TW201300533A - 可溶性干擾素之重組表現技術 - Google Patents
可溶性干擾素之重組表現技術 Download PDFInfo
- Publication number
- TW201300533A TW201300533A TW101118746A TW101118746A TW201300533A TW 201300533 A TW201300533 A TW 201300533A TW 101118746 A TW101118746 A TW 101118746A TW 101118746 A TW101118746 A TW 101118746A TW 201300533 A TW201300533 A TW 201300533A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- host cell
- interferon
- protein
- gene
- cell
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本發明概略而言有關在宿主細胞中重組基因表現的領域。特別是,本發明有關一種用於重組表現哺乳動物干擾素蛋白之宿主細胞,該細胞包含(a)一功能性內源性基因trxB基因;以及(b)一去活性的內源性gor基因。本發明進一步有關此宿主細胞於重組表現干擾素蛋白上之用途。本發明亦提供一種用於在宿主細胞中重組表現可溶性干擾素之方法。
Description
本發明概略而言有關在宿主細胞中重組基因表現的領域。特別是,本發明有關一種用於重組表現哺乳動物干擾素蛋白之宿主細胞,該細胞包含(a)一功能性內源性基因trxB基因;以及(b)一去活性的內源性gor基因。本發明進一步有關此宿主細胞於重組表現干擾素蛋白上之用途。本發明亦提供一種用於在宿主細胞中重組表現可溶性干擾素之方法。
干擾素係一群由哺乳動物細胞因應不同的刺激,像是病毒或細菌感染,分泌出之糖蛋白。干擾素具有各種治療上有用的特點,諸如免疫刺激、抗增生以及抗病毒活性。據此,此等蛋白廣泛地應用於治療一些疾病以及病症,包括病毒感染以及癌症,諸如多發性骨髓瘤、白血病、腎細胞癌以及類似的癌症。依照其等之細胞來源以及抗原性,人類干擾素可分成三群。在人類方面,α干擾素係由白血球產生,β干擾素由纖維母細胞產生,而γ干擾素由B細胞產生。
干擾素起初是從天然來源純化而來之蛋白,如從血液白血球以及纖維母細胞而得。重組DNA技術之出現,已使得干擾素之生產亦可能在工業規模上實行,如藉由在細菌宿主細胞中重組表現干擾素蛋白。大腸桿菌係最常使用於
重組表現異源蛋白之細菌性宿主有機體之一,因為其具有快速生長至高細胞密度之能力、可得到大量的選殖載體以及易於接著將此載體引入用於表現之細胞中。現今大部分有效的用於人類醫學之干擾素均係在大腸桿菌表現系統中產生。另一方面,在大腸桿菌中異源蛋白之表現,已知與某些使得生產大量的藥學活性蛋白受到挑戰之限制有關。在大腸桿菌表現系統中常遇到之問題係,宿主細胞無法產生大量的可溶性以及活性形式之重組蛋白。反而大部分的蛋白係以包涵體之形式貯存,即變性蛋白之凝集物。無法製造可溶性重組蛋白之主要理由在於,事實上大腸桿菌之細胞質係會妨礙雙硫鍵形成之還原環境。從包涵體回收活性蛋白需要使用還原劑來重新摺疊該蛋白,諸如二硫蘇糖醇以及β-巰基乙醇,或變性劑,諸如胍-HCl以及脲,其常常是無效率的且與無法接受之產物損失有關。
為克服此等缺點,建立其中某些還原酶基因經去活性的宿主細胞,以製造能使雙硫鍵形成之更氧化的環境。此等修飾的細胞在編碼硫氧還原蛋白還原酶(trxB)以及麩胺基硫氧化還原酶(gor)之基因中具有突變。由於此等突變,在細胞質中雙硫鍵之形成變成可能,且可溶性產物之產率增加。具有在trxB以及gor基因二者方面均有缺失之細胞可在市面上購得,商品名OrigamiTM(Novagen)或SHuffleTM(NEB)。如公開的美國專利申請案2009/0258394中所述,trxB -/gor - OrigamiTM B(DE3)細胞(在下文中稱為Origami(DE3);Novagen)顯示出可成功地用表現重組干擾
素α2b。
儘管有此等改良,但仍需要可用於可靠的生產干擾素蛋白,特別是人類干擾素蛋白,之更有效的表現系統。新的表現系統應能夠生產大量的可溶性干擾素蛋白,同時在相同時間下使變性蛋白之部分最小化。理想上,該表現系統易於處理,且能夠以較低的成本生產諸如干擾素之細胞激素。
本發明提供新穎的宿主細胞,其特別地適合於重組表現哺乳動物干擾素蛋白。吾人發現,去除宿主細胞之內源性gor基因之活性,同時維持功能性內源性trxB基因,可產生干擾素蛋白之表現獲得改善之宿主細胞。意外地,維持宿主細胞中之功能性內源性trxB基因,導致重組干擾素蛋白之產率顯著地增加。推測trxB基因產物可能參與對表現產率具有影響之不同的調節途徑。
使用該用於重組生產干擾素之新穎的宿主細胞,可在無任何實質包涵體形成之情況下,獲得高數量之可溶性蛋白。如以下範例所示,本發明之宿主細胞產生可溶性干擾素之數量,遠高於具有gor以及trxB基因二者均突變之對應細胞。因此,該新穎宿主細胞在此技藝方面構成顯著的改善,因為其等簡化了干擾素蛋白之生產,同時降低了生產之成本。
在第一態樣方面,本發明有關一種宿主細胞,其適合
用於重組表現干擾素蛋白,該宿主細胞包含(a)一功能性內源性trxB基因;以及(b)一去活性的內源性gor基因。重組表現意指,所欲蛋白之表現會受經基因工程產生之核酸的影響。較佳地,在適合干擾素表現之條件下,培養含有一包含編碼干擾素蛋白之多核苷酸序列之表現載體之宿主細胞。本發明進一步有關此宿主細胞在重組表現干擾素蛋白上之用途。
根據本發明,可使用任何在此技藝中已知適合用於表現異源蛋白,且已經藉由去除內源性gor基因之活性而改質之細胞。該細胞可為真核或原核來源。在一具體例中,該宿主細胞係哺乳動物細胞,如小鼠、大鼠、倉鼠、狗或非人類靈長類動物之初代細胞或衍生而來之細胞株。已經過核可,可用於異源表現蛋白質之哺乳動物細胞包括初代細胞(如,小鼠骨髓細胞、造血幹細胞、小鼠淋巴細胞、肌細胞、肝細胞以及相似物)以及已建立(established)細胞株(如,中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、猴子腎細胞(COS)、幼倉鼠腎(BHK)細胞、非洲綠猴腎(Vero)細胞、馬丁達比(Madin Darby)犬腎(MDCK)細胞以及相似物)二者。
在另外的具體例中,本發明之宿主細胞係酵母細胞。例如,從啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica)、乳酸克鲁維酵母菌(Kluyveromyces lactis)以及畢赤酵母菌(Pichia pastoris)菌種衍生而來之酵母細胞,已顯示出可用於表現干擾素蛋白(Skoko et al.
(2003)Biotechnol.Appl.Biochem.38(Pt3):257-65)。在又另外的具體例中,本發明之宿主細胞亦可從昆蟲細胞衍生而來,諸如從埃及斑蚊、苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)、中國桑蠶(Bombyx mori)、草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)或粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)之昆蟲物種而來之細胞。
從易於操作以及快速細胞生長之觀點視之,在此特佳的係使用細菌性宿主細胞。於此技藝中,已有許多種類之細菌性細胞用於表現異源蛋白。常用之宿主細胞包含大腸桿菌、麩胺酸棒狀桿菌(Crynebacterium glutamicum)以及枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)之菌株。在較佳具體例中,細菌宿主細胞係大腸桿菌細胞,諸如由大腸桿菌菌株BL21衍生而來之細胞。
根據本發明,在此打算用於表現干擾素蛋白之宿主細胞,已經基因工程操作成去除內源性gor基因(即編碼該宿主細胞原生之麩胺基硫氧化還原酶之基因)之活性。在文獻中已有記述,編碼麩胺基硫氧化還原酶之基因存在於許多不同有機體中。例如,大腸桿菌K12之gor基因之核苷酸序列在此提供的是序列辨識編號5。依照gor基因之核苷酸序列,熟悉此技藝之人士可輕易地能夠利用諸如定點突變之標準基因工程方法,去除該基因之活性。去除gor基因之活性,將使得無或實質上無生物活性麩胺基硫氧化還原酶酵素被宿主細胞表現出來。就本發明而言,假如基因操作結果使得功能性麩胺基硫氧化還原酶酵素之數量,相對於未
修飾之宿主細胞,減少了至少90%,較佳地95%或更多,則gor基因被視為去活性的。
該去活性可藉由刪除宿主細胞中整個或部分的gor基因之編碼序列達成。選擇性地亦可能於該基因之編碼序列中引入單一核苷酸取代,但條件是,此取代發生在編碼該氧化還原酶酵素之基本殘基之三聯體(triplet)中。吾人亦可於該編碼區域插入一或多個核苷酸,以便改變gor基因之讀取架構。於本發明之另一較佳具體例中,gor基之去活性係藉由插入以及切除另一多核苷酸,如提供對抗生素具抗性之基因,其可用於篩選。於細菌、哺乳動物以及酵母細胞中去除基因活性之方法,係熟悉此技藝中之人士熟知的。例如,許多的方法記述在有關去除細菌基因之活性之文獻中。此外,定點突變套組可從市面上購得,如Stratagene之QuickChange突變套組、Clontech之Transformer突變套組、Invitrogen之GenTaylor突變系統、Promega之Altered Sites II體外突變套組以及Gene Bridges之Red/ET重組套組。
本發明人已發現,去除宿主細胞之內源性gor基因之活性,可有利地獲得大量的重組表現可溶性干擾素。令人驚訝地,僅內源性gor基因經去活性之宿主細胞,與具有trxB -/gor -基因型之對應的細胞相比,會產生顯著更大量的干擾素蛋白(見下文之範例6)。因此,本發明所考慮之宿主細胞,包含功能性內源性trxB基因,即該宿主細胞原生之trxB基因,以及產生酵素活性硫氧還原蛋白還原酶。因此,本發明之宿主細胞能夠產生原生功能性硫氧還原蛋白還原
酶酵素。
需注意,trxB -/gor -雙剔除菌株僅在其等於編碼烷基過氧化氫還原酶(ahpC*)之基因中亦展現突變之情況下可存活。見Faulkner et al.(2008),PNAS,105(18):6735-40。在此所述之RHB-T7△gor/trx以及Origami(DE3)菌株二者因此均含有ahpC*抑制子突變。相反的,僅帶有去活性gor突變之菌株,可在無ahpC*突變之情況下存活,因為如此之gor基因去活性不具有任何的致命效應。因此,在下文範例2中製得之RHB T7△gor菌株不含ahpC*抑制子突變。
據此,在此較佳地,本發明預期之宿主細胞包含內源性、未經修飾的功能性ahpC基因,即該宿主細胞原生之ahpC基因不含抑制子突變,且能夠產生酵素活性過氧化氫還原酶。
為增加欲進行表現之干擾素蛋白之表現位準,本發明之宿主細胞包含從噬菌體而來之RNA聚合酶,諸如T7 RNA聚合酶。T7 RNA聚合酶確保能夠強力且控制包含在表現載體中且前面有T7啟動子之多核苷酸序列之表現。T7 RNA聚合酶基因可以表現載體之形式提供給宿主細胞。帶有T7 RNA聚合酶基因之表現載體,可與包括用於表現干擾素序列之載體相同或相異。然而較佳的,包含T7 RNA聚合酶基因之序列係被插入宿主細胞之基因組中,如插入細菌染色體中。例如,T7 RNA聚合酶基因係被插入大腸桿菌宿主細胞之基因組中,而編碼干擾素蛋白,諸如IFN-α2a之多核苷酸從能夠在大腸桿菌細胞中表現之表現載體中表現出來。
可利用如下文範例中所述之同源重組方法,將包含T7 RNA聚合酶基因之對應的基因盒,引入細菌宿主細胞之基因組中。此外,包含T7 RNA聚合酶基因之大腸桿菌宿主細胞亦可從市面上購得,例如可從New England Biolabs(Frankfurt,Germany)購得,見例如NEB Cat# C2566、C3016、C3010、C3013,以及SHUffle系列之載體,諸如C3026、C3027、C3029以及C3030。較佳地,T7 RNA聚合酶基因與已經在原核微生物(諸如大腸桿菌細菌)中為了表現而密碼子最適化之干擾素多核苷酸結合使用。
經以上所述操作之宿主細胞,之後將得到編碼外源性干擾素蛋白,較佳地人類干擾素蛋白,之多核苷酸。術語“外源性”意指選擇用於表現干擾素之宿主細胞,事實上不會天然地包含編碼該干擾素之多核苷酸。多核苷酸可經由如轉形或轉染而被插入宿主細胞中。較佳地,編碼欲表現之干擾素蛋白之多核苷酸序列,包含於表現載體中。表現載體之選擇主要取決於宿主細胞之本質。
例如,當宿主細胞係哺乳動物細胞,諸如CHO或Vero細胞,時,表現載體可為,例如,病毒或非病毒性表現載體,其可用於將編碼干擾素之多核苷酸,引入用於後來表現由該多核苷酸編碼之干擾素蛋白之細胞中。表現載體可為游離型載體,即一種能夠在宿主細胞中自動自我複製之載體,或整合型載體,即一種穩定地併入哺乳動物細胞之基因組中之載體。
哺乳動物表現載體正常情況下包含功能性連接至編碼
該干擾素之多核苷酸之啟動子。適合的啟動子包括,但不限於,巨細胞病毒立即早期啟動子(CMV-IE)、脾病灶形成病毒(SFFV)U3啟動子以及腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)。哺乳動物表現載體可包括用於增加表現位準之適合的增強子元素,作為選擇性組份。例子包括SV40早期基因增強子(Dijkema et al(1985)EMBO J.4:761)以及勞氏(Rous)肉瘤病毒之長末端重覆之增強子(LTR)(Gorman et al.(1982b)Proc.Natl.Acad.Sci.79:6777)。表現載體亦任擇地地包含用於改善干擾素蛋白之表現之轉錄終止序列以及多腺苷酸化序列。適合的轉錄終結子以及多腺苷酸化訊號可,例如,從SV40衍生而來(Sambrook et al(1989),Molecular Cloning:A Laboratory Manual)。可於表現載體中加入任何此技藝中已知可用於支持足夠的表現之其它的元素,諸如土撥鼠肝炎轉錄後調節元素(wPRE)。
於特佳態樣中,該表現載體係病毒性表現載體。為了在不破壞病毒之感染性之情況下引入異源多核苷酸,用於本發明之病毒性載體典型地包含一其中原生序列之一部分已經刪除之病毒基因組。由於病毒組份與宿主細胞受體間之專一性交互反應,所以病毒性載體非常適合用於有效的將基因轉移至標的細胞中。用於促進將基因轉移至哺乳動物細胞中之適合的病毒性載體係此技藝中熟知的,且可從不同類型的病毒衍生而來,例如,從逆轉錄病毒、腺病毒e及腺相關病毒(AAV)、正黏液病毒、副黏液病毒、乳多空病毒(papovavirus)、微小核糖核酸病毒或α病毒衍生而來。
不同病毒載體系統之綜述,見Nienhuis et al.,Hematology,Vol.16:Viruses and Bone Marrow,N.S.Young(ed.),353-414(1993)。
另一方面,當宿主細胞係細菌性細胞,諸如大腸桿菌細胞時,表現載體將適應於原核生物細胞環境中之蛋白表現。已有極大量針對大腸桿菌以及其它細菌宿主作說明之表現載體。適合在大腸桿菌細胞中用於蛋白質表現之載體之例子包括,例如,pBluescript系列之載體、pUC系列之載體,如pUC18、pUC19、pBR322、pBR329、pQE70、pQE60、pQE-9、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK233-3、pDR540、pRIT5、pLG338、pKC30、pHSG299、pHSG399、pACYC177、pACYC184、pRSF1010、pBW22以及相似物。較佳的載體係一種屬於pET族群之載體。pET載體典型地包含編碼lac抑制子蛋白之lacI基因、對T7 RNA聚合酶具專一性之T7啟動子、轉錄終止序列、可阻斷轉錄之lac操縱子、用於選殖之多接頭、f1複製起始區、盤尼西林或卡那黴素(kanamycin)抗性基因以及ColE1複製起始區。用於本發明之方法中之pET載體包含,但不限於,pET-21a(+)、pET-24a(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-41a(+)、pET-44a(+)、pET-21b(+)、pET-24b(+)、pET-26b(+)、pET-28b(+)、pET-29b(+)、pET-30b(+)、pET-42b(+)、pET-44b(+)。特佳的係以pET-26b(+)骨架為主之載體。適合的載體之其它例子述於如“Cloning Vectors”(Pouwels et al.(eds.)Elsevier,Amsterdam New
York Oxford,1985)中。
可利用任何適合的方法,將用於細菌性細胞中之表現載體轉形進入宿主細胞中。例如,如Maniatis et al.1982,Molecular Cloning,A laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory所述,可利用如電穿孔或化學方法,諸如磷酸鈣介導的轉形,將用於大腸桿菌之表現載體導入宿主細胞中。
本發明之宿主細胞以及方法可用於重組表現大量的可溶性干擾素蛋白。干擾素之類型沒有特別限制。一般而言,選擇於本發明之宿主細胞中表現之干擾素蛋白可為人類或非人類來源。非人類來源之干擾素多肽包含,例如,牛、馬、豬以及小鼠干擾素,以及分別從狗、貓、兔以及羊而來之蛋白。其它非人類干擾素之類型包括該等可在靈長類中找到者,諸如黑猩猩以及大猩猩。在較佳具體例中,選擇用於在本發明之宿主細胞中表現之干擾素蛋白係人類干擾素,即可在人類中自然產生之干擾素,包括對偶基因突變體。
該干擾素蛋白可屬於任一種此技藝中已知之干擾素亞型。特別是,欲在本發明之宿主細胞中表現之干擾素蛋白可為α-干擾素(IFN-α)、β-干擾素(IFN-β)或γ-干擾素(IFN-γ)。在特佳之具體例中,欲表現之干擾素蛋白是人類IFN-α、IFN-β或IFN-γ或其等之生物活性片段。本發明之方法可進一步用於表現以下所述之IFN-α、IFN-β或IFN-γ之生物活性變體或片段。
在本發明之一具體例中,在本發明之宿主細胞中表現
之IFN係成熟原生人類IFN-α蛋白。然而,本發明亦涵蓋在此別處所述之生物活性IFN-α變異體以及片段之表現。人類IFN-α存在至少25個高度同源之蛋白家族,該蛋白具有由個別基因編碼之166個胺基酸。IFN-α蛋白會抑制病毒複製以及細胞增生以及調控某些免疫反應。重組IFN-α目前用於治療B型肝炎以及C型肝炎,以及亦用於治療白血病、惡性黑色素瘤以及AIDS相關的卡波西氏肉瘤。如本發明之方法表現之較佳的IFN-α包括IFN-α2a、IFN-α2b以及IFN-α2c。成熟原生人類IFN-α2a之胺基酸序列描寫於序列辨識編號1中。
於另一具體例中,在本發明之宿主細胞中表現之IFN係以下所述之成熟原生人類IFN-β蛋白或生物活性IFN-β變體或片段。人類IFN-β係一種具有分子量約20kd之糖蛋白。與IFN-α相似,其顯示出強力的抗病毒活性,且已知會抑制細胞增生。人類IFN-β之成熟形式具有166個胺基酸。成熟人類IFN-β示於序列辨識編號2中。IFN-β被發現可結合至與IFN-α相同之受體。
於本發明之又另一具體例中,在本發明之宿主細胞中表現之IFN係成熟原生人類IFN-γ蛋白。然而,本發明亦涵蓋在此別處所述之生物活性IFN-γ變體以及片段之表現。IFN-γ係一種在免疫系統中行使許多調節功能之糖蛋白。例如,釋出之IFN-γ會促進B細胞的分化,且刺激TNF-α的產生。另外,IFN-γ被發現可以活化表皮以及內皮細胞、纖維母細胞以及巨噬細胞,以便消滅細胞內之病原菌。IFN-γ之作用由調節蛋白結合至IFN-γ反應細胞表面上之個別形式
之受體調解。在其成熟形式方面,單體人類IFN-γ包含143個胺基酸,且具有分子量約17kd。成熟原生人類IFN-γ之胺基酸序列描述於序列辨識編號3中。
當然亦可能使用本發明之宿主細胞以及方法,來生產與以上所提及之干擾素蛋白(特別是該等序列辦識編號1-3所述者)具某些程度不同之干擾素變體。該變體典型地為生物活性變體,即其等保留天然發生干擾素之至少部分的生物活性,如結合其等各別的受體分子之能力。適合用於測定變體結合至干擾素受體第I型之分析法,述於例如美國專利案第5,766,864號中。選擇性地,干擾素變體之生物活性,可藉由測量其抗增生或抗病毒活性而測定出,如美國專利案第5,770,191號以及第5,690,925號中所述。較佳地,該變體干擾素保有己所衍生自之干擾素蛋白之大部分的生物活性,如該活性之至少約50%,更佳地60%、70%、80%、90%、95%或更高。
變體包括天然發生以及重組產生的蛋白質,其與來源參考胺基酸序列差一或多個胺基酸取代、刪除或添加。例如,人類干擾素α2a之變體可具有與以序列辨識編號1所描述之原生人類干擾素α2a,在2、3、4、5、6或高達10、20、30或更多位置上不同之胺基酸序列。較佳的取代係保守取代,即以作用功能相當、極性相似之胺基酸取代一或多個胺基酸殘基。較佳地,作為取代基之胺基酸殘基擇自於與欲被取代之胺基酸殘基相同之胺基酸群組。例如,疏水性殘基可由另一疏水性殘基取代,或極性殘基可由另一具有
相同電荷之極性殘基取代。可用於保守取代之功能性同源胺基酸包含,例如,非極性胺基酸,諸如甘胺酸、纈胺酸、丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸以及色胺酸。不帶電極性胺基酸之例子包含絲胺酸、酥胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、酪胺酸以及半胱胺酸。帶電極性(鹼性)胺基酸之例子包含組織胺酸、精胺酸以及離胺酸。帶電極性(酸性)胺基酸之例子包含天門冬胺酸以及麩胺酸。
亦考慮作為干擾素變體的是與原始干擾素差一或多個(如,2、3、4、5、10或15)額外胺基酸之蛋白質。此等額外的胺基酸存在於原始干擾素蛋白之胺基酸序列中(即,插入),或其等可加在該蛋白之一或二個終端。基本上,插入可在任何位置發生,但胺基酸之添加不能損害該蛋白行使至少一部分天然發生的干擾素蛋白所行使的生物活性之能力。再者,變體亦包含該等其中與原始蛋白相比,缺少一或多個胺基酸之蛋白。此刪除會影響任何胺基酸的位置,但其等不會損害變體行使至少一部分天然發生的干擾素蛋白所行使的生物活性之能力。
干擾素蛋白之變體亦涵蓋相對於天然發生之蛋白,結構經修飾的蛋白,諸如經修飾的胺基酸。根據本發明,經修飾的胺基酸係經天然過程,諸如修飾作用或轉譯後修飾,或化學修飾處理之胺基酸。可在如本發明產生之干擾素變體中發生之胺基酸修飾可包含磷酸化、糖基化、乙醯化、醯化、分枝、ADP核糖基化、交聯、雙硫鍵形成、甲醯化、羥基化、羧化、甲基化、去甲基化、醯胺化、環化
和/或共價或非共價鍵結至磷脂醯肌醇、黃素衍生物、脂膜酸、脂肪酸或脂質。此等修飾在文獻中已有廣泛的說明,如Proteins:Structure and Molecular Properties,T.Creighton,2nd edition,W.H.Freeman and Company,New York(1993)。
在此所指之干擾素變體,與原始干擾素蛋白相比,較佳地展現出顯著的胺基酸序列一致性。較佳地,該胺基酸一致性之數量為約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%以及更佳地超過96%、97%、98%或99%。用於測定胺基酸同源性之方法以及電腦程式係業界熟知的。就本發明而言,序列一致性係使用Smith-Waterman同源性檢索演算法測定(Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.(1981),2:482-489)。
在此業界中已有描述有關人類干擾素蛋白之生物活性變體。例如在美國專利案第5,676,942號中可找到人類IFN-α變體,其亦提供有關IFN-α蛋白中,可在不喪失生物活性之情況下改變之殘基以及區域之資訊。人類IFN-γ中之變體述於如美國專利案第5,690,925號以及第6,046,034號中。
本發明所提供之宿主細胞以及方法,亦可用於表現以上所定義之整段干擾素蛋白或其等之變體之生物活性片段。在此使用之干擾素蛋白之片段係一種蛋白、多肽或胜肽,其與對應的干擾素蛋白之差異為在N終端和/或C終端處缺少一或多個胺基酸,其中仍保留該參考干擾素分子之至少一部分的生物活性,如其受體結合特性或其抗病毒或抗增生活性。天然發生之干擾素蛋白之生物活性片段或對應
的干擾素變體之片段,較佳的保留該參考干擾素之生物活性之至少約50%、至少約75%,較佳地至少約80%、至少約85%、至少約90%或甚至高達至少約99%。
早期已有關於人類干擾素之生物活性片段之描述。例如,從美國專利案第5,770,191號可得知IFN-γ之片段,其揭示包含成熟整段人類IFN-γ之胺基酸95-134之片段。該片段會行使成熟IFN-γ之生物活性。EP 0 306 870揭示在C終端胺基酸7-11處具有缺失之人類IFN-γ片段。與整段人類IFN-γ相比,該片段顯示出大量增加的活性。
當將編碼以上干擾素蛋白之一或其生物活性變體或片段之多核苷酸序列選殖進入細菌表現載體時,為了使其適應於原核細胞之表現,應考慮到,修飾編碼干擾素之多核苷酸序列可能有幫助。用於最適化欲表現之多核苷酸序列之密碼子使用(codon-usage),使其可順從在細菌宿主細胞(諸如大腸桿菌)中表現之方法,係業界已知的,且述於如Maertens et al.(2010),Protein Science,19:1312-1326中。
簡言之,藉由使密碼子使用適應於大腸桿菌之密碼子偏性,操縱編碼欲在宿主細胞中表現之干擾素蛋白之多核苷酸序列。可能的話,避免非常高(>80%)以及非常低(<30%)GC含量之區域。且,避免順式作用序列模體,諸如內部TATA盒、chi位點以及核糖體進入位點、重覆序列、RNA次級結構以及AT富集或GC富集序列延伸。亦利用像Geneart之供應商(Regensburg,Germany),進行基因序列,諸如人類基因序列,在像大腸桿菌之細菌宿主中表現之最適化。
已經對在大腸桿菌中表現進行最適化之編碼人類IFN-α2a之多核苷酸序列,提供於序列辨識編號4中。
本發明亦有關一種用於重組表現可溶性干擾素之方法,其使用以上描述的較詳細之宿主細胞。該方法包含下列步驟:(a)提供一宿主細胞,其包含一功能性內源性trxB基因、一去活性內源性gor基因以及一編碼內源性干擾素蛋白之多核苷酸序列;(b)在容許該干擾素蛋白表現之條件下培養該宿主細胞;以及(c)從該宿主細胞獲得該可溶性干擾素蛋白。
該宿主細胞較佳地包含整合入其基因組之噬菌體RNA聚合酶,如T7 RNA聚合酶,之複本,且經一包含編碼外源性干擾素蛋白之多核苷酸序列之游離型表現建構體(如表現載體)轉形。在用於重組表現可溶性干擾素之方法中使用之宿主細胞,一般可為任何類型之在此別處所討論之真核細胞或原核細胞。較佳地,該宿主細胞係細菌性細胞,更佳地大腸桿菌細胞。
根據本發明提供之方法,該宿主細胞係在容許干擾素蛋白之表現之條件下培養。該特定的條件取決於特定表現系統之選擇,且亦取決於如宿主細胞之本質、可誘導的啟動子之本質等等之因子。熟悉此技藝之人士應能在不需任何發明的努力下,輕易地選擇以及最適化在細胞培養中干擾素蛋白之有效表現所需之條件。
例如,可依照標準發酵方法進行表現干擾素蛋白之大腸桿菌宿主細胞之培養。典型地,大腸桿菌細胞可用批次培養或饋料批次方法培養。在生物方法技術之百科全書中,一般即有關於細菌性宿主細胞之培養的說明:Fermentation,Biocatalysis,and Bioseparation,Volumes 1-5,Flickinger,M.C.,Drew,S.W.(eds.),1999 John Wiley & Sons。典型的溫度條件在20℃至42℃之範圍內,較常見地30℃至40℃,較佳地35℃至38℃。培養之培養基典型地具有pH介於6.5與9.0之間,更典型地7.0至8.0,如7.5。發酵培養可持續一段時間,範圍從數小時至數天。特別地,假如培養係以批次方法進行,則培養時間正常範圍從約12個小時至約36個小時。當使用連續方法時,發酵時間可高達21天或更長。
在方法之最後步驟中,從宿主細胞獲得可溶性干擾素。典型地,從宿主細胞之細胞溶質中分離出蛋白質。可使用,如法式壓力、重覆冷凍與解凍之循環或超音波振盪,使細胞瓦解。可利用離心輕易地將細胞碎片從蛋白部分中移除。之後利用標準色層分析方法,包括,例如尺寸排除色層分析法和/或離子交換色層分析法,從其它蛋白質以及非蛋白質化合物中純化出可溶性干擾素蛋白。亦可使用典型地用於蛋白質純化之其它方法,諸如硫酸銨沈澱法以及過濾和/或透析。由本發明之宿主細胞表現出之干擾素蛋白,亦可使用如單株或多株抗干擾素抗體之親和力純化方法純化。
為簡化純化方法,根據本發明之方法產生之干擾素可表現成融合蛋白,其包含一親和性標籤,該標籤會透過抑制結合親和力之化合物,促進該融合蛋白結合至該標籤。例如,親和性標籤可為包含6-12個組織胺酸殘基之多組織胺酸,其會與鎳離子螯合基質專一性交互反應。選擇性地,該標籤可為容許在麩胺基硫基質上純化之麩胺基硫-S-轉移酶。另外的親和性標籤係業界熟知的。親和性標籤與親和性配位子對之非限制性例子包括麥芽糖結合蛋白(MBP)以及麥芽糖;親和素以及生物素;Streptag以及鏈酶親和素;myc抗原決定位以及抗體。當親和性標籤為胜肽或多肽時,此標籤可方便地與干擾素蛋白一起表現成單一表現產物。當親和性標籤不是蛋白質性質來源時,其可經由化合偶合反應附著。例如,生物素可經由化學偶合至融合蛋白。
較佳地,根據本發明之方法產生之干擾素中至少50%係活性干擾素。更佳地,從本發明之方法獲得之干擾素中,至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%係活性干擾素。
第1圖顯示IPTG誘導之前(t0)以及誘導3小時之後(t3),在SDS-PAGE中所測定之RHB-T7/pET26b(+).IFNα2a以及RHB-T7△gor/pET26b(+).IFNα2a的IFNα2a蛋白位準之比較。可看到二個選殖株表現IFNα2a之數量相似。
第2圖顯示IPTG誘導3小時之後(t3),RHB-T7/pET26b(+).IFNα2a以及RHB-T7△gor/pET26b(+).IFNα2a
之可溶性以及不溶性蛋白部分之SDS-PAGE分析結果。雖然所產生之RHB-T7/pET26b(+).IFNα2a培養物大部分為不溶性干擾素(左格第三道),但RHB-T7△gor/pET26b(+).IFNα2a顯示出主要為可溶性產物(右格之第二道)。
第3圖顯示RHB-T7△gor、RHB-T7△gor/trx以及Origami(DE3)菌株中IFNα2a表現之比較,其等全部事先均經表現載體pET26b(+).IFNα2a轉形。A格顯示SDS-PAGE以及Coomassie染色後之結果。B格顯示免疫墨點以及化學發光檢測之結果。t0:無誘導;t4:用IPTG誘導4個小時;I:包涵體或不溶性部分;C:細胞溶質或可溶性部分;ctrl:重組IFNα2a(Roferon®);LM:分子量標記Invitrogen)。
第4圖顯示編碼人類IFNα2a之核苷酸序列,其在密碼子使用方面,已針對在大腸桿菌中重組表現進行最適化。
將以下列僅為示範說明所提供之範例說明本發明。明確而言,該等範例說明製備具有內源性T7 RNA聚合酶基因以及內源性gor基因已經同源重組而去活性之大腸桿菌細胞之方法。該等範例進一步說明在該大腸桿菌宿主細胞中,人類干擾素α、β以及γ之重組表現。
使用用於同源重組之Red/ET技術(Gene Bridges,Heidelberg,Germany),從BL21菌株開始,製備含有在lacI抑制子控制下之基因組T7 RNA聚合酶基因之大腸桿菌生
產菌株。該生產菌株之製備包括下列步驟:
a)T7基因盒之擴增以及選殖
使用標準套組(Qiagen,Hilden,Germany),製備大腸桿菌BL21-DE3之基因組DNA(Novagen)。利用PCR反應,擴增BL21-DE3之4.44 kb lacUV5-T7基因盒。該DNA基因盒含有lacI基因、lac操縱子之調節功能區、部分的lacZ基因以及編碼T7 RNA聚合酶之大腸桿菌噬菌體T7基因1。PCR反應混合物含有KOD熱啟動DNA聚合酶緩衝液、2mM MgSO4、200 μM dNTPs、1 U KOD熱啟動DNA聚合酶(Novagen)、10μM正向引子(λintl)、10μM反向引子(λint2)以及50ng DNA樣版。依照下列設定使用Mastercycler梯度基因擴增儀(Eppendorf):98℃下變性2分鐘,接著進行34個98℃下30秒、60.5℃黏合溫度下30秒以及72℃下延伸2分鐘之周期。最後的延伸在72℃下進行7分鐘。使用下列引子:λint1:GTCCGACTTATGCCCGAGAAGATGTTGAGCAAACTTATCGCTTATC(序列辨識編號6);λint2:TGCAAAGAGATTCTTGGCGGAGAAACCATAATTGCATCTACTCG(序列辨識編號7);
所產生之PCR產物之後用作為樣版,供使用相同的PCR條件再擴增,其設計用於在T7盒中產生PstI以及SalI之限制酶切位點。在再擴增PCR方面,使用下列引子:PstI-正向:GGAAGCGGGCCTGCAGCGGACACCATCGAATGGCGC(序列辨識編號8);以及SalI-反向:GGGGGGGGGGGTCGACGGAGTCGTATTGATTTGGCG
(序列辨識編號9)。
在限制酶分析以及使用QIAquick凝膠萃取套組(Qiagen,Hilden,Germany)從瓊膠中提取出所產生之片段之後,用PstI/SalI消化的pIBD5質體(其包括可由IPTG誘發之T5啟動子)進行接合反應(快速DNA接合套組,Roche)。利用在此別處所述之電穿孔技術,轉形100μl之大腸桿菌K12 DH10B細胞,劃在含有卡那黴素(Kan)之LB瓊脂培養皿上,在37℃下培養一整夜。該培養皿上之一個選殖株培養用於質體-DNA之製備(Qiaprep Spin Miniprep套阻;Qiagen),用PstI以及SalI消化,然後利用瓊脂凝膠電泳法,確認T7-RNA聚合酶(RNAP)基因盒是否正確插入。新建構的載體命名為pSI。利用基因定序技術,確定pSI中之T7 RNAP基因(GATC Biotech AG)。依照製造商之技術操作方法(Gene Bridges),使用認可的pSI質體作為用於產生供重組步驟用之線性DNA之樣版。
b)製備供用於同源重組之線性DNA
為產生供用於重組之線性DNA,用PCR擴增pSI中之T7基因盒以及卡那黴素抗性基因,在各側邊加上同源臂,其係與所欲的基因組整合基因座(即大腸桿菌之recA基因座)之DNA同源之DNA延伸。PCR反應混合物含有KOD熱啟動DNA聚合酶緩衝液、2mM MgSO4、200μM dNTPs、1 U KOD熱啟動DNA聚合酶(Novagen)、10μM正向引子(5'harecA)、10μM反向引子(3'harecA)以及50ng DNA樣版。依照下列設定使用Mastercycler梯度(Eppendorf):98℃下變性2分鐘,接著35個98℃下30秒、65.5℃黏合溫度下30秒以及72℃下延伸2分鐘之
周期。最後的延伸在72℃下進行7分鐘。使用下列引子:5'harecA:TCGCTATCATCTACAGAGAAATCCGGCGTTGAGTTCGGGTTGCTCAGCAGCTAGATGCATGCTCGAGCGG(序列辨識編號10);3'harecA:GTAAAGGCTCCATCATGCGCCTGGGTGAAGACCGTTCCATGGATGTGGAACTCTGCTGAAGCCAGTTACC(序列辨識編號11)。
用QIAquick PCR純化套組(Qiagen)純化PCR產物,用10單位之DpnI,在37℃下消化30分鐘。
c)轉形勝任大腸桿菌細胞
利用電穿孔BL21細胞(Novagen),以pRed/ET質體轉形大腸桿菌細胞。簡言之,於50μl試樣量之電穿孔勝任細胞中加入1μl之pRed/ET質體DNA,轉移至1mm電穿孔比色管中,然後使用Electroporator #2510(Eppendorf),以1350伏特進行電穿孔。時間常數應介在5.0至5.4毫秒之間。加入1ml之預冷的LB培養基(1%大豆-蛋白腖、0.5%酵母萃取液、1%NaCl,pH 7.0),將樣本移至1.5ml管中,然後在熱環循器中30℃以及800rpm下培育1個小時。將100μl之細胞懸浮液劃在LB瓊脂加上四環黴素(3μg/ml)之培養皿上,然後使培養皿在30℃下培育一整夜。從pRed/ET電穿孔之培養皿中挑出單一個菌落,且在1ml LB培養基加上四環黴素中,30℃,800rpm振盪下培育一整夜。將30μl該培養物移至二個含有1.4ml之LB培養基加上抗生素之管中。令細胞在30℃下生長約2個小時,直到其等達到光學密度(OD)為0.3。一個培養
物藉由添加50μl之10% L-阿拉伯糖進行誘導,而另一個保持無誘導且作為陰性對照組。二個培養物均置於37℃,800rpm下培育約1個小時。為了產生勝任細胞,二個培養物均在4℃,13000rpm下離心,用1ml之預冷10%甘油清洗2次,然後再懸浮於約50μl之10%甘油中。
之後用含有從pSI而來之T7以及卡那黴素抗性基因以及用於重組之同源臂之線性DNA(見上文),轉形此等培養物。於該經誘導以及無誘導之細胞二者中均加入400至800 ng之線性PCR片段,然後以1350伏特對懸浮液進行電穿孔。需注意,DNA樣本之體積不超過4μl。加入1ml冰冷的LB培養基,然後令細胞在37℃,800rpm下培育3個小時。離心後,使細胞重新懸浮於100μl之LB培養基中,劃在LB瓊脂加上具建議濃度之選定的抗生素上,在37℃下培育一整夜。鑑定二個選殖株。利用菌落PCR,確認是否成功的重組基因盒進入此等選殖株之BL21中之recA基因座中。整個整合的序列(lacI、△lacZ以及T7 RNA聚合酶基因)之序列分析顯示出,BL21-DE3中此區域與原始序列完全一致。新的菌株命名為RHB-T7 Kanr。
d)移除卡那黴素抗性基因
如上所述,新菌株RHB-T7 Kanr在細菌基因組中帶有卡那黴素抗性基因。因為由重組結果產生之細胞係要與pET載體一起使用,因此需要進一步之最適化避免雙抗性(基因組以及游離型抗性)。因此,透過同源重組,在卡那黴素基因座上插入兩側含FRT位點的氯黴素抗性基因盒,瓦解基因
組卡那黴素抗性基因。因此,另一由flp蛋白控制之重組結果,導致卡那黴素抗性基因約60%被刪除。此剔除突變因游離型卡那黴素抗性基因(Kan),而能篩選pET轉形體。
用下列之方法,從基因組中除去卡那黴素抗性基因:以同源重組之方法,將具5'與3' DNA延伸與卡那黴素抗性基因之部分同源之兩側含FRT位點的氯黴素抗性基因盒之線性PCR產物,整合入RHB-T7 Kanr之基因組卡那黴素基因座中。因此,使用供同源重組之Red/ET技術(Gene Bridges,Heidelberg,Germany)。簡言之,依照製造商之操作程序(見上文),用pRed/ET質體轉移電穿孔勝任細胞RHB-T7 Kanr細胞。在四環黴素培養皿上作篩選,然後用含有Kanr基因序列之5'與3'同源臂以及兩側含FRT位點之Cm抗性基因之線性PCR片段,轉形陽性選殖株。利用PCR分析檢驗轉形體,以核對修飾的基因體。挑7個單一選殖株,並用菌落PCR篩選分析是否正確的插入RHB-T7 Kanr之卡那黴素基因座。全部7個選殖株分析均為陽性。用Gene Bridges提供之pFLP707質體轉形此等選殖株中之一個。此質體帶有在熱敏感啟動子之轉錄控制下之flp重組酶基因,熱敏感複製起點,以及用於篩選轉形體之四環徵素抗性基因。
在30℃下培養此轉形之單一選殖株。溫度變動至37℃導致表現flp重組酶蛋白,而喪失包括四環黴素之pFLP707質體。將細胞劃在LB瓊脂上,然後利用菌落PCR,分析單一選殖株之陽性flp重組結果。
在含有1.0ml LB培養基以及15μg/ml氯黴素之微量離
心管中,培養3個帶有兩側含FRT位點的氯黴素抗性基因盒之菌落。在蓋子上打洞以利空氣之供給。使培養物在37℃,800 rpm振盪下培育一整夜。在具有1.4 ml LB培養基以及15μg氯黴素之微量離心管中,種入30μl新鮮培育一整夜之培養物,在37℃,900rpm振盪下培養2-3個小時。細胞在冷的微量離心管中以11.000rpm離心30秒,然後倒掉上清液。將沈澱丸重新懸浮於1ml冷的ddH2O中。重複離心以及再懸浮一次。離心後,再次倒掉上清液,正常情況下留下20-30μl與沈澱丸一起。使細胞重新懸浮,且一直保持置於冰上。用1μl pFLP707 DNA進行電穿孔。在四環黴素培養皿上,於30℃下培育一整夜後,在1ml LB培養基中種入單一菌落,然後在30℃下培育2-3個小時。將溫度改至37℃,然後培育該培養物一整夜。將一滴的細胞懸浮液劃在LB瓊脂培養皿上。在37℃下培育一整夜後,利用PCR,分析單一菌落是否成功地除去選擇標記氯黴素。此外,將菌落平板複印在LB瓊脂以及LB瓊脂加上15μg/ml氯黴素二者上,用以篩選陽性選殖株。鑑定出二個喪失氯黴素抗性之陽性選殖株。利用各別的基因組區域之序列分析,確認選殖株。新的菌株命名為RHB-T7。
在電穿孔勝任細胞之製備方面,在20ml之LB培養基上種入培養一整夜之RHB-T7,至到達開始的OD600為約0.1。令細胞在37℃下生長至OD600為約0.6。在4℃以及4600rpm下離心10分鐘。倒掉上清液,同時使沈澱丸再懸浮於14ml
之冰10%甘油中。隨後離心(與以上相同的條件),重覆清洗步驟。最後使沈澱丸重新懸浮於700μl 10%甘油中,之後立即將50μl試樣量之細胞懸浮液冷凍在液態氮中。
於50μl試樣量之電穿孔勝任細胞中加入1μl之pRed/ET質體DNA。混合後,讓樣本保持在冰上。將轉形樣本移至1mm電穿孔比色管中,然後使用來自Eppendorf之Electroporator #2510,以1350伏特進行電穿孔,時間常數在5.0至5.4毫秒之間。加入1ml預冷卻的LB培養基,將該樣本移至1.5 ml試管中,然後在30℃與800rpm之熱循環下培育1個小時。將100μl之細胞懸浮液劃在LB瓊脂加上四環黴素(3μg/ml)上,將培養皿置於30℃下培育一整夜。
從pRed/ET質體電穿孔之培養皿上挑出單一個菌落,且在1m1 LB培養基加上四環黴素上,於30℃,800rpm振盪下培育一整夜。將30μl之該培養物移至二個含有1.4ml之LB培養基加上抗生素之試管中。細胞在30℃下生長約2個小時,直到其等到達OD約0.3。一個培養物藉由添加50μl之10% L-阿拉伯糖誘導,而另一個保持無誘導且作為陰性對照組。二個培養物均在37℃,800rpm下培養約1個小時。為了產生勝任細胞,二個培養物均在4℃,13.000rpm下離心,用1ml預冷卻的10%甘油清洗二次,之後重新懸浮於約50μl之10%甘油中。此等細胞用於含有gor基因序列之5'與3'同源臂之線性PCR片段之轉形。
使用由Gene Bridges(Heidelberg,Germany)提供之FRT-Cm-FRT抗性基因盒,作為用於瓦解從範例1獲得之
RHB-T7中之染色體gor基因之樣版。使用Eppendorf之Mastercycler梯度,以下列設定進行PCR反應:98℃下起始變性2分鐘,接著34個98℃下30秒、60℃黏合溫度下30秒以及72℃下延伸1.5分鐘之循環。最後的延伸在72℃下進行7分鐘,然後貯存在4℃下。使用KOD熱啟動DNA聚合酶(Novagen),引子如下:5'hagor:AACGTGCTCGGTAAAAATAACGTTGATGTAATCAAAGGCTTTGCCCGCTTAATTAACCCTCACTAAAGGGCGG(序列辨識編號12);3'hagor:GATCGGCCGTGATGGTTTCGCCGTTTACCTCCAGCGTTTTGGCATCAACGTAATACGACTCACTATAGGGCTCG(序列辨識編號13);
如此製得1.5kb之PCR產物,其含有兩側含FRT位點的氯黴素抗性基因以及50bp gor同源臂。用QIAquick PCR純化套組(Qiagen)純化PCR產物。於以上製得之經誘導與無誘導的細胞中,加入400至800ng含有gor基因序列之5'與3'同源臂以及兩側含FRT位點的氯黴素抗性基因之線性PCR片段,然後懸浮液以1350伏特進行電穿孔。
純化的PCR產物用於電穿孔經載體pRed/ET(Gene-Bridges)轉形之RHB-T7,然而製備用於同源重組。重組結果產生精準的整合抗性標記基因盒進入RHB-T7基因組之gor基因座。利用PCR確認是否成功的瓦解gor基因。注意DNA樣本的體積不超過4μl。加入1ml冰LB培養基,然後細胞在37℃,800rpm下培育3個小時。離心後,將重新懸浮
在100μl之LB培養基中之細胞劃在具氯黴素之LB瓊脂上,然後在37℃下培育一整夜。利用菌落PCR,檢核是否成功的重組進入基因組。此等PCR反應以及從平板複印實驗之結果證實,抗性標記基因盒整合成功。為了初步排除抗性標記,用如範例1中所述之pFLP707質體(Gene Bridges)轉形陽性選殖株。用PCR以及平板複印,確認抗性標記是否喪失。
整合以及翻轉導致gor開放讀取架構瓦解,因此製造gor缺失之突變株。此可經序列分析證實。RHB-T7 gor-中之gor開放讀取架構產生在位置364-366處具有轉譯終止TAA之截短蛋白(野生型蛋白之三聯體116)。T3啟動子序列、翻轉酶重組標的位點(FRT)以及T7啟動子序列,在翻轉後仍保留在染色體中,藉此引起該讀取架構的瓦解。此新菌株命名為RHB T7△gor。
pET26b(+)IFNα2a表現載體之建構,在Nde/Sal消化的pET26b(+)(Invitrogen)質體片段以及Nde/Sal消化與密碼子最適化IFNα2a插入片段(pMA0813119,GeneArt)之瓊膠電泳以及凝膠洗提後進行。根據此二個分離出之DNA片段(Qiagen minelute凝膠萃取套組),使用Roche快速DNA接合套組進行接合反應。在用一試樣量之接合混合物轉形化學勝任大腸桿菌DH10B細胞後,從含卡那黴素LB培養皿中挑出個別的菌落,然後在37℃下,含50μg/ml選擇標記之液態LB培養基中培養一整夜。之後,從各選殖株中分離出質體DNA,接著使用Nde/Sal限制酶酵素消化。在具有正確大小
之載體片段>5000 bp之二個選殖株中,該消化產生具約550 bp之Nde/Sal片段。為了確定該等選殖株包含正確的表現載體pET26b(+)IFNα2a,使用不同的限制酶酵素使選殖株1經歷更專一性的斷裂,諸如PstI、BglII、BspHI以及SspI。限制酶打斷以及瓊脂凝膠電泳之結果確認DNA片段之正確的數目及尺寸大小。因此,表現載體pET26b(+)IFNα2a被轉形進入勝任RHB-T7△gor細胞中,且產生卡那黴素抗性菌落,從其中隨機選擇5個用於接種3mL之含卡那黴素液態培養物,然後將對應的冷凍原液貯存在-80℃下。
將以上所述之RHB-T7以及RHB-T7△gor菌株而來之大腸桿菌細胞培養至對數生長中期。細胞離心(1 min/16.100×g/0℃),然後重新懸浮於冰10%甘油中,再次離心(1 min/16.100×g/0℃)。重覆此清洗步驟一次。在第二次清洗後,將細胞重新懸浮於50μL冰10%甘油中,然後將懸浮液移至預冷的電穿孔比色管(Gap:2 mm)中。於該比色管中加入一試樣量之pET26b(+).IFNα2a表現載體,然後用Electroporator 2510(Eppendorf AG,Germany),施予1350伏特(V)進行電穿孔。電穿孔後,加入1mL預冷的LB培養基,然後將細胞懸浮液移至新的試管中。在37℃伴隨攪拌(250rpm)下培育1個小時後,在補充50μg/mL卡那黴素之LB瓊脂培養皿上塗上50μL試樣量,然後在37℃下培育一整夜。從轉形培養皿中挑出單一菌落,用於接種3mL培養物(LB培養基,補充50μg/mL卡那黴素)。一整夜培育(37℃
/250rpm)後,以下列方法製備初級冷凍保存原液:將1mL的培養物樣本與0.5mL無菌30%冰甘油在冰凍試管中混合在一起(最終:10%甘油)。在液態氮中快速冷凍(LN2)後,將試管貯存在-80℃中。
以pET26b(+).IFNα2a表現載體轉形RHB-T7以及RHB-T7△gor所獲得之選殖株分別命名為RHB-T7/pET26b(+).IFNα2a以及RHB-T7△gor/pET26b(+).IFNα2a。轉形後所獲得之不同選殖株中之pET26b(+).IFNα2a表現載體之特性以及完整性,可使用限制酶酵素BglII、BspHI、NdeI、PstI、SalI以及SspI之DNA片段分析確認。
接種3mL從快速冷凍原液而來之複合培養基[veg.](27.0g/L植物蛋白腖、14.0g/L酵母萃取物、5.0g/L NaCl、0.5g/L MnSO4*H2O、25.0g/L(w/v)甘油、8.65g/L K2HPO4、6.85g/L KH2PO4;pH7.0±0.1),開始培養RHB-T7/pET26b(+).IFNα2a以及RHB-T7△gor/pET26b(+).IFNα2a,供生產IFN。培養基中補充50μg/mL之卡那黴素。培養物在37℃,250rpm下培育一整夜。15mL表現培養物從使用3mL試樣量之培育一整夜的培養物開始,在37℃,250rpm之振盪培養瓶中,無抗生素之15mL複合培養基[veg.]中,到達起始OD600為0.1。在達到OD600為0.5至0.8之對數中間相後,加入IPTG(最後濃度為1mM),培養物進一步培養3個小時。在IPTG誘導後之前(t0)以及3小時之後(t3),立即取1mL之培養物樣本。
離心1mL之培養物樣本(1 min/16.100×g/0℃)。使細胞
沈澱丸重新懸浮於4mL Tris-EDTA-緩衝液(pH7.4)中,移至玻璃管(內寬22mm)中,然後置於冰浴中。使用裝設有超音波產生器H3之超音波設備UP 400S(Hielscher Ultrasonic GmbH;設備參數:400W,24 kHz),達到細胞之組份分離。技術設定:浸入深度:約15 mm;容量75%;周期:30秒超音波振盪-30秒關閉;總處理時間:10分鐘。之後,將該樣本移至15mL Falcon管中,然後離心(30min/4.080×g/4℃)。不溶性蛋白部分形成沈澱丸。將含有可溶性蛋白之上清液移至新的15mL Falcon管中,用600μL 100%三氯醋酸(最後濃度:15%)穿刺,在離心(30min/4.080×g/4℃)之前,在4℃下培育1個小時。從此步驟而來之沈澱丸代表可溶性蛋白部分。將二個沈澱丸均溶解,用IB緩衝液(8M尿素、50mM DTT、100mM Tris-HCl;pH 8.0)調整到OD600=10。標準化步驟至OD600=10容許直接比較凝膠電泳中不同泳道之相對蛋白的數量。在評估蛋白產率方面,需將分析的培養物之有效測得的OD600列入考慮。
對總細胞蛋白(TCP)以及可溶性以及不溶性蛋白進行SDS-PAGE分析,用Coomassie染色。針對所有的SDS-PAGE凝膠進行方面,使用預製NuPAGE® Novex® 12% Bis-Tris凝膠(Invitrogen,Karlsruhe,Germany),結合相對的XCell SureLock Mini-Cells(Invitrogen)。依照重組INFα2a(19 kDa)之尺寸大小,展開MES緩衝系統(Invitrogen)以便達到最佳的凝膠解析度。將所有的樣本溶於0.25 vol.LDS樣本緩衝液(Invitrogen)中,以0.1 vol.樣本還原劑(Invitrogen)取代,然
後在裝載於凝膠之前,加熱至95℃,歷時10分鐘。在Coomassie染色方面,依照供應商之建議使用Bio-Safe Coomassie染色系統(Bio Rad,Munich,Germany)。依照製造商有關還原條件之指示(Experion Pro260 Analysis Kit Instruction Manual),處理欲利用電泳平台(Experion,Bio-Rad Laboratories,Hercules,USA)分析之樣本,然後將樣本裝載在Experion Pro260晶片(Bio-Rad)上。用Experion Software System Operation and Data Analysis Tool(Bio-Rad,Version 3.0.226.0)進行數據之記錄以及進一步分析。
結果:在3個小時誘導後,RHB-T7/pET26b(+).IFNα2a以及RHB-T7△gor/pET26b(+).IFNα2a二個在SDS-PAGE分析中,在約19kDa處均顯示出顯著的蛋白帶(人類IFNα2a預期的分子量為約18.8kDa)。在IPTG誘導的培養物中特別檢測出蛋白帶,證實二個選殖株中之表現係徹底地受到控制的(見第1圖)。使用抗IFNα2a抗體之免疫墨點分析,確認在SDS-PAGE上觀察到之蛋白帶為IFNα2a(數據未示出)。RHB-T7/pET26b(+).IFNα2a以及RHB-T7△gor/pET26b(+).IFNα2a之SDS-PAGE中蛋白帶強度之比較,顯露出二個菌株均表現相似數量之干擾素蛋白(見第1圖)。
分析該等菌株之可溶性以及不溶性蛋白部分時,發現RHB-T7/pET26b(+).IFNα2a、重組IFNα2a幾乎完全存在於包涵體中。相反地,在RHB-T7△gor/pET26b(+).IFNα2a中,所產生的IFNα2a幾乎完全為可溶性的(見第2圖)。
依照範例3-4中所述之方法,將人類IFN-β以及人類IFN-γ選殖進入pET26b(+)表現載體中。將所產生的質體pET26b(+).IFN-β以及pET26b(+).IFN-γ轉形至RHB-T7△gor以及RHB-T7菌株中。
結果:與以上IFN-α2a所觀察到之結果相似,其顯示出在RHB-T7中,所產生之人類IFN-β以及人類IFN-γ二者主要均呈包涵體之形式,然而在RHB-T7△gor中,至少約90%之重組蛋白表現成可溶性之形式(數據未示出)。
依照範例2製得之RHB-T7△gor菌株之後用於製造trxB -/gor -雙剔除菌株。trxB基因去活性突變,基本上係以如範例2中所述有關gor基因之方法產生。用於去除trxB基因之活性之引子如下:5'hatrx:5'-CACCAAGTTTGAAACTGAGATCATTTTTGATCATATCAACAAGGTGGATCAATTAACCCTCACTAAAGGGCGG-3'(序列辨識編號14);3'hatrx:5'-GCAAGTGTATTCGCCGTTATCGCCATTCAGACGGAACGGACGGTTTTGCATAATACGACTCACTATAGGGCTCG-3'(序列辨識編號15);
所產生的菌株命名為RHB-T7△gor/trx。如以上之解釋,trxB -/gor -雙剔除菌株僅會在其等於ahpC*中展現出突變時生長。因此,於在此所述之RHB-T7△gor/trx中,可利用同源重組完成ahpC*抑制子突變。在RHB-T7△gor菌株中不需此種突變。
用100ng之pET26b(+)IFNα2a DNA轉形RHB-T7△gor以及RHB-T7△gor/trx二者,其分別產生RHB-T7△gor/pET26b(+).IFNα2a株以及RHB-T7△gor/trx-pET26b(+).IFNα2a菌株。
相似地,用100ng之pET26b(+)IFNα2a DNA轉形勝任Origami(DE3)細胞(Novagen),然後在37℃下具有50μg/ml或150μg/ml卡那黴素之選擇性LB瓊脂培養皿中培養一整夜。在150μg/ml培養皿上發現20個菌落,而在50μg/ml培養皿上長出500個菌落。從150μg/ml培養皿中挑出之三個獨立的選殖株之質體DNA製備(Qiagen miniprep套組)以及之後的限制酶消化,顯示出全部三個選殖株均帶有pET26b(+).IFNα2a表現載體。選擇一個選殖株供下列表現實驗(Origami(DE3)/pET26b(+)IFNα2a。
依照範例3-4中所述之方法,進行重組IFN-α2a蛋白之表現分析以及進一步的組份分離步驟、SDS-PAGE,以及免疫墨點檢測。
結果:在所有的測試菌株中觀察到,大部分重組表現的IFN-α2a蛋白係產生在可溶性部分中。僅少量的蛋白在包涵體中檢測得。有趣地,與RHB-T7△gor/trx-pET26b(+).IFNα2a或Origami(DE3)/pET26b(+).IFNα2a相比,在RHB-T7△gor-pET26b(+).IFNα2a中之可溶性IFN-α2a蛋白之數量顯著地較多。在RHB-T7△gor/trx-pET26b(+).IFNα2a中檢測到之數量大於該等於Origami(DE3)/pET26b(+).IFNα2a中之數量(見第3圖)。
第1圖顯示IPTG誘導之前(t0)以及誘導3小時之後(t3),在SDS-PAGE中所測定之RHB-T7/pET26b(+).IFNα2a以及RHB-T7△gor/pET26b(+).IFNα2a的IFNα2a蛋白位準之比較。可看到二個選殖株表現IFNα2a之數量相似。
第2圖顯示IPTG誘導3小時之後(t3),RHB-T7/pET26b(+).IFNα2a以及RHB-T7△gor/pET26b(+).IFNα2a之可溶性以及不溶性蛋白部分之SDS-PAGE分析結果。雖然所產生之RHB-T7/pET26b(+).IFNα2a培養物大部分為不溶性干擾素(左格第三道),但RHB-T7△gor/pET26b(+).IFNα2a顯示出主要為可溶性產物(右格之第二道)。
第3圖顯示RHB-T7△gor、RHB-T7△gor/trx以及Origami(DE3)菌株中IFNα2a表現之比較,其等全部事先均經表現載體pET26b(+).IFNα2a轉形。A格顯示SDS-PAGE以及Coomassie染色後之結果。B格顯示免疫墨點以及化學發光檢測之結果。t0:無誘導;t4:用IPTG誘導4個小時;I:包涵體或不溶性部分;C:細胞溶質或可溶性部分;ctrl:重組IFNα2a(Roferon®);LM:分子量標記Invitrogen)。
第4圖顯示編碼人類IFNα2a之核苷酸序列,其在密碼子使用方面,已針對在大腸桿菌中重組表現進行最適化。
<110> 瑞奇特漢姆生物科技股份有限公司
<120> 可溶性干擾素之重組表現技術
<130> P 85026
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 166
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
<210> 2
<211> 187
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
<210> 3
<211> 166
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
<210> 4
<211> 504
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
<210> 5
<211> 1353
<212> DNA
<213> 大腸桿菌
<400> 5
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引子
<400> 6
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引子
<400> 7
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引子
<400> 8
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引子
<400> 9
<210> 10
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引子
<400> 10
<210> 11
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引子
<400> 11
<210> 12
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引子
<400> 12
<210> 13
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引子
<400> 13
<210> 14
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引子
<400> 14
<210> 15
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> 引子
<400> 15
Claims (15)
- 一種用於重組表現哺乳動物干擾素蛋白之宿主細胞,該細胞包含(a)一功能性內源性trxB基因;以及(b)一去活性的內源性gor基因。
- 如申請專利範圍第1項之宿主細胞,其中該宿主細胞進一步包含一編碼外源性干擾素蛋白之多核苷酸序列。
- 如申請專利範圍第2項之宿主細胞,其中該多核苷酸序列包含於表現載體中。
- 如申請專利範圍第2或3項之宿主細胞,其中該干擾素係擇自於由下列所構成之群組:干擾素α、干擾素β以及干擾素γ,或其活性片段。
- 如申請專利範圍第4項之宿主細胞,其中該干擾素蛋白係人類干擾素蛋白或其生物活性片段。
- 如申請專利範圍第5項之宿主細胞,其中該干擾素蛋白係人類干擾素α2a或其生物活性片段。
- 如申請專利範圍第1-6項中任一項之宿主細胞,其中該宿主細胞係細菌性細胞。
- 如申請專利範圍第7項之宿主細胞,其中該細菌性細胞係大腸桿菌細胞。
- 如申請專利範圍第8項之宿主細胞,其中該大腸桿菌細胞係由大腸桿菌菌株BL21衍生而來。
- 如申請專利範圍第1-9項中任一項之宿主細胞,其中該細胞包含T7 RNA聚合酶基因。
- 如申請專利範圍第10項之宿主細胞,其中該T7 RNA聚 合酶基因被插入該宿主細胞之基因組中。
- 一種用於在宿主細胞中重組表現可溶性干擾素之方法,其包含:(a)提供如申請專利範圍第2-11項中任一項之宿主細胞;(b)在容許該干擾素蛋白表現之條件下培養該宿主細胞;(c)從該宿主細胞獲得該可溶性干擾素蛋白。
- 如申請專利範圍第12項之方法,其中步驟(c)包含瓦解該細胞。
- 如申請專利範圍第13項之方法,其中步驟(c)進一步包含用色層分析法純化該蛋白。
- 一種如申請專利範圍第1-11項中任一項之宿主細胞之用途,其用於重組表現可溶性干擾素。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP11016776 | 2011-05-26 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW201300533A true TW201300533A (zh) | 2013-01-01 |
Family
ID=48137367
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW101118746A TW201300533A (zh) | 2011-05-26 | 2012-05-25 | 可溶性干擾素之重組表現技術 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
TW (1) | TW201300533A (zh) |
-
2012
- 2012-05-25 TW TW101118746A patent/TW201300533A/zh unknown
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6817939B2 (ja) | ペプチド産生のための融合パートナー | |
US9493804B2 (en) | Agents and methods for the expression and secretion of peptides and proteins | |
WO2013065772A1 (ja) | タンパク質の分泌生産法 | |
KR100761486B1 (ko) | 파아지를 이용한 생리 활성 단백질 및 펩티드의 대량생산법 | |
JP2004041218A5 (zh) | ||
EP2714890B1 (en) | Recombinant expression of soluble interferon | |
JP2003199569A (ja) | ストレプトベルティシリウム・ラダカヌムのトランスグルタミナーゼ遺伝子及び該遺伝子によってコードされるトランスグルタミナーゼ | |
AU2001284914A1 (en) | Phage-dependent Superproduction of Biologically Active Protein and Peptides | |
JP2006006312A (ja) | 組換えタンパク質の産生の増進のための核酸コンストラクトおよび発現ベクターならびに組換えタンパク質の大量生産方法 | |
JP2018514231A (ja) | 増殖とタンパク質生成との分離 | |
CN111793118B (zh) | 一种CheY2突变型蛋白及其应用 | |
RU2230116C2 (ru) | ВЕКТОР ДЛЯ ЭКСПРЕСИИ И СЕКРЕЦИИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА(HIFNα), ШТАММ ESCHERICHIA COLI ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ И СЕКРЕЦИИ HIFNα(ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ HIFNα | |
TW201300533A (zh) | 可溶性干擾素之重組表現技術 | |
JP3529423B2 (ja) | 抗菌性ペプチドの製造方法 | |
Sato et al. | Expression of tuna growth hormone cDNA in Escherichia coli | |
CN113461790A (zh) | 一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件 | |
RU2790662C1 (ru) | АМИНОАЦИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗА, ЭФФЕКТИВНОЕ ВВЕДЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ЛИЗИНА | |
RU2662888C1 (ru) | Плазмида, обеспечивающая экспрессию щелочной сериновой протеиназы, содержащая ген, экспрессирующий щелочную сериновую протеиназу семейства S1 из Streptomyces avermitilis VKM Ac-1301, штамм E. coli M15 (pRep4, pQE30-A2.1) - продуцент данной протеиназы | |
CN118240735A (zh) | 一种能表达外源蛋白的菌株、重组人源胶原蛋白及合成方法与应用 | |
CN118272338A (zh) | 突变蛋白、核酸分子、融合标签及其应用 | |
GB2612021A (en) | Chimeric protein and expression system | |
JP2021040596A (ja) | 逆転写酵素 | |
JP2004135532A (ja) | ウニ由来インスレーターを用いた遺伝子発現ベクター | |
JPH0892292A (ja) | イヌインターフェロン−βの生物活性を有するタンパク質 | |
CA2487400A1 (en) | Methods of enhancing yields of soluble proteins |