JP2004528005A - 生物学的に活性なタンパク質およびペプチドのファージ依存性超産生 - Google Patents
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Abstract
本発明は、１つまたは複数の標的遺伝子を有するプラスミドを含有するプロデューサー株の細菌細胞を、標的遺伝子（単数または複数）を含むまたは含まない、バクテリオファージλで感染させることにより、細菌細胞中での生物学的に活性なタンパク質およびペプチドの産生を強化するための方法に関する。生物学的に活性なタンパク質をコードする標的遺伝子は、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターの制御下にあり、かつ、細菌はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現することができる。ファージは、標的タンパク質の合成を増大し、プロデューサー株細胞の溶菌を誘導する。超産生は、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターから達成される高レベルの発現の組合せにより、およびファージの溶菌の発生を遅延する培養条件下でプロデューサー株細胞を培養することにより達成される。生物学的に活性なタンパク質およびペプチドは、その後、プロデューサー株の細胞がファージにより溶菌されると、培地中に可溶性の状態で蓄積される。
Description
【０００１】
［発明の背景］
発明の分野
本発明は、組換えＤＮＡ技術に、特に細菌宿主細胞中での異種タンパク質の産生を増強するための新規の方法に関する。開示された方法は、Ｔ７プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子をコードするプラスミドを含む宿主細胞を、バクテリオファージλによって感染させて、細菌宿主細胞の溶菌を誘導することを含む。超産生は、プラスミド単独が異種ＤＮＡを少なくとも１コピー保有する場合、あるいはプラスミドおよびファージλの両方がそれぞれ、異種ＤＮＡを少なくとも１コピー保有する場合に、選択された宿主細胞中で達成され得る。
【０００２】
関連分野の説明
目下、遺伝子操作方法により、医学および産業における重要な用途を有する種々の生物活性物質をかなりの量で産生することができる微生物株の作製が可能になっている。典型的には、異種遺伝子が挿入されたプラスミドベクターを用いて、細菌宿主細胞を形質転換することができる。エシェリヒア・コリの種々の菌株はしばしば、受容細胞として用いられる。このようなプラスミド依存性形質転換法を用いて、種々の有益なヒトペプチドおよびタンパク質、例えばインスリン、γ−インターフェロン、多数のインターロイキン、スーパーオキシドジスムターゼ、プラスミノーゲン活性剤、腫瘍壊死因子、エリスロポエチン等を産生するために、大腸菌細胞が操作されてきた。これらの物質は、医療行為においてすでに用いられているか、あるいは様々な段階の臨床試験を受けている。
【０００３】
しかしながら、プラスミド法は重大な欠点を有する。つまり、多段階プロセスである生合成後に所望の産物を細菌細胞から抽出しなければならないため、技術的に複雑であるという点である。例えばインターフェロンの抽出は、細胞の崩壊、緩衝液抽出、ポリエチレメニン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｍｉｎｉｎ）処理、光照射、硫酸アンモニウムによる沈殿、透析および遠心分離を含む（欧州特許００４３９８０号（Ｇｏｅｄｄｅｌ））。このような抽出および精製工程の必要性は、組換え産物の産生技術を複雑にするだけでなく、特に大規模工業生産において実質的ロスを発生させる。
【０００４】
さらに複雑にする因子としては、クローン化遺伝子の比較的高レベルでの発現により生成される真核生物タンパク質が、しばしば細胞膜と結合して不溶性集合体として大腸菌の細胞質中に蓄積される傾向があることである。従って、上述したような困難な抽出および精製方法は、不溶性封入体の抽出に関連した付加的技術的手法によって補足改良される必要がある。通常、不溶性タンパク質は、イオン性洗浄剤（例えばＳＤＳまたはラウリルサルコシン）を高い温度で用いて、または変性剤（例えば８Ｍの尿素または６〜８Ｍのグアニジン塩酸塩）の存在下で可溶化される。
【０００５】
精製の最終段階において、可溶化ポリペプチドの再生および再酸化をすることが多いが、これは機能的活性を回復するために必要とされる。その自然立体配座におけるタンパク質の適正なフォールディングに必要であるジスルフィド結合は、再生されなければならない。再生手法、例えばジスルフィド交換は、高価でかつ比較的有毒な試薬、例えばグルタチオン、ならびに酸化２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールを使用することがある。さらに、生物活性遺伝子操作タンパク質の最終収率は比較的低い。さらに、可溶化し、二次および三次のタンパク質構造を再形成するための有毒試薬が、たとえ極微量の濃度でも存在することは、タンパク質のその後の臨床用途を妨げる。したがって、細菌宿主細胞内において不溶性封入体の形態の標的タンパク質を生成することは、組換えタンパク質の産生を複雑にし、収率低減を生じるだけでなく、最終タンパク質を臨床的用途に適さないものにし得る（Ｆｉｓｈｅｒ， Ｂ．， Ｓｕｍｎｅｒ， Ｉ．， Ｇｏｏｄｅｎｏｕｇｈ， Ｐ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ． ４１： ３−１３， １９９３）。
【０００６】
プラスミドで形質転換した細菌宿主細胞から、異種遺伝子の発現により産生されたタンパク質を抽出することに伴う技術上の困難性は、形質転換した細菌宿主細胞をバクテリオファージによって感染させ、その溶菌経路により運搬体（ｂｅａｒｅｒ）細胞を溶菌することにより克服され得る。このようにして、所望のタンパク質は培地中に簡単に放出され得る（英国特許２ １４３ ２３８Ａ（Ｂｒｅｅｚｅ Ａ．Ｓ．））。したがってＢｒｅｅｚｅは、溶菌を制御するために、ｃＩ中に温度感受性突然変異を有するファージλによって細菌細胞を感染させ、その結果エシェリヒア・コリ中で産生される酵素の収率を増大する方法を開示した。ｃＩ遺伝子産物は、初期転写のリプレッサーであり、その結果として、頭−尾（ｈｅａｄ ａｎｄ ｔａｉｌ）アセンブリーおよび細胞溶菌に必要とされるファージＤＮＡの後期領域の転写を遮断する（Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．， Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， １９８２， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。ｃＩ中に温度感受性突然変異を有するバクテリオファージは、ｃＩ遺伝子産物が溶菌成長に必要なファージ遺伝子の転写を抑制できる温度で細胞が増殖する限り、溶原状態を確立し、保持することができる。したがって、形質転換した宿主細胞は３０℃で培養され得るが、この場合、最大発酵生産の段階が達成されるまで、ファージＤＮＡ転写のｃＩ媒介性抑制は継続し、ファージは溶原状態のまま保持される。その後、ｃＩリプレッサーを不活性化し、ファージの溶菌の発生を開始させるために、３０分間、培養温度を４２℃に上げる。次に、宿主細胞を３０℃で２〜３時間インキュベートして、完全溶菌および酵素の放出を可能にする（ＧＢ２ １４３ ２３８Ａ（Ｂｒｅｅｚｅ Ａ．Ｓ．））。
【０００７】
Ｂｒｅｅｚｅは細菌プロデューサー細胞からのタンパク質の放出を教示するが、それは、エシェリヒア・コリの成長にとって最適温度でない３０℃を超えない温度でプロデューサー細胞を培養することを要する。細胞は、３２℃を超える温度では、温度感受性溶菌プロファージが発生し、最大発酵蓄積の段階に達する前に溶菌を受けるために、最適温度（３７℃）での合成は可能でない。さらに、Ｂｒｅｅｚｅにより開示されたように、４２℃で３０分間、細菌宿主細胞をインキュベートすると、標的タンパク質を破壊するプロテアーゼを活性化する可能性がある。
【０００８】
Ａｕｅｒｂａｃｈ等（米国特許第４，６３７，９８０号）は、組換え産物の溶菌放出を誘導するために、ファージλＤＮＡ断片を用いた。その方法では、Ｂｒｅｅｚｅと同様に、λｃＩ遺伝子産物における温度感受性突然変異を用いて、細菌宿主細胞の温度依存性溶菌を与えた。ＡｕｅｒｂａｃｈにおけるλＤＮＡ断片は、４２℃でｃＩリプレッサーを不活性化した後に、リゾチームを産生するために、機能するエンドリシンコード遺伝子Ｎ、Ｑ、ＲおよびＳを保持した。残りのファージ遺伝子のほとんどが欠失され、ＯおよびＰ遺伝子における突然変異は、ファージＤＮＡの複製を防止した。その結果として、λＤＮＡは、標的遺伝子の発現を調整することができる完全な機能を有するファージでなかった。さらに、ＡｕｅｒｂａｃｈのλＤＮＡは、標的遺伝子を保有するためのベクターとして用いるのに適切でなかった。さらに、上記のように、４２℃〜４４℃で９０〜１２０分間、細菌宿主細胞をインキュベートすると、Ａｕｅｒｂａｃｈによる開示のように、標的タンパク質を破壊するプロテアーゼを活性化し得る。
【０００９】
細菌プロデューサー細胞からの活性タンパク質の溶菌放出に加えて、バクテリオファージは、宿主細菌細胞中に異種ＤＮＡを保有させるための、細菌プラスミドベクターに対する代替物としても用いられてきた（Ｍｕｒｒａｙ， Ｎ．Ｅ． ａｎｄ Ｍｕｒｒａｙ， Ｋ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５１：４７６−４８１， １９７４； Ｍｏｉｒ， Ａ．， Ｂｒａｍｍａｒ， Ｗ．Ｊ．， Ｍｏｌｅｃ． ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １４９：８７−９９， １９７６）。典型的には、遺伝子およびそれらの産物の増幅は、ファージの溶菌成長中に達成されるが、この場合、ファージゲノムは細菌宿主ＤＮＡ中に組み込まれる（Ｐａｎａｓｅｎｋｏ， Ｓ．Ｍ．， Ｃａｍｅｒｏｎ， Ｊ．Ｒ．， Ｄａｖｉｓ， Ｒ．Ｖ．， Ｌｅｈｍａｎ， Ｌ．Ｒ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８８−１８９， １９７７； Ｍｕｒｒａｙ， Ｎ．Ｅ． ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｙ， Ｗ．Ｓ．， Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １７５：７７−８７， １９７９； Ｗａｌｔｅｒ， Ｆ．， Ｓｉｅｇｅｌ， Ｍ．， Ｍａｌｋｅ， Ｈ．， １９９０， ＤＤ ２７６， ６９４； Ｍｏｒｙ， Ｙ．， Ｒｅｖｅｌ， Ｍ．， Ｃｈｅｎ， Ｌ．， Ｓｈｅｌｄｏｎ， Ｉ．Ｆ．， Ｙｕｔｉ−Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ， １９８３， ＧＢ ２，１０３，２２２Ａ）。通常、組換えファージλの溶原性培養物が細菌宿主細胞を感染させるために用いられるか、または組換え溶原性ファージλをすでに保有する「ウォームアップ」細菌培養物が、異種遺伝子の発現を増幅するために成育させられる。
【００１０】
異種遺伝子の発現のためのλベクターの使用の成功例があるが、λベクターは、主として遺伝子クローニングのために用いられてきた。一旦クローン化されると、遺伝子はより効果的に発現するためにプラスミドベクターにトランスファーされる。例えば、大腸菌が、ヒトβ−インターフェロン遺伝子を含有するファージλシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａ Ｃ１５によって感染された場合、細胞溶菌産物中のインターフェロンの量は、７〜８×１０６単位／リットルとなる。標的遺伝子を保有するＤＮＡ断片がファージからプラスミドに再クローン化された後、β−インターフェロン収率は１×１０８単位／リットルに向上した（Ｍｏｉｒ， Ａ．， Ｂｒａｍｍａｒ， Ｗ．Ｊ．， Ｍｏｌｅｃ． ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １４９：８７−９９， １９７６）。
【００１１】
組換えλベクターにより細菌宿主細胞中で生成された異種タンパク質の収率を向上させるために、ファージゲノム中に突然変異を導入して、細菌細胞溶菌を開始する能力をファージλから失わせた。その結果、異種遺伝子が細菌宿主細胞により発現される時期が延長され、収率の増大が達成される。したがって、例えばＳ遺伝子中にアンバー突然変異を有するλｇｔ４ｌｉｇＳプロファージを含む溶原性培養中のＤＮＡリガーゼ１の収率は、アンバー突然変異を有さないλｇｔ４ｌｉｇプロファージを含有する溶原性培養中のＤＮＡリガーゼ１の収率の５倍であった（Ｐａｎａｓｅｎｋｏ， Ｓ．Ｍ．， Ｃａｍｅｒｏｎ， Ｊ．Ｒ．， Ｄａｖｉｓ， Ｒ．Ｖ．， Ｌｅｈｍａｎ， Ｌ．Ｒ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８８−１８９， １９７７）。ファージλＳタンパク質は、溶菌のために必要とされる。したがってＳ突然変異体は、宿主細胞を溶菌せずに、多数の細胞内子孫ファージ粒子、ならびに標的タンパク質を蓄積する（Ｍａｎｔｉａｔｉｓ， Ｔ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．， Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， １９８２， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。
【００１２】
同様に、ＤＮＡポリメラーゼ１の収率向上が、アンバー突然変異を有さない組換えファージλと比較して、ＳおよびＱ遺伝子中にアンバー突然変異を有する組換えファージλを含む溶原性培養に関して報告された（Ｍｕｒｒａｙ， Ｎ．Ｅ． ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｙ， Ｗ．Ｓ．， Ｍｏｌｅｃ． ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １７５：７７−８７， １９７９）。ファージλＱタンパク質は、頭−尾（ｈｅａｄ ａｎｄ ｔａｉｌ）アセンブリーおよび細胞溶菌に関与する多数の遺伝子を含むファージＤＮＡの後期領域の転写のために必要である（Ｍａｎｔｉａｔｉｓ， Ｔ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．， Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， １９８２， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。
【００１３】
米国特許第４，７１０，４６３号において、Ｍｕｒｒａｙは、ｃＩにおける温度感受性突然変異、ならびにλＳおよびλＥ遺伝子における突然変異を含有するファージλを用いてエシェリヒア・コリの非抑制（Ｓｕ°）株を溶原化することを開示する。その結果として、通常の方法ではファージ遺伝子産物により溶菌されず、また、組換えファージゲノムはキャプシド封入されず、転写のために依然として利用可能であるため、３７℃で溶原性大腸菌を長期に培養することにより、細胞内に保持される組換えタンパク質が高レベルに産生される。
【００１４】
Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｑおよび／またはＥ突然変異を有するλベクターを用いることにより異種タンパク質の収率の向上が可能であるにもかかわらず、標的タンパク質の溶菌放出に関連したバクテリオファージベクターの潜在的技術的利点は、標的タンパク質は細菌細胞内部に蓄積するために、これらの突然変異により失われ得る。したがって、溶菌欠損突然変異体λベクターが異種タンパク質の産生のために用いられる場合、プラスミドベクターにより形質転換した細菌細胞に関して上述したような抽出および精製工程を実施しなければならず、結果としてロスが生じる。
【００１５】
Ｔ７プロモーター／Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ系は、組換えタンパク質を高レベルで発現させるために有用である。Ｔ７プロモーターの使用は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの存在を要する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、宿主株中の溶原体上に含まれる組換えＴ７ポリメラーゼ遺伝子の誘導により、あるいはＴ７ポリメラーゼ遺伝子の発現のためのプラスミドを用いた形質転換により供給され得る。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、それ自身のプロモーターに対して非常に特異的である。Ｔ７プロモーターからの転写反応は非常に効率的であり、全長ＲＮＡの多数のコピーが各鋳型から産生され得る。
【００１６】
［発明の概要］
一実施形態において、生物学的に活性なタンパク質の産生方法であって、以下の：
Ｔ７ポリメラーゼプロモーターに、作動可能に連結された、生物学的に活性なタンパク質をコードする発現可能遺伝子を少なくとも１コピー有するプラスミドによって、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現することができるエシェリヒア・コリ株を形質転換するステップ、
溶菌の遅延を媒介することができるバクテリオファージを、形質転換した細菌宿主細胞に感染させるステップ、および
上記タンパク質の所望レベルの産生が達成されるまで溶菌を伴わずに、上記細胞の溶菌成長を誘導することができる培養条件下で、かつ、上記タンパク質が、可溶性の生物学的に活性なタンパク質として産生されるように、エシェリヒア・コリ宿主細胞を培養するステップ、
を含む方法が開示される。
【００１７】
好ましい実施形態では、バクテリオファージは温度感受性突然変異を有する。さらに好ましい実施形態では、温度感受性突然変異はｃＩ８５７である。好ましくは、エシェリヒア・コリ宿主細胞は、培養ステップ前に、バクテリオファージの溶菌成長を妨げる温度で成育させられる。
【００１８】
好ましい実施形態では、バクテリオファージは、溶菌の遅延を媒介することができる少なくとも１つの遺伝子中に突然変異を有する。さらに好ましい実施形態では、溶菌の遅延を媒介することができる少なくとも１つの遺伝子は、Ｎ、ＱおよびＲからなる群から選択される。
【００１９】
好ましい実施形態では、エシェリヒア・コリ株は、アンバー突然変異を修復するためのサプレッサーを産生する。
【００２０】
代替的実施形態では、エシェリヒア・コリ株は、アンバー突然変異を修復するためのサプレッサーが欠如する。
【００２１】
好ましい実施形態では、感染バクテリオファージは、約１〜約１００の範囲の感染多重度で提供される。さらに好ましい実施形態では、感染バクテリオファージは、約１０〜約２５の範囲の感染多重度で提供される。
【００２２】
好ましくは、エシェリヒア・コリ株のバクテリオファージ媒介性の溶菌の遅延は、低度の感染多重度と比較してより高度の感染多重度で遅延される。
【００２３】
一実施形態では、発現可能遺伝子は、ヒト酸性線維芽細胞成長因子をコードする。代替的一実施形態では、ヒト酸性線維芽細胞成長因子は１３４個のアミノ酸を含む。別の代替的実施形態では、ヒト酸性線維芽細胞成長因子は１４０個のアミノ酸を含む。別の代替的実施形態では、ヒト酸性線維芽細胞成長因子は１４６個のアミノ酸を含む。別の代替的実施形態では、ヒト酸性線維芽細胞成長因子は１５５個のアミノ酸を含む。もっとも好ましい実施形態では、ヒト酸性線維芽細胞成長因子は配列番号１で記述される配列を有する。
【００２４】
一実施形態では、発現可能遺伝子はヒト成長ホルモンをコードする。代替的実施形態では、発現可能遺伝子はヒトインターフェロンをコードする。さらに別の実施形態では、発現可能遺伝子はエシェリヒア・コリメチオニンアミノペプチダーゼをコードする。
【００２５】
好ましい実施形態では、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下にある。さらに好ましい実施形態では、誘導性プロモーターはｌａｃＵＶ５プロモーターである。
【００２６】
好ましい実施形態では、生物学的に活性なタンパク質の産生方法であって、以下の：
ａ）温度感受性突然変異を有するバクテリオファージλ株を保有するエシェリヒア・コリ細胞の第一の株を成長させるステップ、
ｂ）エシェリヒア・コリの第一の株を溶菌させ、バクテリオファージλを放出させるために温度を調整するステップ、
ｃ）誘導性プロモーターの制御下でＴ７ポリメラーゼプロモーターに、作動可能に連結される、上記生物学的に活性なタンパク質をコードする発現可能遺伝子を少なくとも１コピー有するプラスミドによって形質転換したエシェリヒア・コリ細胞の第二の株を提供し、該エシェリヒア・コリ細胞の第二の株が、誘導物質の添加によりＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現するように誘導され得るようにするステップ、
ｄ）エシェリヒア・コリ細胞の第一の株から放出されたバクテリオファージλで、エシェリヒア・コリ細胞の第二の株を感染させるステップ、および
ｅ）タンパク質が産生され、エシェリヒア・コリ細胞の第二の株の溶菌時に培地中に放出されるように、エシェリヒア・コリ細胞の感染二次株をインキュベートし、上記タンパク質が、可溶性の生物学的に活性なタンパク質として１００μｇ／ｍｌより高い濃度で産生されるようにするステップ、
を含む方法が提供される。
【００２７】
本質的に配列番号１で記述される配列からなる化学合成核酸も、本明細書に開示される発明において具現化される。
【００２８】
本発明、および従来技術を上回って達成される利点を要約するために、本発明の特定の目的および利点を上記において説明した。もちろん、すべてのこのような目的または利点が、本発明の任意の特定の実施形態にしたがって、必ずしも達成できるわけではないことが理解されるはずである。したがって、例えば本発明は、本明細書中に教示されたような一または複数の利点を達成するかまたは最適化する方法で具体化または実行され得るが、本明細書中に教示または示唆され得る他の目的または利点が、必ずしも達成されるわけではないことが当業者には認識されるであろう。
【００２９】
本発明のさらなる態様、特徴および利点は、以下の好ましい実施形態の詳細な説明から明らかになるであろう。
【００３０】
次に、本発明のこれらのおよびその他の特徴を、好ましい実施形態の図面を参照しながら説明するが、これらは本発明を例示するものであって、限定するように意図するものではない。
【００３１】
［好ましい実施形態の詳細な説明］
上記の実施形態は、本発明の好ましい実施形態を代表するが、本発明の精神を逸脱せずに変更が行なわれることは、当業者には理解されるはずである。したがって本発明の範囲は、併記の特許請求の範囲によってのみ確定されるべきである。
【００３２】
ウイルスゲノムの４０％より多くが溶菌成長のために不可欠ではないため、バクテリオファージλはベクターとして有用である。λＤＮＡの中心領域に位置する遺伝子ＪおよびＮ間のλゲノムの領域は、所望の産物をコードする異種ＤＮＡにより置換され得る。その領域は、感染中に初期に転写される。
【００３３】
その合成情報がファージの初期遺伝子の領域に記録される標的遺伝子の発現を最大化するために、ファージの発生のための特定の条件を選択し、確実に適正な複製をさせるべきである。さらに、標的遺伝子を含む初期領域の転写は助長されるべきであるが、細胞溶菌に関与する後期遺伝子の転写は減速されるべきである。これにより、λ粒子の成熟およびその後の細胞溶菌を遅らせることができる。その結果として、標的遺伝子産物を含む初期ファージ産物は細菌細胞中に蓄積する。後期転写の減速、それによる標的遺伝子の発現の延長は、以下の条件により成し遂げられ得る：（１）後期遺伝子の発現を遮断するファージゲノムの突然変異、（２）感染多重度の増大、および／または（３）低温での感染細菌細胞の培養。
【００３４】
バクテリオファージにプロデューサー細胞を感染させることの利点は、ファージが、細菌宿主細胞中でのすべての巨大分子合成の重要な再配列を引き起こす点である。細菌遺伝子の転写を非作動にすることにより、ファージは標的遺伝子の複写を増大し、その結果として、所望の産物の産出を増大することができる。
【００３５】
本発明の超産生系の一実施形態では、細菌の溶菌を遅延するアンバー突然変異（例えばＱ−およびＲ−突然変異）を有するファージλが、ファージλにおけるアンバー突然変異の補正を担うサプレッサーが欠如するＳｕ°と称されるエシェリヒア・コリ株中に提供される。エシェリヒア・コリの非抑制（Ｓｕ°）株を得るために、Ｓｕ°クローンが野生型Ｓｕ＋集団から選択される。好ましくは選択マーカー、例えばテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子が、ファージＤＮＡ中に挿入される。
【００３６】
エシェリヒア・コリの非抑制（Ｓｕ０）株、例えばエシェリヒア・コリＫ８０２の選択は、ファージλｃＩ８５７Ｎａｍ７Ｎａｍ５３ｂｌａ ｔｅｔ（以後、λｂｌａＮ’）を用いて実施された。エシェリヒア・コリＣ６００株（λｂｌａＮ’）は、ファージの供給源として役目を果たした。このファージは、リプレッサー遺伝子（ｃＩ８５７）中にｔｓ−突然変異を有する単一部位（ＥｃｏＲＩ）ベクター中のＥｃｏＲＩ部位にプラスミドｐＣＶ１１（ｂｌａ ｔｅｔ）を挿入することにより得られた。次に、ｉｎ ｖｉｖｏでの組換えにより、２つのアンバー突然変異がファージＮ遺伝子中に導入された。
【００３７】
ファージλクリアを用いて、非溶原性に関してクローンが試験された。ファージλｂｌａＮ’のほかに、ファージλｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４を用いて、サプレッサーに関して検査した。
【００３８】
すでに知られているように、ファージλＮ’突然変異体は宿主細胞を溶菌できず、非常に不安定なプラスミドの形態で細胞中に存在する。宿主細胞がサプレッサーを含有する場合、アンバー突然変異は表現型が補正され、Ｎタンパク質が合成されて、ファージが溶菌的に発生し得る。λＮ’により感染されたＳｕ＋およびＳｕ０細胞の生存能力における違いは、エシェリヒア・コリＳｕ＋細胞集団から自然発生するＳｕ０復帰細胞を選択するための基礎として用いられる。細胞中にアンピシリン耐性マーカーおよびテトラサイクリン耐性マーカーを導入する挿入プラスミドを有するファージλを用いて、非溶菌性Ｓｕ０細胞が突然変異体に関する検査を隠蔽（ｍａｓｋｉｎｇ）しないようにした。ファージは、細胞溶菌を生じるこのようなファージの溶菌発生を可能にするリプレッサー遺伝子中にｔｓ−突然変異も含む。
【００３９】
ファージλｂｌａＮ’による感染とその後の４３℃での成育後、アンピシリンおよびテトラサイクリンを補充された培地にＳｕ＋培養物が接種された場合、プラスミドの形態でファージλｂｌａＮ’を含有するサプレッサーのない単一の細胞がプレート上で発生するはずである。ファージから細胞を救済して、親培養のＳｕ０誘導体を得ることができるはずである。本方法は、いくつかの段階に細分することができる。
【００４０】
１．ファージλｂｌａＮ’による培養物の感染
培養大腸菌Ｓｕ＋を、激しく攪拌しながら３７℃でマルトースを含有するＭ９培地上で、１〜２×１０８細胞／ｍｌの密度になるまで成育させた。１細胞当り５〜１０個の粒子の多重度でファージλｂｌａＮ’を用いて細胞を感染させ、２０℃で２０分間インキュベートした。所定の条件下では、感染効率は約１００％であり、大量のＳｕ＋細胞のほかに、ファージは単一Ｓｕ０細胞も感染する。
【００４１】
２．マーカーファージを含有するサプレッサーのない細胞の選択
感染後、１２γ／ｍｌのテトラサイクリンおよび２０γ／ｍｌのアンピシリンを補充した寒天培地上で細胞を平板培養し、４３℃で成育させた。２４時間で、単一コロニーが発生し、これを、抗生物質を含む寒天培地上で再度平板培養し、３７℃で成長させた。
【００４２】
３．ファージλｂｌａＮ’からの選択クローンの救済
エシェリヒア・コリＳｕ０細胞中のファージλＮ’は、非常に不安定なプラスミドの形態であるため、ファージから救済するために、抗生物質を含有しない選択寒天培地上で選択クローンを平板培養し、３７℃で成育させた。抗生物質を含有しない培地上での一次継代においてファージを失った細胞の数は、１２〜３５％に上った。このような細胞の選択は、抗生物質耐性の欠失およびファージλクリアに対する感受性の獲得をモニタリングすることにより実行した。
【００４３】
４．リプレッサーに関する細胞の検定
アンバー突然変異を有するファージλの、救済クローンの芝地上にプラークを形成する能力を調べた。親エシェリヒア・コリＳｕ＋株と同系であってサプレッサーのない誘導体は、その上にファージλｂｌａＮ’がプラークを形成せず、ファージλｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４が１〜３×１０５ＰＦＵ／ｍｌを産生し、遺伝子ＱおよびＲ中に突然変異を有さないファージλｃＩ８５７が１×１０１０ＰＦＵ／ｍｌを産生したクローンである。
【００４４】
この方法を用いて、エシェリヒア・コリＫ８０２Ｓｕ＋のＳｕ０復帰細胞を得た。感染時点での細胞数およびそれらのうちの、Ｓｕ０復帰細胞の数に基づくと、サプレッサーのない細胞の発生頻度は３×１０−７であった。
【００４５】
好ましい実施形態では、目的遺伝子は、Ｔ７プロモーターの制御下でｐＥＴ−２４ａ（＋）中でクローン化される。任意の目的遺伝子は、本願請求に係る発明の実施に用いられ得る。特定の例としては、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、メチオニンアミノペプチダーゼ、ヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型、ヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型、ヒトａＦＧＦ１４６アミノ酸型およびヒトａＦＧＦ１５５アミノ酸型が挙げられるが、これらに限定されない。代替的実施形態では、目的遺伝子は、適切なプロモーターの制御下で細菌プラスミドおよびファージ中でクローン化され得る。もっとも好ましい実施形態では、化学合成ｈａＦＧＦ１５５遺伝子（配列番号１）は、Ｔ７プロモーターの制御下でｐＥＴ−２４ａ（＋）中でクローン化される。Ｔ７プロモーターは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによってのみ認識され、エシェリヒア・コリのＲＮＡポリメラーゼによっては認識されない。得られたｈａＦＧＦ１５５遺伝子を有するプラスミド（ｐｈａＦＧＦ１５５）をエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）中で形質転換した。この株は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む。Ｔ７ポリメラーゼタンパク質はエシェリヒア・コリ細胞に対して有毒であるので、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、誘導性のｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあって、必要な場合にのみＴ７ＲＮＡポリメラーゼ合成を誘導する。ｌａｃプロモーターによる誘導は、栄養培地にＩＰＴＧを添加することにより実行される。ｈａＦＧＦ１５５タンパク質を得るために、ｈａＦＧＦ１５５遺伝子を有する組換え体プラスミドを含有するプロデューサー株は、２０〜４０℃の温度で、集中的曝気の条件下で、１ｍｌ中に５×１０７〜５×１０９の細胞密度になるように培養される。次にそれは、１細胞当り０．１〜１００個のファージ体の多重度でｔｓ−突然変異ｃＩリプレッサー遺伝子を有するラムダファージにより感染され、インキュベーションが２０〜３７℃で２〜１４時間継続される。ファージと同時的に、ＩＰＴＧが１ｍＭの濃度で導入される。
【００４６】
ｈａＦＧＦ１５５遺伝子は、１５５個のアミノ酸残基を含むタンパク質をコードする。しかしながら、組織試料から単離することができたのは、それより短い２つのａＦＧＦ形態だけであった。２つの単離形態は、１４０および１３４個のアミノ酸残基を含む。１４０個のアミノ酸を含むａＦＧＦは完全体であると考えられるが、一方１３４個のアミノ酸を含むａＦＧＦ形態は切頭（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）されていると考えられる。組織試料から１５５個のアミノ酸を含有するａＦＧＦ形態を抽出することはできなかった。より短いアイソフォームが細胞プロセシングの正常機能として生じるのか、またはａＦＧＦ抽出プロセスにおける特定のプロテアーゼによる単離ステップ中に産生される人工物として生じるのかは、不明である。３つのａＦＧＦ形態に対する単離ＤＮＡ組換え体分子から産生されたタンパク質をウエスタンブロット分析したところ、１４０および１３４形態の発現は高レベルであり、および１５５形態の発現は低レベルであった。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態では、ヒト酸性線維芽細胞成長因子遺伝子は、１５５個のアミノ酸型のａＦＧＦタンパク質をコードし、化学合成される（配列番号１）。ｈａＦＧＦ１５５遺伝子のヌクレオチド配列は、上記のｈａＦＧＦ１５５アミノ酸配列（配列番号２）に基づいて推定された。合成ｈａＦＧＦ１５５遺伝子のアミノ酸配列は、上記のもの、例えば配列番号３のＦＧＦヌクレオチド配列の翻訳配列と異ならない。しかしながら、ｈａＦＧＦ遺伝子の好ましいヌクレオチド配列は、これまでに報告されたものと異なる。本発明の好ましい実施形態では、ｈａＦＧＦ１５５遺伝子は、集約的合成細菌タンパク質に関してエシェリヒア・コリにより最もしばしば用いられるコドンを用いて化学合成された。エシェリヒア・コリに関するコドン使用表は既知であり、利用可能である（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｐｓｙｃｈｅ．ｕｔｈｃｔ．ｅｄｕ／ｓｈａｕｎ／Ｓｂｌａｃｋ／ｃｏｄｏｎｕｓｅ．ｈｔｍｌ．参照）。ヒトａＦＧＦ遺伝子の化学合成は、既知の方法により実行した（Ｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１（１８）：６４１９−６４３５）。
【００４８】
あるいは、任意の重要な遺伝子が、本発明の実施に用いられ、その例としては、当業者に既知の他の形態のｈａＦＧＦタンパク質、例えば１４６、１４０および１３４アイソフォームをコードする動物組織からの単離ＤＮＡ、ならびにその任意の変異体、誘導体、類縁体または断片が挙げられるが、これらに限定されない。ヒト成長ホルモン、ヒトインターフェロンおよびエシェリヒア・コリメチオニンアミノペプチダーゼをコードする遺伝子も、本明細書中に例示される。
【００４９】
図１は、本発明により合成されるｈａＦＧＦ１５５遺伝子の完全ヌクレオチド配列（配列番号１）、ならびにＧｅｎＢａｎｋからのヒト酸性線維芽細胞成長因子の配列（配列番号３）を示す。これら２つの配列は、図２において比較される。８０コドンに違いが認められる。
【００５０】
発現およびクローニングベクターは、典型的には、宿主生物体により認識され、目的遺伝子を作動可能に連結されるプロモーターを含む。プロモーターは、それらが作動可能に連結される特定の核酸配列の転写および翻訳を制御する構造遺伝子（一般に１００〜１０００塩基対以内）の開始コドンに対して、上流（５’）に位置する非翻訳配列である。このようなプロモーターは、典型的には２つの種類、すなわち誘導性プロモーターおよび構成性プロモーターに分類される。誘導性プロモーターとは、培養条件の何らかの変化に、例えば栄養素の存在／非存在に、あるいは温度の変化に応答して、それらの制御下でＤＮＡからの高レベルの転写を開始するプロモーターである。現時点で、原核生物宿主細胞により認識される多数のプロモーターが既知である。適切な制限部位を提供するために、適切なリンカーまたはアダプターを用いて目的遺伝子にそれらを連結する方法が、当業者に既知である。
【００５１】
好ましいプロモーター系は、エシェリヒア・コリバクテリオファージＴ７プロモーター系である。エシェリヒア・コリバクテリオファージＴ７プロモーターは、非常に特異的であり、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの存在を要する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現するプラスミドを用いた形質転換により供給され得るか、あるいは宿主株中の溶原体上に含まれるＴ７ポリメラーゼ遺伝子の誘導により供給され得る。Ｔ７プロモーターおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、市販されている。
【００５２】
形質転換とは、染色体外因子としてまたは染色体中への組込みにより、生物体中にＤＮＡを導入し、ＤＮＡの複製を可能にすることを意味する。原核生物細胞の形質転換は、当業者に既知の技法、例えばＣａＣｌ２による処理または電気穿孔を用いて実施される。
【００５３】
ラムダファージの溶菌の発生を遅延する条件下においてプロデューサー株を培養することにより、組換えタンパク質の超産生を達成した。このような条件としては、培養の温度低下、ならびに後期ラムダファージ遺伝子、例えばＱおよびＲ遺伝子中のアンバー突然変異の使用が挙げられる。
【００５４】
組換えタンパク質は、ラムダファージによるプロデューサー株の細胞溶菌の結果として、可溶性タンパク質として培地中に蓄積される。組換えタンパク質の産出量は、通常培地中に蓄積される可溶性タンパク質の２０％を構成する。遠心分離により、培地から破砕屑を除去した。次に組換えタンパク質は、当業者に既知の精製手法を用いて、夾雑可溶性タンパク質およびポリペプチドから精製され得る。このような手法としては、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、イムノアフィニティー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿およびゲル濾過が挙げられるが、これらに限定されない。ｈａＦＧＦタンパク質の場合、精製ｈａＦＧＦを得るために、ｈａＦＧＦタンパク質をヘパリンセファロースに適用した。
【００５５】
本発明のさらに詳細な説明を以下に提示する。記載された実施形態は本発明の好ましい実施形態を示すが、本発明の精神を逸脱せずに変更が行なわれることが当業者には理解されるはずである。したがって、本発明の範囲は、併記の特許請求の範囲によってのみ確定されるはずである。
【００５６】
実施例１
ファージ依存的方法によるヒトａＦＧＦ１５５の産生
ヒト酸性線維芽細胞成長因子（１５５個のアミノ酸）をコードするｈａＦＧＦ１５５遺伝子を１コピー含有するプラスミドｐＥＴ２４−１５５＠ｒｅｖ（図３）により、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＯＶＡＧＥＮ）の培養物を形質転換した。ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物は、細菌ゲノム中に、誘導性ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼに関する遺伝子を単一コピー含有する（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３−１３０）。プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）（ＮＯＶＡＧＥＮ）中に、Ｔ７プロモーターの制御下で化学合成ｈａＦＧＦ１５５遺伝子（配列番号１）を挿入して、プラスミドｐＥＴ２４−１５５＠ｒｅｖを作成した。ｈａＦＧＦ１５５遺伝子の発現は、ＩＰＴＧによるｌａｃＵＶ５プロモーターの誘導により媒介されて細胞中にＴ７ポリメラーゼが出現した後にのみ、開始する。
【００５７】
５０ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で、３７℃で振盪しながら、ｐＥＴ２４−１５５＠ｒｅｖを有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物を、２×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。次に、１細菌細胞当り約１０ファージ体の多重度で、ファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４により細胞を感染させて、２１℃で約１４時間、振盪しながら培養した。ファージと同時に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地中に導入した。
【００５８】
エシェリヒア・コリＲＬＭＩの溶原性培養物からファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４を調製し、これをＬＢ培地中で、３０℃で集中的に曝気しながら、約１×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。溶原性培養物を４３℃に暖めて、２０分間インキュベートし、ｃＩリプレッサーを不活性化した。次に温度を３７℃に下げて、６０〜７０分後、細菌細胞を溶菌すると、ファージが１〜２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌで生成された。
【００５９】
ファージ感染細胞とともに１４時間インキュベートした後、遠心分離により破砕屑を培地から除去した。ｈａＦＧＦ１５５タンパク質を含有する培地をヘパリンセファロースカラムに適用して、精製ｈａＦＧＦ１５５を得た。
【００６０】
変性条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりｈａＦＧＦ１５５を含有する培地を分析し、クーマシーブルーで染色した。ｈａＦＧＦ１５５タンパク質を含有する培地の電気泳動写真は、図４において精製ｈａＦＧＦタンパク質と比較されている。レーン１は、１０ ｌの培地を示す。レーン２は、７ ｌのヘパリン−セファロース精製ｈａＦＧＦ１５５タンパク質（０．４５ｇ／ｌ）を示す。レーン３は、８０ ｌのうちの１４ ｌのＨＰＬＣ精製ｈａＦＧＦ−１５５を示す。左端の印のないレーンは、分子量標準（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含有する。ファージ感染培養中でのｈａＦＧＦ１５５タンパク質の産生は、総細胞タンパク質の約２０％であった。ｈａＦＧＦ１５５の分子量は、密度計Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ ＶＤＳにより確定した場合、１７，９０８ダルトンであった（データは示されていない）。
【００６１】
上記の方法により産生されたヒトａＦＧＦ１５５は、ニワトリ（ｃｈｉｃｋ）膜アッセイ（実施例６）に基づいた生物学的活性を有した。さらに、精製ヒトａＦＧＦ１５５は、ＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３線維芽細胞を利用した細胞ベースの増殖アッセイ（米国特許第５４０１８３２号（Ｌｉｎｅｍｅｙｅｒ））において生物活性を示した。細胞増殖の１／２最大刺激は、３２ｐｇ／１ｍｌのａＦＧＦ１５５の濃度で生じた。細菌培地中に含入される非精製ヒトａＦＧＦ１５５も、３Ｔ３線維芽細胞アッセイにおいて生物学的活性を示し、これは精製ａＦＧＦ１５５と等価であったが、このことは、ａＦＧＦ１５５が、可溶性の生物学的に活性なタンパク質として、最初から細菌中で合成されたことを示す。
【００６２】
実施例２
ファージ依存的方法によるヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型の産生
ヒトａＦＧＦ（１３４個のアミノ酸）（図６：配列番号４）をコードする化学合成遺伝子を１コピー含有するプラスミドｐＥＴ２４−１３４＠ｒｅｖ（図５）により、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＯＶＡＧＥＮ）の培養物を形質転換した。翻訳アミノ酸配列は、配列番号５で示される。ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物は、細菌ゲノム中に、誘導性ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を単一コピー含有する（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３−１３０）。プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）（ＮＯＶＡＧＥＮ）中に、Ｔ７プロモーターの制御下でヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型遺伝子を挿入した。ヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型遺伝子の発現は、ＩＰＴＧによるｌａｃＵＶ５プロモーターの誘導により媒介されて細胞中のＴ７ポリメラーゼが出現した後にのみ、開始する。
【００６３】
５０ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で、３７℃で振盪しながら、プラスミドｐＥＴ２４−１３４＠ｒｅｖを有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物を、２×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。次に、１細菌細胞当り約１０ファージ体の多重度で、ファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４で細胞を感染させて、２１℃で約１４時間、振盪しながら培養した。ファージと同時に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地中に導入した。
【００６４】
エシェリヒア・コリＲＬＭＩの溶原性培養物からファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４を調製し、これをＬＢ培地中で３０℃で集中的に曝気しながら、約１×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。溶原性培養物を４３℃に暖めて、２０分間インキュベートし、ｃＩリプレッサーを不活性化した。次に温度を３７℃に下げて、６０〜７０分後、細菌細胞を溶菌すると、ファージが１〜２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌで生成された。
【００６５】
ファージ感染細胞とともに１４時間インキュベートした後、遠心分離により破砕屑を培地から除去した。ｈａＦＧＦ１３４タンパク質を含有する培地をヘパリンセファロースカラムに適用して、精製ヒトａＦＧＦ１３４タンパク質を得た。
【００６６】
実施例３
ファージ依存的方法によるヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型の産生
ヒトａＦＧＦ（図８：１４０個のアミノ酸）（配列番号６）をコードする化学合成遺伝子を１コピー含有するプラスミドｐＥＴ２４−１４０＠ｒｅｖ（図７）により、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＯＶＡＧＥＮ）の培養物を形質転換した。対応するタンパク質は、配列番号７として示される。ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物は、細菌ゲノム中に誘導性ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を単一コピー含有する（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３−１３０）。プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）（ＮＯＶＡＧＥＮ）中に、Ｔ７プロモーターの制御下でヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型遺伝子を挿入した。ヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型遺伝子の発現は、ＩＰＴＧによるｌａｃＵＶ５プロモーターの誘導により媒介されて細胞中のＴ７ポリメラーゼが出現した後にのみ、開始する。
【００６７】
５０ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で、３７℃で振盪しながら、ｐＥＴ２４−１４０＠ｒｅｖを有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物を、２×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。次に、１細菌細胞当り約１０ファージ体の多重度で、ファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４で細胞を感染させて、２１℃で約１４時間、振盪しながら培養した。ファージと同時に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地中に導入した。
【００６８】
エシェリヒア・コリＲＬＭＩの溶原性培養物からファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ ５４を調製し、これをＬＢ培地中で、３０℃で集中的に曝気しながら、約１×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。溶原性培養物を４３℃に暖めて、２０分間インキュベートし、ｃＩリプレッサーを不活性化した。次に温度を３７℃に下げて、６０〜７０分後、細菌細胞を溶菌すると、ファージが１〜２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌで生成された。
【００６９】
ファージ感染細胞とともに１４時間インキュベートした後、遠心分離により破砕屑を培地から除去した。ｈａＦＧＦ１４０アミノ酸型を含有する培地をヘパリンセファロースカラムに適用して、精製ｈａＦＧＦ１４０を得た。
【００７０】
上記の方法により産生されたヒトａＦＧＦ１４０は、ニワトリ（ｃｈｉｃｋ）膜アッセイ（実施例６）に基づいた生物学的活性を有した。
【００７１】
実施例４
ファージ依存的方法によるヒトａＦＧＦ１４６アミノ酸型の産生
ヒトａＦＧＦ（１４６個のアミノ酸）（示されていない）をコードする化学合成遺伝子を１コピーを含有するプラスミドｐＥＴ２４−１４６＠ｒｅｖにより、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＯＶＡＧＥＮ）の培養物を形質転換した。ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物は、細菌ゲノム中に誘導性ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を単一コピー含有する（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３−１３０）。プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）（ＮＯＶＡＧＥＮ）中に、Ｔ７プロモーターの制御下でヒトａＦＧＦ１４６アミノ酸型遺伝子を挿入した。ヒトａＦＧＦ１４６アミノ酸型遺伝子の発現は、ＩＰＴＧによるｌａｃＵＶ５プロモーターの誘導により媒介されて細胞中のＴ７ポリメラーゼが出現した後にのみ、開始する。
【００７２】
５０ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で、３７℃で振盪しながら、ｐＥＴ２４−１４６＠ｒｅｖを有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物を、２×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。次に、１細菌細胞当り約１０ファージ体の多重度で、ファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４で細胞を感染させて、２１℃で約１４時間、振盪しながら培養した。ファージと同時に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地中に導入した。
【００７３】
エシェリヒア・コリＲＬＭＩの溶原性培養物からファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４を調製し、これをＬＢ培地中で３０℃で集中的に曝気しながら、約１×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。溶原性培養物を４３℃に暖めて、２０分間インキュベートし、ｃＩリプレッサーを不活性化した。次に温度を３７℃に下げて、６０〜７０分後、細菌細胞を溶菌すると、ファージが１〜２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌで生成された。
【００７４】
ファージ感染細胞とともに１４時間インキュベートした後、遠心分離により破砕屑を培地から除去した。ｈａＦＧＦ１４６タンパク質を含有する培地をヘパリンセファロースカラムに適用して、精製ヒトｈａＦＧＦ１４６を得た。
【００７５】
上記の方法により産生されたヒトａＦＧＦ１４６は、ニワトリ（ｃｈｉｃｋ）膜アッセイ（実施例６）に基づいた生物学的活性を有した。
【００７６】
実施例５
組換えｈａＦＧＦタンパク質の精製
ｈａＦＧＦタンパク質を含有する培地を、１倍量の０．０４ＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．０で希釈し、０．０２ＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．０で平衡させたヘパリン−セファロースカラムに適用した。流量を８０ｍｌ／時間に調整した。ｈａＦＧＦタンパク質を含有する培地の適用後、カラムを０．０２ＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．０で洗浄した。次にカラムを、０．６ＭのＮａＣｌを含有する０．０２ＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．３で洗浄した。１．５ＭのＮａＣｌを含有する０．０２ＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．５を用いて、溶離を実行した。全工程を４℃で実行した。
【００７７】
実施例６
ニワトリ胚漿尿膜（ＣＡＭ）中の新規の血管の形成に及ぼすＦＧＦ作用の試験方法
ニワトリ胚のモデルにおける血管新生の試験方法（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ． （１９８５）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ８２：６４０９−６４１３）を適応させて、精製脳由来酸性線維芽細胞成長因子と比較した場合の、血管形成に及ぼすｈａＦＧＦ１５５、１４６および１４０組換えタンパク質の作用を確定した。精製脳由来酸性線維芽細胞成長因子は、インターロイキンと相同の配列を有する強力な血管新生性血管内皮細胞分裂促進因子である。
【００７８】
３日齢ニワトリ胚の殻をエチルアルコールで滅菌した。鉗子を用いて殻および殻下被膜を気室から除去し、３５ｍｍのプラスチックペトリ皿の底で卵を覆った。胚を３７℃で５〜６日間インキュベートした。この期間の終了時に、胚を検査し、ＣＡＭが十分に発達した血管を有する卵を実験用に選択した。
【００７９】
ＦＧＦを含有するゲルを沈着させた濾紙円板を、ゲルを血管に向けた状態で、卵ＣＡＭ上に載せ、３７℃でさらに３日間、サーモスタット中でインキュベートした。ゲルを以下の方法で調製した：試験量のＦＧＦをイーグル培地（溶液１）３０ ｌ中に溶解し、次に、３０ ｌのイーグル培地中で、１０ｇのヘパリンを溶解し、２％のアガロースを付加した（溶液２）。次に等倍量の溶液１および溶液２を混合し、得られた混合物を、直径１２ｍｍの濾紙円板上に６０ ｌのアリコートで沈着させた。
【００８０】
４日目に、濾紙円板を取り出した。濃化牛乳（乳脂肪１０％）を約１ｍｌまたはそれ未満の量でＣＡＭ下に注入した。それにより、ＣＡＭ血管が容易に観察される白色バックグラウンドになった。
【００８１】
実験結果を、コンピューターに接続したビデオカメラで記録した。以下のパラメーターにより、ＦＧＦの影響下での新規のＣＡＭ血管の形成を評価した：血管成長の性質および方向、それらの量および質（大、中、小）、吻合の存在または非存在等。これらのデータを、ＦＧＦに曝露しなかった対照試料と比較した。発生１４日目のニワトリ胚血管を、本明細書中に記載したファージ依存的組換え方法により産生され、上記のようにヘパリンセファロース上で精製し、ＦＧＦ１５５で処理した。
【００８２】
組換えＦＧＦ１５５タンパク質の適用は、新規の血管形成を実証した。１ｇのＦＧＦ１５５の適用後４日目、血管は主として小さく、放射状成長を示した。ＦＧＦ１５５の量を３ｇへ増大すると、血管のサイズは対応して増大した。中型血管が、放射状成長するのが観察された。適用されたＦＧＦの量を４ｇへさらに増大すると、対照と比較した場合、適用後４日目に大型、中型および小型血管の発達を示した。
【００８３】
実施例７
ファージ依存的方法によるヒト成長ホルモンの産生
ヒト成長ホルモンをコードする化学合成遺伝子（配列番号８）を１コピー含有するプラスミドにより、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＯＶＡＧＥＮ）の培養物を形質転換した。翻訳アミノ酸配列は、配列番号９として示される。ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物は、細菌ゲノム中に、誘導性ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を単一コピー含有する（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３−１３０）。プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）（ＮＯＶＡＧＥＮ）中に、Ｔ７プロモーターの制御下でヒト成長ホルモン遺伝子を挿入した。ヒト成長ホルモン遺伝子の発現は、ＩＰＴＧによるｌａｃＵＶ５プロモーターの誘導により媒介されて細胞中のＴ７ポリメラーゼが出現した後にのみ、開始する。
【００８４】
５０ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で、３７℃で振盪しながら、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換した培養物を、２×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。次に、１細菌細胞当り約１０ファージ体の多重度で、ファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４で細胞を感染させて、２１℃で約１４時間、振盪しながら培養した。ファージと同時に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地中に導入した。
【００８５】
エシェリヒア・コリＲＬＭＩの溶原性培養物からファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４を調製し、これをＬＢ培地中で、３０℃で集中的に曝気しながら、約１×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。溶原性培養物を４３℃に暖めて、２０分間インキュベートし、ｃＩリプレッサーを不活性化した。次に温度を３７℃に下げて、６０〜７０分後、細菌細胞を溶菌すると、ファージが１〜２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌで生成された。
【００８６】
ファージ感染細胞とともに１４時間インキュベートした後、遠心分離により破砕屑を培地から除去した。ヒト成長ホルモンタンパク質を、当業者に既知の方法により、カラムクロマトグラフィーによって精製して、精製ヒト成長ホルモンを得た。精製ヒト成長ホルモンは、Ｎｂ２リンパ腫細胞を利用して細胞ベースのバイオアッセイでアッセイ（Ｇｏｕｔ ＰＷ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４０：２４３３−２４３６， １９８０）した場合、生物学的に活性であった。Ｎｂ２細胞増殖の１／２最大刺激を生じたヒト成長ホルモンの濃度は、１２５ｐｇ／ｍｌであった。
【００８７】
実施例８
ファージ依存的方法によるヒトインターフェロン−２ｂの産生
ヒトインターフェロン−２（図１０；配列番号１０）をコードする化学合成遺伝子を１コピー含有するプラスミドｐＥＴ２４ａｐ−ｉｎｆ＠ｒｅｖ（図９）により、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＯＶＡＧＥＮ）の培養物を形質転換した。翻訳アミノ酸配列は、配列番号１１として示される。ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物は、細菌ゲノム中に、誘導性ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を単一コピー含有する（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３−１３０）。プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）（ＮＯＶＡＧＥＮ）中に、Ｔ７プロモーターの制御下でインターフェロン遺伝子を挿入した。インターフェロン遺伝子の発現は、ＩＰＴＧによるｌａｃＵＶ５プロモーターの誘導により媒介されて細胞中のＴ７ポリメラーゼが出現した後にのみ、開始する。
【００８８】
５０ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で、３７℃で振盪しながら、プラスミドｐＥＴ２４ａｐ−ｉｎｆ＠ｒｅｖを有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物を、２×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。次に細胞を、１細菌細胞当り約１０ファージ体の多重度で、ファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４で感染させて、２１℃で約１４時間、振盪しながら培養した。ファージと同時に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地中に導入した。
【００８９】
エシェリヒア・コリＲＬＭＩの溶原性培養物からファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４を調製し、これをＬＢ培地中で、３０℃で集中的に曝気しながら、約１×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。溶原性培養物を４３℃に暖めて、２０分間インキュベートし、ｃＩリプレッサーを不活性化した。次に温度を３７℃に下げて、６０〜７０分後、細菌細胞を溶菌すると、ファージが１〜２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌで生成された。
【００９０】
ファージ感染細胞とともに１４時間インキュベートした後、遠心分離により破砕屑を培地から除去した。当業者に既知の方法により、カラムクロマトグラフィーによってインターフェロンを精製して、精製インターフェロンを得た。
【００９１】
開示される方法により産生されたインターフェロンは、水疱性口内炎ウイルス感染ウシ腎臓細胞で実施されたインターフェロン抗ウイルスアッセイ（Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｐ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１９：５７９−５９２， １９８６）に基づいた生物学的活性を有した。インターフェロンα２ｂは、このアッセイにおいて、１．８１×１０８国際単位（ＩＵ）／タンパク質１ｍｇの生物学的効力を有した。精製前に細菌培地中に含入されたインターフェロンα２ｂは、この抗ウイルスアッセイにおいて精製インターフェロンと同等の効力を有し、このことは、インターフェロンα２ｂが可溶性の生物学的に活性なタンパク質として、最初から細菌中で合成されたことを示す。
【００９２】
実施例９
ファージ依存的方法によるエシェリヒア・コリメチオニンアミノペプチダーゼの産生
エシェリヒア・コリメチオニンアミノペプチダーゼをコードする化学合成遺伝子を１コピー含有するプラスミドにより、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＯＶＡＧＥＮ）の培養物を形質転換した。ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物は、細菌ゲノム中に、誘導性ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を単一コピー含有する（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３−１３０）。プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）（ＮＯＶＡＧＥＮ）中に、Ｔ７プロモーターの制御下でメチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子を挿入した。大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子の発現は、ＩＰＴＧによるｌａｃＵＶ５プロモーターの誘導により媒介されて細胞中のＴ７ポリメラーゼが出現した後にのみ、開始する。
【００９３】
５０ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で、３７℃で振盪しながら、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換した培養物を、２×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。次に細胞を、１細菌細胞当り約１０ファージ体の多重度で、ファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４で感染させて、２１℃で約１４時間、振盪しながら培養した。ファージと同時に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地中に導入した。
【００９４】
エシェリヒア・コリＲＬＭＩの溶原性培養物からファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４を調製し、これをＬＢ培地中で、３０℃で集中的に曝気しながら、約１×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。溶原性培養物を４３℃に暖めて、２０分間インキュベートし、ｃＩリプレッサーを不活性化した。次に温度を３７℃に下げて、６０〜７０分後、細菌細胞を溶菌すると、ファージが１〜２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌで生成された。
【００９５】
ファージ感染細胞とともに１４時間インキュベートした後、遠心分離により破砕屑を培地から除去した。当業者に既知の方法により、カラムクロマトグラフィーによってエシェリヒア・コリメチオニンアミノペプチダーゼを精製して、精製エシェリヒア・コリメチオニンアミノペプチダーゼを得た。
【００９６】
実施例１０
ファージ依存的方法により産生される組換えタンパク質のゲル分析
変性条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型、ヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型、ヒトａＦＧＦ１５５アミノ酸型、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、およびメチオニンアミノペプチダーゼを含有する培地を分析し、クーマシーブルーで染色した。ヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型、ヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型、ヒトａＦＧＦ１４６アミノ酸型、ヒト成長ホルモン、およびインターフェロンタンパク質を含有する培地の電気泳動写真は、図１１において分子量標準と比較される。レーン２は、ヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型を含有する培地３０ ｌを示す。レーン３は、組換えＦＧＦ１４０タンパク質を含有する培地３０ ｌを示す。レーン４は、組換えインターフェロンを含有する培地３０ ｌを示す。レーン５は、組換えＦＧＦ１５５タンパク質を含有する培地３０ ｌを示す。レーン６は、組換えヒト成長ホルモンを含有する培地３０ ｌを示す。レーン７は、組換えメチオニンアミノペプチダーゼを含有する培地３０ ｌを示す。レーン１は、２ｇの各分子量標準（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を示す。上から、分子量標準は、９４，０００；６７，０００；４３，０００；３０，０００；２０，１００；および１４，４００である。
【００９７】
密度計Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ ＶＤＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてポリアクリルアミドゲル上の染色タンパク質帯域を走査することにより、混合物中のヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型、ヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型、ヒトａＦＧＦ１５５アミノ酸型、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、およびメチオニンアミノペプチダーゼの量の定量を成し遂げた。ファージ感染培養中の組換えタンパク質の産生は、総細胞タンパク質の約２０％であった。
【００９８】
精製組換えヒトａＦＧＦ１３４、ｈａＦＧＦ１４０、ｈａＦＧＦ１４６、インターフェロン、ｈａＦＧＦ１５５およびメチオニンアミノペプチダーゼタンパク質を含有する培地の電気泳動写真を、分子量標準と比較した（図１２）。レーン２は、５ｇの精製ａＦＧＦ１３４タンパク質を示す。レーン３は、５ｇの精製ヒトａＦＧＦ１４０を示す。レーン４は、５ｇの精製ヒトａＦＧＦ１４６アミノ酸型を示す。ファージ感染培養中のヒトａＦＧＦ１４６アミノ酸型の産生は、総細胞タンパク質の約２０％であった。レーン５は、５ｇの精製インターフェロンを示す。レーン６は、５ｇのｈａＦＧＦ１５５タンパク質を示す。レーン７は、５ｇの精製エシェリヒア・コリメチオニンアミノペプチダーゼを示す。レーン１および８は、２ｇの各分子量標準（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を示す。
【００９９】
本発明の精神から逸脱せずに多数のならびに種々の変更がなされ得る、と当業者には理解されよう。したがって、本発明の形態は例証のためだけのものであって、本発明の範囲を限定するように意図されないことは明確に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
高度に発現されたエシェリヒア・コリタンパク質中に見出されるコドンによって天然に存在するコドンを置換することにより改変されたヒト酸性線維芽細胞成長因子（１５５個のアミノ酸） （配列番号１）の化学合成ヌクレオチド配列、ならびに翻訳アミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図２】
化学合成ｈａＦＧＦ１５５コドンにおいてなされた改変を示す。ＦＧＦｆｒＨＵＭＥＣＧＦＢは、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）から得られた配列（配列番号３）である。ＨａＦＧＦ １５５は、本発明の一実施形態による化学合成配列（配列番号１）である。
【図３】
化学合成ｈａＦＧＦ１５５遺伝子（配列番号１）を含有するｐＥＴ２４−１５５＠ｒｅｖ構築物を示す。
【図４】
ＨＰＬＣ精製ｈａＦＧＦ１５５を示す。電気泳動写真において：レーン１：１０ ｌの組換えｈａＦＧＦ１５５を含有する状態調節培地；レーン２：７ ｌのヘパリン−セファロース精製組換えｈａＦＧＦ１５５（０．４５ ｇ／ｌ）；レーン３：８０ ｌのうちの１４ ｌのＨＰＬＣ−精製ｈａＦＧＦ １５５である。左端の印のないレーンは、分子量標準を含有する。
【図５】
化学合成ｈａＦＧＦ１３４遺伝子（配列番号４）を含有するｐＥＴ２４−１３４＠ｒｅｖ構築物を示す。
【図６】
高度に発現された大腸菌タンパク質中に見出されるコドンによって天然に存在するコドンを置換することにより改変された、ヒト酸性線維芽細胞成長因子（１３４個のアミノ酸）（配列番号４）の化学合成ヌクレオチド配列、ならびに翻訳アミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図７】
化学合成ｈａＦＧＦ１４０遺伝子（配列番号６）を含有するｐＥＴ２４−１４０＠ｒｅｖ構築物を示す。
【図８】
高度に発現された大腸菌タンパク質中に見出されるコドンによって、天然に存在するコドンを置換することにより改変された、ヒト酸性線維芽細胞成長因子（１４０個のアミノ酸）（配列番号６）の化学合成ヌクレオチド配列、ならびに翻訳アミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【図９】
化学合成インターフェロン−２ｂ遺伝子（配列番号１０）を含有するｐＥＴ２４ａｐ−ｉｎｆ＠ｒｅｖ構築物を示す。
【図１０】
高度に発現されたエシェリヒア・コリタンパク質中に見出されるコドンによって、天然に存在するコドンを置換することにより改変された、ヒトインターフェロン−２ｂ（配列番号１０）の化学合成ヌクレオチド配列、ならびに翻訳アミノ酸配列（配列番号１１）を示す。
【図１１】
本明細書中に記載したファージ依存的方法により産生されたタンパク質を含有する１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。レーン１：分子量標準、各々２ｇ標準；レーン２：組換えＦＧＦ１３４タンパク質を含有する４０ ｌの培地；レーン３：組換えＦＧＦ１４０タンパク質を含有する４０ ｌの培地；レーン４：組換えインターフェロン２Ｂを含有する４０ ｌの培地；レーン５：組換えＦＧＦ１５５タンパク質を含有する４０ ｌの培地；レーン６：組換えヒト成長ホルモンを含有する４０ ｌの培地；レーン７：組換えメチオニンアミノペプチダーゼを含有する４０ ｌの培地；レーン８：エシェリヒア・コリのガラクトシダーゼを含有する４０ ｌの培地。
【図１２】
本願により請求された発明に従って、精製された組換えタンパク質を含有する１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。レーン１：分子量標準；レーン２：５ｇの精製ＦＧＦ１３４タンパク質；レーン３：５ｇの精製ＦＧＦ１４０タンパク質；レーン４：５ｇの精製ＦＧＦ１４６タンパク質；レーン５：５ｇの精製インターフェロン２Ｂタンパク質；レーン６：５ｇの精製ＦＧＦ１５５タンパク質；レーン７：５ｇの精製メチオニンアミノペプチダーゼタンパク質；レーン８：分子量標準。
［発明の背景］
発明の分野
本発明は、組換えＤＮＡ技術に、特に細菌宿主細胞中での異種タンパク質の産生を増強するための新規の方法に関する。開示された方法は、Ｔ７プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子をコードするプラスミドを含む宿主細胞を、バクテリオファージλによって感染させて、細菌宿主細胞の溶菌を誘導することを含む。超産生は、プラスミド単独が異種ＤＮＡを少なくとも１コピー保有する場合、あるいはプラスミドおよびファージλの両方がそれぞれ、異種ＤＮＡを少なくとも１コピー保有する場合に、選択された宿主細胞中で達成され得る。
【０００２】
関連分野の説明
目下、遺伝子操作方法により、医学および産業における重要な用途を有する種々の生物活性物質をかなりの量で産生することができる微生物株の作製が可能になっている。典型的には、異種遺伝子が挿入されたプラスミドベクターを用いて、細菌宿主細胞を形質転換することができる。エシェリヒア・コリの種々の菌株はしばしば、受容細胞として用いられる。このようなプラスミド依存性形質転換法を用いて、種々の有益なヒトペプチドおよびタンパク質、例えばインスリン、γ−インターフェロン、多数のインターロイキン、スーパーオキシドジスムターゼ、プラスミノーゲン活性剤、腫瘍壊死因子、エリスロポエチン等を産生するために、大腸菌細胞が操作されてきた。これらの物質は、医療行為においてすでに用いられているか、あるいは様々な段階の臨床試験を受けている。
【０００３】
しかしながら、プラスミド法は重大な欠点を有する。つまり、多段階プロセスである生合成後に所望の産物を細菌細胞から抽出しなければならないため、技術的に複雑であるという点である。例えばインターフェロンの抽出は、細胞の崩壊、緩衝液抽出、ポリエチレメニン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｍｉｎｉｎ）処理、光照射、硫酸アンモニウムによる沈殿、透析および遠心分離を含む（欧州特許００４３９８０号（Ｇｏｅｄｄｅｌ））。このような抽出および精製工程の必要性は、組換え産物の産生技術を複雑にするだけでなく、特に大規模工業生産において実質的ロスを発生させる。
【０００４】
さらに複雑にする因子としては、クローン化遺伝子の比較的高レベルでの発現により生成される真核生物タンパク質が、しばしば細胞膜と結合して不溶性集合体として大腸菌の細胞質中に蓄積される傾向があることである。従って、上述したような困難な抽出および精製方法は、不溶性封入体の抽出に関連した付加的技術的手法によって補足改良される必要がある。通常、不溶性タンパク質は、イオン性洗浄剤（例えばＳＤＳまたはラウリルサルコシン）を高い温度で用いて、または変性剤（例えば８Ｍの尿素または６〜８Ｍのグアニジン塩酸塩）の存在下で可溶化される。
【０００５】
精製の最終段階において、可溶化ポリペプチドの再生および再酸化をすることが多いが、これは機能的活性を回復するために必要とされる。その自然立体配座におけるタンパク質の適正なフォールディングに必要であるジスルフィド結合は、再生されなければならない。再生手法、例えばジスルフィド交換は、高価でかつ比較的有毒な試薬、例えばグルタチオン、ならびに酸化２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールを使用することがある。さらに、生物活性遺伝子操作タンパク質の最終収率は比較的低い。さらに、可溶化し、二次および三次のタンパク質構造を再形成するための有毒試薬が、たとえ極微量の濃度でも存在することは、タンパク質のその後の臨床用途を妨げる。したがって、細菌宿主細胞内において不溶性封入体の形態の標的タンパク質を生成することは、組換えタンパク質の産生を複雑にし、収率低減を生じるだけでなく、最終タンパク質を臨床的用途に適さないものにし得る（Ｆｉｓｈｅｒ， Ｂ．， Ｓｕｍｎｅｒ， Ｉ．， Ｇｏｏｄｅｎｏｕｇｈ， Ｐ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ． ４１： ３−１３， １９９３）。
【０００６】
プラスミドで形質転換した細菌宿主細胞から、異種遺伝子の発現により産生されたタンパク質を抽出することに伴う技術上の困難性は、形質転換した細菌宿主細胞をバクテリオファージによって感染させ、その溶菌経路により運搬体（ｂｅａｒｅｒ）細胞を溶菌することにより克服され得る。このようにして、所望のタンパク質は培地中に簡単に放出され得る（英国特許２ １４３ ２３８Ａ（Ｂｒｅｅｚｅ Ａ．Ｓ．））。したがってＢｒｅｅｚｅは、溶菌を制御するために、ｃＩ中に温度感受性突然変異を有するファージλによって細菌細胞を感染させ、その結果エシェリヒア・コリ中で産生される酵素の収率を増大する方法を開示した。ｃＩ遺伝子産物は、初期転写のリプレッサーであり、その結果として、頭−尾（ｈｅａｄ ａｎｄ ｔａｉｌ）アセンブリーおよび細胞溶菌に必要とされるファージＤＮＡの後期領域の転写を遮断する（Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．， Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， １９８２， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。ｃＩ中に温度感受性突然変異を有するバクテリオファージは、ｃＩ遺伝子産物が溶菌成長に必要なファージ遺伝子の転写を抑制できる温度で細胞が増殖する限り、溶原状態を確立し、保持することができる。したがって、形質転換した宿主細胞は３０℃で培養され得るが、この場合、最大発酵生産の段階が達成されるまで、ファージＤＮＡ転写のｃＩ媒介性抑制は継続し、ファージは溶原状態のまま保持される。その後、ｃＩリプレッサーを不活性化し、ファージの溶菌の発生を開始させるために、３０分間、培養温度を４２℃に上げる。次に、宿主細胞を３０℃で２〜３時間インキュベートして、完全溶菌および酵素の放出を可能にする（ＧＢ２ １４３ ２３８Ａ（Ｂｒｅｅｚｅ Ａ．Ｓ．））。
【０００７】
Ｂｒｅｅｚｅは細菌プロデューサー細胞からのタンパク質の放出を教示するが、それは、エシェリヒア・コリの成長にとって最適温度でない３０℃を超えない温度でプロデューサー細胞を培養することを要する。細胞は、３２℃を超える温度では、温度感受性溶菌プロファージが発生し、最大発酵蓄積の段階に達する前に溶菌を受けるために、最適温度（３７℃）での合成は可能でない。さらに、Ｂｒｅｅｚｅにより開示されたように、４２℃で３０分間、細菌宿主細胞をインキュベートすると、標的タンパク質を破壊するプロテアーゼを活性化する可能性がある。
【０００８】
Ａｕｅｒｂａｃｈ等（米国特許第４，６３７，９８０号）は、組換え産物の溶菌放出を誘導するために、ファージλＤＮＡ断片を用いた。その方法では、Ｂｒｅｅｚｅと同様に、λｃＩ遺伝子産物における温度感受性突然変異を用いて、細菌宿主細胞の温度依存性溶菌を与えた。ＡｕｅｒｂａｃｈにおけるλＤＮＡ断片は、４２℃でｃＩリプレッサーを不活性化した後に、リゾチームを産生するために、機能するエンドリシンコード遺伝子Ｎ、Ｑ、ＲおよびＳを保持した。残りのファージ遺伝子のほとんどが欠失され、ＯおよびＰ遺伝子における突然変異は、ファージＤＮＡの複製を防止した。その結果として、λＤＮＡは、標的遺伝子の発現を調整することができる完全な機能を有するファージでなかった。さらに、ＡｕｅｒｂａｃｈのλＤＮＡは、標的遺伝子を保有するためのベクターとして用いるのに適切でなかった。さらに、上記のように、４２℃〜４４℃で９０〜１２０分間、細菌宿主細胞をインキュベートすると、Ａｕｅｒｂａｃｈによる開示のように、標的タンパク質を破壊するプロテアーゼを活性化し得る。
【０００９】
細菌プロデューサー細胞からの活性タンパク質の溶菌放出に加えて、バクテリオファージは、宿主細菌細胞中に異種ＤＮＡを保有させるための、細菌プラスミドベクターに対する代替物としても用いられてきた（Ｍｕｒｒａｙ， Ｎ．Ｅ． ａｎｄ Ｍｕｒｒａｙ， Ｋ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５１：４７６−４８１， １９７４； Ｍｏｉｒ， Ａ．， Ｂｒａｍｍａｒ， Ｗ．Ｊ．， Ｍｏｌｅｃ． ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １４９：８７−９９， １９７６）。典型的には、遺伝子およびそれらの産物の増幅は、ファージの溶菌成長中に達成されるが、この場合、ファージゲノムは細菌宿主ＤＮＡ中に組み込まれる（Ｐａｎａｓｅｎｋｏ， Ｓ．Ｍ．， Ｃａｍｅｒｏｎ， Ｊ．Ｒ．， Ｄａｖｉｓ， Ｒ．Ｖ．， Ｌｅｈｍａｎ， Ｌ．Ｒ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８８−１８９， １９７７； Ｍｕｒｒａｙ， Ｎ．Ｅ． ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｙ， Ｗ．Ｓ．， Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １７５：７７−８７， １９７９； Ｗａｌｔｅｒ， Ｆ．， Ｓｉｅｇｅｌ， Ｍ．， Ｍａｌｋｅ， Ｈ．， １９９０， ＤＤ ２７６， ６９４； Ｍｏｒｙ， Ｙ．， Ｒｅｖｅｌ， Ｍ．， Ｃｈｅｎ， Ｌ．， Ｓｈｅｌｄｏｎ， Ｉ．Ｆ．， Ｙｕｔｉ−Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ， １９８３， ＧＢ ２，１０３，２２２Ａ）。通常、組換えファージλの溶原性培養物が細菌宿主細胞を感染させるために用いられるか、または組換え溶原性ファージλをすでに保有する「ウォームアップ」細菌培養物が、異種遺伝子の発現を増幅するために成育させられる。
【００１０】
異種遺伝子の発現のためのλベクターの使用の成功例があるが、λベクターは、主として遺伝子クローニングのために用いられてきた。一旦クローン化されると、遺伝子はより効果的に発現するためにプラスミドベクターにトランスファーされる。例えば、大腸菌が、ヒトβ−インターフェロン遺伝子を含有するファージλシャロン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａ Ｃ１５によって感染された場合、細胞溶菌産物中のインターフェロンの量は、７〜８×１０６単位／リットルとなる。標的遺伝子を保有するＤＮＡ断片がファージからプラスミドに再クローン化された後、β−インターフェロン収率は１×１０８単位／リットルに向上した（Ｍｏｉｒ， Ａ．， Ｂｒａｍｍａｒ， Ｗ．Ｊ．， Ｍｏｌｅｃ． ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １４９：８７−９９， １９７６）。
【００１１】
組換えλベクターにより細菌宿主細胞中で生成された異種タンパク質の収率を向上させるために、ファージゲノム中に突然変異を導入して、細菌細胞溶菌を開始する能力をファージλから失わせた。その結果、異種遺伝子が細菌宿主細胞により発現される時期が延長され、収率の増大が達成される。したがって、例えばＳ遺伝子中にアンバー突然変異を有するλｇｔ４ｌｉｇＳプロファージを含む溶原性培養中のＤＮＡリガーゼ１の収率は、アンバー突然変異を有さないλｇｔ４ｌｉｇプロファージを含有する溶原性培養中のＤＮＡリガーゼ１の収率の５倍であった（Ｐａｎａｓｅｎｋｏ， Ｓ．Ｍ．， Ｃａｍｅｒｏｎ， Ｊ．Ｒ．， Ｄａｖｉｓ， Ｒ．Ｖ．， Ｌｅｈｍａｎ， Ｌ．Ｒ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８８−１８９， １９７７）。ファージλＳタンパク質は、溶菌のために必要とされる。したがってＳ突然変異体は、宿主細胞を溶菌せずに、多数の細胞内子孫ファージ粒子、ならびに標的タンパク質を蓄積する（Ｍａｎｔｉａｔｉｓ， Ｔ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．， Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， １９８２， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。
【００１２】
同様に、ＤＮＡポリメラーゼ１の収率向上が、アンバー突然変異を有さない組換えファージλと比較して、ＳおよびＱ遺伝子中にアンバー突然変異を有する組換えファージλを含む溶原性培養に関して報告された（Ｍｕｒｒａｙ， Ｎ．Ｅ． ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｙ， Ｗ．Ｓ．， Ｍｏｌｅｃ． ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １７５：７７−８７， １９７９）。ファージλＱタンパク質は、頭−尾（ｈｅａｄ ａｎｄ ｔａｉｌ）アセンブリーおよび細胞溶菌に関与する多数の遺伝子を含むファージＤＮＡの後期領域の転写のために必要である（Ｍａｎｔｉａｔｉｓ， Ｔ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ．， Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， １９８２， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。
【００１３】
米国特許第４，７１０，４６３号において、Ｍｕｒｒａｙは、ｃＩにおける温度感受性突然変異、ならびにλＳおよびλＥ遺伝子における突然変異を含有するファージλを用いてエシェリヒア・コリの非抑制（Ｓｕ°）株を溶原化することを開示する。その結果として、通常の方法ではファージ遺伝子産物により溶菌されず、また、組換えファージゲノムはキャプシド封入されず、転写のために依然として利用可能であるため、３７℃で溶原性大腸菌を長期に培養することにより、細胞内に保持される組換えタンパク質が高レベルに産生される。
【００１４】
Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｑおよび／またはＥ突然変異を有するλベクターを用いることにより異種タンパク質の収率の向上が可能であるにもかかわらず、標的タンパク質の溶菌放出に関連したバクテリオファージベクターの潜在的技術的利点は、標的タンパク質は細菌細胞内部に蓄積するために、これらの突然変異により失われ得る。したがって、溶菌欠損突然変異体λベクターが異種タンパク質の産生のために用いられる場合、プラスミドベクターにより形質転換した細菌細胞に関して上述したような抽出および精製工程を実施しなければならず、結果としてロスが生じる。
【００１５】
Ｔ７プロモーター／Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ系は、組換えタンパク質を高レベルで発現させるために有用である。Ｔ７プロモーターの使用は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの存在を要する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、宿主株中の溶原体上に含まれる組換えＴ７ポリメラーゼ遺伝子の誘導により、あるいはＴ７ポリメラーゼ遺伝子の発現のためのプラスミドを用いた形質転換により供給され得る。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、それ自身のプロモーターに対して非常に特異的である。Ｔ７プロモーターからの転写反応は非常に効率的であり、全長ＲＮＡの多数のコピーが各鋳型から産生され得る。
【００１６】
［発明の概要］
一実施形態において、生物学的に活性なタンパク質の産生方法であって、以下の：
Ｔ７ポリメラーゼプロモーターに、作動可能に連結された、生物学的に活性なタンパク質をコードする発現可能遺伝子を少なくとも１コピー有するプラスミドによって、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現することができるエシェリヒア・コリ株を形質転換するステップ、
溶菌の遅延を媒介することができるバクテリオファージを、形質転換した細菌宿主細胞に感染させるステップ、および
上記タンパク質の所望レベルの産生が達成されるまで溶菌を伴わずに、上記細胞の溶菌成長を誘導することができる培養条件下で、かつ、上記タンパク質が、可溶性の生物学的に活性なタンパク質として産生されるように、エシェリヒア・コリ宿主細胞を培養するステップ、
を含む方法が開示される。
【００１７】
好ましい実施形態では、バクテリオファージは温度感受性突然変異を有する。さらに好ましい実施形態では、温度感受性突然変異はｃＩ８５７である。好ましくは、エシェリヒア・コリ宿主細胞は、培養ステップ前に、バクテリオファージの溶菌成長を妨げる温度で成育させられる。
【００１８】
好ましい実施形態では、バクテリオファージは、溶菌の遅延を媒介することができる少なくとも１つの遺伝子中に突然変異を有する。さらに好ましい実施形態では、溶菌の遅延を媒介することができる少なくとも１つの遺伝子は、Ｎ、ＱおよびＲからなる群から選択される。
【００１９】
好ましい実施形態では、エシェリヒア・コリ株は、アンバー突然変異を修復するためのサプレッサーを産生する。
【００２０】
代替的実施形態では、エシェリヒア・コリ株は、アンバー突然変異を修復するためのサプレッサーが欠如する。
【００２１】
好ましい実施形態では、感染バクテリオファージは、約１〜約１００の範囲の感染多重度で提供される。さらに好ましい実施形態では、感染バクテリオファージは、約１０〜約２５の範囲の感染多重度で提供される。
【００２２】
好ましくは、エシェリヒア・コリ株のバクテリオファージ媒介性の溶菌の遅延は、低度の感染多重度と比較してより高度の感染多重度で遅延される。
【００２３】
一実施形態では、発現可能遺伝子は、ヒト酸性線維芽細胞成長因子をコードする。代替的一実施形態では、ヒト酸性線維芽細胞成長因子は１３４個のアミノ酸を含む。別の代替的実施形態では、ヒト酸性線維芽細胞成長因子は１４０個のアミノ酸を含む。別の代替的実施形態では、ヒト酸性線維芽細胞成長因子は１４６個のアミノ酸を含む。別の代替的実施形態では、ヒト酸性線維芽細胞成長因子は１５５個のアミノ酸を含む。もっとも好ましい実施形態では、ヒト酸性線維芽細胞成長因子は配列番号１で記述される配列を有する。
【００２４】
一実施形態では、発現可能遺伝子はヒト成長ホルモンをコードする。代替的実施形態では、発現可能遺伝子はヒトインターフェロンをコードする。さらに別の実施形態では、発現可能遺伝子はエシェリヒア・コリメチオニンアミノペプチダーゼをコードする。
【００２５】
好ましい実施形態では、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下にある。さらに好ましい実施形態では、誘導性プロモーターはｌａｃＵＶ５プロモーターである。
【００２６】
好ましい実施形態では、生物学的に活性なタンパク質の産生方法であって、以下の：
ａ）温度感受性突然変異を有するバクテリオファージλ株を保有するエシェリヒア・コリ細胞の第一の株を成長させるステップ、
ｂ）エシェリヒア・コリの第一の株を溶菌させ、バクテリオファージλを放出させるために温度を調整するステップ、
ｃ）誘導性プロモーターの制御下でＴ７ポリメラーゼプロモーターに、作動可能に連結される、上記生物学的に活性なタンパク質をコードする発現可能遺伝子を少なくとも１コピー有するプラスミドによって形質転換したエシェリヒア・コリ細胞の第二の株を提供し、該エシェリヒア・コリ細胞の第二の株が、誘導物質の添加によりＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現するように誘導され得るようにするステップ、
ｄ）エシェリヒア・コリ細胞の第一の株から放出されたバクテリオファージλで、エシェリヒア・コリ細胞の第二の株を感染させるステップ、および
ｅ）タンパク質が産生され、エシェリヒア・コリ細胞の第二の株の溶菌時に培地中に放出されるように、エシェリヒア・コリ細胞の感染二次株をインキュベートし、上記タンパク質が、可溶性の生物学的に活性なタンパク質として１００μｇ／ｍｌより高い濃度で産生されるようにするステップ、
を含む方法が提供される。
【００２７】
本質的に配列番号１で記述される配列からなる化学合成核酸も、本明細書に開示される発明において具現化される。
【００２８】
本発明、および従来技術を上回って達成される利点を要約するために、本発明の特定の目的および利点を上記において説明した。もちろん、すべてのこのような目的または利点が、本発明の任意の特定の実施形態にしたがって、必ずしも達成できるわけではないことが理解されるはずである。したがって、例えば本発明は、本明細書中に教示されたような一または複数の利点を達成するかまたは最適化する方法で具体化または実行され得るが、本明細書中に教示または示唆され得る他の目的または利点が、必ずしも達成されるわけではないことが当業者には認識されるであろう。
【００２９】
本発明のさらなる態様、特徴および利点は、以下の好ましい実施形態の詳細な説明から明らかになるであろう。
【００３０】
次に、本発明のこれらのおよびその他の特徴を、好ましい実施形態の図面を参照しながら説明するが、これらは本発明を例示するものであって、限定するように意図するものではない。
【００３１】
［好ましい実施形態の詳細な説明］
上記の実施形態は、本発明の好ましい実施形態を代表するが、本発明の精神を逸脱せずに変更が行なわれることは、当業者には理解されるはずである。したがって本発明の範囲は、併記の特許請求の範囲によってのみ確定されるべきである。
【００３２】
ウイルスゲノムの４０％より多くが溶菌成長のために不可欠ではないため、バクテリオファージλはベクターとして有用である。λＤＮＡの中心領域に位置する遺伝子ＪおよびＮ間のλゲノムの領域は、所望の産物をコードする異種ＤＮＡにより置換され得る。その領域は、感染中に初期に転写される。
【００３３】
その合成情報がファージの初期遺伝子の領域に記録される標的遺伝子の発現を最大化するために、ファージの発生のための特定の条件を選択し、確実に適正な複製をさせるべきである。さらに、標的遺伝子を含む初期領域の転写は助長されるべきであるが、細胞溶菌に関与する後期遺伝子の転写は減速されるべきである。これにより、λ粒子の成熟およびその後の細胞溶菌を遅らせることができる。その結果として、標的遺伝子産物を含む初期ファージ産物は細菌細胞中に蓄積する。後期転写の減速、それによる標的遺伝子の発現の延長は、以下の条件により成し遂げられ得る：（１）後期遺伝子の発現を遮断するファージゲノムの突然変異、（２）感染多重度の増大、および／または（３）低温での感染細菌細胞の培養。
【００３４】
バクテリオファージにプロデューサー細胞を感染させることの利点は、ファージが、細菌宿主細胞中でのすべての巨大分子合成の重要な再配列を引き起こす点である。細菌遺伝子の転写を非作動にすることにより、ファージは標的遺伝子の複写を増大し、その結果として、所望の産物の産出を増大することができる。
【００３５】
本発明の超産生系の一実施形態では、細菌の溶菌を遅延するアンバー突然変異（例えばＱ−およびＲ−突然変異）を有するファージλが、ファージλにおけるアンバー突然変異の補正を担うサプレッサーが欠如するＳｕ°と称されるエシェリヒア・コリ株中に提供される。エシェリヒア・コリの非抑制（Ｓｕ°）株を得るために、Ｓｕ°クローンが野生型Ｓｕ＋集団から選択される。好ましくは選択マーカー、例えばテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子が、ファージＤＮＡ中に挿入される。
【００３６】
エシェリヒア・コリの非抑制（Ｓｕ０）株、例えばエシェリヒア・コリＫ８０２の選択は、ファージλｃＩ８５７Ｎａｍ７Ｎａｍ５３ｂｌａ ｔｅｔ（以後、λｂｌａＮ’）を用いて実施された。エシェリヒア・コリＣ６００株（λｂｌａＮ’）は、ファージの供給源として役目を果たした。このファージは、リプレッサー遺伝子（ｃＩ８５７）中にｔｓ−突然変異を有する単一部位（ＥｃｏＲＩ）ベクター中のＥｃｏＲＩ部位にプラスミドｐＣＶ１１（ｂｌａ ｔｅｔ）を挿入することにより得られた。次に、ｉｎ ｖｉｖｏでの組換えにより、２つのアンバー突然変異がファージＮ遺伝子中に導入された。
【００３７】
ファージλクリアを用いて、非溶原性に関してクローンが試験された。ファージλｂｌａＮ’のほかに、ファージλｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４を用いて、サプレッサーに関して検査した。
【００３８】
すでに知られているように、ファージλＮ’突然変異体は宿主細胞を溶菌できず、非常に不安定なプラスミドの形態で細胞中に存在する。宿主細胞がサプレッサーを含有する場合、アンバー突然変異は表現型が補正され、Ｎタンパク質が合成されて、ファージが溶菌的に発生し得る。λＮ’により感染されたＳｕ＋およびＳｕ０細胞の生存能力における違いは、エシェリヒア・コリＳｕ＋細胞集団から自然発生するＳｕ０復帰細胞を選択するための基礎として用いられる。細胞中にアンピシリン耐性マーカーおよびテトラサイクリン耐性マーカーを導入する挿入プラスミドを有するファージλを用いて、非溶菌性Ｓｕ０細胞が突然変異体に関する検査を隠蔽（ｍａｓｋｉｎｇ）しないようにした。ファージは、細胞溶菌を生じるこのようなファージの溶菌発生を可能にするリプレッサー遺伝子中にｔｓ−突然変異も含む。
【００３９】
ファージλｂｌａＮ’による感染とその後の４３℃での成育後、アンピシリンおよびテトラサイクリンを補充された培地にＳｕ＋培養物が接種された場合、プラスミドの形態でファージλｂｌａＮ’を含有するサプレッサーのない単一の細胞がプレート上で発生するはずである。ファージから細胞を救済して、親培養のＳｕ０誘導体を得ることができるはずである。本方法は、いくつかの段階に細分することができる。
【００４０】
１．ファージλｂｌａＮ’による培養物の感染
培養大腸菌Ｓｕ＋を、激しく攪拌しながら３７℃でマルトースを含有するＭ９培地上で、１〜２×１０８細胞／ｍｌの密度になるまで成育させた。１細胞当り５〜１０個の粒子の多重度でファージλｂｌａＮ’を用いて細胞を感染させ、２０℃で２０分間インキュベートした。所定の条件下では、感染効率は約１００％であり、大量のＳｕ＋細胞のほかに、ファージは単一Ｓｕ０細胞も感染する。
【００４１】
２．マーカーファージを含有するサプレッサーのない細胞の選択
感染後、１２γ／ｍｌのテトラサイクリンおよび２０γ／ｍｌのアンピシリンを補充した寒天培地上で細胞を平板培養し、４３℃で成育させた。２４時間で、単一コロニーが発生し、これを、抗生物質を含む寒天培地上で再度平板培養し、３７℃で成長させた。
【００４２】
３．ファージλｂｌａＮ’からの選択クローンの救済
エシェリヒア・コリＳｕ０細胞中のファージλＮ’は、非常に不安定なプラスミドの形態であるため、ファージから救済するために、抗生物質を含有しない選択寒天培地上で選択クローンを平板培養し、３７℃で成育させた。抗生物質を含有しない培地上での一次継代においてファージを失った細胞の数は、１２〜３５％に上った。このような細胞の選択は、抗生物質耐性の欠失およびファージλクリアに対する感受性の獲得をモニタリングすることにより実行した。
【００４３】
４．リプレッサーに関する細胞の検定
アンバー突然変異を有するファージλの、救済クローンの芝地上にプラークを形成する能力を調べた。親エシェリヒア・コリＳｕ＋株と同系であってサプレッサーのない誘導体は、その上にファージλｂｌａＮ’がプラークを形成せず、ファージλｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４が１〜３×１０５ＰＦＵ／ｍｌを産生し、遺伝子ＱおよびＲ中に突然変異を有さないファージλｃＩ８５７が１×１０１０ＰＦＵ／ｍｌを産生したクローンである。
【００４４】
この方法を用いて、エシェリヒア・コリＫ８０２Ｓｕ＋のＳｕ０復帰細胞を得た。感染時点での細胞数およびそれらのうちの、Ｓｕ０復帰細胞の数に基づくと、サプレッサーのない細胞の発生頻度は３×１０−７であった。
【００４５】
好ましい実施形態では、目的遺伝子は、Ｔ７プロモーターの制御下でｐＥＴ−２４ａ（＋）中でクローン化される。任意の目的遺伝子は、本願請求に係る発明の実施に用いられ得る。特定の例としては、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、メチオニンアミノペプチダーゼ、ヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型、ヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型、ヒトａＦＧＦ１４６アミノ酸型およびヒトａＦＧＦ１５５アミノ酸型が挙げられるが、これらに限定されない。代替的実施形態では、目的遺伝子は、適切なプロモーターの制御下で細菌プラスミドおよびファージ中でクローン化され得る。もっとも好ましい実施形態では、化学合成ｈａＦＧＦ１５５遺伝子（配列番号１）は、Ｔ７プロモーターの制御下でｐＥＴ−２４ａ（＋）中でクローン化される。Ｔ７プロモーターは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによってのみ認識され、エシェリヒア・コリのＲＮＡポリメラーゼによっては認識されない。得られたｈａＦＧＦ１５５遺伝子を有するプラスミド（ｐｈａＦＧＦ１５５）をエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）中で形質転換した。この株は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む。Ｔ７ポリメラーゼタンパク質はエシェリヒア・コリ細胞に対して有毒であるので、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、誘導性のｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあって、必要な場合にのみＴ７ＲＮＡポリメラーゼ合成を誘導する。ｌａｃプロモーターによる誘導は、栄養培地にＩＰＴＧを添加することにより実行される。ｈａＦＧＦ１５５タンパク質を得るために、ｈａＦＧＦ１５５遺伝子を有する組換え体プラスミドを含有するプロデューサー株は、２０〜４０℃の温度で、集中的曝気の条件下で、１ｍｌ中に５×１０７〜５×１０９の細胞密度になるように培養される。次にそれは、１細胞当り０．１〜１００個のファージ体の多重度でｔｓ−突然変異ｃＩリプレッサー遺伝子を有するラムダファージにより感染され、インキュベーションが２０〜３７℃で２〜１４時間継続される。ファージと同時的に、ＩＰＴＧが１ｍＭの濃度で導入される。
【００４６】
ｈａＦＧＦ１５５遺伝子は、１５５個のアミノ酸残基を含むタンパク質をコードする。しかしながら、組織試料から単離することができたのは、それより短い２つのａＦＧＦ形態だけであった。２つの単離形態は、１４０および１３４個のアミノ酸残基を含む。１４０個のアミノ酸を含むａＦＧＦは完全体であると考えられるが、一方１３４個のアミノ酸を含むａＦＧＦ形態は切頭（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）されていると考えられる。組織試料から１５５個のアミノ酸を含有するａＦＧＦ形態を抽出することはできなかった。より短いアイソフォームが細胞プロセシングの正常機能として生じるのか、またはａＦＧＦ抽出プロセスにおける特定のプロテアーゼによる単離ステップ中に産生される人工物として生じるのかは、不明である。３つのａＦＧＦ形態に対する単離ＤＮＡ組換え体分子から産生されたタンパク質をウエスタンブロット分析したところ、１４０および１３４形態の発現は高レベルであり、および１５５形態の発現は低レベルであった。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態では、ヒト酸性線維芽細胞成長因子遺伝子は、１５５個のアミノ酸型のａＦＧＦタンパク質をコードし、化学合成される（配列番号１）。ｈａＦＧＦ１５５遺伝子のヌクレオチド配列は、上記のｈａＦＧＦ１５５アミノ酸配列（配列番号２）に基づいて推定された。合成ｈａＦＧＦ１５５遺伝子のアミノ酸配列は、上記のもの、例えば配列番号３のＦＧＦヌクレオチド配列の翻訳配列と異ならない。しかしながら、ｈａＦＧＦ遺伝子の好ましいヌクレオチド配列は、これまでに報告されたものと異なる。本発明の好ましい実施形態では、ｈａＦＧＦ１５５遺伝子は、集約的合成細菌タンパク質に関してエシェリヒア・コリにより最もしばしば用いられるコドンを用いて化学合成された。エシェリヒア・コリに関するコドン使用表は既知であり、利用可能である（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｐｓｙｃｈｅ．ｕｔｈｃｔ．ｅｄｕ／ｓｈａｕｎ／Ｓｂｌａｃｋ／ｃｏｄｏｎｕｓｅ．ｈｔｍｌ．参照）。ヒトａＦＧＦ遺伝子の化学合成は、既知の方法により実行した（Ｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１（１８）：６４１９−６４３５）。
【００４８】
あるいは、任意の重要な遺伝子が、本発明の実施に用いられ、その例としては、当業者に既知の他の形態のｈａＦＧＦタンパク質、例えば１４６、１４０および１３４アイソフォームをコードする動物組織からの単離ＤＮＡ、ならびにその任意の変異体、誘導体、類縁体または断片が挙げられるが、これらに限定されない。ヒト成長ホルモン、ヒトインターフェロンおよびエシェリヒア・コリメチオニンアミノペプチダーゼをコードする遺伝子も、本明細書中に例示される。
【００４９】
図１は、本発明により合成されるｈａＦＧＦ１５５遺伝子の完全ヌクレオチド配列（配列番号１）、ならびにＧｅｎＢａｎｋからのヒト酸性線維芽細胞成長因子の配列（配列番号３）を示す。これら２つの配列は、図２において比較される。８０コドンに違いが認められる。
【００５０】
発現およびクローニングベクターは、典型的には、宿主生物体により認識され、目的遺伝子を作動可能に連結されるプロモーターを含む。プロモーターは、それらが作動可能に連結される特定の核酸配列の転写および翻訳を制御する構造遺伝子（一般に１００〜１０００塩基対以内）の開始コドンに対して、上流（５’）に位置する非翻訳配列である。このようなプロモーターは、典型的には２つの種類、すなわち誘導性プロモーターおよび構成性プロモーターに分類される。誘導性プロモーターとは、培養条件の何らかの変化に、例えば栄養素の存在／非存在に、あるいは温度の変化に応答して、それらの制御下でＤＮＡからの高レベルの転写を開始するプロモーターである。現時点で、原核生物宿主細胞により認識される多数のプロモーターが既知である。適切な制限部位を提供するために、適切なリンカーまたはアダプターを用いて目的遺伝子にそれらを連結する方法が、当業者に既知である。
【００５１】
好ましいプロモーター系は、エシェリヒア・コリバクテリオファージＴ７プロモーター系である。エシェリヒア・コリバクテリオファージＴ７プロモーターは、非常に特異的であり、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの存在を要する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現するプラスミドを用いた形質転換により供給され得るか、あるいは宿主株中の溶原体上に含まれるＴ７ポリメラーゼ遺伝子の誘導により供給され得る。Ｔ７プロモーターおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、市販されている。
【００５２】
形質転換とは、染色体外因子としてまたは染色体中への組込みにより、生物体中にＤＮＡを導入し、ＤＮＡの複製を可能にすることを意味する。原核生物細胞の形質転換は、当業者に既知の技法、例えばＣａＣｌ２による処理または電気穿孔を用いて実施される。
【００５３】
ラムダファージの溶菌の発生を遅延する条件下においてプロデューサー株を培養することにより、組換えタンパク質の超産生を達成した。このような条件としては、培養の温度低下、ならびに後期ラムダファージ遺伝子、例えばＱおよびＲ遺伝子中のアンバー突然変異の使用が挙げられる。
【００５４】
組換えタンパク質は、ラムダファージによるプロデューサー株の細胞溶菌の結果として、可溶性タンパク質として培地中に蓄積される。組換えタンパク質の産出量は、通常培地中に蓄積される可溶性タンパク質の２０％を構成する。遠心分離により、培地から破砕屑を除去した。次に組換えタンパク質は、当業者に既知の精製手法を用いて、夾雑可溶性タンパク質およびポリペプチドから精製され得る。このような手法としては、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、イムノアフィニティー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿およびゲル濾過が挙げられるが、これらに限定されない。ｈａＦＧＦタンパク質の場合、精製ｈａＦＧＦを得るために、ｈａＦＧＦタンパク質をヘパリンセファロースに適用した。
【００５５】
本発明のさらに詳細な説明を以下に提示する。記載された実施形態は本発明の好ましい実施形態を示すが、本発明の精神を逸脱せずに変更が行なわれることが当業者には理解されるはずである。したがって、本発明の範囲は、併記の特許請求の範囲によってのみ確定されるはずである。
【００５６】
実施例１
ファージ依存的方法によるヒトａＦＧＦ１５５の産生
ヒト酸性線維芽細胞成長因子（１５５個のアミノ酸）をコードするｈａＦＧＦ１５５遺伝子を１コピー含有するプラスミドｐＥＴ２４−１５５＠ｒｅｖ（図３）により、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＯＶＡＧＥＮ）の培養物を形質転換した。ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物は、細菌ゲノム中に、誘導性ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼに関する遺伝子を単一コピー含有する（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３−１３０）。プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）（ＮＯＶＡＧＥＮ）中に、Ｔ７プロモーターの制御下で化学合成ｈａＦＧＦ１５５遺伝子（配列番号１）を挿入して、プラスミドｐＥＴ２４−１５５＠ｒｅｖを作成した。ｈａＦＧＦ１５５遺伝子の発現は、ＩＰＴＧによるｌａｃＵＶ５プロモーターの誘導により媒介されて細胞中にＴ７ポリメラーゼが出現した後にのみ、開始する。
【００５７】
５０ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で、３７℃で振盪しながら、ｐＥＴ２４−１５５＠ｒｅｖを有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物を、２×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。次に、１細菌細胞当り約１０ファージ体の多重度で、ファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４により細胞を感染させて、２１℃で約１４時間、振盪しながら培養した。ファージと同時に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地中に導入した。
【００５８】
エシェリヒア・コリＲＬＭＩの溶原性培養物からファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４を調製し、これをＬＢ培地中で、３０℃で集中的に曝気しながら、約１×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。溶原性培養物を４３℃に暖めて、２０分間インキュベートし、ｃＩリプレッサーを不活性化した。次に温度を３７℃に下げて、６０〜７０分後、細菌細胞を溶菌すると、ファージが１〜２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌで生成された。
【００５９】
ファージ感染細胞とともに１４時間インキュベートした後、遠心分離により破砕屑を培地から除去した。ｈａＦＧＦ１５５タンパク質を含有する培地をヘパリンセファロースカラムに適用して、精製ｈａＦＧＦ１５５を得た。
【００６０】
変性条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりｈａＦＧＦ１５５を含有する培地を分析し、クーマシーブルーで染色した。ｈａＦＧＦ１５５タンパク質を含有する培地の電気泳動写真は、図４において精製ｈａＦＧＦタンパク質と比較されている。レーン１は、１０ ｌの培地を示す。レーン２は、７ ｌのヘパリン−セファロース精製ｈａＦＧＦ１５５タンパク質（０．４５ｇ／ｌ）を示す。レーン３は、８０ ｌのうちの１４ ｌのＨＰＬＣ精製ｈａＦＧＦ−１５５を示す。左端の印のないレーンは、分子量標準（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含有する。ファージ感染培養中でのｈａＦＧＦ１５５タンパク質の産生は、総細胞タンパク質の約２０％であった。ｈａＦＧＦ１５５の分子量は、密度計Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ ＶＤＳにより確定した場合、１７，９０８ダルトンであった（データは示されていない）。
【００６１】
上記の方法により産生されたヒトａＦＧＦ１５５は、ニワトリ（ｃｈｉｃｋ）膜アッセイ（実施例６）に基づいた生物学的活性を有した。さらに、精製ヒトａＦＧＦ１５５は、ＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３線維芽細胞を利用した細胞ベースの増殖アッセイ（米国特許第５４０１８３２号（Ｌｉｎｅｍｅｙｅｒ））において生物活性を示した。細胞増殖の１／２最大刺激は、３２ｐｇ／１ｍｌのａＦＧＦ１５５の濃度で生じた。細菌培地中に含入される非精製ヒトａＦＧＦ１５５も、３Ｔ３線維芽細胞アッセイにおいて生物学的活性を示し、これは精製ａＦＧＦ１５５と等価であったが、このことは、ａＦＧＦ１５５が、可溶性の生物学的に活性なタンパク質として、最初から細菌中で合成されたことを示す。
【００６２】
実施例２
ファージ依存的方法によるヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型の産生
ヒトａＦＧＦ（１３４個のアミノ酸）（図６：配列番号４）をコードする化学合成遺伝子を１コピー含有するプラスミドｐＥＴ２４−１３４＠ｒｅｖ（図５）により、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＯＶＡＧＥＮ）の培養物を形質転換した。翻訳アミノ酸配列は、配列番号５で示される。ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物は、細菌ゲノム中に、誘導性ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を単一コピー含有する（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３−１３０）。プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）（ＮＯＶＡＧＥＮ）中に、Ｔ７プロモーターの制御下でヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型遺伝子を挿入した。ヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型遺伝子の発現は、ＩＰＴＧによるｌａｃＵＶ５プロモーターの誘導により媒介されて細胞中のＴ７ポリメラーゼが出現した後にのみ、開始する。
【００６３】
５０ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で、３７℃で振盪しながら、プラスミドｐＥＴ２４−１３４＠ｒｅｖを有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物を、２×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。次に、１細菌細胞当り約１０ファージ体の多重度で、ファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４で細胞を感染させて、２１℃で約１４時間、振盪しながら培養した。ファージと同時に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地中に導入した。
【００６４】
エシェリヒア・コリＲＬＭＩの溶原性培養物からファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４を調製し、これをＬＢ培地中で３０℃で集中的に曝気しながら、約１×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。溶原性培養物を４３℃に暖めて、２０分間インキュベートし、ｃＩリプレッサーを不活性化した。次に温度を３７℃に下げて、６０〜７０分後、細菌細胞を溶菌すると、ファージが１〜２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌで生成された。
【００６５】
ファージ感染細胞とともに１４時間インキュベートした後、遠心分離により破砕屑を培地から除去した。ｈａＦＧＦ１３４タンパク質を含有する培地をヘパリンセファロースカラムに適用して、精製ヒトａＦＧＦ１３４タンパク質を得た。
【００６６】
実施例３
ファージ依存的方法によるヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型の産生
ヒトａＦＧＦ（図８：１４０個のアミノ酸）（配列番号６）をコードする化学合成遺伝子を１コピー含有するプラスミドｐＥＴ２４−１４０＠ｒｅｖ（図７）により、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＯＶＡＧＥＮ）の培養物を形質転換した。対応するタンパク質は、配列番号７として示される。ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物は、細菌ゲノム中に誘導性ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を単一コピー含有する（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３−１３０）。プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）（ＮＯＶＡＧＥＮ）中に、Ｔ７プロモーターの制御下でヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型遺伝子を挿入した。ヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型遺伝子の発現は、ＩＰＴＧによるｌａｃＵＶ５プロモーターの誘導により媒介されて細胞中のＴ７ポリメラーゼが出現した後にのみ、開始する。
【００６７】
５０ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で、３７℃で振盪しながら、ｐＥＴ２４−１４０＠ｒｅｖを有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物を、２×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。次に、１細菌細胞当り約１０ファージ体の多重度で、ファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４で細胞を感染させて、２１℃で約１４時間、振盪しながら培養した。ファージと同時に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地中に導入した。
【００６８】
エシェリヒア・コリＲＬＭＩの溶原性培養物からファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ ５４を調製し、これをＬＢ培地中で、３０℃で集中的に曝気しながら、約１×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。溶原性培養物を４３℃に暖めて、２０分間インキュベートし、ｃＩリプレッサーを不活性化した。次に温度を３７℃に下げて、６０〜７０分後、細菌細胞を溶菌すると、ファージが１〜２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌで生成された。
【００６９】
ファージ感染細胞とともに１４時間インキュベートした後、遠心分離により破砕屑を培地から除去した。ｈａＦＧＦ１４０アミノ酸型を含有する培地をヘパリンセファロースカラムに適用して、精製ｈａＦＧＦ１４０を得た。
【００７０】
上記の方法により産生されたヒトａＦＧＦ１４０は、ニワトリ（ｃｈｉｃｋ）膜アッセイ（実施例６）に基づいた生物学的活性を有した。
【００７１】
実施例４
ファージ依存的方法によるヒトａＦＧＦ１４６アミノ酸型の産生
ヒトａＦＧＦ（１４６個のアミノ酸）（示されていない）をコードする化学合成遺伝子を１コピーを含有するプラスミドｐＥＴ２４−１４６＠ｒｅｖにより、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＯＶＡＧＥＮ）の培養物を形質転換した。ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物は、細菌ゲノム中に誘導性ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を単一コピー含有する（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３−１３０）。プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）（ＮＯＶＡＧＥＮ）中に、Ｔ７プロモーターの制御下でヒトａＦＧＦ１４６アミノ酸型遺伝子を挿入した。ヒトａＦＧＦ１４６アミノ酸型遺伝子の発現は、ＩＰＴＧによるｌａｃＵＶ５プロモーターの誘導により媒介されて細胞中のＴ７ポリメラーゼが出現した後にのみ、開始する。
【００７２】
５０ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で、３７℃で振盪しながら、ｐＥＴ２４−１４６＠ｒｅｖを有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物を、２×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。次に、１細菌細胞当り約１０ファージ体の多重度で、ファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４で細胞を感染させて、２１℃で約１４時間、振盪しながら培養した。ファージと同時に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地中に導入した。
【００７３】
エシェリヒア・コリＲＬＭＩの溶原性培養物からファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４を調製し、これをＬＢ培地中で３０℃で集中的に曝気しながら、約１×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。溶原性培養物を４３℃に暖めて、２０分間インキュベートし、ｃＩリプレッサーを不活性化した。次に温度を３７℃に下げて、６０〜７０分後、細菌細胞を溶菌すると、ファージが１〜２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌで生成された。
【００７４】
ファージ感染細胞とともに１４時間インキュベートした後、遠心分離により破砕屑を培地から除去した。ｈａＦＧＦ１４６タンパク質を含有する培地をヘパリンセファロースカラムに適用して、精製ヒトｈａＦＧＦ１４６を得た。
【００７５】
上記の方法により産生されたヒトａＦＧＦ１４６は、ニワトリ（ｃｈｉｃｋ）膜アッセイ（実施例６）に基づいた生物学的活性を有した。
【００７６】
実施例５
組換えｈａＦＧＦタンパク質の精製
ｈａＦＧＦタンパク質を含有する培地を、１倍量の０．０４ＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．０で希釈し、０．０２ＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．０で平衡させたヘパリン−セファロースカラムに適用した。流量を８０ｍｌ／時間に調整した。ｈａＦＧＦタンパク質を含有する培地の適用後、カラムを０．０２ＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．０で洗浄した。次にカラムを、０．６ＭのＮａＣｌを含有する０．０２ＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．３で洗浄した。１．５ＭのＮａＣｌを含有する０．０２ＭのＫＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．５を用いて、溶離を実行した。全工程を４℃で実行した。
【００７７】
実施例６
ニワトリ胚漿尿膜（ＣＡＭ）中の新規の血管の形成に及ぼすＦＧＦ作用の試験方法
ニワトリ胚のモデルにおける血管新生の試験方法（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ． （１９８５）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ８２：６４０９−６４１３）を適応させて、精製脳由来酸性線維芽細胞成長因子と比較した場合の、血管形成に及ぼすｈａＦＧＦ１５５、１４６および１４０組換えタンパク質の作用を確定した。精製脳由来酸性線維芽細胞成長因子は、インターロイキンと相同の配列を有する強力な血管新生性血管内皮細胞分裂促進因子である。
【００７８】
３日齢ニワトリ胚の殻をエチルアルコールで滅菌した。鉗子を用いて殻および殻下被膜を気室から除去し、３５ｍｍのプラスチックペトリ皿の底で卵を覆った。胚を３７℃で５〜６日間インキュベートした。この期間の終了時に、胚を検査し、ＣＡＭが十分に発達した血管を有する卵を実験用に選択した。
【００７９】
ＦＧＦを含有するゲルを沈着させた濾紙円板を、ゲルを血管に向けた状態で、卵ＣＡＭ上に載せ、３７℃でさらに３日間、サーモスタット中でインキュベートした。ゲルを以下の方法で調製した：試験量のＦＧＦをイーグル培地（溶液１）３０ ｌ中に溶解し、次に、３０ ｌのイーグル培地中で、１０ｇのヘパリンを溶解し、２％のアガロースを付加した（溶液２）。次に等倍量の溶液１および溶液２を混合し、得られた混合物を、直径１２ｍｍの濾紙円板上に６０ ｌのアリコートで沈着させた。
【００８０】
４日目に、濾紙円板を取り出した。濃化牛乳（乳脂肪１０％）を約１ｍｌまたはそれ未満の量でＣＡＭ下に注入した。それにより、ＣＡＭ血管が容易に観察される白色バックグラウンドになった。
【００８１】
実験結果を、コンピューターに接続したビデオカメラで記録した。以下のパラメーターにより、ＦＧＦの影響下での新規のＣＡＭ血管の形成を評価した：血管成長の性質および方向、それらの量および質（大、中、小）、吻合の存在または非存在等。これらのデータを、ＦＧＦに曝露しなかった対照試料と比較した。発生１４日目のニワトリ胚血管を、本明細書中に記載したファージ依存的組換え方法により産生され、上記のようにヘパリンセファロース上で精製し、ＦＧＦ１５５で処理した。
【００８２】
組換えＦＧＦ１５５タンパク質の適用は、新規の血管形成を実証した。１ｇのＦＧＦ１５５の適用後４日目、血管は主として小さく、放射状成長を示した。ＦＧＦ１５５の量を３ｇへ増大すると、血管のサイズは対応して増大した。中型血管が、放射状成長するのが観察された。適用されたＦＧＦの量を４ｇへさらに増大すると、対照と比較した場合、適用後４日目に大型、中型および小型血管の発達を示した。
【００８３】
実施例７
ファージ依存的方法によるヒト成長ホルモンの産生
ヒト成長ホルモンをコードする化学合成遺伝子（配列番号８）を１コピー含有するプラスミドにより、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＯＶＡＧＥＮ）の培養物を形質転換した。翻訳アミノ酸配列は、配列番号９として示される。ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物は、細菌ゲノム中に、誘導性ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を単一コピー含有する（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３−１３０）。プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）（ＮＯＶＡＧＥＮ）中に、Ｔ７プロモーターの制御下でヒト成長ホルモン遺伝子を挿入した。ヒト成長ホルモン遺伝子の発現は、ＩＰＴＧによるｌａｃＵＶ５プロモーターの誘導により媒介されて細胞中のＴ７ポリメラーゼが出現した後にのみ、開始する。
【００８４】
５０ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で、３７℃で振盪しながら、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換した培養物を、２×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。次に、１細菌細胞当り約１０ファージ体の多重度で、ファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４で細胞を感染させて、２１℃で約１４時間、振盪しながら培養した。ファージと同時に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地中に導入した。
【００８５】
エシェリヒア・コリＲＬＭＩの溶原性培養物からファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４を調製し、これをＬＢ培地中で、３０℃で集中的に曝気しながら、約１×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。溶原性培養物を４３℃に暖めて、２０分間インキュベートし、ｃＩリプレッサーを不活性化した。次に温度を３７℃に下げて、６０〜７０分後、細菌細胞を溶菌すると、ファージが１〜２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌで生成された。
【００８６】
ファージ感染細胞とともに１４時間インキュベートした後、遠心分離により破砕屑を培地から除去した。ヒト成長ホルモンタンパク質を、当業者に既知の方法により、カラムクロマトグラフィーによって精製して、精製ヒト成長ホルモンを得た。精製ヒト成長ホルモンは、Ｎｂ２リンパ腫細胞を利用して細胞ベースのバイオアッセイでアッセイ（Ｇｏｕｔ ＰＷ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４０：２４３３−２４３６， １９８０）した場合、生物学的に活性であった。Ｎｂ２細胞増殖の１／２最大刺激を生じたヒト成長ホルモンの濃度は、１２５ｐｇ／ｍｌであった。
【００８７】
実施例８
ファージ依存的方法によるヒトインターフェロン−２ｂの産生
ヒトインターフェロン−２（図１０；配列番号１０）をコードする化学合成遺伝子を１コピー含有するプラスミドｐＥＴ２４ａｐ−ｉｎｆ＠ｒｅｖ（図９）により、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＯＶＡＧＥＮ）の培養物を形質転換した。翻訳アミノ酸配列は、配列番号１１として示される。ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物は、細菌ゲノム中に、誘導性ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を単一コピー含有する（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３−１３０）。プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）（ＮＯＶＡＧＥＮ）中に、Ｔ７プロモーターの制御下でインターフェロン遺伝子を挿入した。インターフェロン遺伝子の発現は、ＩＰＴＧによるｌａｃＵＶ５プロモーターの誘導により媒介されて細胞中のＴ７ポリメラーゼが出現した後にのみ、開始する。
【００８８】
５０ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で、３７℃で振盪しながら、プラスミドｐＥＴ２４ａｐ−ｉｎｆ＠ｒｅｖを有するエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物を、２×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。次に細胞を、１細菌細胞当り約１０ファージ体の多重度で、ファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４で感染させて、２１℃で約１４時間、振盪しながら培養した。ファージと同時に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地中に導入した。
【００８９】
エシェリヒア・コリＲＬＭＩの溶原性培養物からファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４を調製し、これをＬＢ培地中で、３０℃で集中的に曝気しながら、約１×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。溶原性培養物を４３℃に暖めて、２０分間インキュベートし、ｃＩリプレッサーを不活性化した。次に温度を３７℃に下げて、６０〜７０分後、細菌細胞を溶菌すると、ファージが１〜２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌで生成された。
【００９０】
ファージ感染細胞とともに１４時間インキュベートした後、遠心分離により破砕屑を培地から除去した。当業者に既知の方法により、カラムクロマトグラフィーによってインターフェロンを精製して、精製インターフェロンを得た。
【００９１】
開示される方法により産生されたインターフェロンは、水疱性口内炎ウイルス感染ウシ腎臓細胞で実施されたインターフェロン抗ウイルスアッセイ（Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｐ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１９：５７９−５９２， １９８６）に基づいた生物学的活性を有した。インターフェロンα２ｂは、このアッセイにおいて、１．８１×１０８国際単位（ＩＵ）／タンパク質１ｍｇの生物学的効力を有した。精製前に細菌培地中に含入されたインターフェロンα２ｂは、この抗ウイルスアッセイにおいて精製インターフェロンと同等の効力を有し、このことは、インターフェロンα２ｂが可溶性の生物学的に活性なタンパク質として、最初から細菌中で合成されたことを示す。
【００９２】
実施例９
ファージ依存的方法によるエシェリヒア・コリメチオニンアミノペプチダーゼの産生
エシェリヒア・コリメチオニンアミノペプチダーゼをコードする化学合成遺伝子を１コピー含有するプラスミドにより、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＯＶＡＧＥＮ）の培養物を形質転換した。ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物は、細菌ゲノム中に、誘導性ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を単一コピー含有する（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３−１３０）。プラスミドｐＥＴ−２４ａ（＋）（ＮＯＶＡＧＥＮ）中に、Ｔ７プロモーターの制御下でメチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子を挿入した。大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子の発現は、ＩＰＴＧによるｌａｃＵＶ５プロモーターの誘導により媒介されて細胞中のＴ７ポリメラーゼが出現した後にのみ、開始する。
【００９３】
５０ｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中で、３７℃で振盪しながら、エシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換した培養物を、２×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。次に細胞を、１細菌細胞当り約１０ファージ体の多重度で、ファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４で感染させて、２１℃で約１４時間、振盪しながら培養した。ファージと同時に、１ｍＭのＩＰＴＧを培地中に導入した。
【００９４】
エシェリヒア・コリＲＬＭＩの溶原性培養物からファージｃＩ８５７Ｑａｍ１１７Ｒａｍ５４を調製し、これをＬＢ培地中で、３０℃で集中的に曝気しながら、約１×１０８細胞／ｍｌの密度に成育させた。溶原性培養物を４３℃に暖めて、２０分間インキュベートし、ｃＩリプレッサーを不活性化した。次に温度を３７℃に下げて、６０〜７０分後、細菌細胞を溶菌すると、ファージが１〜２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌで生成された。
【００９５】
ファージ感染細胞とともに１４時間インキュベートした後、遠心分離により破砕屑を培地から除去した。当業者に既知の方法により、カラムクロマトグラフィーによってエシェリヒア・コリメチオニンアミノペプチダーゼを精製して、精製エシェリヒア・コリメチオニンアミノペプチダーゼを得た。
【００９６】
実施例１０
ファージ依存的方法により産生される組換えタンパク質のゲル分析
変性条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型、ヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型、ヒトａＦＧＦ１５５アミノ酸型、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、およびメチオニンアミノペプチダーゼを含有する培地を分析し、クーマシーブルーで染色した。ヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型、ヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型、ヒトａＦＧＦ１４６アミノ酸型、ヒト成長ホルモン、およびインターフェロンタンパク質を含有する培地の電気泳動写真は、図１１において分子量標準と比較される。レーン２は、ヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型を含有する培地３０ ｌを示す。レーン３は、組換えＦＧＦ１４０タンパク質を含有する培地３０ ｌを示す。レーン４は、組換えインターフェロンを含有する培地３０ ｌを示す。レーン５は、組換えＦＧＦ１５５タンパク質を含有する培地３０ ｌを示す。レーン６は、組換えヒト成長ホルモンを含有する培地３０ ｌを示す。レーン７は、組換えメチオニンアミノペプチダーゼを含有する培地３０ ｌを示す。レーン１は、２ｇの各分子量標準（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を示す。上から、分子量標準は、９４，０００；６７，０００；４３，０００；３０，０００；２０，１００；および１４，４００である。
【００９７】
密度計Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ ＶＤＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてポリアクリルアミドゲル上の染色タンパク質帯域を走査することにより、混合物中のヒトａＦＧＦ１３４アミノ酸型、ヒトａＦＧＦ１４０アミノ酸型、ヒトａＦＧＦ１５５アミノ酸型、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、およびメチオニンアミノペプチダーゼの量の定量を成し遂げた。ファージ感染培養中の組換えタンパク質の産生は、総細胞タンパク質の約２０％であった。
【００９８】
精製組換えヒトａＦＧＦ１３４、ｈａＦＧＦ１４０、ｈａＦＧＦ１４６、インターフェロン、ｈａＦＧＦ１５５およびメチオニンアミノペプチダーゼタンパク質を含有する培地の電気泳動写真を、分子量標準と比較した（図１２）。レーン２は、５ｇの精製ａＦＧＦ１３４タンパク質を示す。レーン３は、５ｇの精製ヒトａＦＧＦ１４０を示す。レーン４は、５ｇの精製ヒトａＦＧＦ１４６アミノ酸型を示す。ファージ感染培養中のヒトａＦＧＦ１４６アミノ酸型の産生は、総細胞タンパク質の約２０％であった。レーン５は、５ｇの精製インターフェロンを示す。レーン６は、５ｇのｈａＦＧＦ１５５タンパク質を示す。レーン７は、５ｇの精製エシェリヒア・コリメチオニンアミノペプチダーゼを示す。レーン１および８は、２ｇの各分子量標準（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を示す。
【００９９】
本発明の精神から逸脱せずに多数のならびに種々の変更がなされ得る、と当業者には理解されよう。したがって、本発明の形態は例証のためだけのものであって、本発明の範囲を限定するように意図されないことは明確に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
高度に発現されたエシェリヒア・コリタンパク質中に見出されるコドンによって天然に存在するコドンを置換することにより改変されたヒト酸性線維芽細胞成長因子（１５５個のアミノ酸） （配列番号１）の化学合成ヌクレオチド配列、ならびに翻訳アミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図２】
化学合成ｈａＦＧＦ１５５コドンにおいてなされた改変を示す。ＦＧＦｆｒＨＵＭＥＣＧＦＢは、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）から得られた配列（配列番号３）である。ＨａＦＧＦ １５５は、本発明の一実施形態による化学合成配列（配列番号１）である。
【図３】
化学合成ｈａＦＧＦ１５５遺伝子（配列番号１）を含有するｐＥＴ２４−１５５＠ｒｅｖ構築物を示す。
【図４】
ＨＰＬＣ精製ｈａＦＧＦ１５５を示す。電気泳動写真において：レーン１：１０ ｌの組換えｈａＦＧＦ１５５を含有する状態調節培地；レーン２：７ ｌのヘパリン−セファロース精製組換えｈａＦＧＦ１５５（０．４５ ｇ／ｌ）；レーン３：８０ ｌのうちの１４ ｌのＨＰＬＣ−精製ｈａＦＧＦ １５５である。左端の印のないレーンは、分子量標準を含有する。
【図５】
化学合成ｈａＦＧＦ１３４遺伝子（配列番号４）を含有するｐＥＴ２４−１３４＠ｒｅｖ構築物を示す。
【図６】
高度に発現された大腸菌タンパク質中に見出されるコドンによって天然に存在するコドンを置換することにより改変された、ヒト酸性線維芽細胞成長因子（１３４個のアミノ酸）（配列番号４）の化学合成ヌクレオチド配列、ならびに翻訳アミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図７】
化学合成ｈａＦＧＦ１４０遺伝子（配列番号６）を含有するｐＥＴ２４−１４０＠ｒｅｖ構築物を示す。
【図８】
高度に発現された大腸菌タンパク質中に見出されるコドンによって、天然に存在するコドンを置換することにより改変された、ヒト酸性線維芽細胞成長因子（１４０個のアミノ酸）（配列番号６）の化学合成ヌクレオチド配列、ならびに翻訳アミノ酸配列（配列番号７）を示す。
【図９】
化学合成インターフェロン−２ｂ遺伝子（配列番号１０）を含有するｐＥＴ２４ａｐ−ｉｎｆ＠ｒｅｖ構築物を示す。
【図１０】
高度に発現されたエシェリヒア・コリタンパク質中に見出されるコドンによって、天然に存在するコドンを置換することにより改変された、ヒトインターフェロン−２ｂ（配列番号１０）の化学合成ヌクレオチド配列、ならびに翻訳アミノ酸配列（配列番号１１）を示す。
【図１１】
本明細書中に記載したファージ依存的方法により産生されたタンパク質を含有する１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。レーン１：分子量標準、各々２ｇ標準；レーン２：組換えＦＧＦ１３４タンパク質を含有する４０ ｌの培地；レーン３：組換えＦＧＦ１４０タンパク質を含有する４０ ｌの培地；レーン４：組換えインターフェロン２Ｂを含有する４０ ｌの培地；レーン５：組換えＦＧＦ１５５タンパク質を含有する４０ ｌの培地；レーン６：組換えヒト成長ホルモンを含有する４０ ｌの培地；レーン７：組換えメチオニンアミノペプチダーゼを含有する４０ ｌの培地；レーン８：エシェリヒア・コリのガラクトシダーゼを含有する４０ ｌの培地。
【図１２】
本願により請求された発明に従って、精製された組換えタンパク質を含有する１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。レーン１：分子量標準；レーン２：５ｇの精製ＦＧＦ１３４タンパク質；レーン３：５ｇの精製ＦＧＦ１４０タンパク質；レーン４：５ｇの精製ＦＧＦ１４６タンパク質；レーン５：５ｇの精製インターフェロン２Ｂタンパク質；レーン６：５ｇの精製ＦＧＦ１５５タンパク質；レーン７：５ｇの精製メチオニンアミノペプチダーゼタンパク質；レーン８：分子量標準。
Claims (24)
- 生物学的に活性なタンパク質の産生方法であって、
Ｔ７ポリメラーゼプロモーターに、作動可能に連結された、生物学的に活性なタンパク質をコードする発現可能遺伝子を少なくとも１コピー有するプラスミドによって、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現することができるエシェリヒア・コリ株を形質転換すること、
溶菌の遅延を媒介することができるバクテリオファージを、前記形質転換した細菌宿主細胞に感染させること、および
前記タンパク質の所望レベルの産生が達成されるまで溶菌を伴わずに、前記細胞の溶菌成長を誘導することができる培養条件下で、かつ、前記タンパク質が可溶性の生物学的に活性なタンパク質として産生されるように、前記エシェリヒア・コリ宿主細胞を培養すること、
を含む方法。 - 前記バクテリオファージは、温度感受性突然変異を有するバクテリオファージである請求項１に記載の方法。
- 前記温度感受性突然変異は、ｃＩ８５７である請求項２に記載の方法。
- 培養工程前に、前記エシェリヒア・コリ宿主細胞を、前記バクテリオファージの溶菌成長を防止する温度で成育させる請求項２に記載の方法。
- 前記バクテリオファージは、溶菌の遅延を媒介することができる少なくとも１つの遺伝子中に突然変異を有するバクテリオファージである請求項１に記載の方法。
- 前記溶菌の遅延を媒介することができる少なくとも１つの遺伝子は、Ｎ、ＱおよびＲからなる群から選択される請求項５に記載の方法。
- 前記エシェリヒア・コリ株は、アンバー突然変異の修復のためのサプレッサーを産生する請求項１に記載の方法。
- 前記エシェリヒア・コリ株は、アンバー突然変異の修復のためのサプレッサーが欠如する請求項１に記載の方法。
- 前記感染バクテリオファージは、約１〜約１００の範囲の感染多重度で提供される請求項１に記載の方法。
- 前記感染バクテリオファージは、約１０〜約２５の範囲の感染多重度で提供される請求項１に記載の方法。
- エシェリヒア・コリ株のバクテリオファージ媒介性の溶菌の遅延は、低度の感染多重度と比較してより高度の感染多重度で遅延する請求項１に記載の方法。
- 前記発現可能遺伝子は、ヒト酸性線維芽細胞成長因子をコードする請求項１に記載の方法。
- 前記ヒト酸性線維芽細胞成長因子は、１３４個のアミノ酸を含む請求項１２に記載の方法。
- 前記ヒト酸性線維芽細胞成長因子は、１４０個のアミノ酸を含む請求項１２に記載の方法。
- 前記ヒト酸性線維芽細胞成長因子は、１４６個のアミノ酸を含む請求項１２に記載の方法。
- 前記ヒト酸性線維芽細胞成長因子は、１５５個のアミノ酸を含む請求項１２に記載の方法。
- 前記ヒト酸性線維芽細胞成長因子は、配列番号１で記述される配列を有する請求項１６に記載の方法。
- 前記発現可能遺伝子は、ヒト成長ホルモンをコードする請求項１に記載の方法。
- 前記発現可能遺伝子は、ヒトインターフェロンをコードする請求項１に記載の方法。
- 前記発現可能遺伝子は、エシェリヒア・コリメチオニンアミノペプチダーゼをコードする請求項１に記載の方法。
- 前記Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下にある請求項１に記載の方法。
- 前記誘導性プロモーターは、ｌａｃＵＶ５プロモーターである請求項２１に記載の方法。
- 本質的に配列番号１で記述される配列からなる化学合成核酸。
- 生物学的に活性なタンパク質の産生方法であって、
ａ）温度感受性突然変異を有するバクテリオファージλ株を含むエシェリヒア・コリ細胞の第一の株を成長させること、
ｂ）前記エシェリヒア・コリの第一の株を溶菌させ、およびバクテリオファージλを放出させるために温度を調整すること、
ｃ）誘導性プロモーターの制御下でＴ７ポリメラーゼプロモーターに作動可能に連結される、前記生物学的に活性なタンパク質をコードする発現可能遺伝子を少なくとも１コピー有するプラスミドによって形質転換したエシェリヒア・コリ細胞の第二の株を提供し、該エシェリヒア・コリ細胞の第二の株が、誘導物質の添加によりＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現するように誘導され得るようにすること、
ｄ）前記エシェリヒア・コリ細胞の第一の株から放出されたバクテリオファージλで、前記エシェリヒア・コリ細胞の第二の株を感染させること、および
ｅ）タンパク質が産生され、前記エシェリヒア・コリ細胞の第二の株の溶菌時に培地中に放出されるように、前記エシェリヒア・コリ細胞の感染二次株をインキュベートし、前記タンパク質が可溶性の生物学的に活性なタンパク質として１００μｇ／ｍｌより高い濃度で産生されるようにすること、
を含む方法。
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