（ｌＱｍＱ ）で洗浄した。濾液と洗
液を蒸発乾固させ、残渣を８０％酢酸水溶液（２５ｍＱ
）で室温で１５分間処理した。溶媒留去後、残渣を０
．１Ｍ炭酸トリエチルアンモニウム緩衡液（ｐＨ７，５
，２５ｍ１１ ） ニ溶かし、ジエチルエーテル（３Ｘ
２５＋１１１２ ）で洗浄した。水層を蒸発乾固し、
残渣を０．１Ｍ炭酸トリエチルアンモニウムＭ＆衡液（
ｐＨ７，５，２ＩｌｔＱ）に溶解し、溶液中に粗）１０
ＡｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＩｐＧｐＡ
ｐＧｐＴｐＴＯＨを得た。
ＴｐＧｐＡｐＧｐＴｐＴＯ）ｌの合成： ＤＭＴｒＯＡ””ｐｏＩｐｏｃ”２ｐｏＡ””ｐｏＣ”
”ｐｏＴｐｏＴｐｏＧｉＢｐｏＧｔｈＢｐｏＡ”２ｐｏ
ＴｐｏＧｉＢｐｏＡＢ２ｐｏＧｉＢｐｏＴｐｏＴｐｏＡ
ｃＬｌｐｏ−セルロース（９４，６ｍｇ ）を０．５回
目、Ｎ、Ｎ’ −Ｎ’ −テトラメチルグアニジニウム
ビリジンアルドキシマート［ジオキサン−水（１：１ｖ
／ｖ、１賊）中］と封管中、２０℃で２０時間処理した
。反応混合物に２８％（ｗｈｒ）アンモニア水（１２１
ｄ ）を加え、６０°Ｃで２時間加熱した。固形セルロ
ースを濾別し、水（ｌＱｍＱ ）で洗浄した。濾液と洗
液を蒸発乾固させ、残渣を８０％酢酸水溶液（２５ｍＱ
）で室温で１５分間処理した。溶媒留去後、残渣を０
．１Ｍ炭酸トリエチルアンモニウム緩衡液（ｐＨ７，５
，２５ｍ１１ ） ニ溶かし、ジエチルエーテル（３Ｘ
２５＋１１１２ ）で洗浄した。水層を蒸発乾固し、
残渣を０．１Ｍ炭酸トリエチルアンモニウムＭ＆衡液（
ｐＨ７，５，２ＩｌｔＱ）に溶解し、溶液中に粗）１０
ＡｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＩｐＧｐＡ
ｐＧｐＴｐＴＯＨを得た。
＜７ ）ＨＯＡｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡ
ｐＴｐＧｐＡｐＧｐＴｐＴＯＨの精製： Ｉ）粗生成物の最初の精製はカラムトクロマトグシフィ
ー（バイオゲルＰ２．２４ Ｘ ２．６ｃｍＬＤ ）に
より行った。最初の溶出ピークに相当する画分（５０ｍ
ｔｌ Ｎ）１４０Ａｃ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１剋／
分）を集め、凍結乾燥して最初の精製物を得た。
ｐＴｐＧｐＡｐＧｐＴｐＴＯＨの精製： Ｉ）粗生成物の最初の精製はカラムトクロマトグシフィ
ー（バイオゲルＰ２．２４ Ｘ ２．６ｃｍＬＤ ）に
より行った。最初の溶出ピークに相当する画分（５０ｍ
ｔｌ Ｎ）１４０Ａｃ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１剋／
分）を集め、凍結乾燥して最初の精製物を得た。
１）Ｉｌ、初の精製物の２回目の精製はＨＰＬＣ（ＣＤ
Ｒ−１０，２５ｃｍ Ｘ ４ 、６ｍｍＩＤ ）により
、１Ｍ酢酸アンモニウム−１０％（Ｖ／Ｖ）水性エタノ
ールから４．５Ｍ酢酸アンモニウム−１０％（Ｖ／Ｖ）
水性エタノールまでの直線勾配（８０分間、１ｍＱ／分
、６０’Ｃ）を用イテ行い、２回目の精製物を得た。
Ｒ−１０，２５ｃｍ Ｘ ４ 、６ｍｍＩＤ ）により
、１Ｍ酢酸アンモニウム−１０％（Ｖ／Ｖ）水性エタノ
ールから４．５Ｍ酢酸アンモニウム−１０％（Ｖ／Ｖ）
水性エタノールまでの直線勾配（８０分間、１ｍＱ／分
、６０’Ｃ）を用イテ行い、２回目の精製物を得た。
１ｌ）２回目の精製物の３回目の精製は、逆相ＨＰＬＣ
［Ｒｐ−１８−５μ（Ｘ７７）、１５ｃｍＸ ４ｍｍＩ
Ｄ ］により、０．１Ｍ酢酸アンモニウムから０．１Ｍ
酢酸アンモニウム−１５％（Ｖ／Ｖ ）アセトニトリル
水溶液までの直線勾配（４０分間、１．５ｍｉ／分、室
温）を用いて行い、最終精製物（）ｔＯＡｐＴｐＣｐＡ
ｐＣｐＩｐＩｐＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＧｐＴｐＴＯ
Ｈ）を得た。
［Ｒｐ−１８−５μ（Ｘ７７）、１５ｃｍＸ ４ｍｍＩ
Ｄ ］により、０．１Ｍ酢酸アンモニウムから０．１Ｍ
酢酸アンモニウム−１５％（Ｖ／Ｖ ）アセトニトリル
水溶液までの直線勾配（４０分間、１．５ｍｉ／分、室
温）を用いて行い、最終精製物（）ｔＯＡｐＴｐＣｐＡ
ｐＣｐＩｐＩｐＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＧｐＴｐＴＯ
Ｈ）を得た。
（８）オリゴヌクレオチドの分析：
（ＨＯＡｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐＴｐ
ＧｐＡｐｒｐＴＯＨ）１）ホスホジェステラーゼによる
消化：ＨＯＡｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐ
ＴｐＧｐＡｐＧｐＴｐＴＯＨ（５Ｐｇ、ｓｔ、７４）、
０．２Ｍ ＭｇＣ１，ｐ ｔｏ、、ｃ ）、０．２Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐｉ（８，５） （、１０４）およ
び０．１ｍＭ ＥＤＩＡ水溶液（１３，３４）の混合物
をホスホジェステラーゼ（５単位、５種）で室温にて２
０分間処理し、続いて１００℃で２分間加熱した。
ＧｐＡｐｒｐＴＯＨ）１）ホスホジェステラーゼによる
消化：ＨＯＡｐＴｐＣｐＡｐＣｐＴｐＴｐＧｐＧｐＡｐ
ＴｐＧｐＡｐＧｐＴｐＴＯＨ（５Ｐｇ、ｓｔ、７４）、
０．２Ｍ ＭｇＣ１，ｐ ｔｏ、、ｃ ）、０．２Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐｉ（８，５） （、１０４）およ
び０．１ｍＭ ＥＤＩＡ水溶液（１３，３４）の混合物
をホスホジェステラーゼ（５単位、５種）で室温にて２
０分間処理し、続いて１００℃で２分間加熱した。
ｉ ） Ｈｐｔ、ｃによる分析：
反応混合物中のオリゴヌクレオチドはＨＰＬＣ（ＣＤＲ
−１０，２５ｃｍＸ ４．６ｍｍＩＤ ）により、水〜
２．ＯＭ酢酸アンモニウム（ｐｉ（３゜４）の直線勾配
（４０分間、１．５ｍｌ＋／分、６０℃）を用いで分析
した。標準品の面積と比較することにより、各ピーク面
積からそのヌクレオチド組成を決定した。
−１０，２５ｃｍＸ ４．６ｍｍＩＤ ）により、水〜
２．ＯＭ酢酸アンモニウム（ｐｉ（３゜４）の直線勾配
（４０分間、１．５ｍｌ＋／分、６０℃）を用いで分析
した。標準品の面積と比較することにより、各ピーク面
積からそのヌクレオチド組成を決定した。
計算値： ｐＣｏｎ ２，０００． ｐＡｏ）１３，０
００． ｐＴｏｕ ６，０００゜ｐＣｏｎ４．０００ 実測値： ｐＣｏｎ １，８８６． ｐＡｏ、 ３，２
０８． ｐＴｏｕ ５．９４９゜ｐＣｏｎ３．９５８ 因１０乳主 オリゴヌクレオチド（Ａ１．Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、
Ａ６、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３． Ｂ４、ＢＳ、Ｂ６、Ｃ１，
Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４，Ｃ５、Ｃ６、Ｄｌ、Ｂ２、Ｂ３゜Ｂ
４、Ｂ５、Ｂ６、Ｅｌ、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６
、Ｆｌ、Ｆ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６．Ｇ１、Ｇ２、
Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｈｌ、）１２、Ｂ３、Ｈ４、
Ｂ５．１１．Ｉ２、工３、工４．１５．１６、Ｊｌ、Ｉ
２、Ｉ３． Ｉ４、Ｉ５． Ｉ６、Ｌｌ、Ｂ２、および
Ｂ３）の合成： 下記オリゴヌクレオチドを実施例１に記載のＨ６と同様
の方法で調製した。
００． ｐＴｏｕ ６，０００゜ｐＣｏｎ４．０００ 実測値： ｐＣｏｎ １，８８６． ｐＡｏ、 ３，２
０８． ｐＴｏｕ ５．９４９゜ｐＣｏｎ３．９５８ 因１０乳主 オリゴヌクレオチド（Ａ１．Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、
Ａ６、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３． Ｂ４、ＢＳ、Ｂ６、Ｃ１，
Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４，Ｃ５、Ｃ６、Ｄｌ、Ｂ２、Ｂ３゜Ｂ
４、Ｂ５、Ｂ６、Ｅｌ、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６
、Ｆｌ、Ｆ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６．Ｇ１、Ｇ２、
Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｈｌ、）１２、Ｂ３、Ｈ４、
Ｂ５．１１．Ｉ２、工３、工４．１５．１６、Ｊｌ、Ｉ
２、Ｉ３． Ｉ４、Ｉ５． Ｉ６、Ｌｌ、Ｂ２、および
Ｂ３）の合成： 下記オリゴヌクレオチドを実施例１に記載のＨ６と同様
の方法で調製した。
（１） ＨＯＡｐＡｐＩｐＴｐＣｐＡｐτｐＧ９ＴｐＧ
ｐＴｐ工ＯＨ（Ａｔ）（２） ＨｏａｐＣｐＴｐＧｐＣ
ｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐ工０Ｈ（Ａ２
）（３） ＨＯＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐ
ＡｐＡｐＧｐＣｐＡｐＧＯＨ（Ａ３）（４） ＨＯＴｐ
ＧｐＧｐＣｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＴ
ｐＧＯＨ（Ａ４）（５） ＨＯＩｐＴｐＴｐＡｐＣｐ
ＡｐＴｐＡｐＩｐＧｐＧｐＧｐＴｐＣｐＣＯＨ（Ａ５＞
（６） ＨＯＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴ
ｐＧｐＣｐＴｐＴｐＣｐ丁ＯＲ（Ａ６）（７） ＨＯＡ
ｐＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＴｐ工ｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐ
ＡｐＴｐＡＯＨ（Ｂｌ）（８） ＨＯＣｐＴｐＴｐＴ
ｐＡｐＡｐｒｐＧｐＣＩ）ＡＩ）ＧｐＧｐＴｐＣｐＡＯ
Ｈ（Ｂ２）（９） ＨＯＩｐＴｐＣｐＡｐＧｐＡｐＴｐ
ＧｐＴｐＡｐＧｐＣｐＧｐＧｐＡＯＨ（Ｂ３）（１０）
ＨＯＡｐτｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐｌｐＡｐＩｐＴｐ
ＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（Ｂ４）（１１） ＨＯＡｐＴｐＣ
ｐＴＩ）Ｇｌ）ＡｐＡｌ）ＴｐＧｐＡｐＣｐＣｐＴｐＧ
ｐＣＯＨ（Ｂ５）（１２） ＨＯＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐ
ｌｐＴｐＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＴｐＡｐＣＯＨ（Ｂ
６）（１３） ＨＯＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐ
ＣｐＴｐＣｐＴｐＴｐＴｐＩｐＣＯＨ（Ｃ１）（１４）
８０工ｐＴｐＡｐＧｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＧｐＡｐＡｐＧＯＨ（Ｃ２）（１５） ＨＯＡｐＡｐＴ
ｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧｐＧｐＡｐＧＯ
Ｈ（Ｃ３）（１６） ＨＯＴｐＧｐＣｐＣｐＴｐＡｐＡ
ｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ（Ｃ４）（１７
） ＨＯＩｐＣｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＩｐＩｐＣ
ｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ（Ｃ５）（１８） ＨＯＣｐＴｐ
ＧｐＴｐＣｐＡｐＣｐＩｐＣｐＴｐＣｐＣｐ工ｐｃｐＴ
ｐＴＯＨ（Ｃ６）（１９） ＨＯＡｐＧｐＴｐＧｐｐＡ
ｐＣｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯＨ（Ｄｉ
）（２０） ＨＯＡｐＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＣ
ｐＣｐＡｐＡｐＡｐＴｐ’ｒＯＨ（Ｂ２）（２１） Ｈ
ＯＧｐＴｐＣｐｌｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐ
ＴｐＴＯＨ（Ｂ３）（２２） ＨＯＣｐＴｐＣｐＩｐＧ
ｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（Ｂ４
）（２３） ＨＯＡｐＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡ
ｐＴｐｒｐｒｐｃｐｃｏｕ （Ｂ５）（２４） ＨＯＡ
ｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐ
ＡｐＡＯＨ（Ｂ６）（２５） ＨＯＣｐＡｐＡｐＧｐＣ
ｐＴｐＩｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ（Ｅｌ
）（２６） ＨＯＣｐＴｐＩｐＴｐＡｐＡｐＧｐＧｐＡ
ｐＴｐＧｐＡｐＣｐＣｐＡＯＨ（Ｂ２）（２７） １（
ＯＧｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐ
ＧｐＡｐＧＯＨ（Ｂ３）（２８） ＨＯＣｐＣｐＴｐＴ
ｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＩｐＩｐＩｐＴｐＧｐＡＯＨ（
Ｂ４）（２９） ＨＯＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣ
ｐｌｐＧｐＧｐＴｐＣｐＡｐＴＯＨ（Ｂ５）（３０）
ＨＯ工ｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣｐＩ
ｐ”ｆｐＴｐＴＯＨ（Ｂ６）（３１） ＨＯＴｐＧｐＴ
ｐＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＣｐＡｐＴｐＣｐＡｐＡＯ
Ｈ（Ｆｌ）（３２） ＨＯＧＩ）ＧｐＡｐＡｐＧｐＡｐ
ＣｐＡｐＴｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧｐＴＯ）ｌ （Ｆ２）
（３３） ＨＯＣｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＣｐＡｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（Ｂ３）（３４） ＨＯＴ
ｐＧｐＴｐＣｐＴｐＴｐＣｐＣｐＩｐＴｐＧｐＡｐＴｐ
ＧｐＧＯＨ（Ｂ４）（３５） ＨＯＡｐＡｐＡｐＡｐＣ
ｐＴｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＩｐＴｐＣｐＡＯＨ（Ｂ５
）（３６） ＨＯＴｐＩｐＴｐＴｐＧｐ釦ＴｐＧｐＣｐ
ｒｐＡｐＴｐｒｐＧｐＡＯＨ（Ｂ８）（３７） ＨＯＣ
ｐＡｐＡｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐ
ＣｐＧＯＨ（Ｇｌ）（３８） ＨＯＴｐＧｐＡｐＴｐ
ＧｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ（Ｇ
２）（３９） ｕｏｃｐｃｐＴｐｃｐＡｐｃｐＴｐＡｐ
ＡｐＴｐＴｐＡｐＴｐＴｐＣＯＨ（Ｇ３）（４０） Ｈ
ＯＡｐＧｐＴｐＣｐＡｐＴｐＣｐＡｐＣｐＧｐＴｐＴｐ
ＴｐＣｐＴＯＨ（Ｇ４）（４１） ）ｌＯＴｐＡｐＧｐ
ＴｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡＯＨ
（Ｇ５）（４２） ＨＯＣｐＡｐＧｐＩｐＴｐＡｐＣｐ
ＣｐＧｐＡｐＡｐＴｐＡｐＡｐＴＯＨ（Ｇ６）（４３）
ＨＯＧｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣｐＩｐＧｐＡｐＣｐＴｐ
ＴｐＧｐＡｐＡＯＨ（１１）（４４） ＨＯＴｐＧｐＴ
ｐＣｐＣｐＡｐＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡｐＡｐＧｐＣＯ
Ｈ（Ｂ２）（４５） ｕｏＡｐＡｐＴｐＡｐｃｐＡｐｒ
ｐｃｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＡｐＴｐＣＯＨ（Ｂ３）（
４６） ＨＯＧｐｒｐＴｐＧｐＧｐＡｐＣｐＡｐＴｐＴ
ｐＣｐＡｐＡｐＧｐＴＯＨ（Ｈ４）（４７） ＨＯＣｐ
ＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＴｐｌｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐＧ
ｐＣＯＨ（）１５）（４８） １（ＯＣｐＡｐＡｐＧｐ
ＴｐＧｐＡｐＴｐＧｐＧｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡＯ）ｔ
（Ｉｔ）（４９） ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＣｐ
ＣｐＡｐＧｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴＯＨ（Ｉ２）（５０）
ＨＯＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＧｐＧｐＡｐＡｐ
ＧｐＣｐＧｐＡＯＨ（Ｂ３）（５１） ＨＯＧｐＧｐＣ
ｐＧｐＡｐＣｐＡｐＧｐＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＣｐＣＯ
Ｈ（Ｉ４）（５２） ＨＯＣｐＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴ
ｐＴｐＡｐＧｐＣｐＴｐＧｐＣｐＴＯＨ（Ｂ５）（５３
） ＨＯＣｐＴｐＡｐＣｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＧ
ｐＣｐＴｐＴｐＣＯＨ（Ｂ６）（５４） ｕｏＡｐＡｐ
ＡｐｃｐｃｐｒｐＡｐｃｐＴｐｃｐＡｐｃｐＡｐｒｐｃ
ｐｃｏｔｏ、ｎ）（５５） ＨＯＴｐＧｐＴｐＴｐＴ
ｐＣｐＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＣｐＧｐＡｐＡＯＨ（Ｉ２
）（５６） ＨＯＧｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＣｐＣｐＣ
ｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧＯＨ（Ｉ３）（５７） ＨＯ
ＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＣｐＴ
ｐＧｐＡＯＨ（Ｉ４）（５８） ＨＯＧｐＡｐＴｐＧｐ
ＣｐＴｐＣｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＴＯＨ（Ｉ
５）（５９） ＨＯＧｐＡｐ？ｐＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐ
ＣｐＩｐＧｐＧＯＨ（Ｉ６）（６０） ＨＯＴｐＧｐＴ
ｐＧｐＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（ＬＬ
）（６１） ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣ
ｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（１２）（６２） ＨＯＧｐＡｐ
ＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＴＯＨ（Ｂ３）叉１
ｊす オリゴヌクレオチド（Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ
，Ｉ、Ｊ、に、Ｌ、ＭおよびＮ）の合成： 下記オリゴヌクレオチドを実施例１と同様の方法で調製
した。
ｐＴｐ工ＯＨ（Ａｔ）（２） ＨｏａｐＣｐＴｐＧｐＣ
ｐＣｐＡｐＧｐＧｐＡｐＣｐＣｐＣｐＡｐ工０Ｈ（Ａ２
）（３） ＨＯＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐ
ＡｐＡｐＧｐＣｐＡｐＧＯＨ（Ａ３）（４） ＨＯＴｐ
ＧｐＧｐＣｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＴ
ｐＧＯＨ（Ａ４）（５） ＨＯＩｐＴｐＴｐＡｐＣｐ
ＡｐＴｐＡｐＩｐＧｐＧｐＧｐＴｐＣｐＣＯＨ（Ａ５＞
（６） ＨＯＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＴ
ｐＧｐＣｐＴｐＴｐＣｐ丁ＯＲ（Ａ６）（７） ＨＯＡ
ｐＡｐＡｐＡｐＣｐＣｐＴｐ工ｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐ
ＡｐＴｐＡＯＨ（Ｂｌ）（８） ＨＯＣｐＴｐＴｐＴ
ｐＡｐＡｐｒｐＧｐＣＩ）ＡＩ）ＧｐＧｐＴｐＣｐＡＯ
Ｈ（Ｂ２）（９） ＨＯＩｐＴｐＣｐＡｐＧｐＡｐＴｐ
ＧｐＴｐＡｐＧｐＣｐＧｐＧｐＡＯＨ（Ｂ３）（１０）
ＨＯＡｐτｐＴｐＡｐＡｐＡｐＧｐｌｐＡｐＩｐＴｐ
ＴｐＣｐＴｐＴＯＨ（Ｂ４）（１１） ＨＯＡｐＴｐＣ
ｐＴＩ）Ｇｌ）ＡｐＡｌ）ＴｐＧｐＡｐＣｐＣｐＴｐＧ
ｐＣＯＨ（Ｂ５）（１２） ＨＯＴｐＴｐＣｐＣｐＡｐ
ｌｐＴｐＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＴｐＡｐＣＯＨ（Ｂ
６）（１３） ＨＯＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐ
ＣｐＴｐＣｐＴｐＴｐＴｐＩｐＣＯＨ（Ｃ１）（１４）
８０工ｐＴｐＡｐＧｐＧｐＣｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＧｐＡｐＡｐＧＯＨ（Ｃ２）（１５） ＨＯＡｐＡｐＴ
ｐＴｐＧｐＧｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧｐＧｐＡｐＧＯ
Ｈ（Ｃ３）（１６） ＨＯＴｐＧｐＣｐＣｐＴｐＡｐＡ
ｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＧＯＨ（Ｃ４）（１７
） ＨＯＩｐＣｐＣｐＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＩｐＩｐＣ
ｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ（Ｃ５）（１８） ＨＯＣｐＴｐ
ＧｐＴｐＣｐＡｐＣｐＩｐＣｐＴｐＣｐＣｐ工ｐｃｐＴ
ｐＴＯＨ（Ｃ６）（１９） ＨＯＡｐＧｐＴｐＧｐｐＡ
ｐＣｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＴｐＡＯＨ（Ｄｉ
）（２０） ＨＯＡｐＴｐＧｐＣｐＡｐＧｐＡｐＧｐＣ
ｐＣｐＡｐＡｐＡｐＴｐ’ｒＯＨ（Ｂ２）（２１） Ｈ
ＯＧｐＴｐＣｐｌｐＣｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＡｐＣｐ
ＴｐＴＯＨ（Ｂ３）（２２） ＨＯＣｐＴｐＣｐＩｐＧ
ｐＣｐＡｐＴｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（Ｂ４
）（２３） ＨＯＡｐＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡ
ｐＴｐｒｐｒｐｃｐｃｏｕ （Ｂ５）（２４） ＨＯＡ
ｐＡｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＡｐ
ＡｐＡＯＨ（Ｂ６）（２５） ＨＯＣｐＡｐＡｐＧｐＣ
ｐＴｐＩｐＴｐＴｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ（Ｅｌ
）（２６） ＨＯＣｐＴｐＩｐＴｐＡｐＡｐＧｐＧｐＡ
ｐＴｐＧｐＡｐＣｐＣｐＡＯＨ（Ｂ２）（２７） １（
ＯＧｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐ
ＧｐＡｐＧＯＨ（Ｂ３）（２８） ＨＯＣｐＣｐＴｐＴ
ｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＩｐＩｐＩｐＴｐＧｐＡＯＨ（
Ｂ４）（２９） ＨＯＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐＣｐＴｐＣ
ｐｌｐＧｐＧｐＴｐＣｐＡｐＴＯＨ（Ｂ５）（３０）
ＨＯ工ｐＣｐＴｐＣｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣｐＩ
ｐ”ｆｐＴｐＴＯＨ（Ｂ６）（３１） ＨＯＴｐＧｐＴ
ｐＧｐＧｐＡｐＧｐＡｐＣｐＣｐＡｐＴｐＣｐＡｐＡＯ
Ｈ（Ｆｌ）（３２） ＨＯＧＩ）ＧｐＡｐＡｐＧｐＡｐ
ＣｐＡｐＴｐＧｐＡｐＡｐＴｐＧｐＴＯ）ｌ （Ｆ２）
（３３） ＨＯＣｐＡｐＡｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐ
ＣｐＡｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（Ｂ３）（３４） ＨＯＴ
ｐＧｐＴｐＣｐＴｐＴｐＣｐＣｐＩｐＴｐＧｐＡｐＴｐ
ＧｐＧＯＨ（Ｂ４）（３５） ＨＯＡｐＡｐＡｐＡｐＣ
ｐＴｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＩｐＴｐＣｐＡＯＨ（Ｂ５
）（３６） ＨＯＴｐＩｐＴｐＴｐＧｐ釦ＴｐＧｐＣｐ
ｒｐＡｐＴｐｒｐＧｐＡＯＨ（Ｂ８）（３７） ＨＯＣ
ｐＡｐＡｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＡｐ
ＣｐＧＯＨ（Ｇｌ）（３８） ＨＯＴｐＧｐＡｐＴｐ
ＧｐＡｐＣｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＡｐＡｐＡＯＨ（Ｇ
２）（３９） ｕｏｃｐｃｐＴｐｃｐＡｐｃｐＴｐＡｐ
ＡｐＴｐＴｐＡｐＴｐＴｐＣＯＨ（Ｇ３）（４０） Ｈ
ＯＡｐＧｐＴｐＣｐＡｐＴｐＣｐＡｐＣｐＧｐＴｐＴｐ
ＴｐＣｐＴＯＨ（Ｇ４）（４１） ）ｌＯＴｐＡｐＧｐ
ＴｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡＯＨ
（Ｇ５）（４２） ＨＯＣｐＡｐＧｐＩｐＴｐＡｐＣｐ
ＣｐＧｐＡｐＡｐＴｐＡｐＡｐＴＯＨ（Ｇ６）（４３）
ＨＯＧｐＧｐＴｐＡｐＡｐＣｐＩｐＧｐＡｐＣｐＴｐ
ＴｐＧｐＡｐＡＯＨ（１１）（４４） ＨＯＴｐＧｐＴ
ｐＣｐＣｐＡｐＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡｐＡｐＧｐＣＯ
Ｈ（Ｂ２）（４５） ｕｏＡｐＡｐＴｐＡｐｃｐＡｐｒ
ｐｃｐＡｐＡｐＣｐＴｐＣｐＡｐＴｐＣＯＨ（Ｂ３）（
４６） ＨＯＧｐｒｐＴｐＧｐＧｐＡｐＣｐＡｐＴｐＴ
ｐＣｐＡｐＡｐＧｐＴＯＨ（Ｈ４）（４７） ＨＯＣｐ
ＡｐＴｐＧｐＴｐＡｐＴｐｌｐＧｐＣｐＴｐＴｐＴｐＧ
ｐＣＯＨ（）１５）（４８） １（ＯＣｐＡｐＡｐＧｐ
ＴｐＧｐＡｐＴｐＧｐＧｐＣｐＴｐＧｐＡｐＡＯ）ｔ
（Ｉｔ）（４９） ＨＯＣｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＣｐ
ＣｐＡｐＧｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴＯＨ（Ｉ２）（５０）
ＨＯＡｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＧｐＧｐＡｐＡｐ
ＧｐＣｐＧｐＡＯＨ（Ｂ３）（５１） ＨＯＧｐＧｐＣ
ｐＧｐＡｐＣｐＡｐＧｐＴｐＴｐＣｐＡｐＧｐＣｐＣＯ
Ｈ（Ｉ４）（５２） ＨＯＣｐＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＴ
ｐＴｐＡｐＧｐＣｐＴｐＧｐＣｐＴＯＨ（Ｂ５）（５３
） ＨＯＣｐＴｐＡｐＣｐＧｐＴｐＴｐＴｐＴｐＣｐＧ
ｐＣｐＴｐＴｐＣＯＨ（Ｂ６）（５４） ｕｏＡｐＡｐ
ＡｐｃｐｃｐｒｐＡｐｃｐＴｐｃｐＡｐｃｐＡｐｒｐｃ
ｐｃｏｔｏ、ｎ）（５５） ＨＯＴｐＧｐＴｐＴｐＴ
ｐＣｐＡｐＡｐＧｐＧｐＴｐＣｐＧｐＡｐＡＯＨ（Ｉ２
）（５６） ＨＯＧｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＣｐＣｐＣ
ｐＡｐＧｐＴｐＡｐＡｐＧＯＨ（Ｉ３）（５７） ＨＯ
ＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＡｐＴｐＣｐＴ
ｐＧｐＡＯＨ（Ｉ４）（５８） ＨＯＧｐＡｐＴｐＧｐ
ＣｐＴｐＣｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐＣｐＣｐＴＯＨ（Ｉ
５）（５９） ＨＯＧｐＡｐ？ｐＣｐＣｐＴｐＴｐＡｐ
ＣｐＩｐＧｐＧＯＨ（Ｉ６）（６０） ＨＯＴｐＧｐＴ
ｐＧｐＴｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＡｐＧＯＨ（ＬＬ
）（６１） ＨＯＴｐＡｐＣｐＡｐＣｐＡｐＣｐＴｐＣ
ｐＴｐＴｐＴｐＴＯＨ（１２）（６２） ＨＯＧｐＡｐ
ＴｐＣｐＣｐＴｐＡｐＴｐＣｐＡｐＴＯＨ（Ｂ３）叉１
ｊす オリゴヌクレオチド（Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ
，Ｉ、Ｊ、に、Ｌ、ＭおよびＮ）の合成： 下記オリゴヌクレオチドを実施例１と同様の方法で調製
した。
（１） ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＧｐＡ
ｐＣｐＡＯＨ（Ａ）（２） ＨＯＣｐＧｐＴｐＴｐＡｐ
ＴｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡＯＨ（Ｂ
）＜３） ＨＯＴｐＣｐＡｐＴｐＡｐＡｐＣｐＧｐＧｐ
ＴｐｌｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｃ）＜４） ＨＯＧ
ｐＡｐＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐ
ＡｐＡｐＣＯＨ（Ｄ）（５） ＨＯＡｐＡｐＡｐＴｐＡ
ｐＴｐｌｐＣｐｌｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡＯＨ（
Ｅ）（６） ＨＯＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴ
ｐＣｐＡｐＩｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ（Ｆ）（７） ）ｌ
ＯＧｐＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐｒｐ
ＩｐＡｐＡｐＴＯＨ（Ｇ）（８） ＨＯＧｐＴｐＴｐＣ
ｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐＴｐＧＯ
Ｈ（Ｈ）（９） ＨＯＣｐＡｐＴｐＣｐＧｐＡｐＡｐＣ
ｐＴｐＡｐＧｐＴＰＴｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｉ）（１０）
ＨＯＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＣｐＴｐＡｐＧｐＴｐＩｐ
ＡｐＡｐＣｐＴｌ）ＡＯＨ（Ｊ）（１１） ＨＯＴｐＡ
ｐＧｐｌｐＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡｐＧｐ’ｒｐＴｐＣ
ｐＡｐＣＯＨ（Ｋ）（１２） １（ＯＣｐＴｐＴｐＴ
ｐＩｐＴｐＡｐＣｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＣｐＩｐＩＯ
ｌ（（Ｌ）（１３） ＨＯＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡ
ｐＧｐＧｐＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧＯＨ（Ｍ）（１４）
ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐｒｐＡｐＣｐＣＯ
Ｈ（Ｎ）Ｘ亙±１ オリゴヌクレオチド（ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ，ＳＤ、ＳＥ、
ＳＦ、ＳＧおよびＳＲ）の合成： 下記オリゴヌクレオチドを実施例１と同様の方法で調製
した。
ｐＣｐＡＯＨ（Ａ）（２） ＨＯＣｐＧｐＴｐＴｐＡｐ
ＴｐＧｐＡｐＴｐＧｐＴｐＣｐＧｐＧｐＣｐＡＯＨ（Ｂ
）＜３） ＨＯＴｐＣｐＡｐＴｐＡｐＡｐＣｐＧｐＧｐ
ＴｐｌｐＣｐＴｐＧｐＧｐＣＯＨ（Ｃ）＜４） ＨＯＧ
ｐＡｐＡｐＴｐＡｐＴｐＴｐＴｐＧｐＣｐＣｐＡｐＧｐ
ＡｐＡｐＣＯＨ（Ｄ）（５） ＨＯＡｐＡｐＡｐＴｐＡ
ｐＴｐｌｐＣｐｌｐＧｐＡｐＡｐＡｐＴｐＧｐＡＯＨ（
Ｅ）（６） ＨＯＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡｐＧｐＣｐＴ
ｐＣｐＡｐＩｐＴｐＴｐＣｐＡＯＨ（Ｆ）（７） ）ｌ
ＯＧｐＣｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐＣｐＡｐＡｐｒｐ
ＩｐＡｐＡｐＴＯＨ（Ｇ）（８） ＨＯＧｐＴｐＴｐＣ
ｐＧｐＡｐＴｐＧｐＡｐＴｐＴｐＡｐＡｐＴｐＴｐＧＯ
Ｈ（Ｈ）（９） ＨＯＣｐＡｐＴｐＣｐＧｐＡｐＡｐＣ
ｐＴｐＡｐＧｐＴＰＴｐＡｐＡｐＣＯＨ（Ｉ）（１０）
ＨＯＧｐＣｐＧｐＴｐＡｐＣｐＴｐＡｐＧｐＴｐＩｐ
ＡｐＡｐＣｐＴｌ）ＡＯＨ（Ｊ）（１１） ＨＯＴｐＡ
ｐＧｐｌｐＡｐＣｐＧｐＣｐＡｐＡｐＧｐ’ｒｐＴｐＣ
ｐＡｐＣＯＨ（Ｋ）（１２） １（ＯＣｐＴｐＴｐＴ
ｐＩｐＴｐＡｐＣｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＣｐＩｐＩＯ
ｌ（（Ｌ）（１３） ＨＯＧｐＴｐＡｐＡｐＡｐＡｐＡ
ｐＧｐＧｐＧｐＴｐＡｐＴｐＣｐＧＯＨ（Ｍ）（１４）
ＨＯＡｐＡｐＴｐＴｐＣｐＧｐＡｐｒｐＡｐＣｐＣＯ
Ｈ（Ｎ）Ｘ亙±１ オリゴヌクレオチド（ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ，ＳＤ、ＳＥ、
ＳＦ、ＳＧおよびＳＲ）の合成： 下記オリゴヌクレオチドを実施例１と同様の方法で調製
した。
（１） ＨＯＡｐＡｐＩｐＴｐＣｐＡｐＴｐＧｐＧｐＣ
ｐＴＱ）ｌ （ＳＡ）（２） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧ
ｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣｐＩｐＴｐＣｐＴＯＨ（
ＳＢ）（３） ＨＯＴｐＴｐｆｆｐＧｐＧｐＡｐＡｐＧ
ｐＡｐＣｐＴｐＴｐＴＯＨ（ＳＣ）（４） ＨＯＣｐＡ
ｐＣｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐｌｐ
ＡｐＧＯｔｌ （ＳＤ）（５） ＨＯＴｐＴｐＡｐＣｐ
ＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＩｌ
（ＳＥ）（６） ＨＯＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡ
ｐＡｐＧｐＴｐＴｐＣＯＨ（ＳＦ）（７） ）ｌＯＣｐ
ＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴ
ｐＴＯＨ（ＳＧ）（８） ＨｏｃｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴ
ｐＡｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡｏＨ（ＳＲ）Ｘ及■Ｉ ＩＦＮ遺伝子の調製： 化学合成オリゴヌクレオチドのライゲーション： 各オリゴヌクレオチド（Ａ ２−Ｌ ２ ） （０，４
ｎＭ）゛の一部を、５０ｍＭ工ｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ
７，６）、２０ｍＭ ＤＴＴ。
ｐＴＱ）ｌ （ＳＡ）（２） ＨＯＧｐＧｐＴｐＴｐＧ
ｐＴｐＡｐＡｐＧｐＡｐＡｐＣｐＩｐＴｐＣｐＴＯＨ（
ＳＢ）（３） ＨＯＴｐＴｐｆｆｐＧｐＧｐＡｐＡｐＧ
ｐＡｐＣｐＴｐＴｐＴＯＨ（ＳＣ）（４） ＨＯＣｐＡ
ｐＣｐＴｐＴｐＣｐＧｐＴｐＧｐＴｐＴｐＧｐＡｐｌｐ
ＡｐＧＯｔｌ （ＳＤ）（５） ＨＯＴｐＴｐＡｐＣｐ
ＡｐＡｐＣｐＣｐＡｐＧｐＣｐＣｐＡｐＴｐＧＯＩｌ
（ＳＥ）（６） ＨＯＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＡｐＧｐＡ
ｐＡｐＧｐＴｐＴｐＣＯＨ（ＳＦ）（７） ）ｌＯＣｐ
ＧｐＡｐＡｐＧｐＴｐＧｐＡｐＡｐＡｐＧｐＴｐＣｐＴ
ｐＴＯＨ（ＳＧ）（８） ＨｏｃｐＡｐＴｐＣｐＣｐＴ
ｐＡｐＴｐＣｐＡｐＡｐＣｐＡｏＨ（ＳＲ）Ｘ及■Ｉ ＩＦＮ遺伝子の調製： 化学合成オリゴヌクレオチドのライゲーション： 各オリゴヌクレオチド（Ａ ２−Ｌ ２ ） （０，４
ｎＭ）゛の一部を、５０ｍＭ工ｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ
７，６）、２０ｍＭ ＤＴＴ。
５０＜／ｍ１ｌＢｓＡ、１ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ
ＭｇＣ１ｚおよび２ ｍＭ ＡＩＦを含有する溶液４
〇−中でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ２．５単位を用
いて３７℃で３時間リン酸化した０反応終了後、反応混
合物中の酵素を１００℃で５分間インキュベートして不
活化した。
ＭｇＣ１ｚおよび２ ｍＭ ＡＩＦを含有する溶液４
〇−中でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ２．５単位を用
いて３７℃で３時間リン酸化した０反応終了後、反応混
合物中の酵素を１００℃で５分間インキュベートして不
活化した。
リン酸化されたオリゴヌクレオチドと２種のオリコヌク
レオチｈ（Ａｌおよび１，３）のライゲーションは第３
図に示すようにして行い、まず６断片ブロックを得、最
終的にはクローニング用のＩＦＮ Ｌ）Ｉ遺伝７− （
２３６ｂｐ ）を得る。ライゲーションはＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ（５単位）を用い、５０ｍＭ ＡｆｆＰ（１−
）含有溶液中にて１６℃で５時間行った。各段階におけ
るオリゴヌクレオチドのライゲーション生成物は、Ｔｒ
ｉｓ−ＥＤＴＡ＊ １１４’ｉ液中２−１６％グラジェ
ントＰＡＧＥで電気溶出後、臭化エチジウム染色により
同定した。
レオチｈ（Ａｌおよび１，３）のライゲーションは第３
図に示すようにして行い、まず６断片ブロックを得、最
終的にはクローニング用のＩＦＮ Ｌ）Ｉ遺伝７− （
２３６ｂｐ ）を得る。ライゲーションはＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ（５単位）を用い、５０ｍＭ ＡｆｆＰ（１−
）含有溶液中にて１６℃で５時間行った。各段階におけ
るオリゴヌクレオチドのライゲーション生成物は、Ｔｒ
ｉｓ−ＥＤＴＡ＊ １１４’ｉ液中２−１６％グラジェ
ントＰＡＧＥで電気溶出後、臭化エチジウム染色により
同定した。
寒ｍＭ６
ＩＦＮ ＬＨ遺伝子の分子クローニング：プラスミド
ｐＢＲ３２２をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンド
ヌクレアーゼで消化した０反応を、６５℃で５分間加熱
して終了させ、断片を０．５％アガロースゲル電気泳動
により分離した。 ｐＢＲ３２２由来の大きな断片を回
収し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで１２℃で１８時間ライゲ
ート許せ、２３６ｂｐのＩＦＮ ＬＨ遺伝子を得た。
ライゲーション混合物を用いてクッシュナー（Ｋｕｓｈ
ｎｅｒ ）法により、≧、９旦ＨＢＩＯＩを形質転換し
、アンピシリン耐性形質転換体をテトラサイクリン（２
５ｇ／ｉｌｌ ）含有プレート上で選択した。アンピシ
リンに耐性でテトラサイクリンに感受性を示すクローン
から分離したプラスミドＤＮＡを、ＥｃｏＲｌおよびＢ
ａｍＨＩで消化させ、適当なサイズマーカーと比較した
。予期した２３６ｂｐのＩＦＮ ＬＨ遺伝子断片が生じ
た。し、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ形質転換体から得たプラ
スミド（ｐＬＨ１０７）は、制限酵素分析により、ＩＦ
Ｎ ＬＨ遺伝子（２３６ｂｐ ）を有すると特徴づけら
れた。
ｐＢＲ３２２をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンド
ヌクレアーゼで消化した０反応を、６５℃で５分間加熱
して終了させ、断片を０．５％アガロースゲル電気泳動
により分離した。 ｐＢＲ３２２由来の大きな断片を回
収し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで１２℃で１８時間ライゲ
ート許せ、２３６ｂｐのＩＦＮ ＬＨ遺伝子を得た。
ライゲーション混合物を用いてクッシュナー（Ｋｕｓｈ
ｎｅｒ ）法により、≧、９旦ＨＢＩＯＩを形質転換し
、アンピシリン耐性形質転換体をテトラサイクリン（２
５ｇ／ｉｌｌ ）含有プレート上で選択した。アンピシ
リンに耐性でテトラサイクリンに感受性を示すクローン
から分離したプラスミドＤＮＡを、ＥｃｏＲｌおよびＢ
ａｍＨＩで消化させ、適当なサイズマーカーと比較した
。予期した２３６ｂｐのＩＦＮ ＬＨ遺伝子断片が生じ
た。し、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ形質転換体から得たプラ
スミド（ｐＬＨ１０７）は、制限酵素分析により、ＩＦ
Ｎ ＬＨ遺伝子（２３６ｂｐ ）を有すると特徴づけら
れた。
東厘堡１
ＩＦＮ ＲＨ遺伝子の調製：
各オリゴヌクレオチド（Ｄ３〜Ｊ５）（０，４ｍＭ）の
一部を実施例５に記載のようにリン酸化した。りン酸化
されたオリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドＪ６の
ライゲーションを第４図に示すようにして行い、まず断
片７ブロツクを得、最終的にＩＦＮ ＲＨ遺伝子（ｚ
７ｏｂｐ）を得た。 ＩＦＮＲＨ遺伝子は分取用ＰＡＧ
Ｅにより精製し、ＬＦＮ遺伝子のクローニングに使用し
た。
一部を実施例５に記載のようにリン酸化した。りン酸化
されたオリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドＪ６の
ライゲーションを第４図に示すようにして行い、まず断
片７ブロツクを得、最終的にＩＦＮ ＲＨ遺伝子（ｚ
７ｏｂｐ）を得た。 ＩＦＮＲＨ遺伝子は分取用ＰＡＧ
Ｅにより精製し、ＬＦＮ遺伝子のクローニングに使用し
た。
実施例８
ＩＦＮ遺伝子の分子クローニング：
実施例６で得たプラスミド（ｐＬＨ１０７）を１ｉｎｄ
ｌｌＦおよびＢａｍ１ｌＥで消化した。大きい方の断片
を分取用アガロースゲル電気泳動により回収し、読いて
実施例５に、￥Ｃ！戦のＩＦＮ ＲＨ遺伝子（２７０
ｂｐ）と、工４ ＤＮＡリガーゼの存在下にライゲート
した。このライゲーション混合物を用い≧、ｃｏｌｉ
ＨＢＩＯＩを形質転換した。この形質転換体から得たプ
ラスミド（ｐＦ−３）は、ＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩ消
化により、ＩＦＮ遺伝子（４５０ｂｐ）を有すると特徴
づけられた。
ｌｌＦおよびＢａｍ１ｌＥで消化した。大きい方の断片
を分取用アガロースゲル電気泳動により回収し、読いて
実施例５に、￥Ｃ！戦のＩＦＮ ＲＨ遺伝子（２７０
ｂｐ）と、工４ ＤＮＡリガーゼの存在下にライゲート
した。このライゲーション混合物を用い≧、ｃｏｌｉ
ＨＢＩＯＩを形質転換した。この形質転換体から得たプ
ラスミド（ｐＦ−３）は、ＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩ消
化により、ＩＦＮ遺伝子（４５０ｂｐ）を有すると特徴
づけられた。
実施例９
トリプトファンプロモーターπ遺伝子の構築ニブロック
Ｉ’ 、ＩＩ’ 、１［’ 、および■′のそれぞれの
オリゴヌクレオチド（Ｂ−５Ｇ）をＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼでリン酸化し、前述のようにＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼでライゲートした。このブロック（Ｉ’ −■’
）と未リン酸化オリゴヌクレオチド（ＡおよびＳＲ）を
順次縮合させた。最後のライゲーション生成物を分取用
７．５％ＰＡＧＥにより精製し、１６３ｂｐからなるｔ
ｒｐプロモーター■遺伝子を得た。
Ｉ’ 、ＩＩ’ 、１［’ 、および■′のそれぞれの
オリゴヌクレオチド（Ｂ−５Ｇ）をＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼでリン酸化し、前述のようにＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼでライゲートした。このブロック（Ｉ’ −■’
）と未リン酸化オリゴヌクレオチド（ＡおよびＳＲ）を
順次縮合させた。最後のライゲーション生成物を分取用
７．５％ＰＡＧＥにより精製し、１６３ｂｐからなるｔ
ｒｐプロモーター■遺伝子を得た。
実施例１０
ｔｒｐプロモーター■遺伝子のクローニング：実施例９
で構築したｔｒｐプロモーターｎ遺伝子をｐＢＲ３２２
のＥｃｏＲＩ −Ｂａｍ）ＩＩ断岸とライゲートし、次
いでこのライゲーション生成物を用いＥ、ｃｏｌｉ Ｈ
Ｂｌｏｌを形質転換した。 ＲＡｍｐ５Ｔｅｔ形質転換
体から得たプラスミドを）ＩｐａＩで消化してバンド（
４，１ｋｂｐ ）を確認し、続いてＢａｍＨＩで消化し
、ＰＡＧＥで９０ｂｐのバンドを確認した。、きらに、
ＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩ消化による５６ｂｐの断片は
ＰＡＧＥでサイズマーカーと比較することにより確認し
た。このプラスミドをｐＴｒｐＥＢ７と名付け、発現ベ
クターの構築に使用した。
で構築したｔｒｐプロモーターｎ遺伝子をｐＢＲ３２２
のＥｃｏＲＩ −Ｂａｍ）ＩＩ断岸とライゲートし、次
いでこのライゲーション生成物を用いＥ、ｃｏｌｉ Ｈ
Ｂｌｏｌを形質転換した。 ＲＡｍｐ５Ｔｅｔ形質転換
体から得たプラスミドを）ＩｐａＩで消化してバンド（
４，１ｋｂｐ ）を確認し、続いてＢａｍＨＩで消化し
、ＰＡＧＥで９０ｂｐのバンドを確認した。、きらに、
ＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩ消化による５６ｂｐの断片は
ＰＡＧＥでサイズマーカーと比較することにより確認し
た。このプラスミドをｐＴｒｐＥＢ７と名付け、発現ベ
クターの構築に使用した。
罠直輿Ｕ
ＩＦＮ ＬＨ発現ベクター（ｐｙｔ、ｒｐ）の構築：
実施例１０で調製したｔｒｐプロモーター■ベクタ（ｐ
ＴｒｐＥＢ７ ）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化
し、分取用アガロースゲル電気泳動により大きな断片（
４，１ｋｂｐ ）を得た。この断片を、ＥｃｏＲＩ −
ＢａｍＨ１消化によりプラスミドｐＬＨ１０７から調製
したＩＦＮ遺伝子とライゲートした。このライゲーショ
ン混合物を用いＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩを形質転換し
て、アンピシリン耐性でテトラサイクリン感受性の形質
転換体を得た。この形質転換体から得たプラスミド（ｐ
ｙｔ−ｒｐ）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、
７．５％ＰＡＧＥでＩＦＮ遺伝子（２３６ｂｐ ）を確
認した。プラスミドり７ｔｒｐ含有Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢ
ｌｏｌはＥ、ｃｏｌｉ Ｆ−９と名付けた。旦輩月ユＦ
−９は１９８４年９月２０日に受託番号、微工研菌寄第
７８６３号として工業技術院微生物工業研究所に寄託さ
れた後、１９８５年９月１４日に同所においてブタペス
ト条約に基づく寄託に移管きれ、現在の受託番号は微工
研条寄第９０５号である。
実施例１０で調製したｔｒｐプロモーター■ベクタ（ｐ
ＴｒｐＥＢ７ ）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化
し、分取用アガロースゲル電気泳動により大きな断片（
４，１ｋｂｐ ）を得た。この断片を、ＥｃｏＲＩ −
ＢａｍＨ１消化によりプラスミドｐＬＨ１０７から調製
したＩＦＮ遺伝子とライゲートした。このライゲーショ
ン混合物を用いＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩを形質転換し
て、アンピシリン耐性でテトラサイクリン感受性の形質
転換体を得た。この形質転換体から得たプラスミド（ｐ
ｙｔ−ｒｐ）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、
７．５％ＰＡＧＥでＩＦＮ遺伝子（２３６ｂｐ ）を確
認した。プラスミドり７ｔｒｐ含有Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢ
ｌｏｌはＥ、ｃｏｌｉ Ｆ−９と名付けた。旦輩月ユＦ
−９は１９８４年９月２０日に受託番号、微工研菌寄第
７８６３号として工業技術院微生物工業研究所に寄託さ
れた後、１９８５年９月１４日に同所においてブタペス
ト条約に基づく寄託に移管きれ、現在の受託番号は微工
研条寄第９０５号である。
火凰五旦
Ｅ、ｃｏｌｉ Ｆ−９（プラスミドｐｙｔｒｐ含有Ｅ、
ｃｏｌｉＨＢＩＯＩ）をアンピシリン５０ｘ／ｌｌ１
ｌｌ含有Ｌブロス中で一晩培養し、０．２％グルフース
、０．５％カサミノｒＪ１．（ｒＪ１加水加水分解イセ
インヒタミンＢ１５０に／ｒａＱおよびアンピシリン２
５ ｓｒ ／ ｍＱを含有するＭ９培地に１＝２０の割
合で植種し、３７°Ｃで培養した。
ｃｏｌｉＨＢＩＯＩ）をアンピシリン５０ｘ／ｌｌ１
ｌｌ含有Ｌブロス中で一晩培養し、０．２％グルフース
、０．５％カサミノｒＪ１．（ｒＪ１加水加水分解イセ
インヒタミンＢ１５０に／ｒａＱおよびアンピシリン２
５ ｓｒ ／ ｍＱを含有するＭ９培地に１＝２０の割
合で植種し、３７°Ｃで培養した。
次にβ−インドールアクリル酸を加え、最終濃度１０＜
／ｍｕとした。この時のＡ６００は０．５であった。
／ｍｕとした。この時のＡ６００は０．５であった。
さらに菌体を２時間培養し、遠心分ｔｉｌｔ （５ｋｒ
ｐｍ、４℃、５分間）により集めた。
ｐｍ、４℃、５分間）により集めた。
Ｋ１園長
ＩＦＮ発現ベクター（ｐｙｔｒｐ）の構築：実施例１０
で調製したｔｒｐプロモーターベクター（ｐＴｒｐＥＢ
７ ）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、分取用
アガロースゲル電気泳動により大きな断片（４，１ｋｂ
ｐ ）を得た。この断片を、ＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩ
消化によりプラスミドｐＦ−３から調製したＩＦＮ遺伝
子とライゲートした。このライゲーション混合物を用い
、常法（クシュナー法）により≧、銘見ＨＢＬＯＬを形
質転換した。この形質転換体から得たプラスミド（ｐｙ
ｔｒｐ）は以下の制限酵素分析により特徴づけられた；
Ｐｓ仁Ｉ −）１ｐａＩ （８２５ｂｐ ）、ＰｓｔＩ
−ＥｃｏＲＩ （８５９ｂｐ ）、ＨｐａＩ −Ｂａ
ｍＨＩ （４８４ｂｐ ） １． ＨｐａＩ −Ｈｌｎ
ｄｌｌ［（２１４ｂｐ）、ＥｃｏＲＩ −）ｆｉｎｄ
ｍ （１８０ｂｐ ）、ＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩ （
４５０ｂｐ ）、およびＨｉｎｄＩ［−Ｂａｍ）ＩＩ（
２７０ｂｐ） 実施例１４ ＩＦＮ遺伝子の配列決定はＦ、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ
）により開発されたＭ１３ジデオキシ法を用いて行っ
た。Ｍ１３ベクター（Ｍ Ｌ３ｍｐ８ＲＴ ）をＥｃｏ
ＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した。断片（７，２ｋｂｐ
）をセファクリルｓ ｔｏｏｏゲル濾過により回収し
、次いでＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩ消化によりプラスミ
ドｐｙｔ−ｒｐから得たＩＦＮ遺伝子（４５０ｂｐ ）
と、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下にライゲートした。
で調製したｔｒｐプロモーターベクター（ｐＴｒｐＥＢ
７ ）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、分取用
アガロースゲル電気泳動により大きな断片（４，１ｋｂ
ｐ ）を得た。この断片を、ＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩ
消化によりプラスミドｐＦ−３から調製したＩＦＮ遺伝
子とライゲートした。このライゲーション混合物を用い
、常法（クシュナー法）により≧、銘見ＨＢＬＯＬを形
質転換した。この形質転換体から得たプラスミド（ｐｙ
ｔｒｐ）は以下の制限酵素分析により特徴づけられた；
Ｐｓ仁Ｉ −）１ｐａＩ （８２５ｂｐ ）、ＰｓｔＩ
−ＥｃｏＲＩ （８５９ｂｐ ）、ＨｐａＩ −Ｂａ
ｍＨＩ （４８４ｂｐ ） １． ＨｐａＩ −Ｈｌｎ
ｄｌｌ［（２１４ｂｐ）、ＥｃｏＲＩ −）ｆｉｎｄ
ｍ （１８０ｂｐ ）、ＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩ （
４５０ｂｐ ）、およびＨｉｎｄＩ［−Ｂａｍ）ＩＩ（
２７０ｂｐ） 実施例１４ ＩＦＮ遺伝子の配列決定はＦ、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ
）により開発されたＭ１３ジデオキシ法を用いて行っ
た。Ｍ１３ベクター（Ｍ Ｌ３ｍｐ８ＲＴ ）をＥｃｏ
ＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した。断片（７，２ｋｂｐ
）をセファクリルｓ ｔｏｏｏゲル濾過により回収し
、次いでＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩ消化によりプラスミ
ドｐｙｔ−ｒｐから得たＩＦＮ遺伝子（４５０ｂｐ ）
と、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下にライゲートした。
このライゲーション混合物を、常法により調製したＥ、
ｃｏｌｉ ＪＭ１０３のフンピーテント細胞に加え、４
℃で１時間放置した。熱ショック（４２℃で９０秒間）
を与えた後、この混合物に、２％Ｘｇａｌ （４０４）
およびＬＯＯｍＭ ＩＰＴＧ（４ＯＮ ）を含有するイ
ンキュベーション緩衝液（０，２ｆｆｌＥ１）を加えた
。トップ寒天を加えた後、混合物を寒天平板上に広げ、
３７°Ｃで一晩培養した。生じた単一の白色プラークを
インキュベーション緩衝液（１１１１１１）中で３７°
Ｃで一晩培養した。菌体を遠心分離し、上清にＰＥＧ６
０００およびＮａＣ１を加えてファージ粒子を沈殿させ
た。沈殿物を遠心分離により集め、ＴＥ溶液（１５０１
ｄ ）に懸濁し、次いでフェノールで抽出し、エタノー
ルで沈殿させた。祖一本５Ｊ４ ＤＮＡ （５ｓＤＮＡ
）から、Ｍ１３ｍｐ８の５ｓＤＮＡを分取用アガロー
スゲル電気泳動により取出した。この５ｓＤＮＡの濃度
は５００ｎｇ／ Ｈに調整した。５ｓＤＮＡはＭ１３ジ
デオキシ法のマニュアルに従って分析した。
ｃｏｌｉ ＪＭ１０３のフンピーテント細胞に加え、４
℃で１時間放置した。熱ショック（４２℃で９０秒間）
を与えた後、この混合物に、２％Ｘｇａｌ （４０４）
およびＬＯＯｍＭ ＩＰＴＧ（４ＯＮ ）を含有するイ
ンキュベーション緩衝液（０，２ｆｆｌＥ１）を加えた
。トップ寒天を加えた後、混合物を寒天平板上に広げ、
３７°Ｃで一晩培養した。生じた単一の白色プラークを
インキュベーション緩衝液（１１１１１１）中で３７°
Ｃで一晩培養した。菌体を遠心分離し、上清にＰＥＧ６
０００およびＮａＣ１を加えてファージ粒子を沈殿させ
た。沈殿物を遠心分離により集め、ＴＥ溶液（１５０１
ｄ ）に懸濁し、次いでフェノールで抽出し、エタノー
ルで沈殿させた。祖一本５Ｊ４ ＤＮＡ （５ｓＤＮＡ
）から、Ｍ１３ｍｐ８の５ｓＤＮＡを分取用アガロー
スゲル電気泳動により取出した。この５ｓＤＮＡの濃度
は５００ｎｇ／ Ｈに調整した。５ｓＤＮＡはＭ１３ジ
デオキシ法のマニュアルに従って分析した。
配列決定の結果は設計きれたＩＦＮ遺伝子と一致した。
衷履五長
Ｅ、ｃｏｌｉにおけるＩＦＮ遺伝子の発現および特徴ニ
ブラスミドｐｙｔｒｐ含有Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩを
、アンピシリン５０ｘ／ｍｕ含有Ｌブロス中で一晩培養
し、０．２％グルフース、０．５％カザミノ酸、チアミ
ン５０（／賊およびアンピシリン２５＜／ｍεを含有す
るＭ９培地に１＝２０の割合で植種し、３７°Ｃで培養
した。β−インドールアクリル酸を加え、最終濃度１０
に／ＩＩＩＱとした。この時の八６００は０．５であっ
た。
ブラスミドｐｙｔｒｐ含有Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩを
、アンピシリン５０ｘ／ｍｕ含有Ｌブロス中で一晩培養
し、０．２％グルフース、０．５％カザミノ酸、チアミ
ン５０（／賊およびアンピシリン２５＜／ｍεを含有す
るＭ９培地に１＝２０の割合で植種し、３７°Ｃで培養
した。β−インドールアクリル酸を加え、最終濃度１０
に／ＩＩＩＱとした。この時の八６００は０．５であっ
た。
次に菌体を３時間培養し、遠心分離（８ｒｐｍ、４℃、
１０分間）により集めた。菌体を１０ｍＭ ＰＢＳ −
ＥＤＴＡに！！ＡＬ、、０℃で超音波処理により破壊し
た懸濁混合物を遠心分離し、上清を、ＩＦＮ（１，３Ｘ
１０６１Ｕ／ｍＱ＠ｅ物）の活性を検出するため抗ウィ
ルス活性のアッセイにより検討した。また、ＩＦＮのバ
ンドを５ＤＳ−ＰＡＧＥで約１７．１ ｋダルトンの位
置に検出した。得られたＩＦＮの活性（４゜２Ｘ １０
５ＩＵ／戒）は、Ｉ Ｎ ＨＣＩでｐＨ２，０に調整す
ると４２ＩＵ／賊まで減少した。上記がＩＦＮ産生の特
徴であった。
１０分間）により集めた。菌体を１０ｍＭ ＰＢＳ −
ＥＤＴＡに！！ＡＬ、、０℃で超音波処理により破壊し
た懸濁混合物を遠心分離し、上清を、ＩＦＮ（１，３Ｘ
１０６１Ｕ／ｍＱ＠ｅ物）の活性を検出するため抗ウィ
ルス活性のアッセイにより検討した。また、ＩＦＮのバ
ンドを５ＤＳ−ＰＡＧＥで約１７．１ ｋダルトンの位
置に検出した。得られたＩＦＮの活性（４゜２Ｘ １０
５ＩＵ／戒）は、Ｉ Ｎ ＨＣＩでｐＨ２，０に調整す
ると４２ＩＵ／賊まで減少した。上記がＩＦＮ産生の特
徴であった。
実施例１６
ＩＦＮのバイオアッセイ：
５％ＦＢＳ含有イーグルＭＥＭ中ＦＬ細胞（４Ｘ１０５
個／ｍＱ ）を０．１１１１１１ずつ９６ウエルマイク
ロプレートに加えた。菌体を５％Ｃ０２インキユベータ
ー中において３７℃で３時間インキュベートし、次いで
インキュベーション緩衡液を２％ＦＢＳ含有イーグルＭ
ＥＭに変更した。菌体にＩＦＮ含有希釈液を加え、５％
ＣＯｚインキュベーター中において３７℃で一晩インキ
ユヘートした。 ＩＦＮ溶液除去後、インキュベーショ
ン緩衝液をイーグルＨＥＭに変え、続いて０，０５％Ｂ
ＳＡ含有イーグルＭＥＭで希釈したシンドビス（５ｉｎ
ｄｖｉｓ ）ウィルス（１０６ｆｆｕ／ ｍＱ、Ｑ、１
ｍｕ）を加えた。３％ＣＯ２インキュベーター中におい
て３７℃で２４時間インキュベートした後、菌体類１０
％ホルマリンで固定し、０．１％クリスタルバイオレッ
ト溶液で着色した。
個／ｍＱ ）を０．１１１１１１ずつ９６ウエルマイク
ロプレートに加えた。菌体を５％Ｃ０２インキユベータ
ー中において３７℃で３時間インキュベートし、次いで
インキュベーション緩衡液を２％ＦＢＳ含有イーグルＭ
ＥＭに変更した。菌体にＩＦＮ含有希釈液を加え、５％
ＣＯｚインキュベーター中において３７℃で一晩インキ
ユヘートした。 ＩＦＮ溶液除去後、インキュベーショ
ン緩衝液をイーグルＨＥＭに変え、続いて０，０５％Ｂ
ＳＡ含有イーグルＭＥＭで希釈したシンドビス（５ｉｎ
ｄｖｉｓ ）ウィルス（１０６ｆｆｕ／ ｍＱ、Ｑ、１
ｍｕ）を加えた。３％ＣＯ２インキュベーター中におい
て３７℃で２４時間インキュベートした後、菌体類１０
％ホルマリンで固定し、０．１％クリスタルバイオレッ
ト溶液で着色した。
ＩＦＮの活性（ＩＵ／ｍＱ ）は、ＮＩＨ国際標品（Ｌ
ｅｕＨｕ ＩＦＮｆｆ、Ｇ ０２３−９０１−５２７
）に基づく実測値（Ｕ／−）から決定した。
ｅｕＨｕ ＩＦＮｆｆ、Ｇ ０２３−９０１−５２７
）に基づく実測値（Ｕ／−）から決定した。
第１図はＩＦＮ ＬＨ遺伝子の構築の工程を、第２図は
ＩＦＮ ＲＨ遺伝子の構築の工程を、第３図はＩＦＮ遺
伝子のクローニングの工程を、第４図はｔｒｐプロモー
ター■遺伝子の構築の工程を、第５図はｔｒｐプロモー
ター■遺伝子のクローニングの工程を、第６図は組換え
プラスミドｐｙｔｒｐの構築の工程をそれぞれ示す。 １４ ５ ｒ２ ｔｒｐアロモーターＩＩ ｌ伝壬０
りＤ−ニフグρＴｒｐヒｂｌ 第 ６ 図 朝ｊ炎えアラスミドｐＴｔｒｐの構やＦ
Ｎ
ＩＦＮ ＲＨ遺伝子の構築の工程を、第３図はＩＦＮ遺
伝子のクローニングの工程を、第４図はｔｒｐプロモー
ター■遺伝子の構築の工程を、第５図はｔｒｐプロモー
ター■遺伝子のクローニングの工程を、第６図は組換え
プラスミドｐｙｔｒｐの構築の工程をそれぞれ示す。 １４ ５ ｒ２ ｔｒｐアロモーターＩＩ ｌ伝壬０
りＤ−ニフグρＴｒｐヒｂｌ 第 ６ 図 朝ｊ炎えアラスミドｐＴｔｒｐの構やＦ
Ｎ
Claims (5)
- （１）下記の配列を特徴とするγ−インターフェロン（
以下ＩＦＮと称する）をコードする遺伝子またはそのサ
ブユニット： 【遺伝子配列があります】 - （２）下記の配列の７３個のアミノ酸からなるＩＦＮ
ＬＨの発現をコードする遺伝子 【遺伝子配列があります】 と下記の配列の８７個のアミノ酸からなるＩＦＮ ＲＨ
の発現をコードする遺伝子 【遺伝子配列があります】 を連結することを特徴とするＩＦＮをコードする遺伝子
の製造法。 - （３）プロモーター遺伝子およびＩＦＮをコードする遺
伝子を含有する発現ベクター。 - （４）プロモーター遺伝子およびＩＦＮをコードする遺
伝子を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換
体。 - （５）プロモーター遺伝子およびＩＦＮをコードする遺
伝子を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換
体を培地に培養し、得られる培養液からＩＦＮを採取す
ることを特徴とするＩＦＮの製造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB08424198A GB2164650A (en) | 1984-09-25 | 1984-09-25 | Process for production of y-interferon |
| GB8424198 | 1984-09-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6192574A true JPS6192574A (ja) | 1986-05-10 |
Family
ID=10567223
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60211654A Pending JPS6192574A (ja) | 1984-09-25 | 1985-09-25 | γ‐インターフエロンの製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0176916A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6192574A (ja) |
| GB (1) | GB2164650A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6624804B2 (en) | 1998-04-06 | 2003-09-23 | Ethertouch Limited Of Brumby House | Positioning a cursor on the display screen of a computer |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3751468T2 (de) * | 1986-10-30 | 1996-02-29 | Daicel Chem | Verfahren zur herstellung von oligonukleotiden und verbindungen zur bildung hochmolekularer schutzgruppen. |
| US7049102B1 (en) | 1989-09-22 | 2006-05-23 | Board Of Trustees Of Leland Stanford University | Multi-gene expression profile |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU561343B2 (en) * | 1981-10-19 | 1987-05-07 | Genentech Inc. | Human immune interferon by recombinant dna |
| EP0088540A3 (en) * | 1982-02-22 | 1984-10-17 | Biogen, Inc. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human immune interferon-like polypeptides |
| IL68100A0 (en) * | 1982-03-24 | 1983-06-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Novel dna and use thereof |
| US6936694B1 (en) * | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
| JPH0787797B2 (ja) * | 1982-05-20 | 1995-09-27 | サントリー株式会社 | ヒト・ガンマ・インタ−フエロン様ポリペプチドの製造法 |
| IL69851A0 (en) * | 1982-09-30 | 1983-12-30 | Japan Found Cancer | Novel dna and recombinant plasmid containing the same |
| WO1984002129A1 (en) * | 1982-11-22 | 1984-06-07 | Takeda Chemical Industries Ltd | Human immune interferon protein and process for its preparation |
| JPS59169494A (ja) * | 1983-03-17 | 1984-09-25 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規組み換えｄｎａおよびその用途 |
| ZA846554B (en) * | 1983-09-20 | 1985-04-24 | Hoffmann La Roche | Immune interferon and method for its purification |
| JPH0788398B2 (ja) * | 1983-10-17 | 1995-09-27 | サントリー株式会社 | 新規生理活性ポリペプチドおよびその製造法 |
-
1984
- 1984-09-25 GB GB08424198A patent/GB2164650A/en not_active Withdrawn
-
1985
- 1985-09-24 EP EP85112054A patent/EP0176916A3/en not_active Withdrawn
- 1985-09-25 JP JP60211654A patent/JPS6192574A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6624804B2 (en) | 1998-04-06 | 2003-09-23 | Ethertouch Limited Of Brumby House | Positioning a cursor on the display screen of a computer |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB8424198D0 (en) | 1984-10-31 |
| GB2164650A (en) | 1986-03-26 |
| EP0176916A3 (en) | 1987-04-08 |
| EP0176916A2 (en) | 1986-04-09 |
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