CN111793118B

CN111793118B - 一种CheY2突变型蛋白及其应用

Info

Publication number: CN111793118B
Application number: CN202010624917.4A
Authority: CN
Inventors: 郭敏亮; 高大伟; 宗仁杰; 叶竞阳; 徐楠
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2020-07-01
Filing date: 2020-07-01
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2040-07-01
Also published as: CN111793118A

Abstract

本发明公开了一种CheY2突变型蛋白及其应用。具体地，所述CheY2突变型蛋白在野生型的趋化响应调节蛋白CheY2的第93位、96位、107位、109位、123位氨基酸中的至少1个氨基酸发生突变。相比野生型CheY2蛋白，本发明的CheY2蛋白突变体可显著提高农杆菌在游动平板上的游动能力，以及对毛细管中对单一物质乙酰丁香酮AS（但不限于AS）趋化能力，同时显著提高CheY2蛋白与鞭毛马达调节区FliM蛋白的结合能力。

Description

一种CheY2突变型蛋白及其应用

技术领域

本发明属于微生物应用领域，涉及一种农杆菌CheY2突变型蛋白及其应用。

背景技术

根癌农杆菌是一种革兰氏阴性菌，它能将自身Ti质粒上的一段DNA序列(也称为T-DNA)转移并整合到宿主植物基因组中，导致冠瘿瘤的产生，并遗传转化宿主。因此，人们将所需要的目的基因插入到经过改造后的T-DNA区域，借助根癌农杆菌的侵染来实现外源基因向植物细胞的转移与整合，以此获得转基因植株。目前，根癌农杆菌已经成为植物转基因的重要工具菌。通过根癌农杆菌介导的遗传转化技术，使许多重要的农业和园艺作物转化成功，为在遗传性状、作物产量和抗逆性等方面进行遗传改良提供了很好的基础。

根癌农杆菌对植物受伤组织释放化学物质的趋化响应是其侵染宿主细胞的第一个步骤。大量的文献表明趋化性在各种动物病原菌和植物病原菌的侵染宿主的毒力过程中具有重要的作用。并且根癌农杆菌的趋化能力应用前景十分广阔，其拥有20个趋化响应受体蛋白(MCPs)，文献报道农杆菌对重金属离子具有出色的趋化和利用能力，便于其在未来的环境污染治理方面得到应用。与此前报道的细菌或古细菌的趋化系统不同，根癌农杆菌只有一个趋化操纵子，其中有两个同源的趋化响应调节蛋白CheY，CheY1和CheY2。其中CheY2对农杆菌趋化性的调节起着决定性的作用。

但是天然的农杆菌对趋化吸引物(如AS，但不限于AS)的趋化响应调节能力不够显著，相关趋化性实验重复性较差，这对于实验室进行细菌趋化性验证等相关科研活动中产生较大影响。因此，本领域迫切需要发明一种具有强响应调节作用的CheY蛋白，产成一种改造菌，能够具有较强的趋化能力，满足目前的科研及未来生产应用的需要。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种CheY2突变型蛋白，该含有改造后的趋化响应调节蛋白的宿主菌对趋化吸引物的趋化能力更强，从而使工程菌的趋化强度满足人们在科研和生产过程中的需要。

本发明还要解决的技术问题是提供了核酸或基因，所述的核酸或基因编码所述的突变型蛋白。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种载体，所述载体包含所述的核酸或基因。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种宿主细胞或重组菌。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种产生所述的CheY2突变型蛋白的方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供了CheY2突变型蛋白的用途。

技术方案：本发明提供了一种CheY2突变型蛋白，所述的突变蛋白为非天然蛋白，所述CheY2突变型蛋白在野生型的趋化响应调节蛋白CheY2的第96位、第107位、第109位或第123位氨基酸中的至少1个氨基酸发生突变。

在另一优选例中，与野生型的趋化响应调节蛋白(CheY2)相比，所述趋化响应调节蛋白(CheY2)突变蛋白的调节能力提高了10％，较佳地，提高了25％，更佳地，提高了50％，最佳地，提高了100％。

在另一优选例中，所述氨基酸可各自独立地突变为极性氨基酸。

在另一优选例中，所述氨基酸各自独立突变的类型可以相同，可以不同。

在另一优选例中，所述组氨酸可各自独立地突变为选自下组的一种或多种氨基酸：丙氨酸(A)、赖氨酸(K)、色氨酸(W)、缬氨酸(V)、精氨酸(R)或其组合。

在另一优选例中，所述突变蛋白来源于Agrobacterium tumefaciens。

在另一优选例中，所述趋化响应调节蛋白(CheY2)为农杆菌中CheY2蛋白。

在另一优选例中，所述突变蛋白在野生型的趋化响应调节蛋白(CheY2)的对应于SEQ ID NO：1的选自下组的一个或多个核心氨基酸发生突变：第93位氨基酸由R突变为A；第96位氨基酸由V突变为K；第107位氨基酸由V突变为W；第109位氨基酸由A突变为V；第123位氨基酸由A突变为R。

在另一优选例中，所述第93位氨基酸(R)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)或其组合。

在另一优选例中，所述第96位氨基酸(V)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：组氨酸(H)或其组合。在另一优选例中，第107位氨基酸(V)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：色氨酸(K)、酪氨酸(Y)、丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(D)、谷氨酰胺(Q)、苏氨酸(T)或其组合。

在另一优选例中，第109位氨基酸(A)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：缬氨酸(K)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)或其组合。

在另一优选例中，第123位氨基酸(A)突变为选自下组的一种或多种氨基酸：赖氨酸(K)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)或其组合。在另一优选例中，所述CheY2突变型蛋白的氨基酸序列选自下组：

(1)氨基酸序列如SEQ ID NO：2-6任一所示的多肽；

(2)将SEQ ID NO：2-6任一所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(1)所述多肽功能的由SEQ ID NO：2-6所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。

在另一优选例中，所述突变蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：2-6所示的氨基酸序列具有70％以上的序列相同性，优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％以上的序列相同性。

在另一优选例中，所述的突变蛋白除所述突变(如93、96、107、109和/或123位)外，其余的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所示的序列相同或基本相同。

本发明内容还包括核酸或基因，所述的核酸或基因编码所述的突变蛋白，所述核酸或基因选自下组：

(a)核酸或基因序列如SEQ ID NO：7-11任一所示的核酸或基因；

(b)核酸或基因序列与野生型CheY2蛋白的核苷酸序列所示序列的同源性≥95％，且如SEQ ID NO：7-11任一所示的核酸或基因；

(c)与(a)～(b)任一所述的核酸或基因互补的核酸或基因。

在另一优选例中，所述的核酸或基因在所述突变蛋白的ORF的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6His)、或其组合。

在另一优选例中，所述的核酸或基因选自下组：DNA序列、RNA序列或其组合。

本发明内容还包括一种载体，所述载体包含所述的核酸或基因。

在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。

在另一优选例中，所述载体包括质粒、病毒载体。

在另一优选例中，所述的病毒载体选自下组：腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、SV40、痘病毒或其组合。

在另一优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。

本发明内容还包括一种宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的核酸或基因或所述的载体。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌、农杆菌。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞，如酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞(包括人和非人哺乳动物)。

在另一优选例中，所述酵母细胞选自下组的一种或多种来源的酵母：毕氏酵母、克鲁维酵母、或其组合；较佳地，所述的酵母细胞包括：克鲁维酵母，更佳地为马克斯克鲁维酵母、和/或乳酸克鲁维酵母。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：大肠杆菌、农杆菌、麦胚细胞，昆虫细胞，SF9、Hela、HEK293、CHO、酵母细胞或其组合。

本发明内容还包括一种重组菌，所述重组菌包含所述的核酸或基因或所述的载体。

本发明内容还包括一种产生所述的CheY突变型蛋白的方法，包括以下步骤：在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞，从而表达CheY突变型蛋白；和/或分离所述CheY突变型蛋白。

本发明内容还包括所述的CheY突变型蛋白的用途，所述的突变型蛋白用于提高农杆菌对单一物质或混合物的趋化能力、和/或趋化效率；和/或提高突变蛋白与鞭毛马达调节区FliM蛋白的结合能力。

本发明内容还包括所述的突变蛋白用于制备提高宿主细胞的趋化能力的工程菌细胞，和/或提高突变蛋白与鞭毛马达调节区FliM蛋白的结合能力的酶制剂。

本发明所使用的术语：

如本文使用的，术语“受试者”、“需要的对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类、牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊、长颈鹿、鹿、骆驼、玲羊、野兔和家兔。

CheY家族蛋白

趋化响应调节家族蛋白，广泛存在于植物病原菌、动物病原菌及人感染的病原菌微生物细胞之中，作为生物体内趋化响应过程中的关键响应蛋白和马达调节蛋白，它在其他生理过程中起着重要作用。例如，在Borrelia burgdorferi中，CheY2蛋白在螺旋体的感染生命周期中至关重要。

野生型CheY2蛋白

如本文所用，“野生型CheY2蛋白”是指天然存在的、未经过人工改造的CheY2蛋白，其核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。所述野生型CheY2蛋白的来源为Agrobacteriumtumefaciens C58野生型细胞株。

CheY2蛋白的突变体及其编码核酸

如本文所用，术语“突变蛋白”、“本发明突变蛋白”、“本发明Che2Y突变蛋白”、“本发明突变的Che2Y蛋白”、“CheY2突变体”、“CheY2蛋白的突变体”均可互换使用，均指非天然存在的突变的CheY2蛋白，并且所述突变蛋白在野生型的趋化响应调节蛋白(CheY2)的第93/96/107/109/123位氨基酸中的至少1个氨基酸发生突变。

在本发明中，所述氨基酸可各自独立地突变为极或非极性性氨基酸，并且所述组氨酸各自独立突变的类型可以相同，可以不同。

在一优选实施方式中，所述组氨酸突变为选自下组的一种或多种氨基酸：丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、精氨酸(R)、色氨酸(W)、赖氨酸(K)或其组合。

在一优选实施方式中，本发明的所述突变的CheY2蛋白为对SEQ ID NO：1所示蛋白进行人工改造的蛋白。

其中，所述的突变蛋白含有与活性相关的核心氨基酸，且所述核心氨基酸中至少有一个是经过人工改造的；并且本发明突变蛋白具有显著提高宿主细胞趋化能力。

术语“核心氨基酸”指的是基于SEQ ID NO：1且与SEQ ID NO：1同源性达至少80％，如84％、85％、90％、92％、95％、98％的序列中，相应位点是本文所述的特定氨基酸，如基于SEQ ID NO：1所示的序列，核心氨基酸为：第93位氨基酸(R)；第96位氨基酸(V)；第107位氨基酸(V)；第109位氨基酸(A)；第123位氨基酸(A)。

且对上述核心氨基酸进行突变所得到的突变蛋白具有显著提高宿主细胞的趋化能力。

应理解，本发明突变的CheY2蛋白中的氨基酸编号基于野生型CheY2蛋白(优选地，SEQ ID NO：1)作出。当某一具体突变蛋白与SEQ ID NO：1所示序列的同源性达到80％或以上时，突变蛋白的氨基酸编号可能会有相对于SEQ ID NO：1的氨基酸编号的错位，如向氨基酸的N末端或C末端错位1-5位，而采用本领域常规的序列比对技术，本领域技术人员通常可以理解这样的错位是在合理范围内的，且不应当由于氨基酸编号的错位而使同源性达80％(如90％、95％、98％)的、具有相同或相似活性的突变蛋白不在本发明突变蛋白的范围内。

本发明突变蛋白是合成蛋白或重组蛋白，即可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的突变蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的突变蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括所述突变蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述突变蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白。

本发明的突变蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的突变蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的突变蛋白，或(iii)成熟突变蛋白与另一个化合物(比如延长突变蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的突变蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此突变蛋白序列而形成的突变蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此突变蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，优选地，所述的突变型蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID NO：2～6任一所示的氨基酸序列。

应理解，本发明突变蛋白与SEQ ID NO：2～6任一所示的序列相比，通常具有较高的同源性(相同性)，优选地，所述的突变蛋白与SEQ ID NO：2～6任一所示序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％-90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％。

此外，还可以对本发明突变蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的突变蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在突变蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的突变蛋白。这种修饰可以通过将突变蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的突变蛋白。

术语“编码突变蛋白的核酸或基因或多核苷酸”可以是包括编码本发明突变蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的核酸或基因或多核苷酸。

本发明的核酸或基因或多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。在另一优选例中，所述核苷酸为DNA。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQ ID NO：2-6任一所示的多肽的序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2-6任一所示的多肽，但相应编码区序列有差别的核酸序列。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或突变蛋白的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的突变蛋白的功能。

核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。核酸序列可以是基因组的、重组的或合成的。核酸序列可以是分离的或纯化的。核酸序列可以是单链或双链的。优选地，核酸序列将编码如本文描述的光敏蛋白。核酸序列可以通过克隆衍生，例如使用包括限制性酶切、连接、凝胶电泳的标准的分子克隆技术，例如在Sambrook等Molecular Cloning：Alaboratorymanual，Cold Spring Harbour Laboratory Press)中描述的。核酸序列可是分离的，例如使用PCR技术分离的。分离意指从任何杂质和从被自然地发现与其来源中的核酸序列缔合的其他核酸序列和/或蛋白中分离核酸序列。优选地，其还将不含细胞材料、培养基或来自纯化/生产过程的其他化学物质。核酸序列可以是合成的，例如通过直接的化学合成产生。核酸序列可以作为裸露的核酸被提供，或可与蛋白或脂质复合提供。

本发明的突变蛋白和核酸或基因或多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。

本发明核酸或基因或多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

在本发明中，所述CheY2蛋白突变体的DNA编码序列为SEQ ID NO：7-11任一所示的核苷酸序列。

表达载体和宿主细胞：

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明突变蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的突变蛋白。一般来说有以下步骤：

(1)、用本发明的编码本发明突变蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)、在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)、从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，编码突变蛋白的核酸或基因或多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明突变蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞(如大肠杆菌、农杆菌)，或是低等真核细胞，或是高等真核细胞，如酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞(包括人和非人哺乳动物)。代表性例子有：农杆菌、大肠杆菌、麦胚细胞，昆虫细胞，SF9、Hela、HEK293、CHO、酵母细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择农杆菌细胞。

本发明的核酸或基因或多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明还提供了一种设计和方法，即通过对基因组中CheY2蛋白序列比对分析后，进行点突变，提高宿主细胞的趋化响应能力。包括以下步骤：

(1)A.tumefaciens CheY2家族蛋白序列分析，方法如下：

A、A.tumefaciens CheY2与E.coli中CheY蛋白进行序列比对；

B、以E.coli中CheY蛋白影响趋化能力的重要氨基酸位点作为参考，通过序列比对，找出在A.tumefaciens中相对应的氨基酸位点，分别为第93/96/107/100/109/123位氨基酸，并进行定点突变。

C、对该位点进行可改造性分析，如是否影响CheY2的活性，并最终选定替代氨基酸，如CheY2的定点突变选自下组：R93A、V96K、A100R、V107W、A109V、A123R，或其组合。

(2)含cheY1基因上下游同源臂的重组自杀载体和含cheY2基因上下游同源臂的重组自杀载体的构建，构建方法如下：

从基因数据库中下载农杆菌C58 cheY1基因核苷酸序列SEQ ID NO：17，用引物SEQID NO：18-19扩增cheY1基因上游序列550bp，用引物SEQ ID NO：20-21扩增cheY1基因下游序列550bp，连接自杀载体pEX18km；下载农杆菌C58cheY2基因核苷酸序列SEQ ID NO：12，用引物SEQ ID NO：13-14扩增cheY2基因上游序列550bp，用引物SEQ ID NO：15-16扩增cheY2基因下游序列550bp，连接自杀载体pEX18km；

(3)构建敲除特定基因的供体DNA，方法如下：

A、将携带cheY1基因上下游各约550bp的自杀载体，电转至农杆菌C58菌株中；

B、经过体内两次筛选，获得不带kan抗性和蔗糖敏感性的菌株；

C、使用引物SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：21经过菌落PCR扩增上下游同源臂序列鉴定，获得正确序列大小(约1100bp)的C58ΔcheY1基因突变体。

D、将携带cheY2基因上下游各约550bp的自杀载体，电转至农杆菌C58ΔcheY1菌株中；

E、经过体内两次筛选，获得不带kan抗性和蔗糖敏感性的菌株；

F、使用引物SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：16经过菌落PCR扩增上下游同源臂序列鉴定，获得正确序列大小(约1100bp)的C58ΔY1Y2基因突变体。

(4)构建CheY2突变蛋白R93A，V96K，A100R，V107W，A109V，A123R回补载体DNA，方法如下：

A、对特定基因核苷酸位点处，分别使用6对背向的引物(SEQ ID NO：24-35)，扩增出从突变氨基酸位点开始的整个线性回补质粒pUCA19；

B、使用试剂盒，将携带有突变位点的回补质粒pUCA19首尾连接，形成环状重组质粒DNA；

(5)获得点突变特定基因的细胞株，方法如下：

A、将回补质粒DNA电转化到农杆菌C58ΔY1Y2感受态细胞中；

B、筛选出羧苄抗性单克隆细胞进行扩大培养，用引物(SEQ ID NO：22-23)对CheY2基因进行扩增，扩增的PCR产物经测序验证；

(6)携带有CheY2点突变的细胞株的趋化能力鉴定，方法如下：

将各待测菌株于AB-sucrose液体培养基中震荡培养至对数生长中期后，用AB-sucrose液体培养基将菌液OD600nm值调整为0.5。取3μL菌液接种于预先浇好的游动平板表面，每块平板重复五次。接种完成后，将平板置于收纳盒中，同时在收纳盒中放置饱和硫酸钾溶液，以保证湿度。28℃静置培养36-48h后，观察测量菌圈的半径或直径，并进行数据统计分析。(注：游动平板由AB-sucrose液体培养基和终浓度为0.2％Agar配制而成)。

有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：

(1)本发明通过对农杆菌细胞基因组中CheY家族蛋白和大肠杆菌CheY进行序列比对分析，首次提供了一系列农杆菌中CheY家族蛋白中可能影响趋化响应调节能力的氨基酸位点。

(2)本发明对CheY2进行基因敲除并对CheY2中一系列可能影响趋化响应调节能力的氨基酸位点进行定点突变，首次得到了多株可显著提高宿主细胞趋化能力的菌株。

(3)本发明以农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)为实施例，但同样的设计和分析、实验方法也适用于其他原核细胞，真核细胞，酵母，人源细胞，Hela，CHO，HEK293，Saccharomyces cerevisiae等细胞。

(4)本发明首次发现，对CheY2蛋白的核心氨基酸进行突变，会显著提高宿主细胞的趋化响应能力。

附图说明

图1是根癌农杆菌、大肠杆菌与根瘤菌CheY2的序列同源性对比。

图2是pUCA19-CheY2质粒图谱。该质粒带有lac启动子和rep A农杆菌复制子，并带有Amp筛选标记；

图3是pUCA19-CheY2-R93A质粒图谱。

图4是质粒骨架线性片段R93A，V96K，A100R，V107W，A109V，A123R琼脂糖凝胶电泳图。

图5是C58ΔcheY1突变株的PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图。泳道1、3、9、10代表筛选正确的cheY基因缺失突变株，其余泳道鉴定为野生型。

图6是C58ΔY1Y2突变株的PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图。泳道2、4、6、7、9、11、12、13、22、23代表筛选正确的cheY1cheY2基因双缺失突变株，其余泳道鉴定为野生型。

图7是经由半固体游动平板法分析蛋白突变体在趋化系统中的综合调节能力。如图所示，CheY2的基因敲除和不同位置的氨基酸突变可显著降低和提高宿主细胞的趋化响应能力；平板菌圈从左到右，从上到下，分别为A123R、ΔY1Y2、R93A、A109V、WTY2、V107W、A100R、V96K。

图8是经由半固体游动平板法分析蛋白突变体在趋化系统中的对植物叶片组织分泌物的调节能力；如图所示，CheY2的基因敲除和不同位置的氨基酸突变可显著降低和提高宿主细胞的趋化响应能力；菌株为ΔY1Y2、R93A、A109V、WTY2、A100R。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Har bor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。除非有特别说明，否则本发明实施例中的试剂和材料均为市售产品。

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地获得一种农杆菌CheY2蛋白突变体。相比野生型CheY2蛋白，本发明的CheY2蛋白的突变体可显著提高宿主细胞的趋化响应能力。在此基础上，本发明人完成了本发明。

本发明以农杆菌(Agrobacterium tumefaciens C58)为实施例，但同样的设计和分析、实验方法也适用于其他原核细胞，真核细胞，酵母，人源细胞，Hela、CHO、HEK293、Saccharomyces cerevisiae等细胞。

实施例1 A.tumefaciens中CheY家族基因的分析

在A.tumefaciens的基因组中，有两个同源的cheY基因，cheY1(atu0516)和cheY2(atu0520)。它们位于A.tumefaciens的一个趋化操纵子上。与大肠埃希菌CheY进行序列比对发现，CheY1序列与大肠杆菌的CheY同源性为31.78％，CheY2序列与大肠杆菌CheY序列同源性为32.31％。将根癌农杆菌中的CheY、大肠杆菌中的CheY和根瘤菌中的CheY2进行了比较发现，两个CheY2蛋白在马达结合表面(α4-β5-α5结构域)保持高度的一致性或相似性。而大肠杆菌CheY的马达结合表面被认为是趋化信号转导的重要位点。这预示着在农杆菌中，这些相同的位点同样在趋化信号转导中也可能起着重要作用。大肠杆菌中CheY α4-β5-α5面几个关键的残基已被鉴定出，包括Ala90、Lys92、ILe95、Ala99、Tyr106、Val108、Lys119、Lys122。序列比对发现，农杆菌中CheY1和CheY2在这些重要的位点处的氨基酸具有较大的差异。这预示着有可能这些位点的不同，导致了两个CheY在趋化过程中扮演了不同的角色。通过改造这些位点，极有可能筛选出更高活性的趋化响应调节蛋白的突变体。

实施例2 C58ΔcheY1菌株和C58ΔY1Y2菌株的获得

2.1含目的基因上下游同源臂的重组自杀载体的构建

从基因数据库中下载农杆菌C58 cheY1基因核苷酸序列SEQ ID NO：17，用引物SEQID NO：18-19扩增cheY1基因上游序列550bp，用引物SEQ ID NO：20-21扩增cheYl基因下游序列550bp，连接自杀载体pEX18km；下载农杆菌C58 cheY2基因核苷酸序列SEQ ID NO：12，用引物SEQ ID NO：13-14扩增cheY2基因上游序列550bp，用引物SEQ ID NO：15-16扩增cheY2基因下游序列550bp，连接自杀载体pEX18km；2.2目的基因缺失突变体的筛选

A、将携带cheY1基因上下游各约550bp的自杀载体，电转至农杆菌C58菌株中，经卡那霉素筛选后，得到第一次重组后质粒整合到基因组中的阳性克隆，然后再用该阳性克隆划至含有蔗糖的平板上进行第一次筛选，选择不含蔗糖抗性的菌落，稀释到无菌水中后，涂布浓度5％蔗糖平板进行第二次蔗糖筛选，此时质粒上与根癌农杆菌基因组上同源的部分会发生第二次重组，在浓度5％蔗糖平板上获得不带kan抗性和蔗糖敏感性的菌株；

B、使用引物SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：21经过菌落PCR扩增上下游同源臂序列鉴定，获得正确序列大小(约1100bp)的C58ΔcheY1基因突变体(图5)。

C、将携带cheY2基因上下游各约550bp的自杀载体，电转至农杆菌C58ΔcheY1菌株中；经过和A步骤里一样的体内两次筛选，获得不带kan抗性和蔗糖敏感性的菌株；

D、使用引物SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：16经过菌落PCR扩增上下游同源臂序列鉴定，获得正确序列大小(约1100bp)的C58AY1Y2基因突变体(图6)。

实施例3目的基因回补质粒DNA的构建及WTY2菌株的获得

3.1、目的基因的克隆

使用引物cheY2-PF(SEQ ID NO：22)和cheY2-PR(SEQ ID NO：23)，以根癌农杆菌的基因组为模板，扩增出cheY2基因序列。通过双酶切，将环状DNApUCA19质粒酶切成线性质粒。使用同源重组酶试剂盒，将二者连成一个重组质粒。具体如下；

将扩增产物cheY2 6μL，线性双酶切质粒DNA pUCA19 2μL，再加入2μL 5XLigation-Free Cloning MasterMix(试剂盒名为Ligation-Free Cloning System)，混匀后冰浴0.5h。冰浴结束后，将10μL反应液全部加入100μL感受态细胞(来源于擎科生物科技有限公司)中，冰上放置0.5h，42℃热激90s后，加入1 mLLB液体培养基37℃恒温振荡培养1h，涂布于Amp抗性LB固体培养，37℃倒置培养至单克隆长出。挑取6个单克隆在LB液体培养基中振荡培养，PCR检测阳性并测序确认后，提取质粒保存，命名为pUCA19-cheY2。

3.2根癌农杆菌感受态电转化

从-80℃冰箱取出提前制备好的根癌农杆菌感受态(本实例使用的是实施例2获得的C58ΔY1Y2基因突变菌株)，冰上融化，加入2μL pUCA19-cheY2质粒，混匀后全部转入电击杯中，冰浴5min；将电击杯放入电转仪中进行电击(参数为2.4kV，200Ω，25μF)；电击结束后立即加入1000μL LB，28℃，130rpm摇床孵育2h；取100μL涂布于MG/L(含羧苄抗性)平板，28℃培养2天至单菌落出现。

3.3阳性鉴定

在细胞转化后的平板上挑取12-24个单克隆，以细胞为模板，用鉴定引物cheY2-PF(SEQ ID NO：22)和cheY2-PR(SEQ ID NO：23)对样品进行PCR检测。PCR结果阳性并经测序鉴定的细胞株，确定为阳性细胞株并分别命名为WTY2。

实施例4定点突变CheY2 R93，V96，A100，V107，A109，A123位点

4.1供体DNA质粒构建及扩增

为了便于线性供体DNA的保存及扩增，本实施例将供体点突变DNA CheY2-R93A，CheY2-V96K，CheY2-A100R，CheY2-V107W，CheY2-A109V，CheY2-A123R分别插入到pUCA19-cheY2质粒中，并通过PCR扩增得到线性供体DNA序列。以pUCA19-cheY2质粒为模板，以6对背向引物SEQ ID NO：24-25、26-27、28-29、30-31、32-33、34-35分别进行PCR扩增，将整个环状质粒扩增出来，获得质粒骨架线性片段pUCA19-cheY2-R93A，pUCA19-cheY2-V96K，pUCA19-cheY2-A100R，pUCA19-cheY2-V107W，pUCA19-cheY2-A109V和pUCA19-cheY2-A123R。操作步骤如下：

4.1.1 PCR反应

(1)设计合成变异导入的引物和对应的PCR用的引物并委托生物公司合成。设计的点突变引物序列详见序列SEQ ID NO：24-35。

(2)配制全量50μL的PCR反应液，并且使用PCR仪完成PCR反应。PCR反应体系以及设置的程序详见下表：

(3)对步骤(2)中获得的PCR反应液进行1％浓度的琼脂糖凝胶电泳(见图4)。

(4)对目的DNA片段进行胶回收。

4.1.2 Blunting Kination反应

(1)在微量离心管中按照下表配制反应液。

(2)将反应液放入37℃恒温水浴锅中，反应时间为10分钟。

(3)将步骤(2)中得到的反应液放入70℃恒温水浴锅中，反应时间为10分钟。

4.1.3 Ligation反应

(1)向新的微量离心管中加入5μL的Bluming Kination反应中得到的溶液。

(2)加入5μL的Ligation Solution I到步骤(1)得到的溶液中，并使其均匀混合。

(3)反应体系放在16℃的温度下反应1小时得到pUCA19-cheY2-R93A，

pUCA19-cheY2-V96K，pUCA19-cheY2-A100R，pUCA19-cheY2-V107W，

pUCA19-cheY2-A109V和pUCA19-cheY2-A123R质粒。

4.2根癌农杆菌感受态电转化

从-80℃冰箱取出提前制备好的根癌农杆菌感受态(本实例使用的是实施例2获得的C58ΔY1Y2基因突变菌株)，冰上融化，加入2μL pUCA19-cheY2-R93A或pUCA 19-cheY2-V96K或pUCA 19-cheY2-A 100R或pUCA 19-cheY2-V 107W或pUCA19-cheY2-A109V或pUCA19-cheY2-A123R质粒，混匀后全部转入电击杯中，冰浴5min；将电击杯放入电转仪中进行电击(参数为2.4kV，200Ω，25μF)；电击结束后立即加入1000μL LB，28℃，130rpm摇床孵育2h；取100μL涂布于MG/L(含羧苄抗性)平板，28℃培养2天至单菌落出现。

4.3阳性鉴定

在细胞转化后的平板上挑取12-24个单克隆，以细胞为模板，用鉴定引物cheY2-PF(SEQ ID NO：22)和cheY2-PR(SEQ ID NO：23)对样品进行PCR检测。PCR结果阳性并经测序鉴定的细胞株，确定为阳性细胞株并分别命名为R93A，V96K，A100R，V107W，A109V，A123R。

实施例5 CheY2突变株对营养物质趋化能力的分析

5.1 AB-sucrose buffer的配制

20×AB Buffer(1L)：K₂HPO4·3H₂O78.6g，NaH₂PO₄·2H₂O29.9g，PH 7.0

20×AB Salts(1L)：NH₄C1 20g，MgSO₄·7H₂O 6g，KCl 3g，CaCl₂0.2g，FeSO₄·7H₂O0.05g

AB-sucrose液体培养基(1L)：20×AB Buffer 50ml，20×AB Salts 50ml，sucrose5g。

5.2游动平板法检测突变体趋化能力

将各待测菌株(R93A、V96K、A100R、V107W、A109V、A123R、WTY2、ΔY1Y2)于AB-sucrose液体培养基中震荡培养至对数生长中期后，用AB-sucrose液体培养基将菌液OD600nm值调整为0.5。取3μL菌液接种于预先浇好的游动平板表面，每块平板重复五次。接种完成后，将平板置于收纳盒中，同时在收纳盒中放置饱和硫酸钾溶液，以保证湿度。28℃静置培养36-48h后，观察测量菌圈的半径或直径，并进行数据统计分析。(注：游动平板由AB-sucrose液体培养基和终浓度为0.2％Agar配置而成)。

从图7结果表明：与野生型细胞株相比，本发明的改造细胞株R93A、V96K、V107W、A109V、A123R的趋化能力均有明显的提高，其中R93A、A109V对营养物质的趋化能力提高最大，提高了约100％。

实施例6 CheY2突变株植物叶片组织分泌物趋化能力的分析

在游动平板表面的中心位置，放置新鲜的高凉菜属植物落地生根(Kalanchoepinnata)的叶圆片。叶圆片直径为5mm。叶圆片可用1mL枪头在落地生根叶片上打孔获得。叶片打孔前，需用70％酒精擦拭表面消毒。待酒精挥发后，即可打孔。在距离叶圆片中心2.5em处，接种等细胞量的各待测菌株(R93A、A100R、A109V、WTY2、AY1Y2)。接种完成后，将平板置于收纳盒中，同时在收纳盒中放置饱和硫酸钾溶液，以保证湿度。28℃静置培养36-48h后，采用相对迁移距离(接种点到叶片方向的菌圈边缘的距离-接种点到平皿方向的菌圈边缘的距离)来判断各突变体对落地生根叶片释放化学物质的趋化响应的强弱。每个菌株设置四个重复，并进行数据统计和方差分析。

图8结果表明：与野生型细胞株相比，本发明的改造细胞株R93A和A109V对植物叶片组织分泌物的趋化能力也有显著性地提升约100％和50％。

以上所有结果说明，本发明对农杆菌CheY2蛋白进行的定点突变可以有效地提升其趋化能力，特别是突变体R93A和A109V有着最为明显和高效地提升。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种CheY2突变型蛋白及其应用

<160> 35

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 129

<212> PRT

<213> 根癌农杆菌CheY2(Agrobacterium tumefaciens)

<400> 1

Met Ser Leu Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ile Val Asp Asp Gln Val

1 5 10 15

Thr Ser Arg Leu Leu Leu Ser Asp Ala Leu Thr Gln Leu Gly Phe Lys

20 25 30

Gln Ile Thr Ser Ala Gly Asp Gly Glu Gln Gly Leu Lys Ile Met Glu

35 40 45

Gln Gln Pro His His Leu Val Ile Ser Asp Phe Asn Met Pro Lys Met

50 55 60

Asp Gly Leu Gly Phe Leu His Ala Val Arg Ala Asn Pro Thr Thr Lys

65 70 75 80

Lys Ala Ala Phe Ile Ile Leu Thr Ala Gln Gly Asp Arg Ala Leu Val

85 90 95

Gln Lys Ala Ala Gln Leu Gly Ala Asn Asn Val Leu Ala Lys Pro Phe

100 105 110

Thr Ile Asp Lys Met Arg Ala Ala Ile Glu Ala Val Phe Gly Ser Leu

115 120 125

Lys

<210> 2

<211> 129

<212> PRT

<213> 根癌农杆菌CheY2突变型蛋白(Agrobacterium tumefaciens)

<400> 2

Met Ser Leu Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ile Val Asp Asp Gln Val

1 5 10 15

Thr Ser Arg Leu Leu Leu Ser Asp Ala Leu Thr Gln Leu Gly Phe Lys

20 25 30

Gln Ile Thr Ser Ala Gly Asp Gly Glu Gln Gly Leu Lys Ile Met Glu

35 40 45

Gln Gln Pro His His Leu Val Ile Ser Asp Phe Asn Met Pro Lys Met

50 55 60

Asp Gly Leu Gly Phe Leu His Ala Val Arg Ala Asn Pro Thr Thr Lys

65 70 75 80

Lys Ala Ala Phe Ile Ile Leu Thr Ala Gln Gly Asp Ala Ala Leu Val

85 90 95

Gln Lys Ala Ala Gln Leu Gly Ala Asn Asn Val Leu Ala Lys Pro Phe

100 105 110

Thr Ile Asp Lys Met Arg Ala Ala Ile Glu Ala Val Phe Gly Ser Leu

115 120 125

Lys

<210> 3

<211> 129

<212> PRT

<213> 根癌农杆菌CheY2突变型蛋白(Agrobacterium tumefaciens)

<400> 3

Met Ser Leu Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ile Val Asp Asp Gln Val

1 5 10 15

Thr Ser Arg Leu Leu Leu Ser Asp Ala Leu Thr Gln Leu Gly Phe Lys

20 25 30

Gln Ile Thr Ser Ala Gly Asp Gly Glu Gln Gly Leu Lys Ile Met Glu

35 40 45

Gln Gln Pro His His Leu Val Ile Ser Asp Phe Asn Met Pro Lys Met

50 55 60

Asp Gly Leu Gly Phe Leu His Ala Val Arg Ala Asn Pro Thr Thr Lys

65 70 75 80

Lys Ala Ala Phe Ile Ile Leu Thr Ala Gln Gly Asp Arg Ala Leu Lys

85 90 95

Gln Lys Ala Ala Gln Leu Gly Ala Asn Asn Val Leu Ala Lys Pro Phe

100 105 110

Thr Ile Asp Lys Met Arg Ala Ala Ile Glu Ala Val Phe Gly Ser Leu

115 120 125

Lys

<210> 4

<211> 129

<212> PRT

<213> 根癌农杆菌CheY2突变型蛋白(Agrobacterium tumefaciens)

<400> 4

Met Ser Leu Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ile Val Asp Asp Gln Val

1 5 10 15

Thr Ser Arg Leu Leu Leu Ser Asp Ala Leu Thr Gln Leu Gly Phe Lys

20 25 30

Gln Ile Thr Ser Ala Gly Asp Gly Glu Gln Gly Leu Lys Ile Met Glu

35 40 45

Gln Gln Pro His His Leu Val Ile Ser Asp Phe Asn Met Pro Lys Met

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Lys Ala Ala Phe Ile Ile Leu Thr Ala Gln Gly Asp Arg Ala Leu Val

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Lys

<210> 5

<211> 129

<212> PRT

<213> 根癌农杆菌CheY2突变型蛋白(Agrobacterium tumefaciens)

<400> 5

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1 5 10 15

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Gln Gln Pro His His Leu Val Ile Ser Asp Phe Asn Met Pro Lys Met

50 55 60

Asp Gly Leu Gly Phe Leu His Ala Val Arg Ala Asn Pro Thr Thr Lys

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Gln Lys Ala Ala Gln Leu Gly Ala Asn Asn Val Leu Val Lys Pro Phe

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Thr Ile Asp Lys Met Arg Ala Ala Ile Glu Ala Val Phe Gly Ser Leu

115 120 125

Lys

<210> 6

<211> 129

<212> PRT

<213> 根癌农杆菌CheY2突变型蛋白(Agrobacterium tumefaciens)

<400> 6

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Lys

<210> 7

<211> 390

<212> DNA

<213> 根癌农杆菌CheY2突变型基因(Agrobacterium tumefaciens)

<400> 7

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ctcctcagcg atgcgctgac acagctgggc ttcaagcaga tcacctccgc tggcgacggc 120

gagcagggat tgaagatcat ggagcagcag ccccatcatc tcgtcatctc cgacttcaac 180

atgccgaaga tggacggcct cggtttcctg cacgcggtgc gggccaaccc gaccaccaag 240

aaggccgcct tcatcattct caccgcgcag ggtgacgccg cgctggtgca gaaggcagcc 300

cagctcggcg ccaacaacgt gctggccaag cccttcacca tcgacaagat gcgcgcggcc 360

atcgaagcgg ttttcggatc gctgaaatga 390

<210> 8

<211> 390

<212> DNA

<213> 根癌农杆菌CheY2突变型基因(Agrobacterium tumefaciens)

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<212> DNA

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<400> 9

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<212> DNA

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<400> 10

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<211> 390

<212> DNA

<213> 根癌农杆菌CheY2突变型基因(Agrobacterium tumefaciens)

<400> 11

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<210> 12

<211> 390

<212> DNA

<213> 根癌农杆菌CheY2基因(Agrobacterium tumefaciens)

<400> 12

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ctcctcagcg atgcgctgac acagctgggc ttcaagcaga tcacctccgc tggcgacggc 120

gagcagggat tgaagatcat ggagcagcag ccccatcatc tcgtcatctc cgacttcaac 180

atgccgaaga tggacggcct cggtttcctg cacgcggtgc gggccaaccc gaccaccaag 240

aaggccgcct tcatcattct caccgcgcag ggtgaccgcg cgctggtgca gaaggcagcc 300

cagctcggcg ccaacaacgt gctggccaag cccttcacca tcgacaagat gcgcgcggcc 360

atcgaagcgg ttttcggatc gctgaaatga 390

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gactctagag gatccggcgg gtcgtaaggt cgtc 34

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gccgcagctt ccatcattta gtcagcacct tctttgcg 38

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gaaggtgctg actaaatgat ggaagctgcg gcc 33

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgctgccaac tcgagcggag tggtggcggt gtg 33

<210> 17

<211> 366

<212> DNA

<213> 根癌农杆菌CheY1基因(Agrobacterium tumefaciens)

<400> 17

gtgaagaaaa aagttcttac cgtggatgat tccagaacga tcaggaacat gctcctggtc 60

acgctcaaca atgccggttt cgaaaccatt caggccgaag acggcatcga gggtctcgaa 120

gtgctggaac agagcaaccc ggatgtcatc gtaaccgaca tcaacatgcc gcgtctcgac 180

ggtttcggct tcatcgaggg cgtgcggcgc aacgaaaaat accgtgcgat cccgatcctc 240

gttctgacga ccgaaagcga tgcggaaaag aagaaccgcg cccgccaggc cggtgcgacc 300

ggctggatcg tcaagccgtt cgaccctgca aaactcatcg atgccattga gcgcgtaacc 360

gcctga 366

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gactctagag gatcccagcg cctccgaggc cg 32

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tcgtgaaatg tcccgtatca cttttgcatc tcct 34

<210> 20

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tacgggacat ttcacgatgg atatgaacga aatc 34

<210> 21

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tgctgccaac tcgagcggct cgaaaccgct tt 32

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gattacgcca agcttgatgt ctctcgcaga aaa 33

<210> 23

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

acggccagtg aattctcatt tcagcgatcc ga 32

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gccgcgctgg tgcagaaggc 20

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gtcaccctgc gcggtgag 18

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ctgaagcaga aggcagccca gct 23

<210> 27

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cgcgcggtca ccctgcg 17

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cgccagctcg gcgccaacaa 20

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tgccttctgc accagcgc 18

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

aactggctgg ccaagccctt ca 22

<210> 31

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gttggcgccg agctggg 17

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ctggtcaagc ccttcaccat cga 23

<210> 33

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

cacgttgttg gcgccgag 18

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gaacgggttt tcggatcgct gaa 23

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gatggccgcg cgcatctt 18

Claims

1.一种CheY2突变型蛋白，其特征在于，所述CheY2突变型蛋白在野生型的趋化响应调节蛋白CheY2的第93位氨基酸发生突变，所述CheY2突变型蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的多肽。

2.核酸或基因，所述的核酸或基因编码权利要求1所述的突变型蛋白，所述核酸或基因序列如SEQ ID NO：7所示。

3.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求2所述的核酸或基因。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求2所述的核酸或基因或权利要求3所述的载体。

5.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌包含权利要求2所述的核酸或基因或权利要求3所述的载体。

6.一种产生权利要求1所述的CheY2突变型蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：在适合表达的条件下，培养权利要求4所述的宿主细胞或表达权利要求5所述的重组菌，从而获得CheY2突变型蛋白；和/或分离所述CheY2突变型蛋白。

7.权利要求1所述的CheY2突变型蛋白的用途，其特征在于，所述的突变型蛋白用于提高农杆菌对于营养物质以及叶片组织分泌物的趋化能力。