SU1089119A1 - Способ получени @ -лактамазы - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ/ -ЛАКТАМАЗЫ путем культивировани  продуцента E., содержащего плазмиду pBR 322, с фагом, отличающийс  тем, что, с целью повышени  выхода р-лактамазы, фаг Ц ApQR внос т в культуруЕ.сое;W 3101 гее , причем используют фаг -Д. ApQR с множественностью от 1 до 20 фаговых корпускул на клетку.

Description

Изобретение относитс  к получению белковых продуктов, например ферментов из микроорганизмов, и может быть использова.но дл  получе ни  биологических активных веществ в частности фермента / -лактамазы из микроорганизмов в промьшшенных масштабах, а также дл  повышени  биосинтеза продуктов рекомбинатных молекул ДНК плазмид при тестировании экспрессии последних. Известен способ получени  биоло гически активного вещества на осно многокопийных плазмид, содержащих ген, ответственный за синтез заданного продукта. Фрагмент ДНК с генами рестриктазы и метилазы EcoR встраивают в мультикопийный вектор который обеспечивает как увеличени количества копий рекомбинатной плазмиды до 10, так и более эффективную экспрессию клонированны генов ферментов, причем плазмидна  ДНК обеспечивает повьшенньй синтез фермента в 3 раза по сравнению с исходным уровнем 1 . Недостатками данного способа  в л етс  то, что после процесса ампл ф:/сации антибиотики необходимо удал ть из культуральной среды, поэтому  вл етс  нетехнологичным. Наиболее.близким к предлагаемом  вл етс  способ получени  ( -лакта мазы, включающий выращивание культ ры E.co2ic 600, содержащей плаз идy pBR 322 и последующее введение в эту культуру фага 857 с мутаци ми в генах Q и R 2 . Недостатком известного способа  вл етс  невысокий выход фермента Цель изобретени  - повышение выхода fi -лактамазы. Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу получе и  Я -лактамазы путем культивировани  продуцента Е.соЕ содержащего плазмиду рВЕ 322, с фагом, фаг Л внос т в культуру E. VM3101 гее /f 13 вир, причем используют фаг -Д с множест венностью от 1 до 20 фаговых корпускул на клетку. Способ осуществл ют следующим образом. С помощью фага Я переключают белковый синтез с бактериальной хромосомы на геном фага и геном плазмиды. При этом в составе гено фага и в составе генома плазмиды содержитс  ген, отвечающий за синтеа интересующего нас продукта. В частности используют фаг 71 , содержащий в своем составе ген Ар, отвечающий на синтез фермента в -лактамазы , разрушающего антибиотики с 1 -лактамным кольцом, который по предлагаемому способу должен содержатьс  и в геноме плазмиды. В качестве бактериальной кyльтypы содержащей плазмиду pBR 322 и подвергающейс  заражению фагом Д с Ар-агентом, используют E.co6iW3101 гес A l39up. Используют эту культуру из-за снижени  частоты рекомбинации между гомологичными последовательност ми фага Я и плазмиды pBft 322, имеющими место в виде Ар-гена. Мутаци  в гее А-гене это условие вьшолн ет. Культуру E-coPiWaiOl гее А 13 5Up° с плазмидой pBR 322 выращивают до плотности клеток в 1 МП при 37°С и довод т до посто нной скорости роста, затем заражают фагом Д с Ар-геном в соотношении 10 фаговых корпускул на 1 бактериальную клетку, инкубируют 2,5-3 ч при , а затем инкубируют 14 15 ч при 28°Сч. Инкубирование культуры , зараженной фагом Я , при 28 С способствует замедлению лизиса клеток , так как оптимальной дл  развити  фага  вл етс  37 С. Замедление лизиса клеток способствует накоплению / -лактамазы, дл  чего используют amber-мутации в фаговых генах Q и R. Ген Q  вл етс  регул тор ым геном, отвечающим за включение поздних генов фага, среди которых находитс  и ген R, продукт которого принимает участие в лизисе бактериальной оболочки. В результате в бактериальной культуре Е,со€л W 3101 гее yap, содержащей плазмиду pBR 322, в течение 16 ч при 37 С синтезируетс  13555 ед. активности } -лактамазы (за единицу активности прин то наименьшее количество фермента, которое инактивирует ЮМ пенициллина (60 ед.) за 1 ч при 37 С в фосфатном буфере рН 6,8-7,0). В этой же бактериальной культуре, не содержащей плазмиду pBR 322, но подвергавшейс  заражению фагом Я ApQan,117 Ram курировавшейс  2,5-3 ч при , 3 а затем 14-15 ч при , синтезируетс  227796 ед активности р -лак тамазы в1 мл культуральной жидкос В бактериальной культуре E.coBi )N 3101 гее , содержащей плаз МИДУ pBR 322 и подвергавшейс  зара жению фагом , активность. Р -лактамазы после инкубировани  2,5-3 ч при , а за тем 14-15 ч при 28 С, достигает 2 млн. ед. в 1 мл. Пример. Культуру E. 3101 гее SUp° с плазмидой pBR 322 выращивают на среде Амино пептид, разведенной.О,14 М раствором NaC в соотношении 1:1 при 37С на качалке до плотности 1 Ю клеток в 1 мл. Затем эту культуру заражают фагом }( , содер жащим Ар-ген, а qmber -мутации в генах Q и R, блокирующие лизис бактериальной клетки, что в свою очередь обеспечивает более длитель ное функционирование Ар-гена. Заражение осуществл ют с множественностью 10 фаговых корпускул на 1 бактериальную клетку. Фаг получают следующим образом. Лизогенную культуру, содержащую в составе своей хромосомы нужный нам фаг, в данном случае )(. ApQ R 94 выращивают при на среде Аминопептид на качалке до плотности клеток 1 «1Сгв 1 мл. Затем эти клетки прогревают .20 мин при 43 С, в результате чего инактивируетс  фаговый репрессор благодар  t -мутации в С1-гене, и фаг начинает развиватьс  по литическому пути, через 50 мин после прогрева (термоиндукции ) при 43 С клетки лизируют , освобожда  каждые 100-200 фаговых корпускул. Если плотность клеток была 1МО° мл, то они образуют 1-2flO фаговых корпускул в 1 мл. Заражение Е. с плазмидой, выросшей до плотности 1Х10 фагом с множественностью 10 означает, что например, к 10 мл культуры надо прилить 1 МП фаговой суспензии. После внесени  фага культуру вьщерживают 2,5-3 ч при 37 С, затем культуру, зараженную фагом, инкубируют при 28 С в .течение 14 ч. Перенесение культуры с оптимальной температуры на пониженную гпосббстеует замедлению развити  фага и более длительному функционированию Ар-гена. За это врем  в 1 мл суспензии накапливаетс  до 2 млн,ед активности уЗ -лактамазы.

Claims (1)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ft-ЛАКТАМАЗЫ путем культивирования продуцента E.CO&, содержащего плазмиду pBR 322,' с фагом, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода р-лактамазы, фаг Ц ApQR~ вносят в культуруE.cog;W 3101 rec A'13J3up°, причем используют фаг ApQR с множественностью от 1 до 20 фаговых корпускул на клетку.