JP2580170B2 - ベクタ−とそれを用いた遺伝子の検出方法および蛋白質の発現方法 - Google Patents
ベクタ−とそれを用いた遺伝子の検出方法および蛋白質の発現方法Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はベクターとそれを用いた遺伝子の検出方法、
および蛋白質の発現方法に関する。
および蛋白質の発現方法に関する。
ここでいう蛋白質とは、アミノ酸を複数個含むポリペ
プチドを指すものである。
プチドを指すものである。
［従来の技術］ 遺伝子工学的手法による蛋白質の発現や、蛋白工学等
のバイオテクノロジー利用技術の開発が盛んに行なわれ
るようになってきた今日、より優れた技術開発が大いに
期待されている。以上の蛋白工学の中でも、蛋白質（酵
素）の改良や解析は重要な役割を有しており、今後益々
の発展が期待されている。
のバイオテクノロジー利用技術の開発が盛んに行なわれ
るようになってきた今日、より優れた技術開発が大いに
期待されている。以上の蛋白工学の中でも、蛋白質（酵
素）の改良や解析は重要な役割を有しており、今後益々
の発展が期待されている。
近年、合成DNAを用いた遺伝子変換によるアミノ酸変
換等がよく行なわれるようになってきており、変異体の
検出にラジオアイソトープ（放射性同位元素）を用いた
オートラジオグラフィーが利用されている。
換等がよく行なわれるようになってきており、変異体の
検出にラジオアイソトープ（放射性同位元素）を用いた
オートラジオグラフィーが利用されている。
一方、従来より大腸菌を宿主とするpUCベクター（pUC
8/pUC9）が市販されている。このpUCベクターは第２図
に示すように、複製開始信号、アンピシリン耐性遺伝
子、ラクトースプロモーター、オペレーター、β−ガラ
クトシダーゼ遺伝子（lacZ′）およびマルチクローニン
グサイトより構成されている。このpUCベクターは、ジ
デオキシ法によるDNAシークエンシングに適したプラス
ミドベクターであり、lacZ′領域内にマルチクローニン
グサイトを持っており、イソプロピルβ−チオ−ガラク
トピラノシド（IPTG）と５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−ガラクトサイド（Ｘ−gal）を含むプレー
ト上で、外来DNA（目的とするDNA）の挿入の有無を容易
に色の変化（青→白）によって判別することができるも
のである。また、ラクトースプロモーターを利用して外
来遺伝子を発現することもできるものである。
8/pUC9）が市販されている。このpUCベクターは第２図
に示すように、複製開始信号、アンピシリン耐性遺伝
子、ラクトースプロモーター、オペレーター、β−ガラ
クトシダーゼ遺伝子（lacZ′）およびマルチクローニン
グサイトより構成されている。このpUCベクターは、ジ
デオキシ法によるDNAシークエンシングに適したプラス
ミドベクターであり、lacZ′領域内にマルチクローニン
グサイトを持っており、イソプロピルβ−チオ−ガラク
トピラノシド（IPTG）と５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−ガラクトサイド（Ｘ−gal）を含むプレー
ト上で、外来DNA（目的とするDNA）の挿入の有無を容易
に色の変化（青→白）によって判別することができるも
のである。また、ラクトースプロモーターを利用して外
来遺伝子を発現することもできるものである。
［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら、前記従来のオートラジオグラフィーに
あっては、ラジオアイソトープによる放射能被曝の危険
性があり、また高価であるという欠点があった。
あっては、ラジオアイソトープによる放射能被曝の危険
性があり、また高価であるという欠点があった。
また、染色体中の蛋白をコードする遺伝子を色の判別
で検索しようとする場合もしくはlacプロモーターにつ
なげる外来遺伝子とlacZ′遺伝子を連結し融合蛋白を発
現させようとする場合、いずれの場合においても、従来
のpUC系ベクターを用いた場合、フレームが前後とも完
全にあうものを偶然に取得することしか出来なかった
（確率は1/18）。
で検索しようとする場合もしくはlacプロモーターにつ
なげる外来遺伝子とlacZ′遺伝子を連結し融合蛋白を発
現させようとする場合、いずれの場合においても、従来
のpUC系ベクターを用いた場合、フレームが前後とも完
全にあうものを偶然に取得することしか出来なかった
（確率は1/18）。
［問題点を解決するための手段］ 本発明は上記従来における問題点を解決した。新規な
ベクターとそれを用いた遺伝子の検出方法および蛋白質
の発現方法を提供することを目的とする。そして、その
目的は、本発明によれば、制限酵素EcoR I,Sac I,EcoR
V,Nco I,Bgl II,Kpn I,Cla I,Mlu I,Xho I,Hind IIIの
各切断部位の塩基配列を有する第一のマルチクローニン
グサイト及び第二のマルチクローニングサイトの２個を
有し、該第一のマルチクローニングサイト、３種の終止
コドンが挿入された中継ぎ塩基配列、該第二のマルチク
ローニングサイト、及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と
連結されていることを特徴とするベクター（第１発
明）、制限酵素EcoR I,Sac I,EcoR V,Nco I,Bgl II,Kpn
I,Cla I,Mlu I,Xho I,Hind IIIの各切断部位の塩基配
列を有する第一のマルチクローニングサイト及び第二の
マルチクローニングサイトの２個を有し、該第一のマル
チクローニングサイト、３種の終止コドンが挿入された
中継ぎ塩基配列、該第二のマルチクローニングサイト、
及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と連結されているベク
ターであって、該ベクターは前記のすべての切断部位の
アミノ酸に対応するフレームを３種類すべて前記第一及
び第二のマルチクローニングサイトに有する18種のもの
を備えてなるベクターシリーズ（第２発明）、制限酵素
EcoR I,Sac I,EcoR V,Nco I,Bgl II,Kpn I,Cla I,Mlu
I,Xho I,Hind IIIの各切断部位の塩基配列を有する第一
のマルチクローニングサイト及び第二のマルチクローニ
ングサイトの２個を有し、該第一のマルチクローニング
サイト、３種の終止コドンが挿入された中継ぎ塩基配
列、該第二のマルチクローニングサイト、及びβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子と連結されているベクターであっ
て、該ベクターは前記のすべての切断部位のアミノ酸に
対応するフレームを３種類すべて前記第一及び第二のマ
ルチクローニングサイトに有する18種のものを備えてな
るベクターシリーズの中から所望のベクターを選択し、
該ベクターおよび蛋白質をコードしている遺伝子を所定
の制限酵素にて切り出した後両者を結合することによ
り、β−ガラクトシダーゼ反応を利用して色の変化を判
別することにより蛋白質をコードしている遺伝子を検出
することを特徴とする遺伝子の検出方法（第３発明）、
制限酵素EcoR I,Sac I,EcoR V,Nco I,Bgl II,Kpn I,Cla
I,Mlu I,Xho I,Hind IIIの各切断部位の塩基配列を有
する第一のマルチクローニングサイト及び第二のマルチ
クローニングサイトの２個を有し、該第一のマルチクロ
ーニングサイト、３種の終止コドンが挿入された中継ぎ
塩基配列、該第二のマルチクローニングサイト、及びβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子と連結されている発現ベクタ
ーであって、該ベクターは前記のすべての切断部位のア
ミノ酸に対応するフレームを３種類すべて前記第一及び
第二のマルチクローニングサイトに有する18種のものを
備えてなるベクターシリーズの中から所望のベクターを
選択し、該ベクターおよび蛋白質をコードしている遺伝
子を所定の制限酵素にて切り出した後両者を結合し、次
いで形質転換を行なうことにより、蛋白質を発現させる
ことを特徴とする蛋白質の発現方法（第４発明）、制限
酵素EcoR I,Sac I,EcoR V,Nco I,Bgl II,Kpn I,Cla I,M
lu I,Xho I,Hind IIIの各切断部位の塩基配列を有する
第一のマルチクローニングサイト及び第二のマルチクロ
ーニングサイトの２個を有し、該第一のマルチクローニ
ングサイト、３種の終止コドンが挿入された中継ぎ塩基
配列、該第二のマルチクローニングサイト、及びβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子と連結されているベクターであっ
て、該ベクターは前記のすべての切断部位のアミノ酸に
対応するフレームを３種類すべて前記第一及び第二のマ
ルチクローニングサイトに有する18種のものを備えてな
るベクターシリーズのすべての混合物、および蛋白質を
コードしている遺伝子を所定の制限酵素にて切り出した
後両者を結合することにより、β−ガラクトシダーゼ反
応を利用して色の変化を判別することにより蛋白質をコ
ードしている遺伝子を検出することを特徴とする遺伝子
の検出方法（第５発明）、および制限酵素EcoR I,Sac
I,EcoR V,Nco I,Bgl II,Kpn I,Cla I,Mlu I,Xho I,Hind
IIIの各切断部位の塩基配列を有する第一のマルチクロ
ーニングサイト及び第二のマルチクローニングサイトの
２個を有し、該第一のマルチクローニングサイト、３種
の終止コドンが挿入された中継ぎ塩基配列、該第二のマ
ルチクローニングサイト、及びβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子と連結されている発現ベクターであって、該ベクタ
ーは前記のすべての切断部位のアミノ酸に対応するフレ
ームを３種類すべて前記第一及び第二のマルチクローニ
ングサイトに有する18種のものを備えてなるベクターシ
リーズのすべての混合物、および蛋白質をコードしてい
る遺伝子を所定の制限酵素にて切り出した後両者を結合
し、次いで形質転換を行なうことにより、蛋白質を発現
させることを特徴とする蛋白質の発現方法（第６発
明）、により達成することができる。
ベクターとそれを用いた遺伝子の検出方法および蛋白質
の発現方法を提供することを目的とする。そして、その
目的は、本発明によれば、制限酵素EcoR I,Sac I,EcoR
V,Nco I,Bgl II,Kpn I,Cla I,Mlu I,Xho I,Hind IIIの
各切断部位の塩基配列を有する第一のマルチクローニン
グサイト及び第二のマルチクローニングサイトの２個を
有し、該第一のマルチクローニングサイト、３種の終止
コドンが挿入された中継ぎ塩基配列、該第二のマルチク
ローニングサイト、及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と
連結されていることを特徴とするベクター（第１発
明）、制限酵素EcoR I,Sac I,EcoR V,Nco I,Bgl II,Kpn
I,Cla I,Mlu I,Xho I,Hind IIIの各切断部位の塩基配
列を有する第一のマルチクローニングサイト及び第二の
マルチクローニングサイトの２個を有し、該第一のマル
チクローニングサイト、３種の終止コドンが挿入された
中継ぎ塩基配列、該第二のマルチクローニングサイト、
及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と連結されているベク
ターであって、該ベクターは前記のすべての切断部位の
アミノ酸に対応するフレームを３種類すべて前記第一及
び第二のマルチクローニングサイトに有する18種のもの
を備えてなるベクターシリーズ（第２発明）、制限酵素
EcoR I,Sac I,EcoR V,Nco I,Bgl II,Kpn I,Cla I,Mlu
I,Xho I,Hind IIIの各切断部位の塩基配列を有する第一
のマルチクローニングサイト及び第二のマルチクローニ
ングサイトの２個を有し、該第一のマルチクローニング
サイト、３種の終止コドンが挿入された中継ぎ塩基配
列、該第二のマルチクローニングサイト、及びβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子と連結されているベクターであっ
て、該ベクターは前記のすべての切断部位のアミノ酸に
対応するフレームを３種類すべて前記第一及び第二のマ
ルチクローニングサイトに有する18種のものを備えてな
るベクターシリーズの中から所望のベクターを選択し、
該ベクターおよび蛋白質をコードしている遺伝子を所定
の制限酵素にて切り出した後両者を結合することによ
り、β−ガラクトシダーゼ反応を利用して色の変化を判
別することにより蛋白質をコードしている遺伝子を検出
することを特徴とする遺伝子の検出方法（第３発明）、
制限酵素EcoR I,Sac I,EcoR V,Nco I,Bgl II,Kpn I,Cla
I,Mlu I,Xho I,Hind IIIの各切断部位の塩基配列を有
する第一のマルチクローニングサイト及び第二のマルチ
クローニングサイトの２個を有し、該第一のマルチクロ
ーニングサイト、３種の終止コドンが挿入された中継ぎ
塩基配列、該第二のマルチクローニングサイト、及びβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子と連結されている発現ベクタ
ーであって、該ベクターは前記のすべての切断部位のア
ミノ酸に対応するフレームを３種類すべて前記第一及び
第二のマルチクローニングサイトに有する18種のものを
備えてなるベクターシリーズの中から所望のベクターを
選択し、該ベクターおよび蛋白質をコードしている遺伝
子を所定の制限酵素にて切り出した後両者を結合し、次
いで形質転換を行なうことにより、蛋白質を発現させる
ことを特徴とする蛋白質の発現方法（第４発明）、制限
酵素EcoR I,Sac I,EcoR V,Nco I,Bgl II,Kpn I,Cla I,M
lu I,Xho I,Hind IIIの各切断部位の塩基配列を有する
第一のマルチクローニングサイト及び第二のマルチクロ
ーニングサイトの２個を有し、該第一のマルチクローニ
ングサイト、３種の終止コドンが挿入された中継ぎ塩基
配列、該第二のマルチクローニングサイト、及びβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子と連結されているベクターであっ
て、該ベクターは前記のすべての切断部位のアミノ酸に
対応するフレームを３種類すべて前記第一及び第二のマ
ルチクローニングサイトに有する18種のものを備えてな
るベクターシリーズのすべての混合物、および蛋白質を
コードしている遺伝子を所定の制限酵素にて切り出した
後両者を結合することにより、β−ガラクトシダーゼ反
応を利用して色の変化を判別することにより蛋白質をコ
ードしている遺伝子を検出することを特徴とする遺伝子
の検出方法（第５発明）、および制限酵素EcoR I,Sac
I,EcoR V,Nco I,Bgl II,Kpn I,Cla I,Mlu I,Xho I,Hind
IIIの各切断部位の塩基配列を有する第一のマルチクロ
ーニングサイト及び第二のマルチクローニングサイトの
２個を有し、該第一のマルチクローニングサイト、３種
の終止コドンが挿入された中継ぎ塩基配列、該第二のマ
ルチクローニングサイト、及びβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子と連結されている発現ベクターであって、該ベクタ
ーは前記のすべての切断部位のアミノ酸に対応するフレ
ームを３種類すべて前記第一及び第二のマルチクローニ
ングサイトに有する18種のものを備えてなるベクターシ
リーズのすべての混合物、および蛋白質をコードしてい
る遺伝子を所定の制限酵素にて切り出した後両者を結合
し、次いで形質転換を行なうことにより、蛋白質を発現
させることを特徴とする蛋白質の発現方法（第６発
明）、により達成することができる。
本発明のベクターは、制限酵素EcoR I,Sac I,EcoR V,
Nco I,Bgl II,Kpn I,Cla I,Mlu I,Xho I,Hind IIIの各
切断部位の塩基配列を有する第一のマルチクローニング
サイト及び第二のマルチクローニングサイトの２個を有
し、該第一のマルチクローニングサイト、３種の終止コ
ドンが挿入された中継ぎ塩基配列、該第二のマルチクロ
ーニングサイト、及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と連
結されているベクターであり、本発明に係るベクターシ
リーズは前記の全ての切断部位のアミノ酸に対応するフ
レームを３種類全て前記第一及び第二のマルチクローニ
ングサイトに有する18種類の前記第一及び第２のベクタ
ーからなるものである。
Nco I,Bgl II,Kpn I,Cla I,Mlu I,Xho I,Hind IIIの各
切断部位の塩基配列を有する第一のマルチクローニング
サイト及び第二のマルチクローニングサイトの２個を有
し、該第一のマルチクローニングサイト、３種の終止コ
ドンが挿入された中継ぎ塩基配列、該第二のマルチクロ
ーニングサイト、及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と連
結されているベクターであり、本発明に係るベクターシ
リーズは前記の全ての切断部位のアミノ酸に対応するフ
レームを３種類全て前記第一及び第二のマルチクローニ
ングサイトに有する18種類の前記第一及び第２のベクタ
ーからなるものである。
これら18種の各ベクターは、第１図に示す如く、クロ
ーニングサイトとして、前部の制限酵素EcoR I,Sac I,E
coR V,Nco I,Bgl II,Kpn I,Cla I,Mlu I,Xho I,Hind II
Iの各切断部位の塩基配列を持つマルチクローニングサ
イトを有するリンカー（以後、ポリリンカーという）、
中継ぎ配列（必ず、３種の終止コドンが入る）、後部の
ポリリンカー、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ′）
と連なっている。そしてその他の構造はアンピシリン耐
性遺伝子（Ampr）、複製開始信号（Ori）を有するもの
（pKISAベクターとよぶ）、および他の構造として前記
のほか更に従来のpUCベクターと同様に、M13の遺伝子間
領域（IG）を有しているものがある（pKISA1ベクターと
よぶ）。
ーニングサイトとして、前部の制限酵素EcoR I,Sac I,E
coR V,Nco I,Bgl II,Kpn I,Cla I,Mlu I,Xho I,Hind II
Iの各切断部位の塩基配列を持つマルチクローニングサ
イトを有するリンカー（以後、ポリリンカーという）、
中継ぎ配列（必ず、３種の終止コドンが入る）、後部の
ポリリンカー、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ′）
と連なっている。そしてその他の構造はアンピシリン耐
性遺伝子（Ampr）、複製開始信号（Ori）を有するもの
（pKISAベクターとよぶ）、および他の構造として前記
のほか更に従来のpUCベクターと同様に、M13の遺伝子間
領域（IG）を有しているものがある（pKISA1ベクターと
よぶ）。
本発明に係るベクターは、３種のフレームのポリリン
カー（前部）×３種のフレームのポリリンカー（後部）
×２（クローニングサイトが逆向きもある）から、18種
類存在するということになるのであり、本発明ではこれ
らの18種類のベクターを組合わせて構成したベクターシ
リーズをも提供するものである。
カー（前部）×３種のフレームのポリリンカー（後部）
×２（クローニングサイトが逆向きもある）から、18種
類存在するということになるのであり、本発明ではこれ
らの18種類のベクターを組合わせて構成したベクターシ
リーズをも提供するものである。
本発明においては、18種のベクターシリーズのすべて
を用いることにより、オープンリーディングフレームの
検索に用いることができる。
を用いることにより、オープンリーディングフレームの
検索に用いることができる。
本発明のベクターにおいては、第１図におけるマルチ
クローニングサイトであるＡ部分およびＢ部分は第１表
に示すような塩基配列を有するものである。また、これ
らの塩基配列は第２表に示す通りである。
クローニングサイトであるＡ部分およびＢ部分は第１表
に示すような塩基配列を有するものである。また、これ
らの塩基配列は第２表に示す通りである。
また、一例としてpKISAベクター及びpKISA1ベクター
のうち、pKISA801/pKISA10801の構造の特徴部分を表わ
せば、第３表の如くである。
のうち、pKISA801/pKISA10801の構造の特徴部分を表わ
せば、第３表の如くである。
本発明のベクターにおいては、前記の通り、前後に制
限酵素EcoR I,Sac I,EcoR V,Nco I,Bgl II,Kpn I,Cla
I,Mlu I,Xho I,Hind IIIの各切断部位の塩基配列、すな
わち、マルチクローニングサイトを有し、また、前記制
限酵素の全ての切断部位のアミノ酸に対応するフレーム
を３種類全て両マルチクローニングサイトに有する18種
類の各ベクターを取り揃えている。
限酵素EcoR I,Sac I,EcoR V,Nco I,Bgl II,Kpn I,Cla
I,Mlu I,Xho I,Hind IIIの各切断部位の塩基配列、すな
わち、マルチクローニングサイトを有し、また、前記制
限酵素の全ての切断部位のアミノ酸に対応するフレーム
を３種類全て両マルチクローニングサイトに有する18種
類の各ベクターを取り揃えている。
従って、このベクターあるいはベクターシリーズを用
いることにより、蛋白質をコードしている遺伝子を極め
て容易に検出（検索）することができる。すなわち、目
的の蛋白質をコードしている遺伝子を適宜の制限酵素に
て切り出した後、上記18種のベクターから所望のベクタ
ーを選択し、そのベクターを前記遺伝子を切り出した制
限酵素と同一の制限酵素で切って、両者をDNAリガーゼ
等の連結酵素により結合させると、蛋白質をコードして
いる遺伝子を含んでいる場合のみ青色となるので、この
遺伝子を検出すること、更に、形質転換を行なうことに
より蛋白質を発現することができるのである。
いることにより、蛋白質をコードしている遺伝子を極め
て容易に検出（検索）することができる。すなわち、目
的の蛋白質をコードしている遺伝子を適宜の制限酵素に
て切り出した後、上記18種のベクターから所望のベクタ
ーを選択し、そのベクターを前記遺伝子を切り出した制
限酵素と同一の制限酵素で切って、両者をDNAリガーゼ
等の連結酵素により結合させると、蛋白質をコードして
いる遺伝子を含んでいる場合のみ青色となるので、この
遺伝子を検出すること、更に、形質転換を行なうことに
より蛋白質を発現することができるのである。
一方、例えば、真核生物等のような、蛋白質をコード
している遺伝子（構造遺伝子）が、全体の遺伝子の中で
相当な間隔をおいて並んでいる場合においては、所定の
制限酵素によりランダムに切断した遺伝子と、同一の制
限酵素で上記18種のベクターを混合し、これらを切断し
て、DNAリガーゼ等の連結酵素により結合すれば、蛋白
質をコードしている遺伝子を含んでいる場合のみ青色と
なるので、この遺伝子を検出すること、および形質転換
を行なうことにより蛋白質を発現することができる。
している遺伝子（構造遺伝子）が、全体の遺伝子の中で
相当な間隔をおいて並んでいる場合においては、所定の
制限酵素によりランダムに切断した遺伝子と、同一の制
限酵素で上記18種のベクターを混合し、これらを切断し
て、DNAリガーゼ等の連結酵素により結合すれば、蛋白
質をコードしている遺伝子を含んでいる場合のみ青色と
なるので、この遺伝子を検出すること、および形質転換
を行なうことにより蛋白質を発現することができる。
即ち、切断、結合の操作を１度あるいは少数回行なう
ことにより、容易に目的とする遺伝子の検出（いわゆる
カラースクリーニング）および蛋白質の発現を行なうこ
とができる。
ことにより、容易に目的とする遺伝子の検出（いわゆる
カラースクリーニング）および蛋白質の発現を行なうこ
とができる。
pKISAベクター又はpKISA1ベクターにクローン化され
た蛋白質をコードする遺伝子に、合成DNAを用いてDNAの
突然変異によるアミノ酸変換をラジオアイソトープを用
いないで、突然変異体を容易に検出することができる。
た蛋白質をコードする遺伝子に、合成DNAを用いてDNAの
突然変異によるアミノ酸変換をラジオアイソトープを用
いないで、突然変異体を容易に検出することができる。
また、上記の遺伝子検出方法では、ラジオアイソトー
プを用いていないので、危険性がなく、しかも安価にで
きるため極めて有益である。
プを用いていないので、危険性がなく、しかも安価にで
きるため極めて有益である。
［実施例］ 以下、本発明を実施例に基いて説明する。
まず、本発明のベクター（pKISAベクターおよびpKISA
1ベクター）の作製方法について説明する。
1ベクター）の作製方法について説明する。
pUC1090の作成 １）プラスミドpUC9（10μｇ）を制限酵素EcoR I（50単
位）及びHind III（50単位）を用いて37℃にて１時間反
応させた後、分解産物を0.7％アガロース電気泳動を用
いて分離しEcoR I切断部位からHind III切断部位までの
ポリリンカー断片（30塩基対）をゲルより切り出し、フ
ェノール処理を行なうことにより精製した。
位）及びHind III（50単位）を用いて37℃にて１時間反
応させた後、分解産物を0.7％アガロース電気泳動を用
いて分離しEcoR I切断部位からHind III切断部位までの
ポリリンカー断片（30塩基対）をゲルより切り出し、フ
ェノール処理を行なうことにより精製した。
２）プラスミドpUC119（10μｇ）を制限酵素EcoR I（50
単位）及びHind III（50単位）を用いて37℃にて１時間
反応させた後、分解産物を0.7％アガロース電気泳動を
用いて分離しEcoR I切断部位からHind III切断部位まで
のポリリンカー部分を含まない断片（約3,100塩基対）
をゲルより切り出し、フェノール処理を行なうことによ
り精製した。
単位）及びHind III（50単位）を用いて37℃にて１時間
反応させた後、分解産物を0.7％アガロース電気泳動を
用いて分離しEcoR I切断部位からHind III切断部位まで
のポリリンカー部分を含まない断片（約3,100塩基対）
をゲルより切り出し、フェノール処理を行なうことによ
り精製した。
３） １）で得られたポリリンカー断片0.01μｇと２）
で得られたポリリンカーを含まない断片0.1μｇを混合
し、T4DNAリガーゼ（２単位）を用いて４℃、12時間連
結反応を行なった。
で得られたポリリンカーを含まない断片0.1μｇを混合
し、T4DNAリガーゼ（２単位）を用いて４℃、12時間連
結反応を行なった。
４） ３）で得られた反応生成物を、大腸菌JM83株（ar
a,Δ（lac−proAB）,rpsL,φ80,lacZ ΔM 15）を用いて
形質転換を行なった後、受容菌を寒天1.5％及びアンピ
シリンを1ml当り100μｇを含むＬ寒天培地（組成:1当
りトリプトン10g、イーストエキス5g、食塩10g、pH7.
5）に塗布し、37℃にて一昼夜培養を行ないいくつかの
コロニー（形質転換体）を得た。
a,Δ（lac−proAB）,rpsL,φ80,lacZ ΔM 15）を用いて
形質転換を行なった後、受容菌を寒天1.5％及びアンピ
シリンを1ml当り100μｇを含むＬ寒天培地（組成:1当
りトリプトン10g、イーストエキス5g、食塩10g、pH7.
5）に塗布し、37℃にて一昼夜培養を行ないいくつかの
コロニー（形質転換体）を得た。
５）コロニーの一つをアンピシリンを1mlあたり100μｇ
含むＬ液体培地10mlに移植し、37℃にて12時間振とう培
養を行ない、アルカリ−SDS法によりプラスミドDNAを分
離し、プラスミドpUC1090を得た。
含むＬ液体培地10mlに移植し、37℃にて12時間振とう培
養を行ない、アルカリ−SDS法によりプラスミドDNAを分
離し、プラスミドpUC1090を得た。
pUC1080の作成 pUC1090の作成方法のうち、１）のプラスミドDNAと
してpUC8を、又２）のプラスミドDNAとしてpUC118を用
いることにより、同様の操作を経て、プラスミドpUC108
0を作成した。
してpUC8を、又２）のプラスミドDNAとしてpUC118を用
いることにより、同様の操作を経て、プラスミドpUC108
0を作成した。
次いで、pUC1091の作成方法を説明するが、まずpUC10
90とpUC1091、pUC1092の関係をいうと、pUC1090のポリ
リンカー部分をはさんで、前部で１塩基、後部で２塩基
欠失させたものがpUC1091で、pUC1090のポリリンカー部
分をはさんで、前部で２塩基、後部で１塩基欠失させた
ものがpUC1092である。また、pUC1080とpUC1081、pUC10
82の関係も、上記と同様である。
90とpUC1091、pUC1092の関係をいうと、pUC1090のポリ
リンカー部分をはさんで、前部で１塩基、後部で２塩基
欠失させたものがpUC1091で、pUC1090のポリリンカー部
分をはさんで、前部で２塩基、後部で１塩基欠失させた
ものがpUC1092である。また、pUC1080とpUC1081、pUC10
82の関係も、上記と同様である。
pUC1091の作成 pUC1091は次の段階にわけて作成した。
１）pUC1090より一本鎖DNAの作成 ２）ポリリンカー部位の前部より一塩基欠いたオリゴヌ
クレオチドの合成 ３） １）２）を用いた突然変異体の作成 ４）突然変異体より一本鎖DNAの作成 ５）ポリリンカー部位の後部より２塩基欠いたオリゴヌ
クレオチドの合成 ６） ４）５）を用いた再突然変異体の作成（pUC109
1） −１） pUC1090より一本鎖DNAの作成 pUC1090を大腸菌MV1184株（ara,Δ（lac−pro）,str
A,thi,（φ80,1acZ ΔM15），Δ（srl−recA）306::Tn1
0（tetr）,F′:traD36,proAB,lacIqZ ΔM15）を用いて
形質転換を行なった。
クレオチドの合成 ３） １）２）を用いた突然変異体の作成 ４）突然変異体より一本鎖DNAの作成 ５）ポリリンカー部位の後部より２塩基欠いたオリゴヌ
クレオチドの合成 ６） ４）５）を用いた再突然変異体の作成（pUC109
1） −１） pUC1090より一本鎖DNAの作成 pUC1090を大腸菌MV1184株（ara,Δ（lac−pro）,str
A,thi,（φ80,1acZ ΔM15），Δ（srl−recA）306::Tn1
0（tetr）,F′:traD36,proAB,lacIqZ ΔM15）を用いて
形質転換を行なった。
形質転換体を、アンピシリンを1ml当り100μｇ含む２
×YT液体培地（組成:1当りトリプトン16g、イースト
エキス10g、食塩5g、pH7.6）10mlに植菌し、37℃にて12
時間振とう培養を行なった。
×YT液体培地（組成:1当りトリプトン16g、イースト
エキス10g、食塩5g、pH7.6）10mlに植菌し、37℃にて12
時間振とう培養を行なった。
で得られた培養液100μに、M13K07由来のヘル
パーファージ液（1010pfu/ml）を加え、37℃で30分間静
置した後、アンピシリンを1ml当り150μｇ、カナマイシ
ンを1ml当り70μｇ、チアミンを0.01％含む２×YT液体
培地10mlに加え、37℃にて24時間振とう培養を行なっ
た。
パーファージ液（1010pfu/ml）を加え、37℃で30分間静
置した後、アンピシリンを1ml当り150μｇ、カナマイシ
ンを1ml当り70μｇ、チアミンを0.01％含む２×YT液体
培地10mlに加え、37℃にて24時間振とう培養を行なっ
た。
培養液1mlを取り、遠心分離により菌体を除いた後、2
0％PEG6000及び2.5M NaCl混合溶液を200μ加え遠心分
離を行なうことにより、ファージ粒子を沈降させ、エタ
ノール沈殿処理を行なうことにより、１本鎖DNAを分離
精製、最終的に50μのTE溶液（10mM トリス塩酸、1m
M EDTA、pH8.0の溶液）に溶解させた。
0％PEG6000及び2.5M NaCl混合溶液を200μ加え遠心分
離を行なうことにより、ファージ粒子を沈降させ、エタ
ノール沈殿処理を行なうことにより、１本鎖DNAを分離
精製、最終的に50μのTE溶液（10mM トリス塩酸、1m
M EDTA、pH8.0の溶液）に溶解させた。
収量は約２〜10μｇ程度であった。
−２） 変異部分を含む合成DNAの作成 DNA合成機を用いて第４表に示すNo.9−１−５なる配
列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、T4DNAキナー
ゼ（２単位）を用いて37℃にて１時間反応を行ない、
５′末端部分をリン酸化させ、プライマーDNAとした。
列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、T4DNAキナー
ゼ（２単位）を用いて37℃にて１時間反応を行ない、
５′末端部分をリン酸化させ、プライマーDNAとした。
−３） ポリリンカー前部に変異を有する突然変異体の作成 −１）で得られた一本鎖DNA1μｇと、−２）で得
られたプライマーDNA20pmolを混合して60℃で30分間、
引続き37℃で30分間保温し、アニーリングさせた後、dA
TP、dCTP、dGTP及びTTPを最終濃度が各0.5mMとなるよう
に加え、およびATPを25pmol加え、クレノー（KLENOW）
酵素（４単位）及びT4DNAリガーゼ（１単位）を用いて3
7℃にて３時間反応を行ない、突然変異部分を含む２本
鎖DNAを合成した。
られたプライマーDNA20pmolを混合して60℃で30分間、
引続き37℃で30分間保温し、アニーリングさせた後、dA
TP、dCTP、dGTP及びTTPを最終濃度が各0.5mMとなるよう
に加え、およびATPを25pmol加え、クレノー（KLENOW）
酵素（４単位）及びT4DNAリガーゼ（１単位）を用いて3
7℃にて３時間反応を行ない、突然変異部分を含む２本
鎖DNAを合成した。
次に、反応生成物の一部（約0.1μｇ）を大腸菌JM83
株を用いて形質転換を行なった後、受容菌を1.5％寒
天、アンピシリンを1ml当り100μｇ及びＸ−galを0.005
％含むＬ寒天培地に塗布し、37℃にて一昼夜培養を行な
い、出現したコロニーの内、白色コロニーを選択した。
白色コロニーの出現率は５〜10％程度であった。
株を用いて形質転換を行なった後、受容菌を1.5％寒
天、アンピシリンを1ml当り100μｇ及びＸ−galを0.005
％含むＬ寒天培地に塗布し、37℃にて一昼夜培養を行な
い、出現したコロニーの内、白色コロニーを選択した。
白色コロニーの出現率は５〜10％程度であった。
次いで、白色コロニーを、アンピシリンを1ml当り100
μｇ含むＬ液体培地10mlに植菌し、37℃にて12時間振と
う培養を行ない、常法によりプラスミドDNAを回収し
た。回収したプラスミドDNAを再び大腸菌MV1184株を用
いて形質転換を行ない、受容菌を寒天1.5％、アンピシ
リンを1ml当り100μｇ、Ｘ−galを0.005％及びIPTGを1m
M含むＬ寒天培地に塗布し、37℃にて一昼夜培養を行な
い、白色コロニーを選択し、アンピシリンを1ml当り100
μｇ含むＬ液体培地10mlに移植し、37℃にて12時間振と
う培養を行ない、常法によりプラスミドDNAを分離し
た。
μｇ含むＬ液体培地10mlに植菌し、37℃にて12時間振と
う培養を行ない、常法によりプラスミドDNAを回収し
た。回収したプラスミドDNAを再び大腸菌MV1184株を用
いて形質転換を行ない、受容菌を寒天1.5％、アンピシ
リンを1ml当り100μｇ、Ｘ−galを0.005％及びIPTGを1m
M含むＬ寒天培地に塗布し、37℃にて一昼夜培養を行な
い、白色コロニーを選択し、アンピシリンを1ml当り100
μｇ含むＬ液体培地10mlに移植し、37℃にて12時間振と
う培養を行ない、常法によりプラスミドDNAを分離し
た。
−４）突然変異一本鎖DNAの作成 −３）で得られた突然変異体プラスミドを有する大
腸菌MV184株より、−１）と全く同じ方法を用いて突
然変異を有する一本鎖DNAを得た。
腸菌MV184株より、−１）と全く同じ方法を用いて突
然変異を有する一本鎖DNAを得た。
−５）ポリリンカー後部に変異を有する合成DNAの作
成 −２）と同じ方法を用いて第４表のNo.9−２−５な
る塩基配列を有する合成DNAを作成し、リン酸化を行な
いプライマーDNAを作成した。
成 −２）と同じ方法を用いて第４表のNo.9−２−５な
る塩基配列を有する合成DNAを作成し、リン酸化を行な
いプライマーDNAを作成した。
−６）再突然変異体の作成 −３）と同じ方法を用いて、−４）で得られた一
本鎖DNA及び−５）で得られたプライマーDNAより二本
鎖DNAを合成、大腸菌JM83株を用いて形質転換を行なう
ことにより青色コロニーを得た。これよりプラスミドDN
Aを回収し、再び大腸菌MV1184株を用いて形質転換を行
なうことにより青色コロニーを出現させた。これよりプ
ラスミドDNAを回収することにより、ポリリンカー部分
の前後２個所に合計３塩基対欠失したプラスミドpUC109
1を得た。
本鎖DNA及び−５）で得られたプライマーDNAより二本
鎖DNAを合成、大腸菌JM83株を用いて形質転換を行なう
ことにより青色コロニーを得た。これよりプラスミドDN
Aを回収し、再び大腸菌MV1184株を用いて形質転換を行
なうことにより青色コロニーを出現させた。これよりプ
ラスミドDNAを回収することにより、ポリリンカー部分
の前後２個所に合計３塩基対欠失したプラスミドpUC109
1を得た。
pUC1092の作成 プラスミドpUC1092の作成は、前記のプラスミドpUC
1091の作成例に準じて行なった。変更点は次の通りであ
る。
1091の作成例に準じて行なった。変更点は次の通りであ
る。
（１）−２）の塩基配列を第４表のNo.9−１−３とす
る。
る。
（２）−５）の塩基配列を第４表のNo.9−１−５とす
る。
る。
これによりプラスミドpUC1090よりポリリンカー部分
の前部を２塩基、後部を１塩基、合計３塩基欠いた突然
変異プラスミドpUC1092を得た。
の前部を２塩基、後部を１塩基、合計３塩基欠いた突然
変異プラスミドpUC1092を得た。
pUC1081、pUC1082の作成 前記と同様に、プラスミドpUC1080を基本とし
てポリリンカー部分を１塩基および２塩基ずらした突然
変異プラスミドpUC1081,pUC1082を作成した。
てポリリンカー部分を１塩基および２塩基ずらした突然
変異プラスミドpUC1081,pUC1082を作成した。
変更点は次の通りである。
（１）pUC1081,pUC1082共に、−１）のプラスミドと
してpUC1080を用いた。
してpUC1080を用いた。
（２）−２）の合成DNAとして、pUC1081においては第
４表のNo.8−１−５、pUC1082においてはNo.8−２−５
を用いた。
４表のNo.8−１−５、pUC1082においてはNo.8−２−５
を用いた。
（３）−５）の合成DNAとして、pUC1081においては第
４表のNo.8−１−３、pUC1082においてはNo.8−１−５
を用いた。
４表のNo.8−１−３、pUC1082においてはNo.8−１−５
を用いた。
以上、基本となるプラスミドpUC1090、pUC1080及び作
成した突然変異プラスミドpUC1091、pUC1092、pUC1081
及びpUC1082の間の関係についてまとめると、第５表の
とおりとなる。
成した突然変異プラスミドpUC1091、pUC1092、pUC1081
及びpUC1082の間の関係についてまとめると、第５表の
とおりとなる。
第 ４ 表 合成DNAの塩基配列表 変異部分を含むDNA塩基配列 （９−１−５） ５′GCCAAGCTTGCGTAATCATG3′ （９−２−５） ５′AGCCAAGCTTCGTAATCATG3′ （９−１−３） ５′ACGACGGCCAGAATTCCCGG3′ （９−２−３） ５′CGACGGCCAGGAATTCCCGG3′ （８−１−５） ５′CCGGGAATTCTAATCATGGT3′ （８−２−５） ５′CCGGGAATTCAATCATGGTC3′ （８−１−３） ５′ACGGCCAGTGAAGCTTGGCT3′ （８−２−３） ５′CGGCCAGTGCAAGCTTGGCT3′ pUCA1090の作成 １）プラスミドpUC1090 10μｇを制限酵素EcoR I（10
単位）及びHind III（10単位）を用いて37℃にて１時間
反応を行なった後、分解産物を0.7％アガロース電気泳
動を用いて分離し、ポリリンカー部分を含まないEcoR I
切断部位及びHind III切断部位を含むDNA断片（約3100
塩基対）をゲルより切り出し、フェノール処理を行なう
ことにより精製した。
単位）及びHind III（10単位）を用いて37℃にて１時間
反応を行なった後、分解産物を0.7％アガロース電気泳
動を用いて分離し、ポリリンカー部分を含まないEcoR I
切断部位及びHind III切断部位を含むDNA断片（約3100
塩基対）をゲルより切り出し、フェノール処理を行なう
ことにより精製した。
２）DNA合成機を用いて第６表に示した塩基配列を有す
るポリリンカーの上鎖、下鎖を合成し、各々１μｇづつ
を混合し、70℃に30分間保温し、その後室温にて徐々に
冷却することによりアニーリングを行なった。
るポリリンカーの上鎖、下鎖を合成し、各々１μｇづつ
を混合し、70℃に30分間保温し、その後室温にて徐々に
冷却することによりアニーリングを行なった。
３） １）で得られたDNA断片0.1μｇと、２）で得られ
たポリリンカー部分0.01μｇを混合し、T4DNAリガーゼ
（２単位）を用いて４℃にて12時間連結反応を行なっ
た。反応液を大腸菌MV1184株を用いて形質転換を行なっ
た後、受容菌を寒天1.5％、アンピシリンを1ml当り100
μｇ含むＬ寒天培地に塗布し、37℃にて一昼夜培養を行
なうことにより形質転換体コロニーを得た。次いで該コ
ロニーをアンピシリンを1ml当り100μｇ含むＬ液体培地
10mlに植菌し、37℃にて12時間振とう培養を行ない、常
法によりプラスミドDNAを分離し、プラスミドpUCA1090
を得た。
たポリリンカー部分0.01μｇを混合し、T4DNAリガーゼ
（２単位）を用いて４℃にて12時間連結反応を行なっ
た。反応液を大腸菌MV1184株を用いて形質転換を行なっ
た後、受容菌を寒天1.5％、アンピシリンを1ml当り100
μｇ含むＬ寒天培地に塗布し、37℃にて一昼夜培養を行
なうことにより形質転換体コロニーを得た。次いで該コ
ロニーをアンピシリンを1ml当り100μｇ含むＬ液体培地
10mlに植菌し、37℃にて12時間振とう培養を行ない、常
法によりプラスミドDNAを分離し、プラスミドpUCA1090
を得た。
以下、同様の操作を行なうことにより、pUC1091よりp
UCA1091、pUC1092よりpUCA1092、pUC1080よりpUCA108
0、pUC1081よりpUCA1081、pUC1082よりpUCA1082を作成
した。
UCA1091、pUC1092よりpUCA1092、pUC1080よりpUCA108
0、pUC1081よりpUCA1081、pUC1082よりpUCA1082を作成
した。
次に、pKISA1ベクターの作成方法について述べる。
pKISA1ベクターの作成 −１）フラグメントの分離 プラスミドpUCA1090 10μｇを制限酵素Hind III（50
単位）及びAat II（４単位）を用いて37℃にて１時間反
応させた後、分解産物を0.7％アガロース電気泳動を用
いて分離し、ポリリンカー部分を含むHind III切断部位
からAat II切断部位までのDNA断片（約1,000塩基対）を
ゲルより切り出し、精製を行ない、A1090−Ｌフラグメ
ント１μｇを得た。
単位）及びAat II（４単位）を用いて37℃にて１時間反
応させた後、分解産物を0.7％アガロース電気泳動を用
いて分離し、ポリリンカー部分を含むHind III切断部位
からAat II切断部位までのDNA断片（約1,000塩基対）を
ゲルより切り出し、精製を行ない、A1090−Ｌフラグメ
ント１μｇを得た。
同様に、制限酵素EcoR I（50単位）及びAat II（４単
位）を用いて、ポリリンカー部分を含むEcoR I切断部位
からAat II切断部位までのDNA断片（約2,200塩基対）A1
090−Ｒフラグメント２μｇを得た。
位）を用いて、ポリリンカー部分を含むEcoR I切断部位
からAat II切断部位までのDNA断片（約2,200塩基対）A1
090−Ｒフラグメント２μｇを得た。
以下、プラスミドpUCA1091、A1092、A1080、A1081、A
1082を用いて同様の操作を行なうことにより、A1091−
Ｌ、A1091−Ｒ、A1092−Ｌ、A1092−Ｒ、A1080−Ｌ、A1
080−Ｒ、A1081−Ｌ、A1081−Ｒ、A1082−Ｌ及びA1082
−Ｒフラグメント合計12種類を得た。各フラグメント、
切断されるプラスミド及び切断する酵素の組合わせは次
の通りである。
1082を用いて同様の操作を行なうことにより、A1091−
Ｌ、A1091−Ｒ、A1092−Ｌ、A1092−Ｒ、A1080−Ｌ、A1
080−Ｒ、A1081−Ｌ、A1081−Ｒ、A1082−Ｌ及びA1082
−Ｒフラグメント合計12種類を得た。各フラグメント、
切断されるプラスミド及び切断する酵素の組合わせは次
の通りである。
−２）ジョイント配列の作成例 DNA合成機を用いて第７表に示すジョイント配列の上
鎖及び下鎖を各々合成した。
鎖及び下鎖を各々合成した。
上鎖１μｇ及び下鎖１μｇを混合し、70℃に30分間保
温し、室内に放置し徐々に冷却することによりアニーリ
ングを行ない、２本鎖DNAとした。
温し、室内に放置し徐々に冷却することによりアニーリ
ングを行ない、２本鎖DNAとした。
−３）L,Rフラグメントとジョイント配列の結合 −１）で得られたA1090−Ｌフラグメント0.1μｇ、
A1090−Ｒフラグメント0.2μｇ及び−２）で得られた
ジョイント配列0.01μｇを、常法によりT4DNAリガーゼ
（２単位）を用いて連結反応を行なわせた。反応液を大
腸菌JM83株を用いて形質転換を行なった後、受容菌を1.
5％寒天及びアンピシリンを1ml当り100μｇ含むＬ寒天
培地に塗布し、37℃にて一昼夜培養することにより形質
転換コロニーを出現させ、アンピシリンを1ml当り100μ
ｇ含むＬ液体培地10mlに移植し、37℃にて12時間振とう
培養を行なった。その後培養液より常法によりプロスミ
ドDNAを分離し、プラスミドpKISA10900を得た。
A1090−Ｒフラグメント0.2μｇ及び−２）で得られた
ジョイント配列0.01μｇを、常法によりT4DNAリガーゼ
（２単位）を用いて連結反応を行なわせた。反応液を大
腸菌JM83株を用いて形質転換を行なった後、受容菌を1.
5％寒天及びアンピシリンを1ml当り100μｇ含むＬ寒天
培地に塗布し、37℃にて一昼夜培養することにより形質
転換コロニーを出現させ、アンピシリンを1ml当り100μ
ｇ含むＬ液体培地10mlに移植し、37℃にて12時間振とう
培養を行なった。その後培養液より常法によりプロスミ
ドDNAを分離し、プラスミドpKISA10900を得た。
以下、フラグメントの組合わせを変えることにより、
pKISA10901、A10902、A10910、A10911、A10912、A1092
0、A10921、A10922、A10800、A10801、A10802、A1081
0、A10811、A10812、A10820、A10821及びA10822の合計1
8種類のpKISA1ベクターシリーズを作成した。
pKISA10901、A10902、A10910、A10911、A10912、A1092
0、A10921、A10922、A10800、A10801、A10802、A1081
0、A10811、A10812、A10820、A10821及びA10822の合計1
8種類のpKISA1ベクターシリーズを作成した。
完成したpKISA1ベクター及びフラグメントの組合わせ
は次の通りである。
は次の通りである。
pKISAベクターシリーズの作成 −１）pKISA900、A901、A902、A910、A911、A912、A9
20、A921、A922の作成 プラスミドpUC9 ５μｇを制限酵素Pvu II（24単位）
を用いて37℃にて１時間反応させた後、0.7％アガロー
ス電気泳動にて分離を行ない、ポリリンカー部分を含ま
ないDNA断片（約2,300塩基対）をゲルより切り出し精製
した。又、pKISA109シリーズ（即ち、pKISA10900、A109
01、A10902、A10910、A10911、A10912、A10920、A1092
1、A10922）各々５μｇを同じく制限酵素Pvu II（24単
位）を用いて37℃にて１時間反応させた後、0.7％アガ
ロース電気泳動にて分離を行ない、ポリリンカー部分を
含むDNA断片（約300塩基対）をゲルより精製した。
20、A921、A922の作成 プラスミドpUC9 ５μｇを制限酵素Pvu II（24単位）
を用いて37℃にて１時間反応させた後、0.7％アガロー
ス電気泳動にて分離を行ない、ポリリンカー部分を含ま
ないDNA断片（約2,300塩基対）をゲルより切り出し精製
した。又、pKISA109シリーズ（即ち、pKISA10900、A109
01、A10902、A10910、A10911、A10912、A10920、A1092
1、A10922）各々５μｇを同じく制限酵素Pvu II（24単
位）を用いて37℃にて１時間反応させた後、0.7％アガ
ロース電気泳動にて分離を行ない、ポリリンカー部分を
含むDNA断片（約300塩基対）をゲルより精製した。
次に、上記のpUC9由来のDNA断片0.2μｇ及びpKISA109
シリーズ由来のDNA断片各々0.05μｇを混合し、T4DNAリ
ガーゼ（２単位）を用いて４℃、12時間連結反応を行な
い、大腸菌JM83株を用いて順次形質転換を行ない、形質
転換体よりプラスミドDNAを順次分離し、プラスミドpKI
SA900、A901、A902、A910、A911、A912、A920、A921、A
922を得た。
シリーズ由来のDNA断片各々0.05μｇを混合し、T4DNAリ
ガーゼ（２単位）を用いて４℃、12時間連結反応を行な
い、大腸菌JM83株を用いて順次形質転換を行ない、形質
転換体よりプラスミドDNAを順次分離し、プラスミドpKI
SA900、A901、A902、A910、A911、A912、A920、A921、A
922を得た。
−２）pKISA800、A801、A802、A810、A811、A812、A8
20、A821、A822の作成 −１）において、pKISA109シリーズの代りにpKISA1
08シリーズ（即ち、pKISA10800、A10801、A10802、A108
10、A10811、A10812、A10820、A10821、A10822）を用い
ることにより、全く同様の操作を経て、プラスミドpKIS
A800、A801、A802、A810、A811、A812、A820、A821、A8
22を得た。
20、A821、A822の作成 −１）において、pKISA109シリーズの代りにpKISA1
08シリーズ（即ち、pKISA10800、A10801、A10802、A108
10、A10811、A10812、A10820、A10821、A10822）を用い
ることにより、全く同様の操作を経て、プラスミドpKIS
A800、A801、A802、A810、A811、A812、A820、A821、A8
22を得た。
次に、本発明のpKISAベクターシリーズを用いて大腸
菌のテトラサイクリン耐性遺伝子のサブクローン化を行
なった実施例を説明する。
菌のテトラサイクリン耐性遺伝子のサブクローン化を行
なった実施例を説明する。
（実施例） １）大腸菌のテトラサイクリン耐性遺伝子を有するプラ
スミドpBR322（宝酒造（株）販売）10μｇを、制限酵素
EcoR V（10単位）及びAcc III（10単位）を用いて、37
℃にて１時間反応を行なった後、分解産物を0.7％アガ
ロース電気泳動を用いて分離し、ゲルより制限酵素EcoR
Vサイト及びAcc IIIサイトを有する大腸菌のテトラサ
イクリン耐性遺伝子のDNA断片（約1500塩基対）を切り
出し、フェノール処理を行なうことにより精製した。
スミドpBR322（宝酒造（株）販売）10μｇを、制限酵素
EcoR V（10単位）及びAcc III（10単位）を用いて、37
℃にて１時間反応を行なった後、分解産物を0.7％アガ
ロース電気泳動を用いて分離し、ゲルより制限酵素EcoR
Vサイト及びAcc IIIサイトを有する大腸菌のテトラサ
イクリン耐性遺伝子のDNA断片（約1500塩基対）を切り
出し、フェノール処理を行なうことにより精製した。
２）プラスミドpKISA10900 10μｇを制限酵素EcoR V
（10単位）及びAcc III（10単位）を用いて、37℃にて
１時間反応を行なった後、分解産物を0.7％アガロース
電気泳動を用いて分離し、ゲルより制限酵素EcoR Vサイ
トよりAcc IIIサイトまでを有する大きい方のDNA断片
（約1500塩基対）を切り出し、フェノール処理を行なう
ことにより精製した。
（10単位）及びAcc III（10単位）を用いて、37℃にて
１時間反応を行なった後、分解産物を0.7％アガロース
電気泳動を用いて分離し、ゲルより制限酵素EcoR Vサイ
トよりAcc IIIサイトまでを有する大きい方のDNA断片
（約1500塩基対）を切り出し、フェノール処理を行なう
ことにより精製した。
３）次に、１）で得られたDNA断片0.1μｇと２）で得ら
れたDNA断片0.1μｇを混合し、T4DNAリガーゼ（２単
位）を用いて４℃、12時間凍結反応を行なった後、反応
液の一部を大腸菌CSH16株を用いて形質転換を行なっ
た。受容菌を1.5％寒天及びアンピシリンを1ml当り100
μｇ含むＬ寒天培地に塗布し、37℃にて一昼夜培養を行
ない、青色の形質転換体コロニーを得た。
れたDNA断片0.1μｇを混合し、T4DNAリガーゼ（２単
位）を用いて４℃、12時間凍結反応を行なった後、反応
液の一部を大腸菌CSH16株を用いて形質転換を行なっ
た。受容菌を1.5％寒天及びアンピシリンを1ml当り100
μｇ含むＬ寒天培地に塗布し、37℃にて一昼夜培養を行
ない、青色の形質転換体コロニーを得た。
本形質転換体コロニーは、プラスミドpBR322のEcoR V
サイト及びAcc IIIサイトに大腸菌のテトラサイクリン
耐性遺伝子のEcoR VサイトからAcc IIIサイトまでのDNA
断片がクローン化されたプラスミドを有している。
サイト及びAcc IIIサイトに大腸菌のテトラサイクリン
耐性遺伝子のEcoR VサイトからAcc IIIサイトまでのDNA
断片がクローン化されたプラスミドを有している。
以上の実施例の結果より、大腸菌のテトラサイクリン
耐性遺伝子のクローン化を容易に行なうことができるこ
とがわかった。
耐性遺伝子のクローン化を容易に行なうことができるこ
とがわかった。
［発明の効果］ 以上説明したように、本発明のベクターあるいはベク
ターシリーズによれば、蛋白質をコードしている遺伝子
を極めて容易に検出できるという利点を有する。
ターシリーズによれば、蛋白質をコードしている遺伝子
を極めて容易に検出できるという利点を有する。
第１図は本発明に係るベクターの一例の遺伝子地図、第
２図は従来のベクターの遺伝子地図である。
２図は従来のベクターの遺伝子地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (6)
- 【請求項１】制限酵素EcoR I,Sac I,EcoR V,Nco I,Bgl
II,Kpn I,Cla I,Mlu I,Xho I,Hind IIIの各切断部位の
塩基配列を有する第一のマルチクローニングサイト及び
第二のマルチクローニングサイトの２個を有し、該第一
のマルチクローニングサイト、３種の終止コドンが挿入
された中継ぎ塩基配列、該第二のマルチクローニングサ
イト、及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と連結されてい
ることを特徴とするベクター。 - 【請求項２】制限酵素EcoR I,Sac I,EcoR V,Nco I,Bgl
II,Kpn I,Cla I,Mlu I,Xho I,Hind IIIの各切断部位の
塩基配列を有する第一のマルチクローニングサイト及び
第二のマルチクローニングサイトの２個を有し、該第一
のマルチクローニングサイト、３種の終止コドンが挿入
された中継ぎ塩基配列、該第二のマルチクローニングサ
イト、及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と連結されてい
るベクターであって、該ベクターは前記のすべての切断
部位のアミノ酸に対応するフレームを３種類すべて前記
第一及び第二のマルチクローニングサイトに有する18種
のものを備えてなるベクターシリーズ。 - 【請求項３】制限酵素EcoR I,Sac I,EcoR V,Nco I,Bgl
II,Kpn I,Cla I,Mlu I,Xho I,Hind IIIの各切断部位の
塩基配列を有する第一のマルチクローニングサイト及び
第二のマルチクローニングサイトの２個を有し、該第一
のマルチクローニングサイト、３種の終止コドンが挿入
された中継ぎ塩基配列、該第二のマルチクローニングサ
イト、及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と連結されてい
るベクターであって、該ベクターは前記のすべての切断
部位のアミノ酸に対応するフレームを３種類すべて前記
第一及び第二のマルチクローニングサイトに有する18種
のものを備えてなるベクターシリーズの中から所望のベ
クターを選択し、該ベクターおよび蛋白質をコードして
いる遺伝子を所定の制限酵素にて切り出した後両者を結
合することにより、β−ガラクトシダーゼ反応を利用し
て色の変化を判別することにより蛋白質をコードしてい
る遺伝子を検出することを特徴とする遺伝子の検出方
法。 - 【請求項４】制限酵素EcoR I,Sac I,EcoR V,Nco I,Bgl
II,Kpn I,Cla I,Mlu I,Xho I,Hind IIIの各切断部位の
塩基配列を有する第一のマルチクローニングサイト及び
第二のマルチクローニングサイトの２個を有し、該第一
のマルチクローニングサイト、３種の終止コドンが挿入
された中継ぎ塩基配列、該第二のマルチクローニングサ
イト、及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と連結されてい
る発現ベクターであって、該ベクターは前記のすべての
切断部位のアミノ酸に対応するフレームを３種類すべて
前記第一及び第二のマルチクローニングサイトに有する
18種のものを備えてなるベクターシリーズの中から所望
のベクターを選択し、該ベクターおよび蛋白質をコード
している遺伝子を所定の制限酵素にて切り出した後両者
を結合し、次いで形質転換を行なうことにより、蛋白質
を発現させることを特徴とする蛋白質の発現方法。 - 【請求項５】制限酵素EcoR I,Sac I,EcoR V,Nco I,Bgl
II,Kpn I,Cla I,Mlu I,Xho I,Hind IIIの各切断部位の
塩基配列を有する第一のマルチクローニングサイト及び
第二のマルチクローニングサイトの２個を有し、該第一
のマルチクローニングサイト、３種の終止コドンが挿入
された中継ぎ塩基配列、該第二のマルチクローニングサ
イト、及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と連結されてい
るベクターであって、該ベクターは前記のすべての切断
部位のアミノ酸に対応するフレームを３種類すべて前記
第一及び第二のマルチクローニングサイトに有する18種
のものを備えてなるベクターシリーズのすべての混合
物、および蛋白質をコードしている遺伝子を所定の制限
酵素にて切り出した後両者を結合することにより、β−
ガラクトシダーゼ反応を利用して色の変化を判別するこ
とにより蛋白質をコードしている遺伝子を検出すること
を特徴とする遺伝子の検出方法。 - 【請求項６】制限酵素EcoR I,Sac I,EcoR V,Nco I,Bgl
II,Kpn I,Cla I,Mlu I,Xho I,Hind IIIの各切断部位の
塩基配列を有する第一のマルチクローニングサイト及び
第二のマルチクローニングサイトの２個を有し、該第一
のマルチクローニングサイト、３種の終止コドンが挿入
された中継ぎ塩基配列、該第二のマルチクローニングサ
イト、及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と連結されてい
る発現ベクターであって、該ベクターは前記のすべての
切断部位のアミノ酸に対応するフレームを３種類すべて
前記第一及び第二のマルチクローニングサイトに有する
18種のものを備えてなるベクターシリーズのすべての混
合物、および蛋白質をコードしている遺伝子を所定の制
限酵素にて切り出した後両者を結合し、次いで形質転換
を行なうことにより、蛋白質を発現させることを特徴と
する蛋白質の発現方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62130799A JP2580170B2 (ja) | 1987-05-27 | 1987-05-27 | ベクタ−とそれを用いた遺伝子の検出方法および蛋白質の発現方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62130799A JP2580170B2 (ja) | 1987-05-27 | 1987-05-27 | ベクタ−とそれを用いた遺伝子の検出方法および蛋白質の発現方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63294790A JPS63294790A (ja) | 1988-12-01 |
| JP2580170B2 true JP2580170B2 (ja) | 1997-02-12 |
Family
ID=15042977
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62130799A Expired - Fee Related JP2580170B2 (ja) | 1987-05-27 | 1987-05-27 | ベクタ−とそれを用いた遺伝子の検出方法および蛋白質の発現方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2580170B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001048226A1 (fr) * | 1999-12-28 | 2001-07-05 | Japan Science And Technology Corporation | Ligands d'ajustement de cadres |
-
1987
- 1987-05-27 JP JP62130799A patent/JP2580170B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63294790A (ja) | 1988-12-01 |
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