JPS62166881A - 大腸菌のペリプラズム蛋白質分泌変異株 - Google Patents
大腸菌のペリプラズム蛋白質分泌変異株Info
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- JPS62166881A JPS62166881A JP496886A JP496886A JPS62166881A JP S62166881 A JPS62166881 A JP S62166881A JP 496886 A JP496886 A JP 496886A JP 496886 A JP496886 A JP 496886A JP S62166881 A JPS62166881 A JP S62166881A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は産業上有用な蛋白質又はペプチドを菌体外部へ
放出又は分泌できる能力を示す大腸菌ペリプラズム蛋白
質分泌変異株に関する。
放出又は分泌できる能力を示す大腸菌ペリプラズム蛋白
質分泌変異株に関する。
（従来の技術及び発明が解決しようとする問題点）細菌
の細胞質膜は多くの物質の有効な透過障壁となっていて
、能動輸送による物質の取り込み、あるいは疎水性分子
を結びつけることによる菌体内物質の分泌等を除いて、
細胞質膜を経る物質の自由な移動はないことが知られて
いる＠大腸菌などの、細胞外膜を有するダラム陰性細菌
においては、更に細胞外膜が大きな分子の出入りの障害
となっている・細胞における物質出入プの障害を細胞か
ら除くことは特異的にいくつかの物質については行われ
たこともあるが、細胞内蛋白質の多くに通用する透過障
壁の形成の理論は明らかになっていない。大腸菌の遺伝
子操作技術による各種の有用物質の生産は成る分野の物
質ですでに試みられているが、その産生された有用物質
が菌体内の蛋白質又はペプチドに属する場合には、大腸
菌の菌体外部へ培養液中へ放出されないことが多い。
の細胞質膜は多くの物質の有効な透過障壁となっていて
、能動輸送による物質の取り込み、あるいは疎水性分子
を結びつけることによる菌体内物質の分泌等を除いて、
細胞質膜を経る物質の自由な移動はないことが知られて
いる＠大腸菌などの、細胞外膜を有するダラム陰性細菌
においては、更に細胞外膜が大きな分子の出入りの障害
となっている・細胞における物質出入プの障害を細胞か
ら除くことは特異的にいくつかの物質については行われ
たこともあるが、細胞内蛋白質の多くに通用する透過障
壁の形成の理論は明らかになっていない。大腸菌の遺伝
子操作技術による各種の有用物質の生産は成る分野の物
質ですでに試みられているが、その産生された有用物質
が菌体内の蛋白質又はペプチドに属する場合には、大腸
菌の菌体外部へ培養液中へ放出されないことが多い。
従って、菌体からその目的物質を分離、採取しなければ
ならないので、種々な問題を伴なう。
ならないので、種々な問題を伴なう。
（問題点を解決するための手段）
本発明者らは大腸菌の温度感受性及び蛋白質分泌能を有
する変異株を分離することに成功し、その遺伝子の同定
、細胞膜構造の解析などの研究を進め、蛋白質分泌の制
御方法を検討した。その研究に基づいて本発明者らが割
裂した蛋白質分泌能を有する大腸菌変異株であって本発
明者らが大腸菌ＨＪＭ２３−２株と命名した大腸菌変異
株は、３０°Ｃで培養させた時には菌体内に産生された
ぼりデラズム蛋白質例えばβ−ラクタマーゼ酵素を菌体
外へ培養液中へ実質的に放出すなわち分泌しないけれど
も、温度の制御により、特に培養温度を発育至適温度よ
り高く上げることにより、例えば４２°Ｃに上げると、
ハリデラズム蛋白質を菌体外部へ放出できる能力を示す
ことを見出した。従って、本発明者らは、温度制御によ
υペリプラズム蛋白質を菌体外部に放出する能力を示す
新規な大腸菌を創製することに今回、成功した。大腸菌
が菌体内に産生ずるペリプラズム蛋白質には、産業上有
用な各種のペプチド乃至蛋白質がある・本発明者らが創
製した新規な大腸菌が温度制御により、例えば培養温度
の上昇にょシ、その菌体内のにリグラズム蛋白質を菌体
外部へ培養液中へ放出又は分易できる能力を示し、この
能力によって、はリグラズム蛋白質を培養液又は培地中
へ放出した場合には、培養液中からか＼る菌体内蛋白質
を採取することを可能にさせ、菌体自体の内部がら採取
する場合に比べて簡便である・従って、本発明者らによ
って今回創製された大腸菌は大腸菌の遺伝子操作技術に
よる各種の有用な蛋白質の製造に宿主細胞として利用で
きる。
する変異株を分離することに成功し、その遺伝子の同定
、細胞膜構造の解析などの研究を進め、蛋白質分泌の制
御方法を検討した。その研究に基づいて本発明者らが割
裂した蛋白質分泌能を有する大腸菌変異株であって本発
明者らが大腸菌ＨＪＭ２３−２株と命名した大腸菌変異
株は、３０°Ｃで培養させた時には菌体内に産生された
ぼりデラズム蛋白質例えばβ−ラクタマーゼ酵素を菌体
外へ培養液中へ実質的に放出すなわち分泌しないけれど
も、温度の制御により、特に培養温度を発育至適温度よ
り高く上げることにより、例えば４２°Ｃに上げると、
ハリデラズム蛋白質を菌体外部へ放出できる能力を示す
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が菌体内に産生ずるペリプラズム蛋白質には、産業上有
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外部へ培養液中へ放出又は分易できる能力を示し、この
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へ放出した場合には、培養液中からか＼る菌体内蛋白質
を採取することを可能にさせ、菌体自体の内部がら採取
する場合に比べて簡便である・従って、本発明者らによ
って今回創製された大腸菌は大腸菌の遺伝子操作技術に
よる各種の有用な蛋白質の製造に宿主細胞として利用で
きる。
従って、本発明の要旨とするところは、温度制御により
はリプラズム蛋白質の外部放出能を示すことを特徴とす
る大腸菌にある。
はリプラズム蛋白質の外部放出能を示すことを特徴とす
る大腸菌にある。
本発明による上記の、、ｌ リプラズム蛋白質の外部放
出能を示す大腸菌は、菌体内のハリグラズム空間で産生
された蛋白質すなわちハＩＪグラズム蛋白質を細胞外膜
を透過して細胞外部の培養液又は培地中へ分泌できる能
力を示すのであシ、この能力の発現を培養温度の上昇と
いう手段で人為的（制御できるのである。か＼る新規な
能力をもつ本発明の大腸菌の一例としては、本出願人が
微工研に昭和６０年１１月１日以来寄託しである大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔ ） ＨＪ Ｍ
２３−２株（微工研菌寄第８５０６勺）がある。
出能を示す大腸菌は、菌体内のハリグラズム空間で産生
された蛋白質すなわちハＩＪグラズム蛋白質を細胞外膜
を透過して細胞外部の培養液又は培地中へ分泌できる能
力を示すのであシ、この能力の発現を培養温度の上昇と
いう手段で人為的（制御できるのである。か＼る新規な
能力をもつ本発明の大腸菌の一例としては、本出願人が
微工研に昭和６０年１１月１日以来寄託しである大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔ ） ＨＪ Ｍ
２３−２株（微工研菌寄第８５０６勺）がある。
本発明の大腸菌の一例である大腸菌ＨＪＭ２３−２株は
後記の変異方法及び分離方法で創製されたものである。
後記の変異方法及び分離方法で創製されたものである。
すなわち、大腸菌ＨＪ１１ｉ１１２３−２株の創製には
、ペニシリン耐性株として公知の保存菌である大腸菌Ｋ
１２株に由来して且つ［Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ Ｊ工山 ２０９〜２１６頁（１１５年）に大腸菌に
１２株ＨＪ２として記載されである大腸菌ＨＪ−２を親
株として用いた〔この菌株は遺伝子（Ｆ−ｔｈｒ １ｅ
ｕｔｒｐ ｈｉｓ ａｒａ ｌａｃ ｇａｌ ｍａｌ
ｔｏｎＡ ｍｒｃＡ ）をもつことが前出の文献に示さ
れてあり、本発明の大腸菌を誘導した親株であるので、
今回、微工研に昭和６０年１１月１日以来、大腸菌（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｅｏｌｉ ） ＨＪ −２（微
工研菌寄第８５０５号）として寄託しである〕。
、ペニシリン耐性株として公知の保存菌である大腸菌Ｋ
１２株に由来して且つ［Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ Ｊ工山 ２０９〜２１６頁（１１５年）に大腸菌に
１２株ＨＪ２として記載されである大腸菌ＨＪ−２を親
株として用いた〔この菌株は遺伝子（Ｆ−ｔｈｒ １ｅ
ｕｔｒｐ ｈｉｓ ａｒａ ｌａｃ ｇａｌ ｍａｌ
ｔｏｎＡ ｍｒｃＡ ）をもつことが前出の文献に示さ
れてあり、本発明の大腸菌を誘導した親株であるので、
今回、微工研に昭和６０年１１月１日以来、大腸菌（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｅｏｌｉ ） ＨＪ −２（微
工研菌寄第８５０５号）として寄託しである〕。
先ず、この親株（微工研菌寄第８５０５号）を、デュフ
コ・ニュートリエンド・ブロス（Ｄｉｆｃ。
コ・ニュートリエンド・ブロス（Ｄｉｆｃ。
ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ ） Ｋ Ｏ，５％食
塩ヲ加エテナル培地（以下、ＤＮＢ培地という）に植え
て、１晩、３０°Ｃで振盪培養した。この培養菌を新し
いＤＮＢ培地に接種し、３０°Ｃで対数増殖期まで振盪
培養した。次に、アデルペルグ（Ａｄｅｌｂｅｒｇ ）
等の方法（ｒ ＢＢＲＣＪ ＩＬ ７８ｇ （１９
６５））に工す、培養された大腸菌細胞を１００μｆ／
ｄの変異誘導剤Ｎ−メチル−Ｎ／−二トローＮ−ニトロ
ソグアニジン（Ｎ −ｍｅｔｈｙｌ −Ｎ’ −ｎ１ｔ
ｒｏ −Ｎ −ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉ−ｄｉｎｅ）
で３０°０１３０分間変異処理した。その後、変異処理
を受けた大腸菌細胞を３０’Ｃで２〜３世代時間にわた
って新しいＤＮＢ培地で培養した。
塩ヲ加エテナル培地（以下、ＤＮＢ培地という）に植え
て、１晩、３０°Ｃで振盪培養した。この培養菌を新し
いＤＮＢ培地に接種し、３０°Ｃで対数増殖期まで振盪
培養した。次に、アデルペルグ（Ａｄｅｌｂｅｒｇ ）
等の方法（ｒ ＢＢＲＣＪ ＩＬ ７８ｇ （１９
６５））に工す、培養された大腸菌細胞を１００μｆ／
ｄの変異誘導剤Ｎ−メチル−Ｎ／−二トローＮ−ニトロ
ソグアニジン（Ｎ −ｍｅｔｈｙｌ −Ｎ’ −ｎ１ｔ
ｒｏ −Ｎ −ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉ−ｄｉｎｅ）
で３０°０１３０分間変異処理した。その後、変異処理
を受けた大腸菌細胞を３０’Ｃで２〜３世代時間にわた
って新しいＤＮＢ培地で培養した。
次に、生育した大腸菌のうちから宮用等の方法（ｒ Ｊ
、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｊ １１２．９５０
（１９７２） ）を基にβ−ラクタム抗生物質に高い感
受性を示し且つ４２°Ｃの如き高温では増殖しないとい
う温度感受性を示す変異株の多数を分離し九〇この内の
一株として、親株に比べて、β−ラクタム抗生物質に高
い感受性を示すことに加えて分子量の大きい抗生物質例
えばマカルボマイシンに対して顕著に増大された感受性
を示すという薬剤高感受性の変異株として、大腸菌ＨＪ
Ｍ２３−２株を選別、分離した。
、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｊ １１２．９５０
（１９７２） ）を基にβ−ラクタム抗生物質に高い感
受性を示し且つ４２°Ｃの如き高温では増殖しないとい
う温度感受性を示す変異株の多数を分離し九〇この内の
一株として、親株に比べて、β−ラクタム抗生物質に高
い感受性を示すことに加えて分子量の大きい抗生物質例
えばマカルボマイシンに対して顕著に増大された感受性
を示すという薬剤高感受性の変異株として、大腸菌ＨＪ
Ｍ２３−２株を選別、分離した。
本発明の大腸菌の一例である大腸菌ＨＪ Ｍ ２３−２
株（微工研菌寄第８５０６号）の菌学的性質は、通常の
大腸菌及び親株の大腸菌ＨＪ２株と基本的に同様であり
、１． ｌ 〜１．５ Ｘ ２．０〜６．０ ｔｉｍ
の中等大の桿菌であり、周毛性のペン毛を有し、普通培
地によく発育し、寒天平板で灰白色、円形、不透明、光
沢ある湿潤性コロニ士作る＠ブイヨン培地では、平等に
混濁し、菌膜を作らない。しかも、大腸菌ＨＪＭ２３−
２株ははニジリン分解酵素β−ラクタマーゼ（ペリプラ
ズム蛋白質の一種としての酵素）を菌体内に産生する。
株（微工研菌寄第８５０６号）の菌学的性質は、通常の
大腸菌及び親株の大腸菌ＨＪ２株と基本的に同様であり
、１． ｌ 〜１．５ Ｘ ２．０〜６．０ ｔｉｍ
の中等大の桿菌であり、周毛性のペン毛を有し、普通培
地によく発育し、寒天平板で灰白色、円形、不透明、光
沢ある湿潤性コロニ士作る＠ブイヨン培地では、平等に
混濁し、菌膜を作らない。しかも、大腸菌ＨＪＭ２３−
２株ははニジリン分解酵素β−ラクタマーゼ（ペリプラ
ズム蛋白質の一種としての酵素）を菌体内に産生する。
しかし、本発明による大腸菌ＨＪＭ２３−２株は、親株
ＨＪ２株と次の特性を示す点で異なる。
ＨＪ２株と次の特性を示す点で異なる。
（１）至適発育温度より高い４２°Ｃの如き高温でペリ
プラズム性の蛋白質を培地中に分泌するが、この能力は
親株ＨＪ２株にはない。
プラズム性の蛋白質を培地中に分泌するが、この能力は
親株ＨＪ２株にはない。
（２） 増殖が３０°Ｃで正常であるが４２８Ｃでは増
殖しない点で温度感受性で′ｈＤ、例えはデュフコ・ニ
ュートリエンド寒天平板上で３０°Ｃで正常に増殖する
が、４２°Ｃ又は４５°Ｃでは増殖しない０ （３） 本発明による変異株ＨＪＭ２３−２株は、親
株ＨＪ２株にくらべて、ベンジルペニシリンはじめ多く
のβ−ラクタム抗生物質に対しやや感受性を増加したが
、マカルボｉイシン・ ノぐンコマイシン會 バチドラ
ジン、 ポリミキシンＢ・ メチマイシン、 ナリゾク
ス酸、ＩＪファマイシン、 ノボビオシン等の大きい分
子量の抗生物質に対して高度に感受性を増加しているＯ 本発明による大腸菌ＨＪＭ２３−２株が薬剤高感受性を
有することを示すために、その発育を阻止する各種の抗
生物質の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を親株ＨＪ−２と比較
して測定したので、その結果を次の第１表に示す０ 第１表 はニジリンＧ ２５ １２．５
アンピシリン ３．１３ １．５
（。
殖しない点で温度感受性で′ｈＤ、例えはデュフコ・ニ
ュートリエンド寒天平板上で３０°Ｃで正常に増殖する
が、４２°Ｃ又は４５°Ｃでは増殖しない０ （３） 本発明による変異株ＨＪＭ２３−２株は、親
株ＨＪ２株にくらべて、ベンジルペニシリンはじめ多く
のβ−ラクタム抗生物質に対しやや感受性を増加したが
、マカルボｉイシン・ ノぐンコマイシン會 バチドラ
ジン、 ポリミキシンＢ・ メチマイシン、 ナリゾク
ス酸、ＩＪファマイシン、 ノボビオシン等の大きい分
子量の抗生物質に対して高度に感受性を増加しているＯ 本発明による大腸菌ＨＪＭ２３−２株が薬剤高感受性を
有することを示すために、その発育を阻止する各種の抗
生物質の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を親株ＨＪ−２と比較
して測定したので、その結果を次の第１表に示す０ 第１表 はニジリンＧ ２５ １２．５
アンピシリン ３．１３ １．５
（。
セファロリジン １．５６ １．５
６セフアロチン ＋２．５ ６．２
５セフアレキシン ＋２．５ ６
．２５マカルボマイシン ２００
（１，５６バンコマイシン ２００
１２．５バチドラジン １６００
２５ホスホマイシン ２５ ｔ
ｏ。
６セフアロチン ＋２．５ ６．２
５セフアレキシン ＋２．５ ６
．２５マカルボマイシン ２００
（１，５６バンコマイシン ２００
１２．５バチドラジン １６００
２５ホスホマイシン ２５ ｔ
ｏ。
ポリミキシンＲ６，２５０，３９
カナマイシン ０．７８ ０．７
ｇメゾマイシン ）８０ｏ ＜
６．２５ナリノクス酸 ３．１３
０．７８リフアマイシン ３．１３０．０４
５ノボビオシン ８００ ２５
第１表に示したＭＩＣの測定方法は、デュ７コ・ニュー
トリエンド・プロス中２８°Ｃで供試大腸菌を定常期ま
で振脅培養した培養物の５μｔ を、二倍希釈系列濃度
の供試薬剤を含むデュフコ・ニュー） ＩＪエンド寒天
平板に滴下、しみこませ、２日間３０’Ｃでインキュベ
ートし、生育の有無を判定してＭＩＣを決定した。
ｇメゾマイシン ）８０ｏ ＜
６．２５ナリノクス酸 ３．１３
０．７８リフアマイシン ３．１３０．０４
５ノボビオシン ８００ ２５
第１表に示したＭＩＣの測定方法は、デュ７コ・ニュー
トリエンド・プロス中２８°Ｃで供試大腸菌を定常期ま
で振脅培養した培養物の５μｔ を、二倍希釈系列濃度
の供試薬剤を含むデュフコ・ニュー） ＩＪエンド寒天
平板に滴下、しみこませ、２日間３０’Ｃでインキュベ
ートし、生育の有無を判定してＭＩＣを決定した。
本発明による大腸菌ｆ（ＪＭ２３−２株ははリグラズム
蛋白質分泌能を示す外、前述のように温度感受性及び薬
剤高感受性を示すが、親株に比べてこのように変異した
ことに関与する遺伝子について研究を進めて次の知見を
得た。
蛋白質分泌能を示す外、前述のように温度感受性及び薬
剤高感受性を示すが、親株に比べてこのように変異した
ことに関与する遺伝子について研究を進めて次の知見を
得た。
すなわち、本発明による大腸菌ＨＪＭ２３−２株におけ
る温度感受性・薬剤高感受性変異に関与する遺伝子な
ｏｍｓ （ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ５ｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ））と命名し、ＰＩファーノによる形質導入の
三点測定法により、大腸菌染色体上のｔｏｎＡＣ４分）
とｍｅｔＤ（５分）の中間に遺伝子ｏｍｓの座を決定し
た。
る温度感受性・薬剤高感受性変異に関与する遺伝子な
ｏｍｓ （ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ５ｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ））と命名し、ＰＩファーノによる形質導入の
三点測定法により、大腸菌染色体上のｔｏｎＡＣ４分）
とｍｅｔＤ（５分）の中間に遺伝子ｏｍｓの座を決定し
た。
更に、別の実験結果に基づいて、本発明者らは、大腸菌
ＨＪＭ２３−２株が有するところのペリプラズム蛋白質
を温度制御により菌体外に放出する性質と、細胞増殖の
温度感受性と、薬剤高感受性とは同一の遺伝子ｏｍｓの
変異で起ることを確認した。
ＨＪＭ２３−２株が有するところのペリプラズム蛋白質
を温度制御により菌体外に放出する性質と、細胞増殖の
温度感受性と、薬剤高感受性とは同一の遺伝子ｏｍｓの
変異で起ることを確認した。
（発明の効果）
本発明によると、細胞外膜を有する大腸菌ににリグラズ
ム蛋白質の外部放出能を持たすことができ、本発明の大
腸菌を利用すると、大腸菌の遺伝子操作技術の応用によ
ってインターフェロン、インターロイキン、ＴＮＦ等の
有用なＡ：ｆチド乃至蛋白質の大腸菌による菌体外生産
を計ることができる。
ム蛋白質の外部放出能を持たすことができ、本発明の大
腸菌を利用すると、大腸菌の遺伝子操作技術の応用によ
ってインターフェロン、インターロイキン、ＴＮＦ等の
有用なＡ：ｆチド乃至蛋白質の大腸菌による菌体外生産
を計ることができる。
本発明による大腸菌）ＩＪＭ２３−２株は４２°Ｃの温
度で培養した場合には増殖しないので、４２０Ｃの温度
条件で長時間培養すると生育を止めるが、ＨＪＭ２３−
２株が菌体内で産生ずるβ−ラクタマーゼの如きＩ Ｉ
Ｊプラズム蛋白質を培地中に菌体から分泌する。従って
、ＨＪＭ２３−２株を４２°Ｃで培養し念培養液はその
培養ｒ液中にβ−ラクタマーゼ活性を示した。しかし、
大腸菌のサイトプラズム（ｃｙｔｏｐｌａｓｏｍ ）
中に産生ずる蛋白質は培地中には放出されないので、
サイトグラズム酵素の活性は培養ｒ液中に検出されない
。
度で培養した場合には増殖しないので、４２０Ｃの温度
条件で長時間培養すると生育を止めるが、ＨＪＭ２３−
２株が菌体内で産生ずるβ−ラクタマーゼの如きＩ Ｉ
Ｊプラズム蛋白質を培地中に菌体から分泌する。従って
、ＨＪＭ２３−２株を４２°Ｃで培養し念培養液はその
培養ｒ液中にβ−ラクタマーゼ活性を示した。しかし、
大腸菌のサイトプラズム（ｃｙｔｏｐｌａｓｏｍ ）
中に産生ずる蛋白質は培地中には放出されないので、
サイトグラズム酵素の活性は培養ｒ液中に検出されない
。
本発明者らは、本発明による大腸菌ＨＪＭ２３−２株が
温度制御によりβ−ラクタマーゼの如きはリデラズム蛋
白質を菌体外部へ分泌する能力を示すことを例証するた
めに、またペリプラズム蛋白質生産の遺伝子を導入され
るホスト細胞として利用された場合にその遺伝子導入で
ペリプラズム蛋白質の生産能をもつように形質転換され
た大腸菌株がペリプラズム蛋白質分泌性の変異株になっ
たことを例証するために、下記の実験を行った。
温度制御によりβ−ラクタマーゼの如きはリデラズム蛋
白質を菌体外部へ分泌する能力を示すことを例証するた
めに、またペリプラズム蛋白質生産の遺伝子を導入され
るホスト細胞として利用された場合にその遺伝子導入で
ペリプラズム蛋白質の生産能をもつように形質転換され
た大腸菌株がペリプラズム蛋白質分泌性の変異株になっ
たことを例証するために、下記の実験を行った。
実験例１
大腸菌ＨＪ Ｍ ２３−２株（微工研菌寄第８５０６号
）の細胞にβ−ラクタマーゼ（−！リグラズム酵素）及
ヒクロラムフエニコールアシルトランスフエラーゼ（Ｃ
ＡＴ）（サイトプラズム蛋白質）の遺伝子をのせている
薬剤耐性プラスミドとして公知であるプラスミドＲＧ
Ｎ Ｂ ２３ （ｒＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋１０４
．６２０−６２９（＋９７０）） を遺伝子操作技術
上の常法で導入し、こうして形質転換株（以下、大腸菌
ＨＪＭ２３−２／ＲＧＮ８２３株という）を得た。
）の細胞にβ−ラクタマーゼ（−！リグラズム酵素）及
ヒクロラムフエニコールアシルトランスフエラーゼ（Ｃ
ＡＴ）（サイトプラズム蛋白質）の遺伝子をのせている
薬剤耐性プラスミドとして公知であるプラスミドＲＧ
Ｎ Ｂ ２３ （ｒＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋１０４
．６２０−６２９（＋９７０）） を遺伝子操作技術
上の常法で導入し、こうして形質転換株（以下、大腸菌
ＨＪＭ２３−２／ＲＧＮ８２３株という）を得た。
この大腸菌ＨＪＭ２３−２／ＲＧＮｇ２３株を、３０°
ＣでＬ−培地（ｒＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、Ｊ Ｉ ６
０゜ｇ ８９−８ Ｃ１４（＋９８４））中で４時間振
盪培養した培養物をｒ過し、得られた培養ｒ液のβ−ラ
クタ實−ゼ活性を測定したけれども、この酵素活性は実
質的に検出できなかった。
ＣでＬ−培地（ｒＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、Ｊ Ｉ ６
０゜ｇ ８９−８ Ｃ１４（＋９８４））中で４時間振
盪培養した培養物をｒ過し、得られた培養ｒ液のβ−ラ
クタ實−ゼ活性を測定したけれども、この酵素活性は実
質的に検出できなかった。
さらに上記の形質転換株、大腸菌ＨＪＭ２３−２１ＲＧ
Ｎ８２３株を上記のＬ−培地で３０°Ｃで菌数が約３
Ｘ Ｉ Ｏ−／ｒｓｔになるまで培養した後、４２°Ｃ
に培養温度を上げて更に４時間培養を続けた。４２°Ｃ
での培養開始時とその後の培養中に、培養液相中に存在
するβ−ラクタマーゼとＣＡＴとの両酵素の活性ならび
に菌体内に残留する両酵素の活性（力価、単位／−）を
当初は３０分後に、次いで１時間毎に測定した。このよ
うにして、４２６ｃでの培養過程中における培養液相中
でのβ−ラクタマーゼ活性及び菌体中のβ−ラクタマー
ゼ活性の経時的変化を測定した結果を、添付図面の第１
図の左側の図表に、白丸を結ぶ曲線（揚及び黒丸を結ぶ
曲線（６）で夫々で表わした。また、４２°Ｃでの培養
過程中における培養液相中でのＣＡＴ（クロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ）活性及び菌体中の
ＣＡＴ活性の経時的変化を測定した結果を第１図の右側
の図表に、白い３角形を結ぶ曲線（Ｃ）及び黒い３角形
を結ぶ曲線（ｄ）で夫々に表わした。
Ｎ８２３株を上記のＬ−培地で３０°Ｃで菌数が約３
Ｘ Ｉ Ｏ−／ｒｓｔになるまで培養した後、４２°Ｃ
に培養温度を上げて更に４時間培養を続けた。４２°Ｃ
での培養開始時とその後の培養中に、培養液相中に存在
するβ−ラクタマーゼとＣＡＴとの両酵素の活性ならび
に菌体内に残留する両酵素の活性（力価、単位／−）を
当初は３０分後に、次いで１時間毎に測定した。このよ
うにして、４２６ｃでの培養過程中における培養液相中
でのβ−ラクタマーゼ活性及び菌体中のβ−ラクタマー
ゼ活性の経時的変化を測定した結果を、添付図面の第１
図の左側の図表に、白丸を結ぶ曲線（揚及び黒丸を結ぶ
曲線（６）で夫々で表わした。また、４２°Ｃでの培養
過程中における培養液相中でのＣＡＴ（クロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ）活性及び菌体中の
ＣＡＴ活性の経時的変化を測定した結果を第１図の右側
の図表に、白い３角形を結ぶ曲線（Ｃ）及び黒い３角形
を結ぶ曲線（ｄ）で夫々に表わした。
第１図の左側の図表に示した曲線をみるに、曲線（ｂ）
から経時的に菌体内のβ−ラクタマーゼ活性が減り、曲
線（（転）から経時的に培養液相中のβ−ラクタマーゼ
活性が増えることが観察されるから、３０ＱＣで培養し
ている間に菌体中に産生蓄積されたβ−ラクタマーゼま
でが４２°Ｃ培養中に菌体外に放出していることが認め
られる。
から経時的に菌体内のβ−ラクタマーゼ活性が減り、曲
線（（転）から経時的に培養液相中のβ−ラクタマーゼ
活性が増えることが観察されるから、３０ＱＣで培養し
ている間に菌体中に産生蓄積されたβ−ラクタマーゼま
でが４２°Ｃ培養中に菌体外に放出していることが認め
られる。
実験例２
更に、実験例１で得た形質転換株の大腸菌１（ＪＭ２３
−２／ＲＧＮ８２３株を、実験例１と同様に先づ３０’
ＣでＣ−培地中で菌数が約３×１０個／−になるまで培
養した後、３７°Ｃに培養温度を上げて培養を続けた。
−２／ＲＧＮ８２３株を、実験例１と同様に先づ３０’
ＣでＣ−培地中で菌数が約３×１０個／−になるまで培
養した後、３７°Ｃに培養温度を上げて培養を続けた。
実験例１と同様にして、３７０Ｃで培養中における培養
液相中のβ−ラクタマーゼ活性及び菌体中のβ−ラクタ
マーゼ活性の経時的変化を測定して、添付図面の第２図
の左側の図表に白丸を結ぶ曲線（ａ′）及び黒丸を結ぶ
曲線（ｂ′）で夫々に表わした。また、３７°Ｃの培養
中における培養液相中のＣＡＴ活性及び菌体中のＣＡＴ
活性の経時的変化も、同様に測定して、第２図の右側の
図表に白い３角形を結ぶ曲線Ｃｃ）及び黒い３角形を結
ぶ曲線（ｄ′）で夫々に表わした。
液相中のβ−ラクタマーゼ活性及び菌体中のβ−ラクタ
マーゼ活性の経時的変化を測定して、添付図面の第２図
の左側の図表に白丸を結ぶ曲線（ａ′）及び黒丸を結ぶ
曲線（ｂ′）で夫々に表わした。また、３７°Ｃの培養
中における培養液相中のＣＡＴ活性及び菌体中のＣＡＴ
活性の経時的変化も、同様に測定して、第２図の右側の
図表に白い３角形を結ぶ曲線Ｃｃ）及び黒い３角形を結
ぶ曲線（ｄ′）で夫々に表わした。
実験例１でみられたと同様に、３７°Ｃで培養中にβ−
ラクタマーゼの菌体外放出の結果が観察された。
ラクタマーゼの菌体外放出の結果が観察された。
他方、野生型の親株として用いた大腸菌ＨＪ２を上記の
グラスミドＲＧＮ８２３の導入で形質転換して得られた
大腸菌ＨＪ ２／ＲＧＮ８２３株を、上記の実験例１〜
２と同様に３０’Ｃで培養後、培養温度を４２°Ｃ又は
３７°Ｃに上げて培養を続けたが、β−ラクタマーゼの
菌体外放出が認められなかった＠
グラスミドＲＧＮ８２３の導入で形質転換して得られた
大腸菌ＨＪ ２／ＲＧＮ８２３株を、上記の実験例１〜
２と同様に３０’Ｃで培養後、培養温度を４２°Ｃ又は
３７°Ｃに上げて培養を続けたが、β−ラクタマーゼの
菌体外放出が認められなかった＠
第１図は、本発明の大腸菌を形質転換して得られた大腸
菌変異株ＨＪＭ２３−２／ｎａＮｇ ２３株を４２°Ｃ
で培養した場合の培養液相中及び菌体中のβ−ラクタマ
ーゼ活性（単位／−）及びＣＡＴ活性（単位／−）の経
時的変化の曲線図を示す。 第２図は、上記の変異株ＨＪＭ２３−２／ＲＧＮ８２３
株を３７°Ｃで培養した場合におけるβ−ラクタマーゼ
活性及びＣＡＴ活性（単位／−）の経時的変化の曲線図
である。
菌変異株ＨＪＭ２３−２／ｎａＮｇ ２３株を４２°Ｃ
で培養した場合の培養液相中及び菌体中のβ−ラクタマ
ーゼ活性（単位／−）及びＣＡＴ活性（単位／−）の経
時的変化の曲線図を示す。 第２図は、上記の変異株ＨＪＭ２３−２／ＲＧＮ８２３
株を３７°Ｃで培養した場合におけるβ−ラクタマーゼ
活性及びＣＡＴ活性（単位／−）の経時的変化の曲線図
である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、温度制御によりペリプラズム蛋白質の外部放出能を
示すことを特徴とする大腸菌。 ２、大腸菌ＨＪＭ２３−２株（微工研菌寄第８５０６号
）である特許請求の範囲第１項に記載の大腸菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP496886A JPS62166881A (ja) | 1986-01-16 | 1986-01-16 | 大腸菌のペリプラズム蛋白質分泌変異株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP496886A JPS62166881A (ja) | 1986-01-16 | 1986-01-16 | 大腸菌のペリプラズム蛋白質分泌変異株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62166881A true JPS62166881A (ja) | 1987-07-23 |
| JPH0528103B2 JPH0528103B2 (ja) | 1993-04-23 |
Family
ID=11598389
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP496886A Granted JPS62166881A (ja) | 1986-01-16 | 1986-01-16 | 大腸菌のペリプラズム蛋白質分泌変異株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62166881A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0338410A2 (de) * | 1988-04-19 | 1989-10-25 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Sekretormutante von Escherichia coli |
| JPH05502274A (ja) * | 1989-11-23 | 1993-04-22 | シェムレック・アクチボラゲット | 高い硫化度を有する、硫酸塩パルプ蒸解用蒸解液の製造方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60199381A (ja) * | 1983-12-14 | 1985-10-08 | アンステイテユ−・メリウ | 大腸菌変異株ならびにその製法及び応用 |
-
1986
- 1986-01-16 JP JP496886A patent/JPS62166881A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60199381A (ja) * | 1983-12-14 | 1985-10-08 | アンステイテユ−・メリウ | 大腸菌変異株ならびにその製法及び応用 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0338410A2 (de) * | 1988-04-19 | 1989-10-25 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Sekretormutante von Escherichia coli |
| JPH05502274A (ja) * | 1989-11-23 | 1993-04-22 | シェムレック・アクチボラゲット | 高い硫化度を有する、硫酸塩パルプ蒸解用蒸解液の製造方法 |
| JP2815701B2 (ja) * | 1989-11-23 | 1998-10-27 | シェムレック・アクチボラゲット | 高い硫化度を有する、硫酸塩パルプ蒸解用蒸解液の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0528103B2 (ja) | 1993-04-23 |
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