JPH04211391A - ヒルジン誘導体、その取得法、組換えｄｎａ及び組換えベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｅ．コリー分泌型突然
変異体からヒルジン誘導体を得る方法並びにＮ−末端ア
ミノ酸配列Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを
有するヒルジン誘導体に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒルジンは、６５のアミノ酸を有するポ
リペプチドであり、ヒル（Ｈｉｒｕｄｏｍｅｄｉｃｉｎ
ａｌｉｓ）から単離された。これは、トロンビンに対す
る高特異的な抑制剤としての作用をし、この際、これは
トロンビンと安定な錯体を形成し、従って、多くの治療
的使用可能性、殊に、抗凝血治療のための用途を有する
（　Ｆ．　　Ｍａｒｋｑｕａｒｄｔ，　Ｂｉｏｍｅｄ．
　　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　　Ａｃｔａ　　４４（１９８５
）、１００７〜１０１３参照）。

【０００３】ヒルジンの完全なアミノ酸配列の開示（Ｊ
．Ｄｏｄｔ　等によるＦＥＢＳ　　ＬＥＴＴＥＲＳ　　
１６５（２）、（１９８４）、１８０〜１８４）の後に
、組換えＤＮＡ−技術及び微生物中での表現によるヒル
ジンの製造に関する前提が示された。

【０００４】欧州特許（ＥＰ−Ａ）第１５８５６４号（
Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）明細書は、宿主細胞殊にバクテリ
ア細胞内でのヒルジン又はヒルジン類縁体の表現のため
のクローニングベクターを開示している。ここでは、ヒ
ルジンに関してコードする遺伝子が、ヒルからのｍＲＮ
Ａから出発してｃＤＮＡ−合成により得られる。殊に、
Ｎ−末端配列Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ
を有するヒルジン誘導体並びにその取得法が記載されて
いる。

【０００５】欧州特許（ＥＰ−Ａ）第１６８３４２号（
Ｃｉｂａ　　Ｇｅｉｇｙ）明細書中には、ヒルジンの天
然アミノ酸配列に関してコードするＤＮＡ−配列が開示
されており、ここでＮ−末端アミノ酸配列は、Ｖａｌ−
Ｖａｌ−Ｔｈｙ−Ｔｈｒ−Ａｓｐである。ヒルジンの表
現は、微生物Ｅ．コリー及びサッカロミセス・セレヴィ
ジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　Ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）の細胞内で起こる。

【０００６】欧州特許（ＥＰ−Ａ）第１７１０２４号（
Ｈｏｅｃｈｓｔ　　ＡＧ）明細書中には、殊にＥ．コリ
ー細胞内でのヒルジン活性を有するポリペプチドの遺伝
子技術による製法が開示されており、これによれば、細
胞を溶解させ、その細胞抽出物からヒルジン活性を有す
るポリペプチドを取得する。場合により存在する融合蛋
白質分は、蛋白質分解又は化学的分解により分離除去で
き、遊離されたヒルジン分子を精製することができる。

【０００７】西ドイツ特許出願公開（ＤＥ−ＯＳ）第３
４４５５７１号（ＧＥＮ−ＢＩＯ−ＴＥＣ）の目的は、
ヒルジンの生物学的活性を有する蛋白質に関してコード
するＤＮＡ−配列並びに適当な組換えベクターで形質転
換されているようなＥ．コリー細胞からの細胞のリシス
（Ｌｙｓｉｓ）による蛋白質の取得法である。

【０００８】ベルクマン（Ｂｅｒｇｍａｎｎ）等による
論文（Ｂｉｏｌ．　　Ｃｈｅｍ．　　Ｈｏｐｐｅ　　Ｓ
ｅｙｌｅｒ　　３６７（１９８６）、７３１〜７４０頁
）にも、Ｅ．コリー中でのヒルジン合成が記載されてい
る。この細胞からのヒルジンの遊離を、トルオールでの
処理により行なっており、この際、細胞のＡ５７８単位
約５００ｎｇ／ｌの僅かな収量のみが達成される。

【０００９】欧州特許（ＥＰ−Ａ）第２００６５５号（
Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）、同第２５２８５４号（Ｔｒａｎ
ｓｇｅｎｅ）及び同第２２５６３３号（Ｃｉｂａ　　Ｇ
ｅｉｇｙ）明細書には、分泌により真核性宿主微生物殊
に酵母からヒルジン活性を有する蛋白質を取得すること
が開示されており、ここでは、構造遺伝子の上流に１個
の信号ペプチドを有するＤＮＡ−配列を有するベクター
上での表現を行なっている。酵母中のＮ−末端配列Ｖａ
ｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ並びにＮ−末端配
列Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを有するヒ
ルジン誘導体の分泌が開示されている。この際、１００
ｍｇ／ｌまでの収量が示されている。

【００１０】西ドイツ特許出願公開（ＤＥ−ＯＳ）第３
９００６２６号（Ｈｏｅｃｈｓｔ　　ＡＧ）明細書中に
は、Ｎ−末端配列Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａ
ｓｐを有するヒルジン誘導体が記載されている。この表
現は、有利に、酵母中で認められ、この際、酵母−フェ
ロモン遺伝子ＭＦαのプロモータ及び信号配列がヒルジ
ン誘導体の表現及び分泌のために使用される。

【００１１】しかしながら、前記の全てのヒルジン誘導
体の製法は欠点を有する。例えば宿主微生物として酵母
を使用し、培地中でのヒルジンの分泌を用いる際に、比
較的高い収量が得られるが、酵母細胞の培養は、細菌例
えばＥ．コリーのそれよりも時間がかかり、困難が多い
。これに反して、Ｅ．コリー細胞中では、収量が比較的
僅かでかつ／又は細胞の溶解時に複雑な単離法が必要で
ある。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、細胞の溶解を必要としない方法で、バクテリア細胞
から高収量でヒルジン誘導体を取得することのできる簡
単な方法を開発することであった。

【００１３】

【課題を解決する手段】本発明の目的は、Ｅ．コリー分
泌型突然変異体からヒルジン誘導体を得る方法であり、
この方法は、 （１）　　バクテリア信号ペプチドをコードするＤＮＡ
−フラグメントの後にヒルジン誘導体に関してコードす
る遺伝子を有する組換えベクターを形成し、（２）　　
工程（１）で形成された組換えベクターを用いてＥ．コ
リー分泌型突然変異体を用いて形質転換させ、（３）　
　この形質転換された細胞を培地中で培養し、（４）　
　この培地からヒルジン誘導体を取得することより成る
。

【００１４】本発明によるヒルジン誘導体とは、ヒルか
ら誘導され、トロンビン抑制剤としての作用をし、最低
１００００ＡＴ−Ｕ（抗トロンビン単位）／ｍｇの特異
活性を有する蛋白質（　Ｄｏｄｔ　等の　Ｂｉｏｌ．　
　Ｃｈｅｍ．　　Ｈｏｐｐｅ　　Ｓｅｙｌｅｒ，３６６
（１９８５）、３７９〜３８５頁）である。ヒルジン誘
導体の概念には、約５０のアミノ酸の長さのＮ−末端融
合分を有し、蛋白質分解又は化学的分解により部分的に
又は完全に除去できる融合蛋白質をも包含し、この際、
分解生成物として最低１００００ＴＡ−Ｕ／ｍｇの特異
活性を有するヒルジン誘導体が生じる。

【００１５】有利に、本発明の方法により、次のＮ−末
端アミノ酸配列を有するヒルジン誘導体が得られる：（
Ｘ）ｍ−Ｚ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ［ここで
ｍ＝０〜５０、Ｘは同一又は異なる遺伝子コード化可能
なアミノ酸であり、ＺはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｖａ
ｌ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ及びＴｙｒの群からの遺伝子
コード化可能なアミノ酸を表わす］。

【００１６】ｍが０より大きい場合には、配列Ｘは特に
その末端に蛋白質分解又は化学的分解−位置を有するこ
とが有利である。例えば、配列Ｘの最後のアミノ酸がＡ
ｒｇ−基である場合は、融合配列Ｘは、典型的な消化（
Ａｒｇへの分解）により、離脱させ、活性のヒルジン誘
導体を精製することができる。しかしながら、融合分の
離脱は、同様に、他の公知の蛋白質分解酵素又は化学的
分解試薬によって実施することができる。例えば、Ｘの
アミノ酸配列が末端にＭｅｔ−基を有する場合は、シア
ン化ハロゲン分解（　Ｅ．　Ｇｒｏｓｓ　　及び　　Ｂ
．　Ｗｉｔｔｋｏｐ　、　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　
Ｓｏｃ．８２（１９６１）、１５１０〜１５１７）によ
り、融合蛋白質を分解することができる。例えば、Ｘの
Ｃ−末端アミノ酸配列が、アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含有する場合は、因子Ｘａを用いる
分解を行なうことができる（欧州特許ＥＰ−Ａ第２５１
９０号及び同第１６１９７３号参照）。

【００１７】本発明の方法でｍ＝０である場合には、Ｚ
はＧｌｎ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、
Ａｓｐ又はＡｓｎ特にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ
又はＡｓｎであるのが有利である。ｍが０でＺがＡｌａ
であるヒルジン誘導体が最も有利である。

【００１８】従って、本発明の目的物の１つは、Ｎ−末
端配列Ａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（ここでＡ
はＧｌｎ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、
Ａｓｐ又はＡｓｎ特にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ
又はＡｓｎを表わす）を有するヒルジン誘導体である。 Ｎ−末端配列Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ
を有する誘導体が最も有利である。このヒルジン誘導体
から、Ｅ．コリー分泌型突然変異体の培養上澄み中に、
意想外にも、２ｇ／ｌ（培地）より多い活性ヒルジンを
得ることができた。

【００１９】本発明方法のもう１つの利点は、細胞培地
内へのヒルジン誘導体の分泌により、ヒルジンのジサル
ファイド橋が、培地の酸化条件下に正当に形成されるこ
とである。

【００２０】本発明におけるＥ．コリー分泌型突然変異
体とは、培地中で、多量の蛋白質分泌を示すＥ．コリー
菌株である。この分泌型突然変異体の製法は、欧州特許
（ＥＰ−Ａ）第３３８４１０号明細書中に開示されてい
る。適当なＥ．コリー分泌型突然変異体の取得時には、
殊にＥ．コリーＤＳ４１０（ＤＳＭ４５１３）又はＥ．
コリーＢＷ７２６１（ＤＳＭ５２３１）から出発するこ
とができる。それぞれのＥ．コリー菌株を、まず、分泌
可能な蛋白質に関してコードするＤＮＡ−配列を含有す
るプラスミドを用いて形質転換させる。引続きこの形質
転換されたＥ．コリー菌株をＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジンを用いる処理により突然変異
生成を行なわせる。次いで、適当な分泌型突然変異菌株
の選択を行なう。分泌可能な蛋白質として例えばα−シ
クロデキストリングリコシルトランスフェラーゼを使用
すると、分泌型突然変異体は、細胞壁活性物質Ｄ−サイ
クロセリンに対する耐性により認識できる。更に、α−
サイクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（
ＣＧＴアーゼ）の分泌は、周囲の培地（これはアミロペ
クチン−アズール−培地の使用の際に、分泌型突然変異
体に関する付加的な選択可能性を与える）中のデンプン
を加水分解する作用をする。

【００２１】本発明のための組換えベクターとしては、
Ｅ．コリーゲノム中に集積できるベクター（例えばバク
テリオファージλ）又は形質転換されたＥ．コリー細胞
内に染色体外で存在するベクター（例えばプラスミド）
が好適である。プラスミドを使用するのが有利である。

【００２２】信号蛋白質及びヒルジン−誘導体より成る
蛋白質に関してコードする組換えベクター上のこの遺伝
子構成は、有利に、誘導可能なプロモータ特にｔｒｐ−
ｌａｃ−融合プロモータ（これは、ラクトース−又はイ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）−
添加により誘導可能である）の制御（Ｋｏｎｔｒｏｌｌ
ｅ）下に存在する。このベクター上には、更に、選択マ
ーカー遺伝子及び場合によりｌａｃ−リプレッサー遺伝
子が存在する。

【００２３】ヒルジン誘導体の分泌を可能とするバクテ
リア信号配列としては、原則的に、Ｅ．コリー細胞の膜
の侵入を許容する全ての周知信号蛋白質が好適である。 従って、グラム陰性菌からの信号蛋白質、例えば次のＥ
．コリーの蛋白質の信号蛋白質を使用するのも有利であ
る：細胞膜外蛋白質ＯｍｐＡ（ＤｉＲｉｅｎｚｏ　等の
１９７８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７，４
８１〜５３２）、アルカリホスファターゼＰｈｏＡ（Ｉ
ｎｏｕｙｅ　等の１９８２、Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
．　　１４９，４３４〜４３９）、ＬａｍＢ−蛋白質（
Ｈｅｄｇｐｅｔｈ　等の１９８０、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ
．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ　　７７，２６２１〜
２６２５）、マルトース結合蛋白質Ｍａ１Ｅ（Ｂｅｄｏ
ｕｅｌｌｅ　　Ｈ．　等の１９８０、Ｎａｔｕｒｅ　２
８５：７８〜８１）。

【００２４】特にα−ＣＧＴアーゼ−信号蛋白質を使用
するのが有利である。

【００２５】本発明の方法に好適なベクターは、例えば
プラスミドｐＣＭ７０５（図１参照）であり、これは、
欧州特許（ＥＰ−Ａ）第３８３４１０号明細書に記載の
プラスミドｐＣＭ７０３から、約１ｋｂの長さのＮｒｕ
Ｉ−フラグメントの除去により入手される。このベクタ
ーは、アンピシリン−耐性遺伝子、ｌａｃ−リプレッサ
ーに関する遺伝子及び信号蛋白質に関してコードする断
片を５′−末端に有するＣＧＴアーゼ−遺伝子を有する
。ヒルジン誘導体に関してコードする遺伝子は、ベクタ
ーｐＣＭ７０５内に集めると、細胞内で、そのＮ−末端
にα−ＣＧＴアーゼの信号蛋白質を有する先駆分子が生
じる。この遺伝子構造は、ｔａｃ−プロモーターの制御
下にある。この方法で得られるプラスミドを用いて、Ｅ
．コリー分泌型突然変異体が形質転換されうる。

【００２６】ポジチブに形質転換されたクローンを振動
フラスコ中又は培養器中で培養する。約１の光学密度（
ＯＤ６００）の達成時にＩＰＴＧ（イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトシド）又はラクトースによる誘導を行
なう。

【００２７】次いで、トロンビン−不活性化試験（Ｇｒ
ｉｅｓｂａｃｈ　等のＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ３７、（１９８５）、３４７〜３５０）を用い
て、ヒルジン誘導体の生産の経過を測定する。融合蛋白
質の蓄積をＨＰＬＣ−クロマトグラフィ（逆相）により
分析する。融合蛋白質のプレ分（Ｐｒａｅａｎｔｅｉｌ
）は、分解することができ、生じる活性ヒルジン誘導体
を精製することができる。

【００２８】

【実施例】次の実施例につき、図１〜図５を用いて本発
明を詳説する。

【００２９】図面は次のものを示している：図１　　　
　プラスミドｐＣＭ７０５ 図２　　　　ｐＫ１５２からの合成ヒルジン遺伝子のＤ
ＮＡ−配列 図３　　　　オリゴヌクレオチドＨＩＲ１、ＨＩＲ２及
びＨＩＲ３の配列 図４　　　　プラスミドｐＣＭ７０５１図５　　　　プ
ラスミドｐＣＭ７０５３例　　１ 分泌ベクターの形成 プラスミドｐＫ１５２は、その配列が欧州特許（ＥＰ−
Ａ）第０１７１０２４号明細書中に記載されている合成
ヒルジン遺伝子を有する。このプラスミドから出発して
、アガロース−ゲル電気泳動により、約２００ｂｐの大
きさのＨｉｎｆＩ−Ｈｉｎｄ　　ＩＩＩ　　ＤＮＡ−プ
ラグメント（これはヒルジンに関してコードするＤＮＡ
配列の大部分を有する）（図２）を単離した。欠失５′
−末端配列を、新合成オリゴヌクレオチド（ＨＩＲ１）
により再生させる。このオリゴヌクレオチドのこのコー
ドする配列は図３中に示されている。Ｈｉｎｆ　　Ｉ−
末端の融合により、Ｎ−末端配列Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙ
ｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを有するヒルジン誘導体が生じる。

【００３０】プラスミドｐＣＭ７０５（図１）をＰｓｔ
　　Ｉ及びＨｉｎｄ　　ＩＩＩを用いて切断する。双方
の切断位置は、ＣＧＴアーゼの遺伝子に関するコード化
範囲内にあり、これにより、約１ｋｂの大きさのＤＮＡ
−片が切り出される。Ｐｓｔ　　Ｉは、信号ペプチダー
ゼ切断位置に関してコードする範囲内で正確に切断する
。

【００３１】フラグメントｐＣＭ７０５　　Ｐｓｔ　　
Ｉ−Ｈｉｎｄ　　ＩＩＩ　　６．３ｋｂ、ｐＫ１５２　
　Ｈｉｎｆ　　Ｉ−Ｈｉｎｄ　　ＩＩＩ　　０．２ｋｂ
及びオリゴヌクレオチドＨＩＲ１は相互に連結され、こ
れにより、プラスミドｐＣＭ７０５１が生じる（図４）
。この連結バッチを用いて、Ｅ．コリー菌株ＨＢ１０１
（ＤＳＭ１６０７）を形質転換させる。アミロペクチン
アズール（着色されたアミロペクチン）を有する選択培
地上でデンプン分解暈を示さず、従ってα−ＣＧＴアー
ゼ−表現を示さないコロニーを単離し、単一になるまで
精製する。多数の精製されたクローンから、プラスミド
−ＤＮＡを単離し、制限分析により特徴付ける。ヒルジ
ン−インサートを有する２個のプラスミドで、融合領域
の配列分析を実施する。

【００３２】正確なヒルジン−遺伝子構造を有するプラ
スミド−ＤＮＡを、Ｎｒｕ　　Ｉ及びＮｄｅ　　Ｉを用
いて切断し、アガロースゲル電気泳動により５．１８ｋ
ｂの大きさのフラグメントを単離する。

【００３３】Ｎｄｅ　　Ｉ切断により突出する配列のク
レノフ−酵素での充填の後に、このフラグメントをリゲ
ーションにより環状化させる。生じたプラスミドをｐＣ
Ｍ７０５３と称する（図５）。

【００３４】このプラスミドｐＣＭ７０５３を用いて、
分泌型突然変異体Ｅ．コリーＷＣＭ１００（これは、欧
州特許ＥＰ−Ａ第０３３８４１０号明細書に記載の方法
で得られた）を形質転換させる。

【００３５】 例　　２ 振動フラスコ実験でのヒルジンの分泌の試験アンピシリ
ン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ−培地１０ｍｌに、
ＷＣＭ１００ｐＣＭ７０５３の新製１晩培養物を光学密
度ＯＤ４２０＝０．１まで接種した。この培養物を３０
℃で振動させる。光学密度ＯＤ４２０＝１．０に達した
ら直ちに、インダクターラクトースを１％の最終濃度ま
で添加する。４８時間後に、培養物から試料を取り出し
、細胞を遠心分離し、上澄み中のヒルジン濃度を測定す
る。この測定は、トロンビン失活試験を用いて行なう。 ４０００ＡＴ−Ｕ／ｍｌ（抗トロンビン単位）までの収
量が測定された（∧２５０ｍｇ／ｌ）。

【００３６】 例　　３ １０ｌ醗酵槽内でのヒルジン生産 アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するミニマル培地
（Ｍｉｎｉｍａｌｍｅｄｉｕｍ）７ｌに、ＷＣＭ１００
ｐＣＭ７０５３の新製１晩培養物を、光学密度ＯＤ６０
０＝０．１になるまで接種する。

【００３７】 醗酵条件は次のとおりである： 温度　　　　：３０℃ 撹拌速度：４５０〜９５０ｒ．ｐ．ｍ．通気　　　　：
０．５〜１．５Ｖｖｍ ｐＨ値　　：７．０±０．１ 光学密度ＯＤ６００＝１．０の達成時に、ＩＰＴＧ（イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）０．５ｍＭを
添加する。

【００３８】ＩＰＴＧ添加後４０時間に、上澄み中で３
６０００ＡＴ−Ｕ／ｍｌが測定できた（∧２．２５ｇ／
ｌ）。

【００３９】 例　　４ Ｎ−末端配列Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ
−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを有するヒルジンの分泌例１
と同様に実施するが、オリゴヌクレオチドＨＩＲ１の代
りにオリゴヌクレオチドＨＩＲ２（図３）を用いると、
信号ペプチドの離脱の後にＮ−末端配列Ａｌａ−Ｔｈｒ
−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを
有するヒルジン融合蛋白質が得られる。上澄み中でのこ
の融合蛋白質の蓄積を、逆相条件の使用下（Ｃ１８−ク
ロマトグラフィカラム）でＨＰＬＣ−分析により測定す
る。この遺伝子構造を有する菌株ＷＣＭ１００の醗酵は
、融合蛋白質２５ｍｇ／ｌの収量をもたらした。

【００４０】トリプシン−分解により、Ｎ−末端配列Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐを有する活性ヒ
ルジンを得ることができる。

【００４１】 例　　５ 分泌型突然変異体ＷＣＭ８８を用いるヒルジンの分泌同
様に欧州特許ＥＰ−Ａ第０３３８４１０号明細書に記載
の方法で得られた分泌型突然変異体ＷＣＭ８８を、プラ
スミドｐＣＭ７０５３を用いて形質転換させる（例１参
照）。培地中での分泌によるヒルジンの生産を、振動フ
ラスコ実験及び醗酵により試験する。

【００４２】 ａ）　　振動フラスコ実験 例２と同様に、菌株ＷＣＭ８８ｐＣＭ７０５３を培養す
る。４８時間後に、培養液の上澄み中のヒルジン濃度を
測定する。１８００ＡＴ−Ｕ／ｍｌまでの収量が得られ
た（∧１１０ｍｇ／ｌ）。

【００４３】 ｂ）　　１０ｌ醗酵槽内での生産 例３の記載と同様に、菌株の醗酵を行なう。ＩＰＴＧの
添加４５時間後に、上澄み中で２１０００ＡＴ−Ｕ／ｍ
ｌが測定できた（∧１．３ｇ／ｌ）。

【００４４】 例　　６ テトラサイクリン耐性遺伝子を有する分泌ベクターの形
成 プラスミドｐＢＲ３２２（Ｆ．　　Ｂｏｌｉｖｅｒ　等
の　Ｇｅｎｅ　　２、９５〜１１３（１９７７））の１
．１ｋｂ　　Ｎｒｕ　　Ｉ−フラグメンを単離し、Ｎｒ
ｕ　　Ｉ−分解により線状化されたプラスミドｐＣＭ７
０５１（図４参照）と連結させた。この連結混合物を用
いてＥ．コリーＨＢ１０１を形質転換させた。形質転換
物をそのテトラサイクリン耐性に基づき選択した。選択
されたクローンのプラスミド−ＤＮＡを再単離し、Ｎｄ
ｅ　　Ｉ及びＡｖａ　　Ｉを用いて切断した。ＤＮＡ−
フラグメントをアガロースゲル−電気泳動で分離した。 大きいフラグメントを単離し、突出１本鎖にクレノフ酵
素を充填し、連結させた。

【００４５】生成プラスミドはｐＣＭＴ２０３であった
。

【００４６】 例　　７ 分泌ベクターｐＣＭＴ２０３の使用下でのヒルジンの分
泌 分泌型突然変異体ＷＣＭ１００（例１参照）を、プラス
ミドｐＣＭＴ２０３を用いて形質転換させた。生じる菌
株を１０ｌ醗酵槽内で培養した。ＩＰＴＧ添加の４５時
間後に、ヒルジン４２０００ＡＴ−Ｕ／ｍｌが測定され
る（∧２．６３ｇ／ｌ）。

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＣＭ７０５を示す図

【図２】ｐＫ
１５２からの合成ヒルジン遺伝子のＤＮＡ−配列を示す
図

【図３】オリゴヌクレオチドＨＩＲ１、ＨＩＲ２及びＨ
ＩＲ３の配列を示す図

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　Ｅ．コリー分泌型突然変異体からヒル
   ジン誘導体を得る方法において、 （１）　　バクテリア信号ペプチドに関してコードする
   ＤＮＡ−断片の直後にヒルジン誘導体に関してコードす
   る遺伝子を有する組換えベクターを形成し、（２）　　
   工程（１）で形成された組換えベクターを用いてＥ．コ
   リー分泌型突然変異体を形質転換させ、（３）　　この
   形質転換された細胞を培地中で培養し、（４）　　この
   培地からヒルジン誘導体を取得することを特徴とする、
   Ｅ．コリー分泌型突然変異体からヒルジン誘導体を取得
   する方法。
2. 【請求項２】　　Ｎ−末端配列： Ａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ ［ここでＡはＡｌａ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ
   、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＡｓｎを表わす］を有す
   ることを特徴とする、ヒルジン誘導体。
3. 【請求項３】　　請求項２のヒルジン誘導体に関してコ
   ードする組換えＤＮＡ。
4. 【請求項４】　　バクテリア信号ペプチド及びヒルジン
   誘導体より成るペプチドに関してコードする遺伝子構造
   のコピー１以上を有することを特徴とする、組換えベク
   ター。