JPH0235077A - 培地中に多量の蛋白質分泌を行うための大腸菌株、その製法及び蛋白質の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は培地中に多量の蛋白質全分泌する大腸菌株、そ
の製法及び蛋白質の製造性に関する。

従来の技術 ダラム陰性菌の細胞壁の構造のために、蛋白質の培地中
への実質的な分泌は行なわれないということが前提とな
っている、それというのも外膜が強力な透過性妨害壁を
形成しているためである。自然においては、犬ｌｉ！ｊ
Ｉ菌（１蛋白質全分泌すること、もしくは培地中に排泄
することはない。大腸菌においてはべりプラズム中への
蛋白質搬出だけが可能である。蛋白質へモリジン及びコ
リシンの二つが例外である。Ｏれらのエキソ蛋白質は、
それぞれのエキソ蛋白質に特異的な分泌蛋白質が排泄工
程において関与しているので、例外である（　Ｗａｇｎ
ｅｒ等著、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｂｅｍ−’ｓ第３６９巻、１９８８年、第６９〜４６
頁。

更に、文献には大腸菌のための人工的な分泌システムが
記載されているが、これは培地中への非常に僅かなエキ
ソ蛋白質収率にのみ導びくか、又はその使用において制
限がある。

（ａ）　　いわゆる“漏出変異体”　この種の突然変異
体としては例えば大腸菌に１２株が公知であり、この際
外膜中での欠失のためにペリプラズム蛋白質もしくはべ
りプラズム蓄積蛋白質が培地中に達する。これは非特異
的な機構である（　Ｌａｚｚｏｓｏｎｉ　＆　Ｐｏｒｔ
ａｌｉｅｒ著、Ｊ、　Ｂａｃｔ、　、第１４５巻（１９
８１年）、第１６５１〜１３５８頁）。この漏出変異体
の１部は外膜において変化したリポ多糖構造を有する菌
株であり、１部は外膜において変化したリポ蛋白質量を
有する菌株である（　Ｈｉｒｏｔａ等署、Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、第７４巻（１９７７年）第１４１７
〜１４２０頁、並びにＹｅｍ　＆　Ｗｕ著、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、第１ろ６巻（１９７８年）、
第１４１９〜１４２６頁参照）。いわゆる“ｔ○１″座
での突然変異もホスホリパーゼＡの活性化金倉して”漏
出″−表現型に導びく。この場合、特異的又は非特異的
゛漏出゛′でありうる。

（ｂ）　　ヨーロッパ特許公開第０２２５８６０号公報
＝８６．８５０４１５．Ｏ，による蛋白質入−融合によ
る蛋白質分泌。

この技術水準の基礎は大腸菌中でのフィラメント状成長
の誘導がペリプラズム蛋白質の培地中への分泌に導び（
という観察である。大腸菌はいわゆる熱シヨツク応答の
誘導においてフィラメント状成長全示す。所望の遺伝子
生成物の表現全熱ショック応答に依存性であるようにす
る場合、所主のペリプラズム中に蓄積する蛋白質の分泌
が達せられる。この方法においてはスタフィロコッカス
・アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅ
ｕｓ　）からの蛋白質Ａ並びにこの蛋白質のフラグメン
トが大腸菌中で熱シヨツク応答全惹起するということを
利用する。多分この■白質Ａは太陽菌中で自体熱シヨツ
ク蛋白質全形成する。それというのもこの蛋白質ＡＨ本
来のプロモーターの上流に／ダマ−３２−様プロモータ
ー構造を有してオ６Ｆ）、これにより効果は更に増大す
るためである。すなわち、蛋白質Ａのプロモーター配列
、シグナル配列及びＮ−末端フラグメント’に所望の蛋
白質の遺伝情報と結合すると、熱シヨツク応答及びフィ
ラメント状成長？介してペリプラズム蛋白質の培地への
分泌が生じる。しかしながら、このシステムは熱シヨツ
ク応答により付加的にＡＴＰ−依存グロチアーゼＬａが
生産される限りでは問題である。こうして所望の蛋白質
の蛋白質分解が生じる。従って、Ｌａ−欠失株（Ｉｏｎ
　　；　Ｙｏｕｎｇ　＆　Ｄａｖｉｓ著、Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　％第８０
巻（１９８３年）、第１１９４〜１１９８頁参照）？生
産のために使用することが所望される。しかしながら、
このような菌株は従来製造されていない。

ｆｃ）　　ヨーロッパ特許公開第０１２１１３８号公報
−８４，１０２４４０，９，によるペニシリナーゼ及び
キシラナーゼの細胞外製造この公知技術はベニシリナー
ゼ及びキシラナゼ全培地中に分泌するための特別な大腸
菌構造全使用する方法に関する。この公知法は特別な蛋
白質の獲得に限定される。

発明が解決しようとする課題 従って、本発明の課題は、培地中に細胞の多量の蛋白質
分泌を示なう大腸菌株金裂造することである。部分課題
は、 非病原体としての大腸菌中でのエキソ蛋白質の生産、 できるだけ高い分泌率及び エキソ蛋白質の培地からの簡単な処理（場合により濾過
）。

課題全解決する友めの手段 本発明の課題は本発明により、 （ａ）　　表現すべきエキソ蛋白質の構造遺伝子を、表
現のために好適なプラスミド中に自体公知法で統合して
ハイブリッドプラスミドとし、（ｂ）　　この形成され
たハイブリッドグラスミドで大腸菌全自体公知法で形質
転換し、 ｉｃ）　　この形質転換大腸菌株に自体公知法で突然変
異誘発全行ない、かつ （ｄｌ　　場合により、その後細胞壁活性物質にさらし
、 （ｅ）　　工程（ｃ）及び場合により工程（ｄ）　ｋ行
なった細胞材料全、自体公知法で、使用−した大腸菌株
に対して高められた蛋白質分泌を有する大腸菌突然変異
体に関するスクリーニングにかけ、かつ （ｆ）　　場合により、工程（ｅ）により得られた高め
られた蛋白質分泌’ｒ！する大腸菌突然変異体全自体公
知法で、プラスミド不含にする、ことにより製造可能な
、培地中に多量の蛋白質全分泌するための大腸菌株によ
り解決する。

エキソ蛋白質の構造遺伝子という概念は該明細書におい
ては、搬出に必須のシグナル配列（読みとり配列）をも
含む所望の蛋白質全分泌するＤＮＡ配列を意味する。工
程（ｂ）ではｍｉｎ　Ａ及び／又はｍｉｎ　Ｂ−突然変
異を有する゛大腸菌株もしくは外膜の蛋白質１種又は複
数種中に突然変異誘発する大腸菌株を使用するのが有利
である。有利に本発明による大腸菌株は大腸菌株ｕｓ１
０１より高い蛋白質分泌能により特徴付けられている。

本発明の更なる課題は本発明により、 （ａ）　　表現すべきエキソ蛋白質の構造遺伝子全表現
のために好適なプラスミド中に自体公知法で統合してハ
イブリッドプラスミドとし、（ｂ）　　この形成された
ハイブリッドプラスミドで大腸菌全自体公知法で形質転
換し、 （ｃ）　　この形質転換大腸菌株に自体公知法で突然変
異誘発を行ない、かつ （ｄ）　　場合により、その後細胞壁活性物質にさらし
、 ｔｅｌ　　工程（ｃ）及び場合により工程（ｄ）　ｋ行
なった細胞材料を、自体公知法で、使用した大腸菌株に
対して高められた蛋白質分泌を有する大腸菌突然変異体
に関するスクリーニングにかけ、かつ （ｆ）　　場合により、工程（ｅ）により得られた高め
られた蛋白質分泌を有する大腸菌突然変異体全自体公知
法で、プラスミド不含にする、こと全特徴とする、本発
明による大腸菌株の製法により解決する。

突然変異誘発は化学的に、例えばＮ−メチルＮ′−二ト
ローＮ−二トロソグアニジン（ＭＮＮＧ）金円いて実施
することができる。

細胞壁活性物質の例はＤ−サイクロセリンである。工程
（１））においてｍｉｎ　Ａ−及び／又はｍ１ｎＢ−突
然変異誘発する大腸菌株もしくは外膜の蛋白質１種又は
複数種中に突然変異を有する犬Ｓ唱株を使用するのが有
利である。特に、本発明方法において大腸菌ＤＳ４１０
もしくは大腸菌ＢＷ７２６１から出発するのが有利であ
る。

本発明方法によれば、生産が望１れている蛋白質の構造
遺伝子を包含するハイブリッドブラスミドで出発菌株を
形質転換することができる。

しかしながら、本発明方法を、培地中への所望な多量蛋
白質分泌の特性を有する突然変異体全簡単な方法でスク
リーニングさせる指示蛋白質の構造遺伝子を包含するハ
イブリッドプラスミドで出発菌株を１ず形質転換すると
いうように実施することもできる。この種の突然変異体
は指示蛋白質により確かめられるので、ここで取り扱か
う本発明方法の変法によりプラスミド不含にされ、これ
によりこのプラスミド不含突然変異的を工業的生産が宅
１れる蛋白質の構造遺伝子を包含する他のハイブリッド
プラスミドで形質転換する。指示反応としての多糖加水
分解（デンプン加水分解）に関するその能力が容易なス
クリーニング全可能とするので、指示蛋白質の例はＣＧ
Ｔである。ＣＧＴの使用においてエキソ蛋白質全コード
するＤＮＡフラグメントヲ独自の、搬出に必須のシグナ
ル配列と共に、簡単にかつ目的にあわせてその活性を制
御することのできる強力なプロモーターの制御下に、例
えばｔａ、ｃ−プロモーターの制御下におく。このため
には前記のＤＮＡ−切断部を１マルチコピーナンバー（
ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ　−ｎｕｍｂｅｒ　）”−プラスミ
ドｐＪＦ　−１１８ｕｔ中に統合することができる。

大喝菌株の形質転換、有利にはｍｉｎ　Ａ−及び／又は
ｍｉｎ　Ｂ−突然変異を有する大腸菌（ミニ細胞株）、
例えば大腸菌ＤＳ４１０、もしくは外膜の１種又は複数
種蛋白質中に突然変異を有する大腸菌、例えば大腸菌Ｂ
Ｗ７２６１の組換えプラスミドでの転換の後、化学的突
然変異誘発の受容を行ない、かつ引き続＠膜及び細胞壁
活性物質を作用させる。Ｄ−サイクロセリンに対する耐
性は本発明により改良された排泄のための使用可能な指
示である。細胞壁活性物質での処理は有利に複数回繰り
返す。潜在性分泌突然変異体は多数の得られた突然変異
体から簡単なスクリーニングシステムで選択される。突
然変異体の定量評価は酵素テスト又はイムノブロッティ
ング法（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ　）により行な
われる。

ハイブリッドプラスミド形成、形質転換、突然変異誘発
、細胞壁活性物質での処理、スクリーニング、プラスミ
ド除去、細菌の培養、並びに蛋白質獲得に関しては導入
部に記載した文献のような関連技術文献に記載されてい
る。

本発明は次の利点を提供する： （ａｌ　　本発明による大腸菌株は産業上利益となる規
模でエキソ蛋白質を生産する。

（ｂ）　　本発明による突然変異体から製造されたエキ
ソ蛋白質は安価で、かつ短時間で精製されるか、もしく
は更に使用される。

エキソ蛋白質を過剰に生産する公知細菌がその生産物金
”封入体”に凝集して細胞内に貯蔵するのに対し、本発
明による突然変異体は過剰に生産したエキソ蛋白質を定
量的に培地中に排泄する。こうして、細胞破壊及び”封
入体″の変性といった時間がかかり、かつ１部複雑な工
程がな（なる。”封入体”はしばしば搬出すべき蛋白質
のプレ型からなり、こうしてなおシグナル配列全有し、
こうして完全な触媒機能を示すことはない。僅かな場合
にのみ変性が満足のいく程度に達せられるので、本発明
による突然変異体を用いるエキソ蛋白質生産は著しく方
法全容易にした。エキソ蛋白質は培地からのみ（場合に
より濾過により）精製すればよいか、又はエキソ酵素の
場合には高い収率のために直接所望の酵素反応に使用さ
れる。

本発明による突然変異体は細菌性エキソ蛋白質生産の分
野に広く使用することができる。市販に有用な蛋白質に
関する遺伝情報を有する所望の組換プラスミドを本発明
による突然変異体中に組換ＤＮＡ法を用いて挿入するこ
とができる。

細菌増殖の静止期においては、エキソ蛋白質は本発明に
よる突然変異体により特異的に培地中に分泌される。こ
うして簡単で、迅速で、かつ安価な所望の蛋白質の精製
が可能である。エキソ蛋白質が酵素である場合、例えば
２５０ｍ９／ｌ又はそれ以上の高い酵素収率のために培
地上澄全直接酵素反応に使用することができる。

実施例 次に実施例につき本発明の詳細な説明する。

例１（本発明による大腸菌突然変異体の製造）分泌突然
変異体の製造のためにＣＧＴに関する遺伝情報金含有す
るグラスミドｐＣＭ　７　ｒ３３及び大腸菌ＤＳ４１０
’を選択する。改良された酵素分泌を有する突然変異体
に関する指示体としてＣ（）Ｔ’ｉ選択した。これに応
じて、大腸菌ＤＳ４１０　（１）ＣＭ　７０３　）　’
！ｉ−完全培地の液体培地中で６７°Ｃで培養した。光
学密度１が達せられた後、この培地懸濁液にＮ−メチル
−Ｎ′−二トロＮ−ニトロングアニジン（ＭＮＮＧ　）
　２　［１μＩ／　ｍｌ　ｆ添加し、その後更に３０分
間３７°Ｃで恒温保持した（約９０係殺菌）。細胞を燐
酸塩緩衝／ｆｉ、（ｐＨ７，０）で洗浄することにより
、突然変異誘発物質の作用を中断した。細胞懸濁液の部
分ｉ’ｋＬＢ−プレート（デンプン２チ、ラクトース０
．５チ及びＤ−サイクロセリンの上昇濃度）にひろげる
。選択のために使用した抗生物質濃度はＤ−サイクロセ
リン２００〜１０００μＩ／　ｍｌ　ｆ有し、この際こ
の濃度は各突然変異誘発工程の後２倍になった。３７°
Ｃで４８時間培養した後、分泌されたＣＧＴの活性に起
因するデンプン加水分解量の大きさにより突然変異体の
選択全行なった。グラスミド金コードする酵素の改良さ
れた潜在性の分泌を、指示プレート（アミロペクチンア
ズール０．５％）上に塗ることにより試験し、酵素テス
トにおいて確かめる。多数の突然変異体から最高細胞外
酵素活性を示す大腸菌株を選択した（大腸菌Ｄ８４１０
に５とする）。抗生物質不含培地中で多数回培養するこ
とにより、突然変異体をプラスミド不含にすることがで
きた。

例２　（ｃＧＴ−分泌） 本発明によるプラスミド不含突然変異体大腸菌Ｄｓ４１
０に５にプラスミドｐＣＭ　７０３（ｃＧＴ’ｉコード
する）で再形質転換した。この組換え菌株をＬＢ−液体
培地（ラクトース０．５係及びグルコース０．２％）中
で６０℃で培養した。２４時間、４８時間もしくは７２
時間恒温保持した後、そのつと細胞懸濁液の部分量を取
ジ出しｆ′ｃ、ｏその後、細胞を遠心分離し、１０チデ
ンプン浴液同量で希釈した培地上澄全４０°Ｃで恒温保
持した。５分間の恒温保持の後、メタノール１．５容ｔ
’を添加した。このことは未反応デンプンの沈殿に導ひ
いた。沈殿したデンプンを遠心分離し、上澄中のシクロ
デキストリン含量をＨＰＬＣ装置で調べた。次の結果金
得た。

単位／　ｍｌ　　　　　■蛋白質／１ ２４時間　　　１６〜２０　　　　６４〜８０４８時間
　　　４５〜５０　　　　１８０〜２００７２時間　　
　５５〜６０　　　　２２［］〜２４０比較例 例２を繰り返したが、大腸菌ＨＢ１０１中にプラスミド
Ｉ）ＣＭ　７０３　ｋ形質転換した。培養及び細胞外酵
素活性の測定を同様にして行なった。

次の結果が得られた： 単位／　ｍｌ　　　　　ｍ９蛋白質／１２４時間　　　
　０．５２ 例ろ（β−ラクタマーゼの分泌） 本発明による突然変異体である大腸菌Ｄ８４１　［１に
５全β−ラクタマーゼに関する遺伝情報′ｆ！：有すル
フラスミドｐＡＰ　５で形質転換した。この組換プラス
ミド中ではβ−ラクタマーゼ遺伝子は例えばラクトース
での誘発によりβ−ラクタマゼの過剰表現に作用するｔ
ａｃ−プロモーターの制御下にある。大腸菌Ｄ３４１０
　　Ｋ５（ｐＡＰ　５　）の培養及び細胞外β−ラクタ
マーゼー活性の測定のための４８時間恒温保持後の試料
採取は例２により行なった。細胞外β−ラクタマーゼ活
性は色原体基質、すなわちニトロセフイン金用いて、４
８０ｎｍにおける分光光度測定法により測定した；　３
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、第２６巻（１９８４年）、
第１２８２〜１２８７頁。

次の結果が得られた： 恒温保持時間　　　上澄中の酵素活性 （相対数値） ４８時間　　　　　　　８６ 比較例２ 例３と同様に行なったが、組換菌株大腸菌ａ　Ｂ　１０
１（ｐＡＰ　５　）全使用した。次の結果が得られた： 恒温保持時間　　　　上澄中の酵素活性（相対数値） ４８時間　　　　　　　　０．１ 例４ 例１及び２による方法金繰り返したが、大腸菌ＤＳ４１
０のかわりに大腸菌株ＢＷ７２６１（ｔｏｎ　Ａ　２２
、ｏｍｐＦ６２７）ｅプラスミドル０Ｍ　７０３と共に
使用した。これから得られた突然変異体全プラスミド不
含とし、プラスミドｐＣＭ　３０３で形質転換した。こ
の菌株をラクトース０．５％及びグルコース０．２チを
含有する液状完全培地（ＬＢ）中で３０’Ｃで培讐した
。

４８時間もしく１ｌ−ｒ、７２時間の恒温保持後、上澄
中の酵素活性を測定した（例２参照） 単位／　ｍｌ　　　　蛋白質ｍ９／１ ４８時間　　　　２８　　　　　　１４０７２時間　　
　　４２　　　　　　２１０用語解説 ｍｉｎ　Ａ　Ｂ−突然変異を有する大腸菌：　Ｄａｖｉ
ｅ等著、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、第１５８巻（１９８
４年）、第１２０２〜１２０３頁。

大腸菌ＤＳ４１Ｄ：ＤＳＭ４５１３、ドイツ微生カ保存
機関（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎＭ
ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　Ｘ　Ｍａｓｃｈｅｒｏ
ｒｄｅｒ　Ｗｅｇｌ　ｂｌ　３　ろ　ＯＱ　　Ｂｒａｕ
ｎｓｃｈｗｅｉｇ　　。

外膜中の蛋白質の突然変異を有する大腸菌株：Ｗａｎｎ
ｅｒ　、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　、第１９１巻
（１９８６年）、第３９頁。

犬１賜菌ＢＷ７２６１　：ＤＳＭ　５２ろ１、ドイツ微
生物保存機関 大腸菌ＨＢ１０１：例えばＤＳＭ　１６０７ｐＪＦ　１
１８　ｕｔ、　：第１図 ｐＣＭ　７０３　　　：第２図 ｐＡＰ　５　　　　：第３図 ｔａｃ　：　ｔａｃ−プロモーター；　Ｄｅ　Ｂｏｅｒ
等著、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　ＵＳＡ　、第８０巻（１９８３年）第２１〜２５頁 ＣＣ）Ｔ　　：　　ＣＧＴ　（ンクロデキストリングリ
コシルトランスフエラーゼ）に関する構造遺伝子（シグ
ナル配例全包含する） ｔ　　：ターミネーター ａｍｐ　　：アンぎシリン耐性 ｔｅｔ　　：テトラサイクリン耐性 ｌａｃ　ｌ　：　１ａｃ−リプンツサーＢａｍＨｉ　Ｘ
Ｃ１ａ　ｌ　ＸＥＣＯＲｌ　、　　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ、
Ｎｒｕ　Ｉ　％Ｐｓｔ　Ｉ、　Ｐｖｕ　Ｉ、Ｓｅａ　Ｉ
　：制限酵素

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＪＦ１１８ｕｔを示す図であり、第２図は９
０Ｍ７０．ろｔ示す図であり、第３図はｐＡＰを示す図
である。 ニｈ１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）表現すべきエキソ蛋白質の構造遺伝子を、表
   現のために好適なプラスミド中に自体公知法で統合して
   ハイブリッドプラスミドとし、（ｂ）この形成されたハ
   イブリッドプラスミドで大腸菌を自体公知法で形質転換
   し、 （ｃ）この形質転換大腸菌株に自体公知法で突然変異誘
   発を行ない、かつ （ｄ）場合により、その後細胞壁活性物質にさらし、 （ｅ）工程（ｃ）及び場合により工程（ｄ）を行なつた
   細胞材料を、自体公知法で、使用した大腸菌株に対して
   高められた蛋白質分泌を有する大腸菌突然変異体に関す
   るスクリーニングにかけ、かつ （ｆ）場合により、工程（ｅ）により得られた高められ
   た蛋白質分泌を有する大腸菌突然変異体を自体公知法で
   、プラスミド不含にする、ことにより製造可能な、培地
   中に多量の蛋白質を分泌するための大腸菌株。 ２、（ａ）表現すべきエキソ蛋白質の構造遺伝子を、表
   現のために好適なプラスミド中に自体公知法で統合して
   ハイブリッドプラスミドとし、（ｂ）この形成されたハ
   イブリッドプラスミドで大腸菌を自体公知法で形質転換
   し、 （ｃ）この形質転換大腸菌株に自体公知法で突然変異誘
   発を行ない、かつ （ｄ）場合により、その後細胞壁活性物質にさらし、 （ｅ）工程（ｃ）及び場合により工程（ｄ）を行なつた
   細胞材料を、自体公知法で、使用した大腸菌株に対して
   高められた蛋白質分泌を有する大腸菌突然変異体に関す
   るスクリーニングにかけ、かつ （ｆ）場合により、工程（ｅ）により得られた高められ
   た蛋白質分泌を有する大腸菌突然変異体を自体公知法で
   、プラスミド不含にする、ことを特徴とする、請求項１
   記載の大腸菌株の製法。 ３、請求項１記載の大腸菌株を使用し、培地中に多量の
   分泌を行なうことにより所望の蛋白質を製造するための
   方法。