FI102544B - Menetelmä E.coli-kannan valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä E.coli-kannan valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI102544B FI102544B FI891832A FI891832A FI102544B FI 102544 B FI102544 B FI 102544B FI 891832 A FI891832 A FI 891832A FI 891832 A FI891832 A FI 891832A FI 102544 B FI102544 B FI 102544B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- coli
- coli strain
- protein
- proteins
- plasmid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12N9/1074—Cyclomaltodextrin glucanotransferase (2.4.1.19)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Led Devices (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
102544
Menetelmä E.coli-kannan valmistamiseksi - Förfarande för framställning av en E.coli stam
Keksinnön kohteena on menetelmä E.coli-kannan valmistamiseksi vähintään 140 mg proteiinia/C proteiinierittämisen aikaansaamiseksi 48 tunnissa viljelyväliaineeseen.
Gram-negatiivisten bakteereiden soluseinämän rakenteen vuoksi on tähän mennessä lähdetty siitä, että viljelyalustaan ei voi tapahtua tosiasiallista proteiinien erittymistä, koska ulompi membraani toimii voimakkaana permeabiliteettisulkuna. E.coli-bakteeri ei luonnollisesti kykene erittämään tai kanavoimaan proteiineja viljelyalustaan. E.colissa on mahdollista proteiinien vienti periplasmaan. Hemolysiini- ja kolisiini-proteiinit muodostavat kaksi poikkeusta. Nämä eksoproteiinit ovat kuitenkin erikoistapauksia, koska kanavoitumistapahtumaan ottaa osaa kyseisellä eksoproteiinille spesifiset eritysproteiinit; vert. Wagner et ai., J. Biol. Chem., 369 (1988) 39-46.
Kirjallisuudessa on lisäksi kuvattu E.colille keinotekoisia eritys-systeemejä, joilla kuitenkin saadaan vain vähäisiä eksoproteiinisaantoja viljelyalustaan tai joiden käytettävyys ·';' ·· on rajoitettu.
(a) Niin kutsutut vuotavat (leaky) mutantit. Tällaisia mutant-teja tunnetaan esim. E.coli K12-kannalla, jolloin ulomman membraanin viasta johtuen viljelyalustaan pääsee periplasman • · · 1 . tai periplasmaan rikastuneita proteiineja. Tällöin on kysymys • · · *·'·' epäspesifisestä mekanismista; vert. Lazzosoni & Portailier, J. Bact., 145 (1981) 1351-1358. Nämä vuotavat mutantit ovat • · osaksi kantoja, joiden lipopolysakkaridirakenne on muuttunut ja osaksi kantoja, joissa ulomman membraanin lipoproteiinien määtä ovat muuttuneet; vert. Hirota et ai., Proc. Natl. Acad.
• · *..] Sei. USA, 74 (1977) 1417-1420, sekä Yem & Wu, J. Bacteeriol., • · *···’ 133 (1978) 1419-1426. Myös mutaatiot niin kutsutuissa "tol"- paikoissa johtavat vuotavaan fenotyyppiin fosfolipaasin A aktivoitumisen kautta. Tällöin voi olla kysymys spesifisestä tai epäspesifisestä vuotamisesta.
2 102544 (b) Proteiinin erittyminen proteiini A:n fuusion avulla patenttijulkaisun EP-A-0 225 860 = 86.850 415.0 mukaisesti.
Tämän tekniikan tason perustana on havainto, että rihmamaisen kasvun indusointi E.colissa aiheuttaa periplasmisten proteiinien erittymistä viljelyalustaan E.colilla esiintyy rihmamais-ta kasvua indusoitaessa niin kutsuttu lämpöshokki-vaste. Kun myös halutun geenituotteen ekspressio tehdään riippuvaiseksi lämpöshokki-vasteesta, voidaan haluttu, periplasman rikastunut proteiini saada erittymään. Tässä menetelmässä käytetään hyödyksi sitä, että Staphylococcus aureus -bakteerista saatu proteiini A sekä tämän proteiinin fragmentti laukaisevat E.colissa lämpöshokki-vasteen. Todennäköisesti proteiini A E.colissa on jo itsekin lämpöshokkiproteiini, koska sillä vastavirtaan päin omasta promoottorista on sigma-32-mainen promoottorirakenne, mikä vielä tehostaa vaikutusta. Jos siten proteiini A:n promoottorisekvenssiin, signaalisekvenssiin ja N-terminaalisiin paloihin liitetään halutun proteiinin geneettinen informaatio, niin lämpöshokki-vasteen ja rihmamaisen kasvun kautta voivat periplasman proteiinit erittyä viljely-alustaan. Tämä systeemi on tosin sikäli ongelmallinen, että lämpöshokkivaste indusoi lisäksi ATP-alisteisen proteaasi . . La:n. Sen vuoksi tapahtuu halutun proteiinin protolyyttistä hajoamista. Tämän vuoksi olisi toivottavaa käyttää tuottami-"· ·' seen La-vajaata kantaa (Ion'; vert. Young & Davis, Proc. Natl. ·.·.· Acad. Sei. USA, 80 (1983) 1194-1198). Tähän mennessä tällaista kantaa ei kuitenkaan ole ollut käytettävissä.
• · · • · · (c) Penisillinaasin ja ksylanaasin ekstrasellulaarinen valmis- • · · taminen patenttijulkaisun EP-A-0 121 138 = 84.102 440.9 mukai- . . sesti. Tässä tekniikan tasossa on kysymys menetelmästä, jossa • ♦ · penisillinaasin ja ksylanaasin erittämiseksi vil jelyalustaan • « « *.* * käytetään erityisiä E.coli-rakenteita. Myös tämä tunnettu menetelmä rajoittuu vain tiettyjen proteiinien valmistamiseen.
« · · • · *·’ Käsillä olevan keksinnön tavoitteena on valmistaa E.coli-*.· ' kantoja, jotka mahdollistavat runsaan proteiinien erittymisen : · soluista viljelyalustaan. Osatavoitteita ovat - eksoproteiinin tuotto ei-patogeenisenä organismina toimivassa E.colissa, - mahdollisimman suuri eritysmäärä ja 3 102544 - eksoproteiinin yksinkertainen saanti viljelmästä (mahdollisesti suodattamisen jälkeen).
Edellä mainittuun tavoitteeseen päästään keksinnön mukaisella menetelmällä, jolle on tunnusomaista se, että (a) ekspressoitavan eksoproteiinin rakennegeeni integroidaan sinänsä tunnetulla tavalla ekspressointiin sopivaan plasmidiin hybridiplasmidiksi, (b) E.coli-kanta, jossa on minA- ja/tai minB-mutaatio tai E.coli-kanta, jossa on mutaatio uloimman membraanin yhdessä tai useammassa proteiinissa, transformoidaan muodostetulla hybridiplasmidilla sinänsä tunnetulla tavalla, (c) transformoitu C.coli-kanta mutagenisoidaan sinänsä tunnetulla tavalla ja (d) mahdollisesti asetetaan sen jälkeen alttiiksi soluseinä-mään vaikuttaville aineille, . . (e) vaiheiden (c) ja mahdollisesti (d) läpikäynyt solumateri- / aali seulotaan sinänsä tunnetulla tavalla E.coli-mutanttien : ' suhteen, jotka erittävät proteiineja enemmän kuin käytetty V.' E.coli-kanta, (f) vaiheen (e) mukaisesti saatu E.coli-mutantti (mutantit) , joka erittää enemmän proteiineja, tehdään mahdollisesti sinänsä tunnetulla tavalla plasmidittomiksi.
• · · Käsitteellä eksoproteiinin rakennegeeni ymmärretään tässä • · · V ’ yhteydessä (vaihe a) ja jäljempänä haluttua proteiinia koodaa-vaa DNA-sekvenssiä, mukaan lukien sen tai kuljettamiseen .···. oleellinen signaalisekvenssi (Leader-sekvenssi) .
·.· * Mutagenointi voidaan suorittaa kemiallisesti, esim. N-metyyli-N' -nitro-N-nitrosoguanidiinilla (MNNG) .
Eräs esimerkki soluseinämään vaikuttavasta aineesta on D-syk-loseriini.
4 102544
Sopiviramin käytetään vaiheessa b) E.-coli-kantaa, jossa on minA- ja/tai minB-mutaatio, tai E.coli-kantaa, jossa on mutaatio ulkomembraanin yhdessä tai useammassa proteiinissa.
Keksinnön mukaisessa menetelmässä lähdetään erityisesti E.coli DS 410-kannasta tai E.coli BW 7261-kannasta.
Keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti voidaan lähtökanta transformoida hybridiplasmidilla, joka sisältää sen proteiinin rakennegeenin, jonka tuottamista halutaan.
Keksinnön mukainen menetelmä voidaan kuitenkin suorittaa myös siten, että lähtökanta transformoidaan ensin hybridiplasmidilla, joka sisältää sellaisen indikaattoriproteiinin rakennegeenin, jolla voidaan yksinkertaisella tavalla seuloa mutantit, jotka omaavat halutun ominaisuuden erittää runsaasti proteiineja viljelyalustaan. Sen jälkeen, kun tällainen mutantti on saatu selville indikaattoriproteiinin avulla, tämä mutantti tehdään plasmidittomaksi keksinnön mukaisen menetelmän tässä esitetyn muunnelman mukaisesti, minkä jälkeen plasmiditon mutantti transformoidaan toisen hybridiplasmidin kanssa, joka sisältää sen proteiinin rakennegeenin, jota halutaan tuottaa i « * ‘ · "· teknisesti .
t « a · ·'·/· Eräs esimerkki indikaattoriproteiinista on CGT, koska sen kyky ·;··; hydrolysoida polysakkarideja (tärkkelyksen hydrolyysi) mahdol- .’1*. listaa indikaattorireaktiona mukavan seulontatavan. CGT-aasia • · · käyttämällä laitetaan eksoproteiinia koodaava DNA-fragment ti • · · yhdessä oman, kuljetukselle oleellisen signaalisekvenssin kanssa voimakkaan promoottorin säätelyn alaiseksi, joka pro- • · · ’·*·' moottori voi säädellä aktiivisuuttaan yksinkertaisesti ja · · ·.· · tavoitteellisesti, esim. tac-promoottorin säätelyn alaiseksi.
zm." Tätä varten voidaan mainittu DNA-pala "multicopy-number"- .···. plasmidin minA- ja/tai minB-mutaatio (minisolu-kanta) , kuten • · E.colli DS 410-kanta tai jossa on mutaatio ulkomembraanin : yhdessä tai useammassa proteiinissa, kuten E.coli BW 7261- : : kanta, on transformoitu rekombinanttiplasmidilla, uusi kanta mutagenoidaan kemiallisesti ja asetetaan sen jälkeen alttiiksi membraaniin tai soluseinämään vaikuttaville aineilla. Kokemuksen perusteella resistenttiys D-sykloseriiniä vastaan on käyt 5 102544 tökelpoinen osoitus parantuneesta kanavoitumisesta. Käsittely soluseinämään vaikuttavalla aineella toistetaan tarkoituksenmukaisesti useita kertoja. Potentiaaliset eritysmutantit valitaan yksinkertaisen seulontasysteemin avulla lukuisista saaduista mutanteista. Mutantit arvioidaan kvantitatiivisesti entsyymitestin tai immunoblottauksen avulla.
Muissa suhteissa ammattimies voi pitäytyä hybridiplasmidin muodostamisen, transformoinnin, mutagenoinnin, soluseinämään vaikuttavilla aineilla käsittelyn, seulonnan, plasmidin poistamisen, bakteereiden viljelyn sekä proteiinin talteenoton suhteen asianmukaiseen tekniikan tasoon, esim. jo mainittuun kirj ailisuuteen.
Keksintö tarjoaa seuraavat edut: (a) Keksinnön mukaiset E.-coli-kannat tuottavat eksoproteii-neja teollisesti mielenkiintoisessa mitassa.
(b) keksinnön mukaisten mutanttien valmistama eksoproteiini voidaan puhdistaa edelleen edullisesti ja vähän aikaa vaatien • . tai se voidaan käyttää edelleen suoraan.
• Kun tunnetut bakteerit, jotka ylituottavat eksoproteiineja, varastoivat tuotteensa solunsisäisesti kasautuneina sulkeuma-hiukkasiksi "Inclusionbodies", keksinnön mukaiset mutantit : kanavoivat ylituotetun eksoproteiinin kvantitatiivisesti viljelyalustaan. Aikaa vievät ja osittain monimutkaiset solu- • · jen hajotus- ja sulkeumahiukkasten uusiinnuttamisprosessit jäävät näin pois. Sulkeumahiukkaset muodostuvat usein kulje- II» I.; tettavan proteiinin esimuodoista, so. niissä on vielä signaa-• · · ’·] * lisekvenssi eikä niillä ole siten mitään täydellistä katalyyt-tistä funktiota. Koska uusiinnuttaminen onnistuu harvoissa tapauksissa tyydyttävässä mitassa, eksoproteiinien tuottaminen ; keksinnön mukaislla mutanteilla helpottaa menetelmää suuresti. ’·’ ' Eksoproteiini täytyy vain puhdistaa viljelmästä (mahdollisesti ·...· suodattamisen jälkeen) tai korkeiden saantojen vuoksi se voidaan eksoentsyymin tapauksessa suoraan käyttää halutussa entsyymireaktiossa.
6 102544
Keksinnön mukaisilla mutanteilla voi olla laajaa käyttöä bakteeriperäisten eksoproteiinien tuottamisessa. Haluttu rekombinantti-plasmidi, joka sisältää geneettisen informaation kaupallisesti mielenkiintoiselle proteiinille, voidaan laittaa keksinnön mukaisiin mutantteihin rekombinantti DNA-tekniikan menetelmien avulla. Bakteerikasvun stationäärivaiheen kuluessa keksinnön mukaiset mutantit erittävät eksoproteiinin spesifisesti viljelyalustaan. Näin on mahdollista puhdistaa haluttu proteiini yksinkertaisella, nopealla ja halvalla tavalla. Jos eksoproteiini on entsyymi, viljelmän supernatantti voidaan käyttää suoraan seuraavassa entsyymireaktiossa johtuen korkeista, esim. 250 mg/1 tai suuremmista entsyymisaannoista.
Seuraavassa keksintöä on selvitetty lähemmin esimerkkien avulla.
Esimerkki 1 (Keksinnön mukaisen E.-coli-mutantin valmistaminen)
Eritysmutantin valmistamiseen valittiin plasmidi pCM703, joka sisältää CGT-aasin geneettisen informaation, ja E.coli DS410.
'· CGT valittiin indikaattoriksi mutanteille, joiden entsyymin : .· erittäminen on parantunut. Siten E.coli DS410 (pCM703)-kantaa kasvatettiin nesteviljelmänä täydellisessä alustassa 37°C:ssa.
: Sen jälkeen kun optiseksi tiheydeksi oli saatu 1, viljelysus- pensioon lisättiin 20 μg/ml N-metyyli-N'-nitro-N-nitrosoquani-diinia (MNNG) , minkä jälkeen inkuboitiin vielä 30 minuuttia • · · 37°C:ssa (soluista kuoli noin 90 %). Solut pestiin fosfaatti-puskurilla (pH 7,0), minkä jälkeen mutageenin vaikutus pysäy- • · · *·*·* tettiin. Yhtä suuret eräs solususpensiota maljättiin LB-mal-• · · ; joille (2 % tärkkelystä, 0,5 % laktoosia ja kasvavat konsent-raatiot D-sykloseriiniä). Selektointiin käytetyt antibiootin .···. konsentraatiot olivat 200 - 1000 ^g D-sykloseriiniä/ml, jol-" loin jokaisen mutagenointivaiheen jälkeen konsentraatio kak-·.· · sinkertaistettiin. Sen jälkeen kun oli inkuboitu 48 tuntia : : 37°C:ssa valittiin mutantit tärkkelyksen hydrolyysikehän suu ruuden perusteella. Tämä suuruus on yhdistettävissä erittyneen CGT-aasin aktiivisuuteen. Plasmidikoodatun entsyymin mahdollisesti parantunut kanavoituminen tutkittiin sivelemällä indi- 7 102544 kaattorimaljoille (0,5 % amylopektiiniatsuria) ja vahvistettiin entsymaattisessa testissä. Lukuisista mutanteista valittiin E.-coli-kanta, jolla oli korkein solunulkoinen entsyymi-aktiivisuus (nimitys: E.coli DS410 KS). Mutantit voitiin tehdä plasmidittomiksi viljelemällä useita kertoja antibiottia sisältämättömässä alustassa.
Esimerkki 2 (CGT-aasin erittäminen)
Keksinnön mukainen plasmiditon mutantti E.coli DE410 K5 (transformoitiin uudelleen pCM703-plasmidilla (joka koodaa CGT-aasia). Rekombinanttikantaa kasvatettiin LB-nestealustassa (0,5 % laktoosia ja 0,2 % glukoosia) 3 0°C:ssa. Solususpensiosta otettiin yhtä suuret erät 24 tunnin, 48 tunnin tai 72 tunnin inkuboinnin jälkeen. Tämän jälkeen solut erotettiin sentrifu-goimalla ja laimennettua viljelysupernatanttia inkuboitiin yhtä suuren tilavuuden kanssa 10 % tärkkelysliuosta 40°C:ssa.
5 minuutin inkubointiajan jälkeen lisättiin 1,5 tilavuusosaa metanolia, mikä saosti reagoimattoman tärkkelyksen. Saostunut tärkkelys erotettiin sentrifugoimalla, minkä jälkeen superna-tantin syklodekstriinipitoisuus määritettiin HPLC-laitteen . , avulla. Saatiin seuraavat tulokset: : Yksikköä/ml mg proteiinia/1 •'.V 24 h 16 - 20 64 - 80 ·:·: 48 h 45 - 50 180 - 200 72 h 55 - 60 220 - 240 • « • · · • · ·
Vertailuesimerkki 1 • · • · · *;[·* Toistettiin esimerkki 2 sillä poikkeuksella, että plasmidi V : pCM703 transformoitiin E.coli HBlOl-kantaan. Viljelysolun ulkoisen entsyymiaktiivisuuden määrittäminen suoritettiin .···. analogisesti. Saatiin seuraavat tulokset: *.· ·’ Yksikköä/ml mg proteiinia/1 24 h 0,5 2 8 102544
Esimerkki 3 (β-laktamaasin erittäminen)
Keksinnön mukaisesti mutantti E.coli DS410 K5 transformoitiin pAP5-plasmidilla, joka sisältää geneettisen informaation β-laktamaasille. Tässä rekombinantti-plasmidissa β-laktamaasi-geeni on tae-promoottorin kontrollin alaisena, joka promottori saa aikaan β-laktamaasin yliekspression indusoimalla esim. laktoosilla. E.coli DS410 K5 (pAP5)-kannan kasvattaminen ja näytteen otto 48 tuntisen inkuboinnin jälkeen ekstrasellulaa-risen β-laktamaasi-aktiivisuuden määrittämiseksi suoritettiin esimerkin 2 mukaisesti. Solunulkoinen β-laktamaasi-aktiivisuus määritettiin spektrofotometrisesti aallonpituudella 480 nm kromogeenisen substraatin, so. nitrosefiinin avulla; vert. Biochemistry, 23 (1984) 1282-1287. Saatiin seuraavat tulokset:
Inkubointiaika Supernatantin entsyymiaktiivisuus (suhteelliset luvut) 48 h 86
Esimerkki 4 , , Esimerkkien 1 ja 2 menettely toistettiin sillä muutoksella, ' ” että E.coli DS410-kannan asemesta käytettiin E.coli BW7261- : kantaa (ton A22, ompF 627), jossa oli plasmidi pCM703. Tästä : saatu mutantti tehtiin plasmidittomaksi ja transformoitiin ·:·: uudelleen plasmidilla pCM703. Tätä kantaa kasvatettiin 30°C:ssa nestemäisessä täysalustassa (LB) , joka sisälsi 0,5 % laktoosia ja 0,2 % glukoosia. Supernatantin entsyymiaktiivisuus määri- « · i tettiin 48 tunnin tai 72 tunnin inkuboinnin jälkeen (kts. esi- . . merkki 2) .
• · · • · · • · • · · V ' Yksikköä/ml mg proteiinia/1 :·. 48 h 28 140 • · · !···. 72 h 42 210 « · • * * 9 102544
Sanasto E.coli-kanta, jossa minAB-mutaatio: Davie et ai., J. Bacteriol., 158 (1984) 1202 - 1203.
E.coli DS410: DSM 4513, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Mascheroder Weg Ib, 3300 Braunschweig.
E.coli-kanta, jossa ulkomembraanin proteiinin mutaatio:
Wanner, J. Mol. Biol. 191 (1986) 39.
E.coli BW7261, DSM 5231, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Mascheroder Weg Ib, 3300 Brauschweig.
E.coli HB101: Z.B. DSM 1607 pJF118ug: kuvio 1 pCM703 : kuvio 2 pAPS : kuvio 3 tae: tae-promoottori; vrt. De Boer et ai., Proc. Natl. Acad.
Sei URA, 80 (1983) 21-25 CGT: CGTaasin rakennegeeni (syklodekstriiniglykosyylitrans-feraasi) (signaalisekvenssin mukaan) t : terminaattori amp: ampisilliini-resistenttiys . . tet: tetrasykliini-resistenttiys ’· lael: lac-repressori • · ·,'.· Luettelo käytetyistä restriktioentyymeistä:
BamH, Cla I, EcoR I, Hind III, Nru I, Pst I, Pvu I, Sea I.
• · · • · · • * • · · • · · • · • · · • · · ♦ · • · · • · · ♦ · · ·· • · • ·· ··· • · « ·
Claims (8)
1. Menetelmä E.coli-kannan valmistamiseksi vähintään 140 mg proteiinia/0 proteiinierittämisen aikaansaamiseksi 48 tunnissa viljelyväliaineeseen, tunnettu siitä, että (a) ekspressoitavan eksoproteiinin rakennegeeni integroidaan sinänsä tunnetulla tavalla ekspressointiin sopivaan plasmidiin hybridiplasmidiksi, (b) E.coli-kanta, jossa on minA- ja/tai minB-mutaatio tai E.coli-kanta, jossa on mutaatio uloimman membraanin yhdessä tai useammassa proteiinissa, transformoidaan muodostetulla hybridiplasmidilla sinänsä tunnetulla tavalla, (c) transformoitu C.coli-kanta mutagenisoidaan sinänsä tunnetulla tavalla ja (d) mahdollisesti asetetaan sen jälkeen alttiiksi soluseinä-mään vaikuttaville aineille, . , (e) vaiheiden (c) ja mahdollisesti (d) läpikäynyt solumateri- '· ' aali seulotaan sinänsä tunnetulla tavalla E.coli-mutanttien : suhteen, jotka erittävät proteiineja enemmän kuin käytetty v.' E. coli-kanta, (f) vaiheen (e) mukaisesti saatu E.coli-mutantti (mutantit) , joka erittää enemmän proteiineja, tehdään mahdollisesti sinänsä tunnetulla tavalla plasmidittomiksi.
• · • · · *·*·* 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu • · · *.* * siitä, että patenttivaatimuksen 1 mukaisessa vaiheessa (c) j*.<# mutagenisoidaan kemiallisesti, esim. N-metyyli-N'-nitro-N-,···. nitrosoguanidiinilla (MNNG) . t · • · φ
: 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, t u n - : : n e t t u siitä, että patenttivaatimuksen 1 mukaisessa vai heessa (d) käytetään soluseinään vaikuttavana aineena D-syklo-seriinä. 102544
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään E.coli DS410(DSM 4513)-kantaa.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään E.coli BW7261(DSM 5231)-kantaa.
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 1 mukaisessa vaiheessa (a) käytetään CGT-rakennegeeniä, patenttivaatimuksen 1 mukaisessa vaiheessa (e) valitaan E.coli-mutanttien, jotka erittävät proteiineja enemmän, indikaattorireaktioksi muodostetun CGTaasin polysakkaridi-hydrolyysi ja vaihe (f) suoritetaan patenttivaatimuksen 1 mukaisesti.
7. Yhden tai useamman patenttivaatimuksen 1-6 mukaan valmistettu E.coli-kanta, jossa on minA- ja/tai minB-mutaatio, tai mutaatio ulkomembraanin yhdessä tai useammassa proteiinissa, proteiinierityksen aikaansaamiseksi, joka on vähintään 140 mg proteiinia/? 48 tunnin aikana viljelyväliaineessa.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukaisen E.coli-kannan käyttö halutun proteiinin tuottamiseksi erittämällä runsaasti viljelyalus- ' taan. t I • · · • · · • · 0 0 0 • 0 » • · 0 · • · · • · · 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 9 9 • · • » · 102544
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3813107A DE3813107A1 (de) | 1988-04-19 | 1988-04-19 | Sekretormutante von escherichia coli |
| DE3813107 | 1988-04-19 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI891832A0 FI891832A0 (fi) | 1989-04-18 |
| FI891832A FI891832A (fi) | 1989-10-20 |
| FI102544B1 FI102544B1 (fi) | 1998-12-31 |
| FI102544B true FI102544B (fi) | 1998-12-31 |
Family
ID=6352379
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI891832A FI102544B (fi) | 1988-04-19 | 1989-04-18 | Menetelmä E.coli-kannan valmistamiseksi |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0338410B1 (fi) |
| JP (1) | JP3040402B2 (fi) |
| AT (1) | ATE112320T1 (fi) |
| DE (2) | DE3813107A1 (fi) |
| DK (1) | DK174508B1 (fi) |
| FI (1) | FI102544B (fi) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4009268A1 (de) * | 1990-03-22 | 1991-09-26 | Consortium Elektrochem Ind | Sekretion von hirudinderivaten |
| US6514730B1 (en) | 1991-03-21 | 2003-02-04 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Secretion of hirudin derivatives |
| DE4113750A1 (de) | 1991-04-26 | 1992-10-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verbesserung der renaturierung bei der sekretion von disulfidverbrueckten proteinen |
| US5830692A (en) * | 1995-03-24 | 1998-11-03 | Consortium Fur Elektrochemische Industrie Gmbh | Expression system which can be regulated |
| US6247571B1 (en) | 1996-08-30 | 2001-06-19 | Aisin Seiki Kabushiki Kaisha | Power transmitting mechanism with two hysteresis mechanisms |
| EP0966521A1 (en) * | 1996-09-13 | 1999-12-29 | Novo Nordisk Biotech, Inc. | Cells having dna insertion mutations which produce altered amounts of a polypeptide |
| DE102006004871A1 (de) | 2006-02-02 | 2007-08-09 | Wacker Chemie Ag | Mikroorganismenstamm zur Produktion von rekombinanten Proteinen |
| DK1903115T3 (da) | 2006-09-22 | 2011-05-23 | Wacker Chemie Ag | Fremgangsmåde til fermentativ fremstilling af antistoffer |
| DE502006006800D1 (de) * | 2006-09-22 | 2010-06-02 | Wacker Chemie Ag | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Proteinen |
| DE102006044841A1 (de) | 2006-09-22 | 2008-04-03 | Wacker Chemie Ag | Signalpeptid zur Produktion von rekombinanten Proteinen |
| DE102006050332A1 (de) | 2006-10-25 | 2008-04-30 | Wacker Chemie Ag | DNS-Konstrukt und Verfahren zur fermentativen Herstellung von Fusionsproteinen |
| WO2009021548A1 (en) * | 2007-08-10 | 2009-02-19 | Wacker Chemie Ag | Expression of full length igg and secretion into the culture medium of prokaryotic cells |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0071485B1 (en) * | 1981-07-30 | 1989-09-20 | Akira Kimura | Novel microorganisms derived from microorganisms of the genus escherichia by mutation and their use in the preparation of glutathione |
| JPS62166881A (ja) * | 1986-01-16 | 1987-07-23 | Michio Matsuhashi | 大腸菌のペリプラズム蛋白質分泌変異株 |
| ATE122391T1 (de) * | 1987-01-30 | 1995-05-15 | Harvard College | Periplasmische protease-mutanten von escherichia coli. |
-
1988
- 1988-04-19 DE DE3813107A patent/DE3813107A1/de not_active Withdrawn
-
1989
- 1989-04-13 AT AT89106554T patent/ATE112320T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-04-13 DE DE58908428T patent/DE58908428D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-13 EP EP89106554A patent/EP0338410B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-18 DK DK198901865A patent/DK174508B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-04-18 FI FI891832A patent/FI102544B/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-04-19 JP JP1097687A patent/JP3040402B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3040402B2 (ja) | 2000-05-15 |
| DE58908428D1 (de) | 1994-11-03 |
| DK174508B1 (da) | 2003-05-05 |
| FI102544B1 (fi) | 1998-12-31 |
| DK186589D0 (da) | 1989-04-18 |
| EP0338410A2 (de) | 1989-10-25 |
| EP0338410A3 (de) | 1991-10-16 |
| DK186589A (da) | 1989-10-20 |
| EP0338410B1 (de) | 1994-09-28 |
| FI891832A (fi) | 1989-10-20 |
| ATE112320T1 (de) | 1994-10-15 |
| JPH0235077A (ja) | 1990-02-05 |
| DE3813107A1 (de) | 1989-11-02 |
| FI891832A0 (fi) | 1989-04-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI102544B (fi) | Menetelmä E.coli-kannan valmistamiseksi | |
| Ohnishi et al. | Peptidoglycan hydrolase LytF plays a role in cell separation with CwlF during vegetative growth of Bacillus subtilis | |
| Bronner et al. | Expression of the capsular K5 polysaccharide of Escherichia coli: biochemical and electron microscopic analyses of mutants with defects in region 1 of the K5 gene cluster | |
| Egelseer et al. | The S-layer proteins of two Bacillus stearothermophilus wild-type strains are bound via their N-terminal region to a secondary cell wall polymer of identical chemical composition | |
| Bankaitis et al. | Proper interaction between at least two components is required for efficient export of proteins to the Escherichia coli cell envelope | |
| JPS59205983A (ja) | 異種遺伝子を原核微生物で発現させる方法 | |
| Sprenger et al. | Analysis of sucrose catabolism in Klebsiella pneumoniae and in Scr+ derivatives of Escherichia coli K12 | |
| ATE246251T1 (de) | Verfahren zur herstellung von polypeptiden in surfaktinmutanten von bacillus zellen | |
| Hervé et al. | Biochemical characterization and physiological properties of Escherichia coli UDP-N-acetylmuramate: L-alanyl-γ-D-glutamyl-meso-diaminopimelate ligase | |
| US8394937B2 (en) | Expression system | |
| Grohs et al. | Vancomycin resistance is associated with serine-containing peptidoglycan in Enterococcus gallinarum | |
| Mitsuyama et al. | Identification and characterization of a cell wall hydrolase for sporangiospore maturation in Actinoplanes missouriensis | |
| HU193266B (en) | Process for preparing a microorganism producing alpha-galactosidase but not producing invertase | |
| Rigby et al. | Construction of intergeneric hybrids using bacteriophage P1CM: transfer of the Klebsiella aerogenes ribitol dehydrogenase gene to Escherichia coli | |
| Davies | Comparison of beta-lactamase II from Bacillus cereus 569/H/9 with a beta-lactamase from Bacillus cereus 5/B/6. | |
| HU194316B (en) | Process for preparing alpha-l human leukocyte interferone | |
| JP3404406B2 (ja) | ７−アミノセファロスポラン酸の酵素的製造方法 | |
| Satta et al. | Peptidoglycan synthesis in cocci and rods of a pH-dependent, morphologically conditional mutant of Klebsiella pneumoniae | |
| CA1339011C (en) | Dna fragment having the cyclodextrin glycosyltransferase structural gene, an expression vector and microorganims for the expression of said gene, and a process for the preparation of same | |
| Iida et al. | Mutants of Escherichia coli defective in penicillin-insensitive murein DD-endopeptidase | |
| RU2003689C1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК рВА1418, кодирующа альфа-амилазу BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS и штамм-бактерий BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS - продуцент альфа-амилазы BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS | |
| Odakura et al. | Mutation of R factors capable of specifying hypersynthesis of penicillinase | |
| Moore et al. | Inhibition of transpeptidase activity in Escherichia coli by thienamycin | |
| AU721877B2 (en) | Deuteriated substances | |
| US4962055A (en) | Plasmid, method for construction of the same, microorganisms carrying the plasmid and method for cultivation of the microorganism |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Owner name: CONSORTIUM FUER ELEKTROCHEMISCHE |
|
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: WACKER CHEMIE AG Free format text: WACKER CHEMIE AG |
|
| MA | Patent expired |