JPS63294788A - ベクタ−、遺伝子の検出方法及び蛋白質の発現方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はベクター、遺伝子の検出方法及び蛋白質の発現
方法に関する。

ここでいう蛋白質とは、アミノ酸を複数個含むポリペプ
チドを指すものである。

［従来の技術］ 遺伝子工学的手法による蛋白質の発現や、蛋白工学等の
バイオテクノロジー利用技術の開発が盛んに行なわれる
ようになってきた今日、より優れた技術開発が大いに期
待されている０以上の蛋白工学の中でも、蛋白質（酵素
）の改良や解析は重要な役割を有しており、今後益々の
発展が期待されている。

従来、外来遺伝子のクローニングおよび蛋白質の発現用
として、大腸菌を宿主とするｐＵＣベクターが市販され
ている。このｐＵＣベクターは第２図に示すように、複
製開始信号（Ｏｒｉ）　、アンピシリン耐性遺伝子、ラ
クトースプロモーター、オペレーター、β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子（ｌ　ａｃＺ′）およびマルチクローニン
グサイトより構成されている。このｐＵＣベクターは、
ジデオキシ法によるＤＮＡシークエンシングに適したプ
ラスミドベクターであり、ｎ　ａｃＺ　’領域内にマル
チクローニングサイトを持っており、イソプロピルβ−
チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）と５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−ガラクトサイド（Ｘ−ｇ
ａｆＬ）を含むプレート上で、外来ＤＮＡ（目的とする
ＤＮＡ）の挿入の有無を容易に色の変化（青→白）によ
って判別することかできるものである。また、ラクトー
スプロモーターを利用して外来遺伝子を発現することも
できるものである。

［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら、ｐＵＣベクターのうち、ｐＵＣ８−１，
８−２，９−１，９−２によって外来遺伝子を発現させ
た場合には、ＤＮＡ塩基配列のパリンドローム（回文）
が長くなり、２次構造を形成することとなり、ジデオキ
シ法ＤＮＡシーケンシング時に正確に読み難くなるほか
、発現効率が低下するという問題があった。

［問題点を解決するための手段］ 本発明は上記従来における問題点を解決した。

新規なベクターとそれを用いた遺伝子の検出方法を提供
することを目的とする。そして、その目的は１本発明に
よれば、複製開始信号、アンピシリン耐性遺伝子、ラク
トースプロモーター、オペレーター、β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子及び制限酵素器ｎｄｍ　、ＰｓｔＩ　、　Ｓ
＠ｌ　Ｉ　、Ａｃｃｌ、ＨｉｎｃＩＩ　、Ｂａｇ旧、５
ｌｌａＩ　、ＥｃｏＲＩの各切断部位を持つマルチクロ
ーニングサイトを有してなるベクター（第１発明）、複
製開始信号、アンピシリン耐性遺伝子、ラクトースプロ
モーター、オペレーター、β−ガラクトシダーゼ遺伝子
及び制限酵素器ｎｄｍ　、ＰｓｔＩ　、　５ａｆＬ　Ｉ
、Ａｃｃｌ、ＨｉｎｃＩＩ　、Ｂａｇ旧、ＳｍａＩ　、
ＥｃｏＲＩの各切断部位を持つマルチクローニングサイ
トを有してなるベクター３種類からなるベクターシリー
ズであって、該ベクターシリーズは前記切断部位のアミ
ノ酸に対応するフレームを３種類すべて有するものであ
るベクターシリーズ（第２発明）、複製開始信号、アン
ピシリン耐性遺伝子、ラクトースプロモーター、オペレ
ーター、β−ガラクトシダーゼ遺伝子及び制限酵素器ｎ
ｄｍ　、ＰｓｔＩ　、　Ｓａｌ　Ｉ　、Ａｃｃｌ、旧ｎ
ｃＩＩ、Ｒａｍ旧、３ｍａＩ　、ＥｃｏＲＩの各切断部
位を持つマルチクローニングサイトを有してなるベクタ
ー３種類からなるベクターシリーズであって、該ベクタ
ーシリーズは前記切断部位のアミノ酸に対応するフレー
ムを３種類すべて有するものであるベクターシリーズの
中から所望のベクターを選択し、そのベクターおよび蛋
白質をコードしている遺伝子を所定の制限酵素にて切り
出した後両者を結合することにより、色の変化を判別し
て蛋白質をコードしている遺伝子を検出することを特徴
とする特許遺伝子の検出方法（第３発明）、および複製
開始信号、アンピシリン耐性遺伝子、ラクトースプロモ
ーター、オペレーター、β−ガラクトシダーゼ遺伝子及
び制限酵素器ｎｄｍ　、ＰｓｔＩ　、　５ａｉＩ　、Ａ
ｃｃｌ。

ＨｉｎｃＨ、Ｂａｇ旧、ＳｍａＩ　、ＥｃｏＲＩの各切
断部位を持つマルチクローニングサイトを有してなるベ
クター３種類からなるベクターシリーズてあって、該ベ
クターシリーズは前記切断部位のアミノ酸に対応するフ
レームを３種類すべて有するものであるベクターシリー
ズの中から蛋白質をコードしている遺伝子の５′末端の
フレームの合うベクターを選択し、所定の制限酵素にて
切り出した後両者を結合し、大腸菌に導入し、蛋白質を
発現することを特徴とする特定蛋白質の発現方法（第４
発明）、により達成することができる。

本発明のベクターの特徴は、クローニングサイトとして
制限酵素器ｎｄＩＩＩ　、ＰｓｔＩ　、　Ｓａ、ｉ　Ｉ
　、Ａｃｃｌ。

ＨｉｎｃＩＩ　、Ｂａｇ旧、５ｓａＩ　、ＥｃｏＲＩの
各切断部位の塩基配列を有していることである。

このベクターの一例は、第１図に示す如く、複りトース
プロモーター、オペレーター、β−ガラクトシダーゼ遺
伝子（ｉａｃＺ’）及びクローニングサイトとしての制
限酵素器ｎｄｍ　＊　Ｐｓ　ｔ　Ｉ　＋　Ｓａ　ｌ　Ｉ
、Ａｃｃｌ、ＨｉｎｃＩＩ　、Ｒａｍ旧、ＳｍａＩ　、
ＥｃｏＲｒの各切断部位の塩基配列から構成されている
ものである。

本発明のベクター（下記の如く、ｐＵｃ８１゜８２およ
びｐＵｃ９１．９２）は、従来公知のｐＵｃ８／ｐＵＣ
９ベクター（宝酒造■販売）のマルチクローニングサイ
トのアミノ酸のフレームを１塩基（−１）欠失させたも
の、さらに２塩基（−２）欠失させたものである。これ
らベクターのマルチクローニングサイトを第１表に示す
。

（以下、余白） 本発明のベクターは、前記の通り、マルチクローニング
サイトとして制限酵素旧ｎｄｍ　、ＰｓｔＩ　。

Ｓａｌ　Ｉ　、Ａｃｃｌ、ＨｉｎｃＩＩ　、Ｒａｍ旧、
ＳｍａＩ　、ＥｃｏＲＩの各切断部位の塩基配列を有し
ており、また、前記切断部位のアミノ酸に対応するフレ
ームを公知のＰｕＯ２およびｐＵＣ９を含めて３種類す
べて取り揃えてベクターシリーズとし、且ついずれのベ
クターにおいてもマルチクローニングサイト内に終止コ
ドンを有しないことを特徴としている。

［発明の効果］ このベクターおよびベクターシリーズを用いることによ
り、蛋白質をコードしている遺伝子を検出することがで
きる。すなわち、ベクターシリーズの中から所望のベク
ターを選択し、そのベクター及び目的の蛋白質をコード
する遺伝子を所定の制限酵素により切断し、ＤＮＡリガ
ー　ゼ等の連結酵素により結合すると、色の変化を判別
すること、例えば白→青により蛋白質をコードしている
遺伝子を検出することができる。

さらに、本発明のベクターおよびベクターシリーズによ
れば、蛋白質をコードしている遺伝子の５′末端のフレ
ームの合うベクターを前記ベクターシリーズから選択し
、所定の制限酵素にて切り出した後、両者を結合し、大
腸菌に導入することにより蛋白質を発現させることが可
能になるという利点を有する。

［実施例コ 以下、本発明を実施例に基いて、詳細に説明する。

まず１本発明のベクターの作成方法から説明する。

■ｐＵｃ１０９０の作成方法 １）プラスミドｐＵＣ９（宝酒造■販売）ｌＯＩＬｇを
制限酵素ＥｃｏＲＩ　　（５０単位）及び旧ｎｄｍ（５
０単位）を用いて３７°Ｃにて１時間反応させた後、分
解産物を０．７％アガロース電気泳動を用いて分離しＥ
ｃｏＲＩ切断部位から旧ｎｄｍ切断部位までのポリリン
カー断片（３０塩基対）をゲルより切り出し、フェノー
ル処理を行なうことにより精製した。

２）プラスミドｐＵｃ１１９（宝酒造■販売）　１０Ｉ
Ｌｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ　　（５０単位）及び旧ｎｄ
ｍ（５０単位）を用いて３７℃にて１時間反応させた後
、分解産物を０．７％アガロース電気泳動を用いて分離
しＥｃｏＲＩ切断部位から旧ｎｄｍ切断部位までのポリ
リンカ一部分を含まない断片（約３，１００塩基対）を
ゲルより切り出し、フェノール処理を行なうことにより
精製した。

３）■）で得られたポリリンカー断片０．０１＃Ｌｇと
２）で得られたポリリンカーを含まない断片０．１ルｇ
を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２単位）を用いて４℃
にて一昼夜反応させることにより連結反応を行なった。

４）３）で得られた反応生成物を、大腸菌ＪＭ８３株（
ａｒａｓΔ（１ａｃ−ｐｒｏＡＢ）　、ｒｐｓＬ、φ８
Ｇ、１ａｃＺΔＭＩｓ）を用いて形質転換を行なった後
、受容菌を寒天１．５％及びアンピシリンを１ｍｆＬ当
り１００ｇｇ含むし寒天培地（組成：１ｕ当りトリプト
ンｌＯｇ、イーストエキス５ｇ、食塩１０ｇ、ＰＨ７−
５）に塗布し、３７°Ｃにて一昼夜培養を行ないいくつ
かのコロニー（形質転換体）を得た。

５）：ｒ口二一の一つをアンピシリンをｌ　ｍ　５Ｌあ
たりｌｏｏＩＬｇ含むＬ液体培地１０　ｍ　４１に移植
し、３７℃にて１２時間振とう培養を行ない、アルカリ
−５ＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを分離し、プラスミ
ドｐＵｃ１０９０を得た。

■　ＵＣ１０８０の　　　法 ■ｐＵｃ１０９０の作成方法のうち、１）のプラスミド
ＤＮＡとしてｐｕｃｓを、又２）のプラスミドＤＮＡと
してｐＵｃ１１８を用いることにより、同様の操作を経
て、プラスミドｐＵｃ１０８０を作成した。

次いで、ｐＵｃ１０９１の作成方法を説明するが、まず
ＰＵＣ１０９０とｐＵｃ１０９１．ｐｕＣ１０９２の関
係をいうと、ｐＵｃ１０９０のポリリンカ一部分をはさ
んで、前部で１塩基、後部で２塩基欠失させたものがｐ
Ｕｃ１０９１て、ｐＵＣ１０９０のポリリンカ一部分を
はさんで、前部で２塩基、後部で１塩基欠失させたもの
がｐｕＣ１０９２である。また、ｐＵｃ１０８０とｐＵ
Ｃ１０８１，ｐＵｃ１０８２の関係も、上記と同様であ
る。

■ｐＵｃ１０９１の作成 ｐＵｃ１０９１は次の段階にわけて作成した。

１）ｐＵｃ１０９０より一本鎖ＤＮＡの作成２）ポリリ
ンカ一部位の前部より一塩基欠いたオリゴヌクレオチド
の合成 ３）　　１）２）を用いた突然変異体の作成４）突然変
異体より一本鎖ＤＮＡの作成５）ポリリンカ一部位の後
部より２塩基欠いたオリゴヌクレオチドの合成 ６）　　４）５）を用いた再突然変異体の作成（ｐＵＣ
■−１） ｐＵｃ１０９０より一本鎖ＤＮＡの作成■ｐＵｃ１０９
０を大腸菌ＭＶ１１８４株（ａｒａ。

△（Ｉａｃ−ｐｒｏ）、５ｔｒＡ、ｔｈｉ、（φ８０．
ＩａｃＺ　　６Ｍ１５）、△（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）：１
０６：：ＴｎｌＯ（Ｌｅｔ’）、Ｆ’　　　：ｔｒａＤ
：１６．ｐｒｏＡＢ。

１ａｃｌｑＺ△Ｍ１５）を用いて形質転換を行なった。

■形質転換体を、アンピシリンを１ｓｎｊＬ当り１１０
０ＪＬ含む２ｘＹＴ液体培地（組成：ｌ見当りトリプト
ン１６ｇ、イーストエキスｌＯｇ、食塩５ｇ、ｐＨ７，
６）ｌＯｎＪＬに植菌し、３７℃にて１２時時間上う培
養を行なった。

■　■て得られた培養液ｌＯＯル見に、Ｍ１３に０７由
来のへルバーファージ液（１０”ｐｆｕ／ｍ　ｆＬ）を
加え、３７℃で３０分間静置した後、アンピシリンをｌ
　ｍ　ｆＬ当り１５０ｇｇ、カナマイシンを１ｍｉ当り
７０ＩＬｇ、チアミンを０．０１％含む２ｘＹＴ液体培
地１０　ｍ　ｆＬに加え、３７℃にて２４時時間上う培
養を行なった。

■培養液１ｍｊＬを取り、遠心分離により菌体な除いた
後、２０％ＰＥＧ６０００及び２．５ＭＮａＣ１混合溶
液を２００１ＬＪＬ加え遠心分離を行なうことにより、
ファージ粒子を沈殿させた。以下、フェノール処理、ク
ロロホルム処理、エタノール沈殿処理を行なうことによ
り、１本鎖ＤＮＡを分離精製し、最終的に５０１Ｌ９．
のＴＥ溶液（１０ｍＭ　　トリス塩酸、１ｍＭ　　ＥＤ
ＴＡ、ｐＨ８，０の溶液）に溶解させた。

収量は約２〜ｌｏＩＬｇ程度であった。

■−２） 変異部）を　む合　ＤＮＡの ＤＮＡ合成機を用いて第２表に示すＮｏ、９−１−５な
る配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、Ｔ４ＤＮ
Ａキナーゼ（２単位）を用いて３７°Ｃにて１時間反応
を行ない、５′末端部分をリン酸化させ、ブライマーＤ
ＮＡとした。

■−３） ポリリンカー前部に変異を有する突然変異体の主成 ■−１）で得られた一水銀ＤＮＡＩ終ｇと、■−２）で
得られたブライマーＤＮＡ　　２０ｐｍｏＪＬを混合し
て６０°Ｃで３０分間、引続き３７℃で３０分間保温し
、アニーリングさせた後、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びＴＴＰを最終濃度が各々０．５ｍＭとなるように
加え、およびＡＴＰを２５ｐｍｏｕ加え、クレノー（Ｋ
ＬＥＮＯＷ）酵素（４単位）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（
１単位）を用いて３７℃にて３時間反応を行ない、突然
変異部分を含む２本鎖ＤＮＡを合成した。

次に１反応生成物の一部（約０−　ＩＪＬｇ）を大腸菌
ＪＭ８３株を用いて形質転換を行なった後、受容菌を１
．５％寒天、アンピシリンを１ｍ文当り１００．ｇ及び
Ｘ−ｇａｇをｏ、ｏｏｓ％含むＬ寒天培地に塗布し、３
７℃にて一昼夜培養を行ナイ、出現したコロニーの内、
白色コロニーヲ選択した。白色コロニーの出現率は５〜
１０％程度であった。

次いで、白色コロニーを、アンピシリンを１ｍ文当り１
００ｇｇ含むＬ液体培地１０ｍＪｌに移植し、３７℃に
て１２時時間上う培養を行ない、常法によりプラスミド
ＤＮＡを回収した。回収したプラスミドＤＮＡを再び大
腸菌ＭＶ１１８４株を用いて形質転換を行なった後、受
容菌を寒天１゜５％、アンピシリンを１　ｍ　５Ｌ当り
ｔｏｏｐｇ、Ｘ−ｇａｌを０．００５％及びＩ　ＰＴＧ
を１ｍＭ含むし寒天培地に塗布し、３７°Ｃにて一昼夜
培養を行ない、白色コロニーを選択し、アンピシリンを
１ｍ見当り１００終ｇ含むＬ液体培地１０　ｍ　ｌに移
植し、３７℃にて１２時時間上う培養を行ない、常法に
よりプラスミドＤＮＡを分離した。

■−４）１、　一本＠ＤＮＡの作 ■−３）で得られた突然変異体プラスミドを有する大＠
ｃＩｉＭＶ１１８４株ヨリ、■−１）ト全＜同シ方法を
用いて突然変異を有する一本鎖ＤＮＡを得た。

■−５）ポリリンカー　部に・　を有する合成りＮＡの
作成 ■−２）と同じ方法を用いて第２表のＮｏ、９−２−５
なる塩基配列を有する合成りＮＡを作成し、リン酸化を
行ないプライマーＤＮＡを作成した。

■−６）再突然変異体の作成 ■−３）と同じ方法を用いて、■−４）で得られた一本
鎖ＤＮＡ及び■−５）で得られたブライマーＤＮＡより
二本鎖ＤＮＡを合成、大腸菌ＪＭ８３株を用いて形質転
換を行なうことにより青色コロニーを得た。これよりプ
ラスミドＤＮＡを回収し、再び大腸菌ＭＶ１１８４株を
用いて形質転換を行なうことにより青色コロニーを出現
させた。これよりプラスミドＤＮＡを回収することによ
り、ポリリンカ一部分の前後２個所に合計３塩基対欠失
したプラスミドｐＵｃ１０９１を得た。

■ｐＵｃ１０９２の作成方法 プラスミドｐＵｃ１０９２の作成は、前記■のプラスミ
ドＰＵＣ１０９１の作成例に準して行なった。変更点は
次の通りである。

（１）■−２）の塩基配列をＷＩｚ表のＮｏ、９−１−
３とする。

（２）■−５）の塩基配列を第２表のＮｏ、９−１−５
とする。

これによりプラスミドｐＵｃ１０９０よりポリリンカ一
部分の前部を２塩基、後部を１塩基、合計３塩基欠いた
突然変異プラスミドｐＵｃ１０９２を得た。

■ＰＵＣ１０８１％　ＵＣ１０８２の　戒　法前記■■
■と同様に、プラスミドｐＵｃ１０８０を基本としてポ
リリンカ一部分を１塩基および２塩基ずらした突然変異
プラスミドｐｕｃｔｏａ１、ｐＵｃ１０８２を作成した
。

変更点は次の通りである。

（１）ｐＵｃ１０８１．ｐＵｃ１０８２共に、■−１）
のプラスミドとしてｐＵｃ１０８０を用いた。

（２）■−２）の合成りＮＡとして、ｐＵｃ１０８１に
おいては第２表のＮｏ、８−１−５、ｐＵＣ１０８２に
おいてはＮｏ、８−２−５を用いた。

（３）■−５）の合成りＮＡとして、ｐＵｃ１０８１に
おいては第２表のＮｏ、８−１−３、ｐｔｒｃ１０８２
においてはＮｏ、８−１−５を用いた。

以上、基本となるプラスミドｐＵｃ１０９０、ｐＵｃ１
０８０及び作成した突然変異プラスミドｐＵｃ１０９１
．ｐＵｃ１０９２、ｐｕｃｔｏｓｌ及びｐＵｃ１０８２
の間の関係についてまとめると、第３表のとおりとなる
。

（以下、余白） 第　　２　　表 合成りＮＡの塩基配列表 変異部分を含むＤＮＡ塩基配列 ５’　ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧ３’
５’　ＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧ３’
５’　ＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧ３’
５’　ＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧ３’
５’　ＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴ３’
５’　ＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣ３’
５’　ＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴ３’
５’　ＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴ３’
第　　３　　表 ■プラスミドｐＵｃ８１．８２．９１．９２の作成 １）既に作成したプラスミドｐｕｃｔｏｓｔ、ｐＵＣ１
０８２，ｐＵｃ１０９１及びｐＵｃ１０９２夫々５ＪＬ
ｇを、制限酵素Ｐｖｕｌｌ（１８単位）を用いて３７°
Ｃ，１時間反応させた後、分解産物を０．７％アガロー
ス電気泳動にて分離を行ない、ポリリンカ一部分を含む
ＤＮＡ断片（約３００塩基対）を切り出し、フェノール
処理を行なうことにより精製した。

２）プラスミドｐＵｃ９　５終ｇを制限酵素Ｐｖｕ■（
２４単位）を用いて３７℃にて１時間反応させた後、分
解産物を０．７％アガロース電気泳動にて分離を行ない
、ポリリンカ一部分を含まないＤＮＡ！ｉｆＩ片（約２
３００塩基対）を切り出し、フェノール処理を行なうこ
とにより精製した。

３）Ｉ）で得られたＰＵＣ１０８１由来のＤＮＡ断片０
．０５終ｇと、２）で得られたｐＵｃ９由来のＤＮＡｌ
ｔｙｒ片０．２１Ｌｇを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（
２単位）を用いて４°Ｃ，１２時間連結反応を行なった
。次に反応液の一部（約０．１ｐ−ｇ）を大腸菌ＪＭ８
３株を用いて形質転換を行ない、受容菌を寒天１．５％
、アンピシリンを１ｍＭちりｌｏｏｇｇ含むし寒天培地
に塗布し、３７℃にて一昼夜培養を行ない形質転換体コ
ロニーを得た。コロニーを、アンピシリンを１　ｍ　ｌ
　当り１１００ＪＬ含むＬ液体培地に植菌し、３７°Ｃ
にて１２時間振どう培養を行ない、常法によりプラスミ
ドＤＮＡを分離し、プラスミドｐＵｃ８１を得た。

４）同様の操作を行なうことにより、プラスミドｐＵｃ
１０８２よりプラスミドｐＵＣ８２、プラスミドｐＵｃ
１０９１よりプラスミドｐＵｃ９１、及びプラスミドｐ
Ｕｃ１０９２よりプラスミドｐＵＣ９２を作成した。

次に、本発明のＰＵＣベクターシリーズを用いて大腸菌
のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現させる場合の実施
例を説明する。

（実施例） ｌ）大腸菌のβ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子
を有するプラスミドｐＭｃ１８７１（ファルマシア■販
売）ｌＯｐｇを、制限酵素ＥｃｏＲＩ　　（ｌＯ単位）
及びＰｓｔｌ　（１０単位）を用いて、３７℃にて１時
間反応を行ない、分解産物を０．７％アガロース電気泳
動を用いて分離し、ゲルより大腸菌のβ−ガラクトシダ
ーゼをコードする遺伝子のうち制限酵素ＥｃｏＲ［サイ
トよりＰｓｔｌサイトまでのＤＮＡ断片（約３０００塩
基対）を切り出し、フェノール処理を行なうことにより
精製した。

２）プラスミドｐＵｃ８１　１０ＩＬｇを制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ　　（１０単位）及びＰｓｔｌ　（１０単位）を
用いて、３７℃にて１時間反応を行ない１分解産物を０
．７％アガロース電気泳動を用いて分離し、ゲルより制
限酵素ＥｃｏＲＩサイトよりＰｓｔｌサイトまでの大き
い方のＤＮＡ断片（約２７００塩基対）を切り出し、フ
ェノール処理を行なうことにより精製した。

３）次ニ、１）テ得られたＤＮＡ断片０．ｔＪｊ−ｇと
２）テ得られたＤＮＡ断片０−　ＩＪＬｇを混合し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ（２単位）を用いて４８Ｃ，１２時間
連結反応を行なった後、反応液の一部を大腸菌Ｃ５Ｈ２
６（ラクトースマイナス）株に形質転換を行なった。受
容菌を１．５％寒天、アンピシリンを１ｍ文当り１００
ルｇ及びＸ−ｇａ文を０．００５％含むし寒天培地に塗
布し、３７℃にて一昼夜培養を行ない、青色の形質転換
体コロニーを得た。

本形質転換体コロニーは、大腸菌のβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子かプラスミドｐＵｃ８１の所定の制限酵素サイ
トに連結され、フレームか一致することにより大腸菌の
β−ガラクトシダーゼ遺伝子を欠いた宿主大腸菌Ｃ３Ｈ
２６（ラクトースマイナス）棟内において大腸菌のβ−
ガラクトシダーゼが発現し、培地中のＸ−ｇａ文か分解
され、コロニーか青色を呈したものである。

以上の実施例の結果より、プラスミドｐＵＣ８１を用い
ることにより大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を容
易に発現させることかできることがわかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係るベクターの一例の遺伝子地図、第
２図は従来のベクターの遺伝子地図、を夫々示すもので
ある。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）複製開始信号、アンピシリン耐性遺伝子、ラクト
   ースプロモーター、オペレーター、β−ガラクトシダー
   ゼ遺伝子及び制限酵素ＨｉｎｄIII、Ｐｓｔ I 、Ｓａｌ
   I 、Ａｃｃ I 、ＨｉｎｃII、ＢａｍＨ I 、Ｓｍａ I
   、ＥｃｏＲ I の各切断部位を持つマルチクローニング
   サイトを有してなるベクター。
2. （２）複製開始信号、アンピシリン耐性遺伝子、ラクト
   ースプロモーター、オペレーター、β−ガラクトシダー
   ゼ遺伝子及び制限酵素ＨｉｎｄIII、Ｐｓｔ I 、Ｓａｌ
   I 、Ａｃｃ I 、ＨｉｎｃII、ＢａｍＨ I 、Ｓｍａ I
   、ＥｃｏＲ I の各切断部位を持つマルチクローニング
   サイトを有してなるベクター３種類からなるベクターシ
   リーズであって、該ベクターシリーズは前記切断部位の
   アミノ酸に対応するフレームを３種類すべて有するもの
   であるベクターシリーズ。
3. （３）複製開始信号、アンピシリン耐性遺伝子、ラクト
   ースプロモーター、オペレーター、β−ガラクトシダー
   ゼ遺伝子及び制限酵素ＨｉｎｄIII、Ｐｓｔ I 、Ｓａｌ
   I 、Ａｃｃ I 、ＨｉｎｃII、ＢａｍＨ I 、Ｓｍａ I
   、ＥｃｏＲ I の各切断部位を持つマルチクローニング
   サイトを有してなるベクター３種類からなるベクターシ
   リーズであって、該ベクターシリーズは前記切断部位の
   アミノ酸に対応するフレームを３種類すべて有するもの
   であるベクターシリーズの中から所望のベクターを選択
   し、そのベクターおよび蛋白質をコードしている遺伝子
   を所定の制限酵素にて切り出した後両者を結合すること
   により、色の変化を判別して蛋白質をコードしている遺
   伝子を検出することを特徴とする特定遺伝子の検出方法
   。
4. （４）複製開始信号、アンピシリン耐性遺伝子、ラクト
   ースプロモーター、オペレーター、β−ガラクトシダー
   ゼ遺伝子及び制限酵素ＨｉｎｄIII、Ｐｓｔ I 、Ｓａｌ
   I 、Ａｃｃ I 、ＨｉｎｃII、ＢａｍＨ I 、Ｓｍａ I
   、ＥｃｏＲ I の各切断部位を持つマルチクローニング
   サイトを有してなるベクター３種類からなるベクターシ
   リーズであって、該ベクターシリーズは前記切断部位の
   アミノ酸に対応するフレームを３種類すべて有するもの
   であるベクターシリーズの中から蛋白質をコードしてい
   る遺伝子の５′末端のフレームの合うベクターを選択し
   、所定の制限酵素にて切り出した後両者を結合し、大腸
   菌に導入し、蛋白質を発現することを特徴とする特定蛋
   白質の発現方法。