CN118240735A - 一种能表达外源蛋白的菌株、重组人源胶原蛋白及合成方法与应用 - Google Patents
一种能表达外源蛋白的菌株、重组人源胶原蛋白及合成方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种能表达外源蛋白的菌株、重组人源胶原蛋白及合成方法与应用。本发明首先提供了一种能表达外源蛋白的菌株，该菌株为脯氨酸营养缺陷型大肠杆菌，能高效表达外源蛋白。以该菌株为宿主表达重组人源胶原蛋白，外源掺入脯氨酸和羟脯氨酸，通过调控培养基中脯氨酸与羟脯氨酸的比例，可实现对胶原蛋白羟化率的精准调控。通过该合成方法，能得到羟化率与天然人胶原蛋白接近的重组胶原蛋白，具有更好的细胞粘附性及蛋白稳定性。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种能表达外源蛋白的菌株、重组人源胶原蛋白及合成方法与应用。
背景技术
胶原蛋白是一种在人体和其他哺乳动物中广泛存在的蛋白质，占总蛋白的比重约为30%。其家族成员数量庞大，目前已发现超过30种。胶原蛋白的分子结构包含一个三螺旋结构以及独特的Gly-X-Y重复序列。在X位置上，通常会发现脯氨酸的存在，而Y位置则是羟脯氨酸。羟脯氨酸在此位置上的存在对于胶原蛋白三螺旋结构的稳定性起决定性作用。在人体中，I、II和III型胶原蛋白是构成胶原纤维的主要成分。I型胶原蛋白广泛分布于真皮、骨骼、肌腱及韧带中，形成了高度有序的纤维组织，为皮肤提供重要支撑作用；II型胶原蛋白则主要存在于肌腱和韧带附着点的纤维软骨区，形成了软骨中的精细网状结构；III型胶原蛋白除分布于胎盘外，还与I型胶原蛋白共同存在于皮肤、肌腱、韧带、血管等结缔组织中，构成了细胞外基质网状结构，不仅对器官的支撑和保护起到了关键作用，还与细胞的附着和迁移密切相关。
目前，工业化生产的胶原蛋白主要依赖于从猪、牛等动物的组织(皮肤或骨骼)或深海鱼皮中通过酸、碱或酶法提取。虽然这种提取方法技术成熟，但其存在的免疫原性以及来源的有限性，使得它难以满足日益增长的市场需求。随着基因工程技术的广泛应用，通过基因工程手段生产重组胶原蛋白成为了解决胶原蛋白来源限制的最具潜力方法。与来源于动物的胶原蛋白相比，重组胶原蛋白具有生产周期短、成本低的优势，更适用于大规模生产。用于发酵的微生物包括大肠杆菌、酵母菌、枯草杆菌等，但由于这些微生物缺乏脯氨酸羟化酶基因，因此无法形成含有脯氨酸羟基化修饰的胶原蛋白。然而，动物来源的脯氨酸羟化酶结构复杂，多聚体形式的存在使其在微生物体内表达后通常活性较低，限制了其应用。
现有的大多数表达重组羟基化胶原蛋白的方法都是胶原蛋白基因与羟化酶基因共表达，这些羟化酶基因或来自微生物，或为人源羟化酶的片段，表达宿主包含大肠杆菌、毕赤酵母、克鲁维酵母等。例如，202210567560.X公开了一种在大肠杆菌体内共表达来源于炭疽芽孢杆菌的脯氨酸羟化酶BaP4H和一种重组人源融合I-III型胶原蛋白，两个质粒分别由L-阿拉伯糖和IPTG诱导，并且先后诱导的时间及条件进行了优化。CN111087464A公开了一种在大肠杆菌体内通过pACYCDute-1质粒由IPTG诱导同时表达巨型病毒脯氨酸羟化酶Hy726制备羟基化的重组人源Ⅲ型胶原蛋白。CN111334512A公开了利用克鲁维酵母为底盘细胞，对脯氨酸羟化酶α亚基或赖氨酸羟化酶进行组成型表达，实现类人胶原蛋白的分泌型表达，实现脯氨酸与赖氨酸的同步羟基化。但是，这种方法存在一定羟化效率的不可调控性。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种能表达外源蛋白的菌株。
本发明的另一目的在于提供上述能表达外源蛋白的菌株的应用。
本发明的再一目的在于提供一种重组人源胶原蛋白的合成方法及由此得到的重组人源胶原蛋白。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种能表达外源蛋白的菌株，是敲除脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因、ompT蛋白酶（家族外膜蛋白酶）基因和Lon蛋白酶基因的大肠杆菌重组工程菌；优选通过如下步骤制备得到：
（1）以大肠杆菌工程菌为出发菌株，敲除脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因，得到菌株A；
（2）在菌株A的基础上敲除ompT蛋白酶基因，得到菌株B；
（3）在菌株B的基础上敲除Lon蛋白酶基因，得到能表达外源蛋白的菌株。
所述的大肠杆菌重组工程菌的出发菌株优选为E.coliBL21(DE3) 、E.coliMG1655、E.coliDH5α、E.coliTop10、E.coliB0013、E.coliATCC 8739、E.coliW3110(DE3)或E.coliJM109。
所述的大肠杆菌工程菌优选为E.coliMG1655、E.coliDH5α、E.coliTop10、E.coliB0013、E.coliATCC 8739、E.coliW3110(DE3)或E.coliJM109。
如大肠杆菌原始菌株基因组中含以上三个基因（敲除脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因、ompT蛋白酶基因和Lon蛋白酶基因），则需按照如上步骤（1）～（3）获得该能外源表达蛋白的菌株；如菌株前期已经代谢改造敲除了其中一个或者两个基因，则只需再将其他基因敲除，如E.coliBL21(DE3)基因组内已敲除ompT和Lon两个蛋白酶基因，则仅需进行步骤（1），即敲除脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因。
所述的脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因优选为ProA、ProB和ProC（吡咯啉-5-羧酸还原酶）中的至少一种。
所述的敲除的方法包括同源臂重组敲除或是基因编辑敲除；优选为基因编辑敲除。
所述的基因编辑优选为CRISPR-cas9基因编辑。
所述的敲除脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因中靶向于脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因的载体优选通过如下步骤得到：在大肠杆菌敲除质粒上插入靶向于脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因的sgRNA和靶向于脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因的敲除框。
所述的大肠杆菌敲除质粒优选为pTargetF质粒。
所述的靶向于脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ IDNo .1所示。
所述的靶向于脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因的敲除框的核苷酸序列如SEQID No .2所示；其含有ProC基因上下游的同源臂。
所述的敲除脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因的步骤如下：在含cas9质粒的大肠杆菌基因工程菌株感受态中，转入靶向于脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因的载体，培养，得到敲除脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因的菌株，即菌株A。
所述的敲除ompT蛋白酶基因中靶向于ompT蛋白酶基因的载体优选通过如下步骤得到：在大肠杆菌敲除质粒上插入靶向于ompT蛋白酶基因的sgRNA和靶向于ompT蛋白酶基因的敲除框。
所述的大肠杆菌敲除质粒优选为pTargetF质粒。
所述的靶向于ompT蛋白酶基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No .3所示。
所述的靶向于ompT蛋白酶基因的敲除框的核苷酸序列如SEQ ID No .4所示；其含有ompT蛋白酶基因上下游的同源臂。
所述的敲除ompT蛋白酶基因的步骤如下：在含cas9质粒的菌株A感受态中，转入靶向于ompT蛋白酶基因的载体，培养，得到敲除脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因、敲除ompT蛋白酶基因的菌株，即菌株B。
所述的敲除Lon蛋白酶基因中靶向于Lon蛋白酶基因的载体优选通过如下步骤得到：在大肠杆菌敲除质粒上插入靶向于Lon蛋白酶基因的sgRNA和靶向于Lon蛋白酶基因的敲除框。
所述的大肠杆菌敲除质粒优选为pTargetF质粒。
所述的靶向于Lon蛋白酶基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No .5所示。
所述的靶向于Lon蛋白酶基因的敲除框的核苷酸序列如SEQ ID No .6所示；其含有Lon蛋白酶基因上下游的同源臂。
所述的敲除Lon蛋白酶基因的步骤如下：在含cas9质粒的菌株B感受态中，转入靶向于Lon蛋白酶基因的载体，培养，得到敲除脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因、敲除ompT蛋白酶基因和敲除Lon蛋白酶基因的菌株，即能表达外源蛋白的菌株。
上述能表达外源蛋白的菌株为脯氨酸营养缺陷型大肠杆菌，特别适合在含有脯氨酸和羟脯氨酸的外源蛋白表达中进行应用，是将富含脯氨酸和羟脯氨酸的外源蛋白编码基因转入能表达外源蛋白的菌株，通过调整培养基中脯氨酸和羟脯氨酸的配比，能精准调控外源蛋白中羟化率，得到目的蛋白。
所述的含有脯氨酸和羟脯氨酸的外源蛋白优选为重组人源胶原蛋白。
所述的重组人源胶原蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID No.7、SEQ ID No.11或SEQID No.13所示。
所述的重组人源胶原蛋白的编码核酸的序列优选如SEQ ID No .8、SEQ ID No.12或SEQ ID No.14所示。
一种重组人源胶原蛋白的合成方法，包括如下步骤：
1）将能表达重组人源胶原蛋白的重组表达载体和能表达T7 RNA聚合酶的重组载体转入上述能表达外源蛋白的菌株，得到重组基因工程菌；
2）培养步骤1）得到的重组基因工程菌，加入诱导剂，诱导表达T7 RNA聚合酶；
3）换液，进行饥饿培养；
4）加入IPTG、脯氨酸和羟脯氨酸进行培养，诱导重组人源胶原蛋白表达；
5）将步骤4）得到的培养液进行固液分离，取菌体；
6）将菌体进行破碎，固液分离，得到的上清纯化，得到重组人源胶原蛋白。
步骤1）中所述的重组人源胶原蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID No.7、SEQ IDNo.11或SEQ ID No.13所示的胶原蛋白。
步骤1）中所述的重组人源胶原蛋白的编码核酸的序列优选如SEQ ID No.8、SEQID No.12或SEQ ID No.14所示。
步骤1）中所述的能表达重组人源胶原蛋白的重组表达载体的载体框架为带有T7启动子的表达载体；优选为pET系列质粒；更优选为pET28a。
所述的能表达重组人源胶原蛋白的重组表达载体中重组人源胶原蛋白的编码核酸设置于T7启动子的下游。
步骤1）中所述的T7 RNA聚合酶来源于大肠杆菌BL21(DE3)，其氨基酸序列优选如SEQ ID No.9所示。
所述的T7 RNA聚合酶编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.10所示。
步骤1）中所述的能表达T7 RNA聚合酶的重组载体的载体框架为含阿拉伯糖启动子的表达载体；更优选为pBAD33。
所述的能表达T7 RNA聚合酶的重组载体中T7 RNA聚合酶的编码基因设置在阿拉伯糖启动子的下游。
步骤1）中所述的转入中能表达重组人源胶原蛋白的重组表达载体和能表达T7RNA聚合酶的重组载体优选按摩尔比1:1配比。
步骤1）中所述的转入的方法优选为电转化法。
步骤2）中所述的培养中所用的培养基为含有对应于能表达重组人源胶原蛋白的重组表达载体和能表达T7 RNA聚合酶的重组载体抗性的抗生素的LB培养基。
所述的培养基优选为含50mg/L卡那霉素和25mg/L氯霉素的LB培养基。
步骤2）中所述的培养的条件优选为于36～38℃、150～250rpm培养；更优选为于37℃、220rpm培养。
步骤2）中所述的培养阶段优选为菌液的OD600达到1～4；更优选为菌液的OD600是2.5。
步骤2）所述的诱导剂是诱导T7 RNA聚合酶启动子活性的物质；优选为阿拉伯糖。
步骤2）所述的诱导剂的加入量优选按其在培养体系中的浓度为0.5～1.5mg/mL计算；更优选按其在培养体系中的浓度为1mg/mL计算。
步骤2）所述的诱导的时间优选为5～40min；更优选为15min。
步骤3）中所述的换液方式可为离心或无菌过滤，更优选为离心。
所述的离心条件优选为于2～8℃、4000～8000rpm离心3～8min；更优选为于4℃、6000rpm离心6min。
步骤3）中所述的饥饿培养采用的培养基组成优选如下：葡萄糖浓度为1～10（w/v）%的M9培养基为溶剂，氯化钠300～600mM、甘氨酸20～500mg/L、丙氨酸20～500mg/L、缬氨酸20～500mg/L、亮氨酸20～500mg/L、异亮氨酸20～500mg/L、甲硫氨酸20～500mg/L、色氨酸20～500mg/L、丝氨酸20～500mg/L、酪氨酸20～500mg/L、半胱氨酸20～500mg/L、苯丙氨酸20～500mg/L、天冬酰胺20～500mg/L、谷氨酰胺20～500mg/L、苏氨酸20～500mg/L、天门冬氨酸20～500mg/L、谷氨酸20～500mg/L、赖氨酸20～500mg/L、精氨酸20～500mg/L和组氨酸20～500mg/L；更优选如下：葡萄糖浓度为1～10（w/v）%的M9培养基为溶剂，氯化钠450～550mM、甘氨酸90～110mg/L、丙氨酸90～110mg/L、缬氨酸90～110mg/L、亮氨酸90～110mg/L、异亮氨酸90～110mg/L、甲硫氨酸90～110mg/L、色氨酸90～110mg/L、丝氨酸90～110mg/L、酪氨酸90～110mg/L、半胱氨酸90～110mg/L、苯丙氨酸90～110mg/L、天冬酰胺90～110mg/L、谷氨酰胺90～110mg/L、苏氨酸90～110mg/L、天门冬氨酸90～110mg/L、谷氨酸90～110mg/L、赖氨酸90～110mg/L、精氨酸90～110mg/L和组氨酸90～110mg/L；最优选如下：葡萄糖浓度为10（w/v）%的M9培养基为溶剂，氯化钠500mM、甘氨酸100mg/L、丙氨酸100mg/L、缬氨酸100mg/L、亮氨酸100mg/L、异亮氨酸100mg/L、甲硫氨酸100mg/L、色氨酸100mg/L、丝氨酸100mg/L、酪氨酸100mg/L、半胱氨酸100mg/L、苯丙氨酸100mg/L、天冬酰胺100mg/L、谷氨酰胺100mg/L、苏氨酸100mg/L、天门冬氨酸100mg/L、谷氨酸100mg/L、赖氨酸100mg/L、精氨酸100mg/L和组氨酸100mg/L。
步骤3）中所述的饥饿培养条件优选为于36～38℃、150～250rpm培养30～90min；更优选为于37℃、220rpm培养60min。
步骤4）中所述的IPTG浓度优选为0.1～2mM；更优选为0.8～1.2mM；最优选为1mM。
步骤4）中所述的脯氨酸浓度优选为0～40mM；更优选为0～16mM；最优选为10～12mM。
步骤4）中所述的羟脯氨酸浓度优选为0～40mM；更优选为4～20mM；最优选为8～10mM。
所述的脯氨酸和所述的羟脯氨酸不能同时为0；优选按摩尔比6:4～5配比；此时得到的重组人源胶原蛋白羟化率在40～45%之间，与人源天然胶原蛋白的羟化率相近。
步骤4）中所述的培养的条件优选为于36～38℃、150～250rpm培养3～6h；更优选为于37℃、220rpm培养5h。
步骤5）中所述的固液分离方式优选为离心。
所述的离心条件优选为于2～8℃、6000～10000rpm离心3～8min；更优选为于4℃、8000rpm离心5min。
步骤6）中所述的菌体破碎所用悬浮液组成如下：15～25mmol/L Tris-HCl、450～550mmol/L NaCl，pH8.0～9.0；优选如下：20mmol/L Tris-HCl、500mmol/L NaCl，pH8.5。
步骤6）中所述菌体破碎条件优选为于2～8℃、25～35 kpsi破碎细胞；更优选为于4℃、30 kpsi破碎细胞。
步骤6）中所述的固液分离方式优选为离心。
所述的离心条件优选为于2～8℃、10000～15000rpm离心30～60min；更优选为于4℃、12000rpm离心50min。
步骤6）中所述的纯化为使用镍亲和层析柱进行纯化。
步骤6）中所述的纯化步骤如下：将破碎液上清上样到镍亲和层析柱中，洗脱液为含50～500mM咪唑，收集含100～150mM咪唑的菌体悬浮液洗脱得到的洗脱液。
上述重组人源胶原蛋白的合成方法在制备不同羟化率的重组人源胶原蛋白中的应用。
上述重组人源胶原蛋白的合成方法在不同羟化率的重组人源胶原蛋白功能研究中的应用。
一种重组人源胶原蛋白，通过上述合成方法得到；优选羟化率为40～50%的重组人源胶原蛋白；更优选羟化率为41～47%的重组人源胶原蛋白。
上述重组人源胶原蛋白在制备生物工程材料和/或化妆品中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
现有的大多数表达重组羟基化胶原蛋白的方法都是胶原蛋白基因与羟化酶基因共表达。这些共表达体系得到的胶原蛋白羟化率不稳定。本发明首先提供了一种脯氨酸营养缺陷型大肠杆菌，其对重组人源胶原蛋白的表达量高。接着本发明使用脯氨酸缺陷型菌株培养基中外源掺入脯氨酸和羟脯氨酸，通过调控培养基中脯氨酸与羟脯氨酸的比例，可实现对胶原蛋白羟化率的精准调控，从而得到羟化率与天然人胶原蛋白接近的重组胶原蛋白，得到的重组胶原蛋白拥有更好的细胞粘附性及蛋白稳定性。
本发明提供的合成方法能实现对胶原蛋白羟化率的精准调控，从而为研究羟化胶原蛋白的功能奠定基础。
附图说明
图1为脯氨酸营养缺陷型大肠杆菌△ProC△ompT△lon MG1655构建过程的菌落验证结果图；其中，泳道1为ProC基因，长度为810bp，泳道4、7、10为ProC敲除验证，ProC基因的验证引物为其两端序列，未扩增出条带说明敲除成功；泳道2为ompT蛋白酶基因，长度为954bp， 泳道5、8、11为ompT敲除验证，验证引物为基因组上其上下游各700bp处的序列，扩增出1400bp的条带说明敲除成功；泳道3为lon基因，长度为2355bp， 泳道6、9、12为lon敲除验证，验证引物为基因组上其上下游各1000bp处的序列，扩增出2000bp的条带说明敲除成功。
图2是不同菌株表达重组人源胶原蛋白的凝胶电泳图；其中，泳道M为蛋白Marker(Thermo Fisher#26616)，泳道W为细胞破碎液全液蛋白，泳道S为细胞破碎液上清蛋白，泳道P为细胞破碎液沉淀蛋白，箭头处为胶原蛋白条带。
图3为培养基中添加不同浓度比例的脯氨酸与羟脯氨酸制备的胶原蛋白羟化率。
图4为不同分子量重组胶原蛋白通过外源掺入法制备的胶原蛋白羟化率。
图5为不同羟化方法制备得到的人源胶原蛋白纯化结果图；其中，泳道M为蛋白Marker，泳道1为未羟基化重组人源胶原蛋白，泳道2为外源掺入法制备的羟基化重组人源胶原蛋白，泳道3为羟化酶法制备的羟基化重组人源胶原蛋白。
图6为不同方法制备的重组人源胶原蛋白的圆二色谱图。
图7为不同方法制备的重组人源胶原蛋白的热稳定性比较图。
图8为不同方法制备的重组人源胶原蛋白与牛I型胶原蛋白标准品的细胞黏附性检测结果图。
图9为不同方法制备的重组人源胶原蛋白与牛I型胶原蛋白标准品的细胞相容性检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明所用的引物如下表所示：
表1 引物序列
实施例1：脯氨酸营养缺陷型大肠杆菌构建
（1）以NCBI网站中E.coliMG1655基因组ProC基因为模板，利用gRNA在线设计网站http://crispor .tefor .net/设计了靶向ProC基因的sgRNA，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
（2）通过RF（无限制）克隆技术将该sgRNA片段插入pTargetF质粒中，获得sgRNA载体。其中，PCR反应体系如下：PrimeSTAR HS(Premix) 5 μL、浓度为10μM的上游引物F1 0.4μL、浓度为10μM的下游引物R1 0.4 μL、浓度为100ng/μL的pTargetF质粒0.4 μL，双蒸水补足至10 μL。PCR的反应条件如下：98℃ 3 min；98℃ 10 s、55℃ 15 s、72℃ 1.5min，30个循环；72°C 5 min；4°C 保存。
（3）ProC敲除框的构建：以E.coliMG1655基因组为模板，通过常规分子克隆方法获得ProC的上下游各500bp的同源臂片段，上游同源臂片段的PCR引物为ProC-up-F和ProC-up-R，下游同源臂片段的PCR引物为ProC-dn-F和ProC-dn-R。使用无缝克隆技术将前述两个片段插入步骤（2）得到的sgRNA载体上，形成敲除框，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。所得质粒命名为ProC 敲除质粒。
无缝克隆反应体系如下：载体sgRNA双酶切（NaeI/SacI）产物3 μL、上游同源臂片段1 μL、下游同源臂片段1 μL、Seamless Mix Master 5 μL。
将配置好的体系在50℃条件下孵育20min。
（4）将pCas9质粒（Thermo Fisher Scientific）电转化至E.coliMG1655感受态中，使用含50mmol/L阿拉伯糖的LB培养基对其诱导后将其制备成感受态。再将步骤（3）成功构建的质粒电转化转至感受态中，涂布于卡那霉素（25mg/L）和大观霉素（30mg/L）双抗LB平板。挑单菌PCR验证，筛选出脯氨酸缺陷型大肠杆菌△ProC MG1655。验证引物为KZ-ProC-S和KZ-ProC-A。
（5）同步骤（1）～（4），构建含ompT敲除框的sgRNA载体，电转化至含cas9质粒的△ProC MG1655感受态中，筛选得到大肠杆菌△ProC△ompT MG1655。sgRNA核苷酸序列如SEQID No.3所示，敲除框核苷酸序列如SEQID No.4所示。RF克隆技术sgRNA片段引物为上游引物F2和下游引物R2。验证引物为ompT-up700-S和ompT-dn700-A。
（6）同步骤（1）～（4），构建含lon敲除框的sgRNA载体，电转化至含cas9质粒的△ProC△ompT MG1655感受态中，筛选得到大肠杆菌△ProC△ompT△lon MG1655。sgRNA核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，敲除框核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。RF克隆技术sgRNA片段引物为上游引物F3和下游引物R3。验证引物为lon-up1000-S和lon-dn1000-A。
菌落PCR验证的结果如图1所示，图1的结果表明成功获得菌株△ProC MG1655、△ProC△ompT MG1655和△ProC△ompT△lon MG1655。
实施例2：重组胶原蛋白表达体系构建
（1）根据重组人源胶原蛋白氨基酸序列SEQ ID No.7，针对宿主大肠杆菌表达的密码子偏好性，设计过程中避免NdeI和BamHI酶切位点，优化基因序列，优化后的基因序列为SEQ ID No.8所示，通过公司合成得到。接着，通过上游引物F4和下游引物R4进行扩增，通过NdeI和BamHI双酶切后得到的片段与NdeI和BamHI双酶切的表达载体pET28a连接，得到重组载体pET28a-rhCOL。
（2）重组表达载体pBAD33-T7RNAP的构建：
1）引物设计：根据无缝克隆的引物设计原则设计T7RNAP片段扩增引物，为上游引物F5和下游引物R5。
2）T7RNAP基因片段的扩增：以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，用上游引物F5和下游引物R5扩增，利用DNA回收纯化试剂盒（TIANGEN）回收PCR产物T7RNAP基因片段。
PCR体系如下：KOD One™ PCR Master Mix 25 μL、浓度为10μM的上游引物F5 2 μL、浓度为10μM的下游引物R5 2 μL、E.coliBL21(DE3)基因组 2 μL，双蒸水补足至50μL。PCR条件如下：98℃ 5 min；98℃ 10 s、55℃ 5 s、72℃ 15 s，30个循环；72°C 5 min；4°C 保存。
3）将步骤2）得到的T7RNAP基因片段通过无缝克隆技术，从SalI和HindIII的酶切位点插入pBAD33表达载体，得到重组载体pBAD33-T7RNAP。
（3）共表达工程菌的制备：将上述构建成功的重组质粒pBAD33-T7RNAP与pET28a-rhCOL按摩尔比1∶1的比例混合，得到的混合物分别通过电转化至上述构建的脯氨酸缺陷型大肠杆菌△ProC MG1655、△ProC△ompTMG1655和△ProC△ompT△lon MG1655感受态中，涂布于含有卡那霉素Kan+（50mg/L）和氯霉素Cm+（25mg/L）抗性的LB平板（下述LB液体培养基中的双抗浓度与此处相同），长出阳性转化子，即为最终的共表达重组基因工程菌，命名为菌株rhCol。
（4）将上述工程菌接种于10mL 含Cm+和Kan+的LB液体培养基中，于37℃、220rpm恒温摇床培养10～12h作为种子液。种子液按体积比1:100转接于装液量为50mL含Cm+和Kan+的LB培养基，加入1mg/mL的阿拉伯糖，置于37℃、220rpm恒温摇床培养至菌液OD600约为0.6时，再加入1mM IPTG，继续培养5h后，收集菌体。
（5）按10 OD/mL的比例加入PBS缓冲液（0.01 M，pH=7.4）将菌体完全悬浮，超声破碎菌体，取样作为细胞破碎液全液蛋白W；离心破碎细胞，在上清中取样作为细胞破碎液上清蛋白S，弃去上清液后再次使用等体积PBS缓冲液重悬沉淀，得到的悬浮液取样作为细胞破碎液沉淀蛋白P；未诱导的蛋白条带为工程菌△ProC△ompT△lon MG1655培养时未加诱导剂（阿拉伯糖和IPTG）制备得到的蛋白破碎液全液。将上述样品各40 μL，加入10 μL 5×SDS-PAGE 上样缓冲液（Loading Buffer），沸水浴10 min使蛋白变性。吸取10 μL样品至SDS-PAGE蛋白胶中，进行蛋白凝胶电泳。最后，经过染色液染色30min，脱色液脱色至条带清晰可见。不同菌株的蛋白表达量如图2所示，结果表明工程菌在敲除蛋白酶基因ompT、lon后，目标重组蛋白产量显著提高。
实施例3：外源掺入羟脯氨酸、脯氨酸制备羟化胶原蛋白
（1）种子液准备：在超净工作台挑取实施例2中转化平板上单菌落接种于10mL 含Cm+和Kan+的LB液体培养基中，于37℃、220rpm恒温摇床培养10～12h作为种子液。
（2）诱导T7RNA聚合酶：将上述种子液按体积比1:100转接于装液量为50mL含Cm+和Kan+的LB培养基，置于37℃、220rpm恒温摇床培养约4.5h后，测定菌液OD600值在2.5时，加入终浓度为1mg/mL的阿拉伯糖，诱导T7RNA聚合酶表达，于37℃、220rpm诱导15min。
（3）离心换液：诱导结束后，将菌液于4℃条件下6000rpm离心6min，超净台中无菌操作弃置上清液，使用含25mg/L Cm+和50mg/L Kan+的合成培养基重悬，于37℃、220rpm饥饿培养1h。
合成培养基：M9培养基（其中葡萄糖的浓度为10%）为溶剂，氯化钠500mM，除脯氨酸以外的19种基本氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸 ）各100mg/L。
（4）诱导重组人源胶原蛋白：饥饿培养后，加入终浓度为1mM 的IPTG以及加入不同浓度的脯氨酸和羟脯氨酸，继续培养5h，诱导重组蛋白表达。诱导结束后，测菌液OD600值，于4℃条件下8000g离心5min，收集得到菌体。
（5）按10 OD/mL的比例加入缓冲液A（Buffer A）溶液对菌体完全悬浮，彻底悬浮后的菌体置于高压破碎仪下破碎细胞（温度：4℃，压力：30kpsi）；破碎完毕后，经4℃、12000g离心50min获得破碎后的上清和沉淀；收集上清样品，即为粗蛋白表达液，上清样品经0.22μm滤膜过滤。将上清加入到5mL Ni亲和树脂重力柱中，使用25 mL含10mM咪唑的Buffer A溶液清洗镍柱，分别用含50mM咪唑的Buffer A溶液、含100mM咪唑的Buffer A溶液、含150mM咪唑的Buffer A溶液、含250mM咪唑的Buffer A溶液和含500mM咪唑的Buffer A溶液各15 mL进行梯度洗脱，SDS-PAGE检测蛋白，将含有目标蛋白且纯度好的洗脱液（100～150mM）合并，得到重组胶原蛋白样品。
Buffer A：20mmol/L Tris-HCl、500mmol/L NaCl、pH8.5、0.22μm滤膜过滤除杂质，常温保存。
（6）纯化后样品测羟化率，检测方法如下：
1）水解重组胶原蛋白
将上述重组胶原蛋白样品在10kDa Spin-XR UF 500离心浓缩器（Millipore）中浓缩，采用蛋白浓度测定试剂盒（Thermo Fisher）测定蛋白质浓度。取10mg蛋白样品，加入5mL浓度为6M的盐酸于水解管中，抽真空并充入氮气，置于110℃烘箱水解24h，水解后待水解管冷却至室温，用ddH2O定容至25mL，取2mL氮吹干燥（加入少量ddH2O重复干燥2次），最后加入ddH2O重悬。
2）羟脯氨酸浓度的检测
取重悬液1 mL，加氯胺T溶液0.5 mL，摇匀后于室温放置20 min；加入显色剂0.5mL，摇匀，塞上塞子于60℃试管加热器（或恒温水浴）中保温20min后取出，迅速冷却，在波长(558±2)nm处测定吸光值。
缓冲溶液（pH=6.8）：称取26.0 g一水柠檬酸、14.0 g氢氧化钠、78.0 g无水乙酸钠，用500 mL水溶解前述试剂并转入1 L的容量瓶中，加入250 mL正丙醇，用水定容。
氯胺T溶液：称取1.41g三水·N-氯-对甲苯磺酰胺钠盐（氯胺T），用100mL缓冲溶液（pH=6.8）溶解。
显色剂：称取10.0g对二甲氨基苯甲醛，用35mL高氯酸溶液（60%）溶解，缓慢加入65mL异丙醇，临用前配置。
3）脯氨酸浓度的检测
取1mL重悬液与0.5mL酸性茚三酮试剂、0.5 mL冰醋酸混合均匀。将混合液于100℃水浴1h，立即置于冰上终止反应。将2mL二甲苯与反应混合液震荡混匀，置于室温20min。待混合液分层后，取上层液体在紫外分光光度计中测定520nm处的吸光值。
酸性茚三酮试剂：称取2.5g茚三酮，加入60mL冰醋酸和40mL浓度为6mol/L的磷酸，于70℃加热溶解，冷却后储于棕色试剂瓶中，4℃保存，两天内稳定。
4）脯氨酸羟化率按下述公式计算：
。
渗入不同浓度脯氨酸和羟脯氨酸得到重组胶原蛋白羟化率如图3所示，可见渗入不同浓度的脯氨酸和羟脯氨酸可以制备得到不同羟化率的重组胶原蛋白，羟化率最高可达88%。
实施例4 外源掺入法羟基化不同分子量重组胶原蛋白
（1）重组人源胶原蛋白rhColA，氨基酸序列为SEQ ID No.11所示，优化后的基因序列为SEQ ID No.12所示，通过上游引物F4和下游引物R6扩增得到，同实施例2步骤（1），构建得到重组载体pET28a-rhCOLA。
（2）重组人源胶原蛋白rhColB，氨基酸序列为SEQ ID No.13所示，优化后的基因序列为SEQ ID No.14所示，通过上游引物F4和下游引物R4扩增得到，同实施例2步骤（1），构建得到重组载体pET28a-rhCOLB。
（3）不同分子量重组胶原蛋白表达工程菌的制备：将上述构建成功的重组质粒同时分别与pBAD33-T7RNAP按摩尔比1∶1的比例混合，得到的混合物分别通过电转化至上述构建的脯氨酸缺陷型大肠杆菌△ProC△ompT△lon MG1655感受态中，涂布于含有卡那霉素Kan+（50mg/L）和氯霉素Cm+（25mg/L）抗性的LB平板，长出阳性转化子，即为最终的共表达重组基因工程菌，对应表达rhColA的工程菌命名为菌株rhColA，对应表达rhColB的工程菌命名为菌株rhColB。
（4）外源掺入羟脯氨酸、脯氨酸制备羟化胶原蛋白
将上述构建的三株重组人源胶原蛋白表达工程菌按照实施例3制备羟基化重组胶原蛋白，并纯化后检测羟化率，羟化情况如图4所示，具体数据如表2所示，即使是不同类型、不同分子量大小的重组胶原蛋白，外源掺入法羟基化得到的羟化率仍然能够控制在一个精准的范围内。
表2 外源掺入法得到的不同分子量重组人源胶原蛋白的羟化率
实施例5 不同方法制备得到羟化率不同的重组胶原蛋白
据报道，人体中自然存在的胶原蛋白的羟化率为40%出头，为了更接近于人体中胶原蛋白的羟化率，按本发明实施例3制备羟基化重组人源胶原蛋白，即外源掺入法制备羟基化重组人源胶原蛋白；其中，步骤（4）诱导重组人源胶原蛋白中羟脯氨酸为8mM，脯氨酸为12mM。
未羟基化胶原蛋白由实施例2步骤（4）的方法制备得到的菌体按实施例3步骤（5）进行纯化。
对照是羟化酶法制备的羟基化重组人源胶原蛋白，由本实验室构建的脯氨酸羟化酶共表达体系得到（按CN202210567560.X-一种重组人源融合胶原蛋白及其高效羟基化方法与应用中的实施例进行构建，将其中的重组胶原蛋白替换成本发明的重组胶原蛋白rhCol），具有典型性。
纯化后样品经SDS-PAGE电泳检测蛋白质大小及纯度，结果如图5所示，蛋白样品纯度在95%以上。
重组人源胶原蛋白羟化率如表3所示：
表3 不同方法制备得到的重组人源胶原蛋白的羟化率
实施例6：重组人源胶原蛋白的性能表征
（1）不同羟化率重组胶原二级结构测定
将实施例5制备的重组人源胶原蛋白溶液在10kDa Spin-XR UF 500离心浓缩器（millipore）中浓缩至终浓度1mg/mL，溶剂为20mM的磷酸缓冲液，4℃保存。利用圆二色谱仪对上述重组胶原蛋白溶液进行光谱扫描，扫描波长在190nm到260nm之间，1mm的石英比色皿，扫描温度为4℃，波长步进为1nm，平均时间1s，CD光谱均为三次扫描的平均值。结果如图6所示，可见本发明实施例5中两种方法制备的羟基化重组人源胶原蛋白在221nm处均有最大吸收峰值，小于200nm处为负峰，符合胶原蛋白三重螺旋的结构特征，外源掺入法制备的羟基化人源胶原蛋白具有更加明显的正吸收峰。
（2）不同羟化率重组胶原热稳定性检测
将上述制备的重组人源胶原蛋白样品使用圆二色谱进行热变温扫描，以1℃/min的速度升温，在221nm处测定CD光谱值与温度的关系。结果如图7所示，可见未羟基化重组人源胶原蛋白的变性温度为22℃，外源掺入法制备的羟基化重组人源胶原蛋白的变性温度为27℃，羟化酶法制备的羟基化重组人源胶原蛋白的变性温度为25℃，故本方法可显著提升重组人源胶原蛋白的热稳定性。
实施例7：不同羟化率重组胶原蛋白细胞粘附性检测
（1）细胞粘附性实验
将实施例5中制备的重组人源胶原蛋白用PBS（0.01 M，pH=7.4）配成0.2mg/mL的胶原蛋白溶液，0.2mg/mL牛I型胶原蛋白标准品作为阳性对照，将上述各溶液30μL/孔加入96孔板中于细胞培养箱中放置1h，每个孔设置3个复孔。用DMEM高糖培养基将小鼠成纤维细胞（NIH3T3）细胞稀释成密度为1×105个/mL，每个孔加入100μL细胞悬液，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养60min，将上清轻轻倒扣出，PBS洗三遍，然后用枪头将孔板里残留的液体尽可能地都吸出，用CCK-8试剂盒检测OD450nm处的吸光度值。
根据空白对照的数值，计算出每孔相对应的吸光度，计算出的吸光度值与贴壁的细胞数成正比。样本吸光度值＝测试孔-空白孔。以未羟化胶原蛋白的吸光度值为100%，计算出两种方法制备的羟基化重组人源胶原蛋白及牛I型胶原蛋白标准品的黏附活性。
结果如表4和图8所示，相比于未羟化及羟化酶法制备的羟基化重组人源胶原蛋白，使用本羟基化重组胶原蛋白其的细胞粘附性显著提升。
表4不同方法制备得到的重组人源胶原蛋白的细胞粘附性
（2）细胞相容性实验
取生长至培养皿面积70%-80%的小鼠成纤维细胞（NIH-3T3），胰酶消化制成细胞密度为5×104个/mL的细胞悬液。取100μL/孔细胞悬液接种于96孔培养，板中并置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养。细胞培养12h后，吸出完全培养液。在实验组中加入高糖DMEM培养基稀释的100μg/mL的实施例5中制备的羟基化重组人源胶原蛋白（设置3个复孔）100μL/孔，阳性对照为向细胞中加入同等浓度的牛I型胶原蛋白标准品的高糖DMEM培养基，继续于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养2天，用CCK-8试剂盒检测OD450nm处的吸光值。
以未羟化胶原蛋白的吸光度值为100%，计算出两种方法制备的羟基化重组人源胶原蛋白及牛I型胶原蛋白标准品的细胞相容性，结果如图9所示，两种羟化均对本重组人源胶原蛋白的细胞相容性无影响。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (14)
1.一种能表达外源蛋白的菌株，其特征在于：所述的能表达外源蛋白的菌株是敲除脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因、敲除ompT蛋白酶基因和敲除Lon蛋白酶基因的大肠杆菌重组工程菌；
所述的敲除中：
靶向于脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因的敲除框的核苷酸序列如SEQ ID No .2所示；
靶向于ompT蛋白酶基因的敲除框的核苷酸序列如SEQ ID No .4所示；
靶向于Lon蛋白酶基因的敲除框的核苷酸序列如SEQ ID No .6所示。
2.根据权利要求1中所述的能表达外源蛋白的菌株，其特征在于通过如下步骤制备得到：
（1）以大肠杆菌基因工程菌株为出发菌株，敲除脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因，得到菌株A；
（2）在菌株A的基础上敲除ompT蛋白酶基因，得到菌株B；
（3）在菌株B的基础上敲除Lon蛋白酶基因，得到能表达外源蛋白的菌株。
3.根据权利要求1或2所述的能表达外源蛋白的菌株，其特征在于：
所述的敲除的方法为CRISPR-cas9基因编辑敲除；
所述的敲除脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因中靶向于脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因的载体通过如下步骤得到：在大肠杆菌敲除质粒上插入靶向于脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因的sgRNA和靶向于脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因的敲除框；
所述的敲除ompT蛋白酶基因中靶向于ompT蛋白酶基因的载体通过如下步骤得到：在大肠杆菌敲除质粒上插入靶向于ompT蛋白酶基因的sgRNA和靶向于ompT蛋白酶基因的敲除框；
所述的敲除Lon蛋白酶基因中靶向于Lon蛋白酶基因的载体通过如下步骤得到：在大肠杆菌敲除质粒上插入靶向于Lon蛋白酶基因的sgRNA和靶向于Lon蛋白酶基因的敲除框。
4.根据权利要求3所述的能表达外源蛋白的菌株，其特征在于：
所述的大肠杆菌敲除质粒为pTargetF质粒；
所述的靶向于脯氨酸合成代谢通路中主要酶基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述的靶向于ompT蛋白酶基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No .3所示；
所述的靶向于Lon蛋白酶基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No .5所示。
5.权利要求1～4任一项所述的能表达外源蛋白的菌株为脯氨酸营养缺陷型大肠杆菌在含有脯氨酸和羟脯氨酸的外源蛋白表达中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的含有脯氨酸和羟脯氨酸的外源蛋白为重组人源胶原蛋白。
7.一种重组人源胶原蛋白的合成方法，其特征在于包括如下步骤：
1）将能表达重组人源胶原蛋白的重组表达载体和能表达T7 RNA聚合酶的重组载体转入权利要求1～4任一项所述的能表达外源蛋白的菌株，得到重组基因工程菌；
2）培养步骤1）得到的重组基因工程菌，加入诱导剂，诱导表达T7 RNA聚合酶；
3）换液，进行饥饿培养；
4）加入IPTG、脯氨酸和羟脯氨酸进行培养，诱导重组人源胶原蛋白表达；
5）将步骤4）得到的培养液进行固液分离，取菌体；
6）将菌体进行破碎，固液分离，得到的上清纯化，得到重组人源胶原蛋白。
8.根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于：
步骤1）中所述的重组人源胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.7、SEQ ID No.11或SEQID No.13所示；
步骤1）中所述的能表达重组人源胶原蛋白的重组表达载体的载体框架为带有T7启动子的表达载体；
步骤1）中所述的T7 RNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示；
步骤1）中所述的能表达T7 RNA聚合酶的重组载体的载体框架为含阿拉伯糖启动子的表达载体；
步骤2）中所述的培养中所用的培养基为含有对应于能表达重组人源胶原蛋白的重组表达载体和能表达T7 RNA聚合酶的重组载体抗性的抗生素的LB培养基；
步骤2）所述的诱导剂是增强T7 RNA聚合酶启动子活性的物质；
步骤2）所述的诱导剂的加入量按其在培养体系中的浓度为0.5～1.5mg/mL计算；
步骤2）所述的诱导的时间为5～40min；
步骤3）中所述的饥饿培养中的培养基的组成如下：葡萄糖浓度为1～10w/v%的M9培养基为溶剂，氯化钠300～600mM、甘氨酸20～500mg/L、丙氨酸20～500mg/L、缬氨酸20～500mg/L、亮氨酸20～500mg/L、异亮氨酸20～500mg/L、甲硫氨酸20～500mg/L、色氨酸20～500mg/L、丝氨酸20～500mg/L、酪氨酸20～500mg/L、半胱氨酸20～500mg/L、苯丙氨酸20～500mg/L、天冬酰胺20～500mg/L、谷氨酰胺20～500mg/L、苏氨酸20～500mg/L、天门冬氨酸20～500mg/L、谷氨酸20～500mg/L、赖氨酸20～500mg/L、精氨酸20～500mg/L和组氨酸20～500mg/L；
步骤3）中所述的饥饿培养的条件为于36～38℃、150～250rpm培养30～90min；
步骤4）中所述的IPTG的浓度为0.1～2mM；
步骤4）中所述的脯氨酸的浓度为0～40mM；
步骤4）中所述的羟脯氨酸的浓度为0～40mM；
所述的脯氨酸和所述的羟脯氨酸不能同时为0；
步骤6）中所述的破碎中所用的菌体悬浮液的组成如下：15～25mmol/L Tris-HCl、450～550mmol/L NaCl，pH8.0～9.0。
9.根据权利要求8所述的合成方法，其特征在于：
步骤1）中所述的重组人源胶原蛋白的编码核酸的序列如SEQ ID No.8、SEQ ID No.12或SEQ ID No.14所示；
步骤1）中所述的能表达重组人源胶原蛋白的重组表达载体的载体框架为pET系列质粒；
所述的T7 RNA聚合酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
步骤1）中所述的能表达T7 RNA聚合酶的重组载体的载体框架为pBAD33；
步骤2）中所述的培养中所用的培养基为含50mg/L卡那霉素和25mg/L氯霉素的LB培养基；
步骤2）所述的诱导剂为阿拉伯糖；
步骤2）所述的诱导的时间为15min；
步骤3）中所述的饥饿培养中的培养基的组成如下：葡萄糖浓度为1～10w/v%的M9培养基为溶剂，氯化钠450～550mM、甘氨酸90～110mg/L、丙氨酸90～110mg/L、缬氨酸90～110mg/L、亮氨酸90～110mg/L、异亮氨酸90～110mg/L、甲硫氨酸90～110mg/L、色氨酸90～110mg/L、丝氨酸90～110mg/L、酪氨酸90～110mg/L、半胱氨酸90～110mg/L、苯丙氨酸90～110mg/L、天冬酰胺90～110mg/L、谷氨酰胺90～110mg/L、苏氨酸90～110mg/L、天门冬氨酸90～110mg/L、谷氨酸90～110mg/L、赖氨酸90～110mg/L、精氨酸90～110mg/L和组氨酸90～110mg/L；
步骤3）中所述的饥饿培养的条件为于37℃、220rpm培养60min；
步骤4）中所述的IPTG的浓度为0.8～1.2mM；
步骤4）中所述的脯氨酸的浓度为0～16mM；
步骤4）中所述的羟脯氨酸的浓度为4～20mM；
步骤6）中所述的破碎中所用的菌体悬浮液的组成如下：20mmol/L Tris-HCl、500mmol/L NaCl，pH8.5；
步骤6）中所述的纯化为使用镍亲和层析柱进行纯化；
步骤6）中所述的纯化的步骤如下：将上清上样到镍亲和层析柱中，洗脱液为含50～500mM咪唑的菌体悬浮液，收集含100～150mM咪唑的菌体悬浮液洗脱得到的洗脱液。
10.根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于：
步骤1）中所述的转入中能表达重组人源胶原蛋白的重组表达载体和能表达T7 RNA聚合酶的重组载选按摩尔比1:1配比；
步骤2）中所述的培养的条件为于36～38℃、150～250rpm培养；
步骤2）中所述的培养的程度为菌液的OD600是1～4；
步骤4）中所述的培养的条件为于36～38℃、150～250rpm培养3～6h；
步骤5）中所述的固液分离的方式为离心；
步骤6）中所述的破碎的条件为于2～8℃、25～35 kpsi破碎细胞；
步骤6）中所述的固液分离的方式为离心。
11.权利要求7～10任一项所述的重组人源胶原蛋白的合成方法在制备不同羟化率的重组人源胶原蛋白中的应用。
12.一种重组人源胶原蛋白，其特征在于：通过权利要求7～10任一项所述的合成方法得到。
13.根据权利要求12所述的重组人源胶原蛋白，其特征在于：所述的重组人源胶原蛋白为羟化率为40～45%的重组人源胶原蛋白。
14.权利要求13所述的重组人源胶原蛋白在制备生物工程材料和/或化妆品中的应用。
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