JP3040402B2 - 培地中に蛋白質を分泌する大腸菌株及びその製法 - Google Patents
培地中に蛋白質を分泌する大腸菌株及びその製法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は培地中に多量の蛋白質を分泌する大腸菌株、
その製法及び蛋白質の製造法に関する。
その製法及び蛋白質の製造法に関する。
従来の技術 グラム陰性菌の細胞壁の構造のために、蛋白質の培地
中への実質的な分泌は行なわれないということが前提と
なつている、それというのも外膜が強力な透過性妨害壁
を形成しているためである。自然においては、大腸菌は
蛋白質を分泌すること、もしくは培地中に排泄すること
はない。大腸菌においてはペリプラズム中への蛋白質搬
出だけが可能である。蛋白質ヘモリジン及びコリシンの
二つが例外である。これらのエキソ蛋白質は、それぞれ
のエキソ蛋白質に特異的な分泌蛋白質が排泄工程におい
て関与しているので、例外である（Wagner等著、J.Bio
l.Chem.、第369巻、1988年、第39〜46頁）。
中への実質的な分泌は行なわれないということが前提と
なつている、それというのも外膜が強力な透過性妨害壁
を形成しているためである。自然においては、大腸菌は
蛋白質を分泌すること、もしくは培地中に排泄すること
はない。大腸菌においてはペリプラズム中への蛋白質搬
出だけが可能である。蛋白質ヘモリジン及びコリシンの
二つが例外である。これらのエキソ蛋白質は、それぞれ
のエキソ蛋白質に特異的な分泌蛋白質が排泄工程におい
て関与しているので、例外である（Wagner等著、J.Bio
l.Chem.、第369巻、1988年、第39〜46頁）。
更に、文献には大腸菌のための人工的な分泌システム
が記載されているが、これは培地中への非常に僅かなエ
キソ蛋白質収率にのみ導びくか、又はその使用において
制限がある。
が記載されているが、これは培地中への非常に僅かなエ
キソ蛋白質収率にのみ導びくか、又はその使用において
制限がある。
（ａ） いわゆる“漏出変異体”。この種の突然変異体
としては例えば大腸菌K12株が公知であり、この際外膜
中での欠失のためにペリプラズム蛋白質もしくはペリプ
ラズム蓄積蛋白質が培地中に達する。これは非特異的な
機構である（Lazzosoni ＆ Portalier著、J.Bact.、第1
45巻（1981年）、第1351〜1358頁）。この漏出変異体の
１部は外膜において変化したリポ多糖構造を有する菌株
であり、１部は外膜において変化したリポ蛋白質量を有
する菌株である（Hirota等著、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A、第74巻（1977年）第1417〜1420頁、並びにYem ＆ Wu
著、J.Bacteriol.、第133巻（1978年）、第1419〜1426
頁参照）。いわゆる“tol"−座での突然変異もホスホリ
パーゼＡの活性化を介して“漏出”−発現型に導びく。
この場合、特異的又は非特異的“漏出”でありうる。
としては例えば大腸菌K12株が公知であり、この際外膜
中での欠失のためにペリプラズム蛋白質もしくはペリプ
ラズム蓄積蛋白質が培地中に達する。これは非特異的な
機構である（Lazzosoni ＆ Portalier著、J.Bact.、第1
45巻（1981年）、第1351〜1358頁）。この漏出変異体の
１部は外膜において変化したリポ多糖構造を有する菌株
であり、１部は外膜において変化したリポ蛋白質量を有
する菌株である（Hirota等著、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A、第74巻（1977年）第1417〜1420頁、並びにYem ＆ Wu
著、J.Bacteriol.、第133巻（1978年）、第1419〜1426
頁参照）。いわゆる“tol"−座での突然変異もホスホリ
パーゼＡの活性化を介して“漏出”−発現型に導びく。
この場合、特異的又は非特異的“漏出”でありうる。
（ｂ） ヨーロッパ特許公開第0225860号公報＝86.8504
15.0.による蛋白質Ａ−融合による蛋白質分泌。
15.0.による蛋白質Ａ−融合による蛋白質分泌。
この技術水準の基礎は大腸菌中でのフイラメント状成
長の誘導がペリプラズム蛋白質の培地中への分泌に導び
くという観察である。大腸菌はいわゆる熱シヨツク応答
の誘導においてフイラメント状成長を示す。所望の遺伝
子生成物の発現を熱シヨツク応答に依存性であるように
する場合、所望のペリプラズム中に蓄積する蛋白質の分
泌が達せられる。この方法においてはスタフイロコツカ
ス・アウレウス（Staphylococcus aureus）からの蛋白
質Ａ並びにこの蛋白質のフラグメントが大腸菌中で熱シ
ヨツク応答を惹起するということを利用する。多分この
蛋白質Ａは大腸菌中で自体熱シヨツク蛋白質を形成す
る。それというのもこの蛋白質Ａは本来のプロモーター
の上流にシグマ−32−様プロモーター構造を有してお
り、これにより効果は更に増大するためである。すなわ
ち、蛋白質Ａのプロモーター配列、シグナル配列及びＮ
−末端フラグメントを所望の蛋白質の遺伝情報と結合す
ると、熱シヨツク応答及びフイラメント状成長を介して
ペリプラズム蛋白質の培地への分泌が生じる。しかしな
がら、このシステムは熱シヨツク応答により付加的にAT
P−依存プロテアーゼLaが生産される限りでは問題であ
る。こうして所望の蛋白質の蛋白質分解が生じる。従つ
て、La−欠失株（lon-;Young ＆ Davis著、Proc.Natl.A
cad.Sci.USA、第80巻（1983年）、第1194〜1198頁参
照）を生産のために使用することが所望される。しかし
ながら、このような菌株は従来製造されていない。
長の誘導がペリプラズム蛋白質の培地中への分泌に導び
くという観察である。大腸菌はいわゆる熱シヨツク応答
の誘導においてフイラメント状成長を示す。所望の遺伝
子生成物の発現を熱シヨツク応答に依存性であるように
する場合、所望のペリプラズム中に蓄積する蛋白質の分
泌が達せられる。この方法においてはスタフイロコツカ
ス・アウレウス（Staphylococcus aureus）からの蛋白
質Ａ並びにこの蛋白質のフラグメントが大腸菌中で熱シ
ヨツク応答を惹起するということを利用する。多分この
蛋白質Ａは大腸菌中で自体熱シヨツク蛋白質を形成す
る。それというのもこの蛋白質Ａは本来のプロモーター
の上流にシグマ−32−様プロモーター構造を有してお
り、これにより効果は更に増大するためである。すなわ
ち、蛋白質Ａのプロモーター配列、シグナル配列及びＮ
−末端フラグメントを所望の蛋白質の遺伝情報と結合す
ると、熱シヨツク応答及びフイラメント状成長を介して
ペリプラズム蛋白質の培地への分泌が生じる。しかしな
がら、このシステムは熱シヨツク応答により付加的にAT
P−依存プロテアーゼLaが生産される限りでは問題であ
る。こうして所望の蛋白質の蛋白質分解が生じる。従つ
て、La−欠失株（lon-;Young ＆ Davis著、Proc.Natl.A
cad.Sci.USA、第80巻（1983年）、第1194〜1198頁参
照）を生産のために使用することが所望される。しかし
ながら、このような菌株は従来製造されていない。
（ｃ） ヨーロツパ特許公開第0121138号公報＝84.1024
40.9.によるペニシリナーゼ及びキシラナーゼの細胞外
製造 この公知技術はペニシリナーゼ及びキシラナーゼを培
地中に分泌するための特別な大腸菌構造を使用する方法
に関する。この公知法は特別な蛋白質の獲得に限定され
る。
40.9.によるペニシリナーゼ及びキシラナーゼの細胞外
製造 この公知技術はペニシリナーゼ及びキシラナーゼを培
地中に分泌するための特別な大腸菌構造を使用する方法
に関する。この公知法は特別な蛋白質の獲得に限定され
る。
発明が解決しようとする課題 従つて、本発明の課題は、培地中に細胞の多量の蛋白
質分泌を行なう大腸菌株を製造することである。部分課
題は、 −非病原体としての大腸菌中でのエキゾ蛋白質の生産、 −できるだけ高い分泌率及び −エキソ蛋白質の培地からの簡単な処理（場合により濾
過）。
質分泌を行なう大腸菌株を製造することである。部分課
題は、 −非病原体としての大腸菌中でのエキゾ蛋白質の生産、 −できるだけ高い分泌率及び −エキソ蛋白質の培地からの簡単な処理（場合により濾
過）。
課題を解決するための手段 本発明の課題は本発明により、 （ａ） 発現すべきエキソ蛋白質の構造遺伝子を、発現
のために好適なプラスミド中に自体公知法で統合してハ
イブリツドプラスミドとし、 （ｂ） この形成されたハイブリツドプラスミドで、mi
nA−及び／又はminB−突然変異を有する大腸菌株又は外
膜の１種又は複数種の蛋白質に突然変異を有する大腸菌
株を自体公知法で形質転換し、 （ｃ） この形質転換大腸菌株に自体公知法で突然変異
誘発を行ない、かつ （ｄ） その後細胞壁活性物質サイクロセリン（Cyclos
erin）にさらし、 （ｅ） 工程（ｃ）及び工程（ｄ）を行なつた細胞材料
を、自体公知法で、使用した大腸菌株に対して高められ
た蛋白質分泌を有する大腸菌突然変異体に関するスクリ
ーニングにかけ、かつ （ｆ） 場合により、工程（ｅ）により得られた高めら
れた蛋白質分泌を有する大腸菌突然変異体を自体公知法
で、プラスミド不含にする、 ことにより製造可能な、培地中に多量の蛋白質を分泌す
るための大腸菌株により解決する。
のために好適なプラスミド中に自体公知法で統合してハ
イブリツドプラスミドとし、 （ｂ） この形成されたハイブリツドプラスミドで、mi
nA−及び／又はminB−突然変異を有する大腸菌株又は外
膜の１種又は複数種の蛋白質に突然変異を有する大腸菌
株を自体公知法で形質転換し、 （ｃ） この形質転換大腸菌株に自体公知法で突然変異
誘発を行ない、かつ （ｄ） その後細胞壁活性物質サイクロセリン（Cyclos
erin）にさらし、 （ｅ） 工程（ｃ）及び工程（ｄ）を行なつた細胞材料
を、自体公知法で、使用した大腸菌株に対して高められ
た蛋白質分泌を有する大腸菌突然変異体に関するスクリ
ーニングにかけ、かつ （ｆ） 場合により、工程（ｅ）により得られた高めら
れた蛋白質分泌を有する大腸菌突然変異体を自体公知法
で、プラスミド不含にする、 ことにより製造可能な、培地中に多量の蛋白質を分泌す
るための大腸菌株により解決する。
エキソ蛋白質の構造遺伝子という概念は該明細書にお
いては、搬出に必須のシグナル配列（読みとり配列）を
も含む所望の蛋白質をコードするDNA配列を意味する。
有利に本発明による大腸菌株は大腸菌株HB101より高い
蛋白質分泌能により特徴付けられている。
いては、搬出に必須のシグナル配列（読みとり配列）を
も含む所望の蛋白質をコードするDNA配列を意味する。
有利に本発明による大腸菌株は大腸菌株HB101より高い
蛋白質分泌能により特徴付けられている。
本発明の更なる課題は本発明により、 （ａ） 発現すべきエキソ蛋白質の構造遺伝子を発現の
ために好適なプラスミド中に自体公知法で統合してハイ
ブリツドプラスミドとし、 （ｂ） この形成されたハイブリツドプラスミドで、mi
nA−及び／又はminB−突然変異を有する大腸菌株又は外
膜の１種又は複数種の蛋白質に突然変異を有する大腸菌
株を自体公知法で形質転換し、 （ｃ） この形質転換大腸菌株に自体公知法で突然変異
誘発を行ない、かつ （ｄ） その後細胞壁活性物質サイクロセリンにさら
し、 （ｅ） 工程（ｃ）及び工程（ｄ）を行なつた細胞材料
を、自体公知法で、使用した大腸菌株に対して高められ
た蛋白質分泌を有する大腸菌突然変異体に関するスクリ
ーニングにかけ、かつ （ｆ） 場合により、工程（ｅ）により得られた高めら
れた蛋白質分泌を有する大腸菌突然変異体を自体公知法
で、プラスミド不含にする、 ことを特徴とする、本発明による大腸菌株の製法により
解決する。
ために好適なプラスミド中に自体公知法で統合してハイ
ブリツドプラスミドとし、 （ｂ） この形成されたハイブリツドプラスミドで、mi
nA−及び／又はminB−突然変異を有する大腸菌株又は外
膜の１種又は複数種の蛋白質に突然変異を有する大腸菌
株を自体公知法で形質転換し、 （ｃ） この形質転換大腸菌株に自体公知法で突然変異
誘発を行ない、かつ （ｄ） その後細胞壁活性物質サイクロセリンにさら
し、 （ｅ） 工程（ｃ）及び工程（ｄ）を行なつた細胞材料
を、自体公知法で、使用した大腸菌株に対して高められ
た蛋白質分泌を有する大腸菌突然変異体に関するスクリ
ーニングにかけ、かつ （ｆ） 場合により、工程（ｅ）により得られた高めら
れた蛋白質分泌を有する大腸菌突然変異体を自体公知法
で、プラスミド不含にする、 ことを特徴とする、本発明による大腸菌株の製法により
解決する。
突然変異誘発は化学的に、例えばＮ−メチル−Ｎ′−
ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（MNNG）を用いて実施
することができる。
ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（MNNG）を用いて実施
することができる。
細胞壁活性物質の例はＤ−サイクロセリンである。特
に、本発明方法において大腸菌DS410もしくは大腸菌BW7
261から出発するのが有利である。
に、本発明方法において大腸菌DS410もしくは大腸菌BW7
261から出発するのが有利である。
本発明方法によれば、生産が望まれている蛋白質の構
造遺伝子を包含するハイブリツドプラスミドで出発菌株
を形質転換することができる。
造遺伝子を包含するハイブリツドプラスミドで出発菌株
を形質転換することができる。
しかしながら、本発明方法を、培地中への所望な多量
蛋白質分泌の特性を有する突然変異体を簡単な方法でス
クリーニングさせる指示蛋白質の構造遺伝子を包含する
ハイブリツドプラスミドで出発菌株をまず形質転換する
というように実施することもできる。この種の突然変異
体は指示蛋白質により確かめられるので、ここで取り扱
かう本発明方法の変法によりプラスミド不含にされ、こ
れによりこのプラスミド不含突然変異的を工業的生産が
望まれる蛋白質の構造遺伝子を包含する他のハイブリツ
ドプラスミドで形質転換する。指示反応としての多糖加
水分解（デンプン加水分解）に関するその能力が容易な
スクリーニングを可能とするので、指示蛋白質の例はCG
Tであある。CGTの使用においてエキソ蛋白質をコードす
るDNAフラグメントを独自の、搬出に必須のシグナル配
列と共に、簡単にかつ目的にあわせてその活性を制御す
ることのできる強力なプロモーターの制御下に、例えば
tac−プロモーターの制御下におく。このためには前記
のDNA−切断部を“マルチコピーナンバー（multicopy−
number）”−プラスミドpJF−118ut中に統合することが
できる。大腸菌株の形質転換、有利にはminA及び／又は
minB−突然変異を有する大腸菌（ミニ細胞株）、例えば
大腸菌DS410、もしくは外膜の１種又は複数種蛋白質中
に突然変異を有する大腸菌、例えば大腸菌BW7261の組換
えプラスミドでの転換の後、化学的突然変異誘発の受容
を行ない、かつ引き続き膜及び細胞壁活性物質を作用さ
せる。Ｄ−サイクロセリンに対する耐性は本発明により
改良された排泄のための使用可能な指示である。細胞壁
活性物質での処理は有利に複数回繰り返す。潜在性分泌
突然変異体は多数の得られた突然変異体から簡単なスク
リーニングシステムで選択される。突然変異体の定量評
価は酵素テスト又はイムノブロツテイング法（Immunobl
otting）により行なわれる。
蛋白質分泌の特性を有する突然変異体を簡単な方法でス
クリーニングさせる指示蛋白質の構造遺伝子を包含する
ハイブリツドプラスミドで出発菌株をまず形質転換する
というように実施することもできる。この種の突然変異
体は指示蛋白質により確かめられるので、ここで取り扱
かう本発明方法の変法によりプラスミド不含にされ、こ
れによりこのプラスミド不含突然変異的を工業的生産が
望まれる蛋白質の構造遺伝子を包含する他のハイブリツ
ドプラスミドで形質転換する。指示反応としての多糖加
水分解（デンプン加水分解）に関するその能力が容易な
スクリーニングを可能とするので、指示蛋白質の例はCG
Tであある。CGTの使用においてエキソ蛋白質をコードす
るDNAフラグメントを独自の、搬出に必須のシグナル配
列と共に、簡単にかつ目的にあわせてその活性を制御す
ることのできる強力なプロモーターの制御下に、例えば
tac−プロモーターの制御下におく。このためには前記
のDNA−切断部を“マルチコピーナンバー（multicopy−
number）”−プラスミドpJF−118ut中に統合することが
できる。大腸菌株の形質転換、有利にはminA及び／又は
minB−突然変異を有する大腸菌（ミニ細胞株）、例えば
大腸菌DS410、もしくは外膜の１種又は複数種蛋白質中
に突然変異を有する大腸菌、例えば大腸菌BW7261の組換
えプラスミドでの転換の後、化学的突然変異誘発の受容
を行ない、かつ引き続き膜及び細胞壁活性物質を作用さ
せる。Ｄ−サイクロセリンに対する耐性は本発明により
改良された排泄のための使用可能な指示である。細胞壁
活性物質での処理は有利に複数回繰り返す。潜在性分泌
突然変異体は多数の得られた突然変異体から簡単なスク
リーニングシステムで選択される。突然変異体の定量評
価は酵素テスト又はイムノブロツテイング法（Immunobl
otting）により行なわれる。
ハイブリツドプラスミド形成、形質転換、突然変異誘
発、細胞壁活性物質での処理、スクリーニング、プラス
ミド除去、細菌の培養、並びに蛋白質獲得に関しては導
入部に記載した文献のような関連技術文献に記載されて
いる。
発、細胞壁活性物質での処理、スクリーニング、プラス
ミド除去、細菌の培養、並びに蛋白質獲得に関しては導
入部に記載した文献のような関連技術文献に記載されて
いる。
本発明は次の利点を提供する： （ａ） 本発明による大腸菌株は産業上利益となる規模
でエキソ蛋白質を生産する。
でエキソ蛋白質を生産する。
（ｂ） 本発明による突然変異体から製造されたエキソ
蛋白質は安価で、かつ短時間で精製されるか、もしくは
更に使用される。
蛋白質は安価で、かつ短時間で精製されるか、もしくは
更に使用される。
エキソ蛋白質を過剰に生産する公知細菌がその生産物
を“封入体”に凝集して細胞内に貯蔵するのに対し、本
発明による突然変異体は過剰に生産したエキソ蛋白質を
定量的に培地中に排泄する。こうして、細胞破壊及び
“封入体”の変性といつた時間がかかり、かつ１部複雑
な工程がなくなる。“封入体”はしばしば搬出すべき蛋
白質のプレ型からなり、こうしてなおシグナル配列を有
し、こうして完全な触媒機能を示すことはない。僅かな
場合にのみ変性が満足のいく程度に達せられるので、本
発明による突然変異体を用いるエキソ蛋白質生産は著し
く方法を容易にした。エキソ蛋白質は培地からのみ（場
合により濾過により）精製すればよいか、又はエキソ酵
素の場合には高い収率のために直接所望の酵素反応に使
用される。
を“封入体”に凝集して細胞内に貯蔵するのに対し、本
発明による突然変異体は過剰に生産したエキソ蛋白質を
定量的に培地中に排泄する。こうして、細胞破壊及び
“封入体”の変性といつた時間がかかり、かつ１部複雑
な工程がなくなる。“封入体”はしばしば搬出すべき蛋
白質のプレ型からなり、こうしてなおシグナル配列を有
し、こうして完全な触媒機能を示すことはない。僅かな
場合にのみ変性が満足のいく程度に達せられるので、本
発明による突然変異体を用いるエキソ蛋白質生産は著し
く方法を容易にした。エキソ蛋白質は培地からのみ（場
合により濾過により）精製すればよいか、又はエキソ酵
素の場合には高い収率のために直接所望の酵素反応に使
用される。
本発明による突然変異体は細菌性エキソ蛋白質生産の
分野に広く使用することができる。市販に有用な蛋白質
に関する遺伝情報を有する所望の組換プラスミドを本発
明ひよる突然変異体中に組換DNA法を用いて挿入するこ
とができる。細菌増殖の静止期においては、エキソ蛋白
質は本発明による突然変異体により特異的に培地中に分
泌される。こうして簡単で、迅速で、かつ安価な所望の
蛋白質の精製が可能である。エキソ蛋白質が酵素である
場合、例えば250mg/又はそれ以上の高い酵素収率のた
めに培地上澄を直接酵素反応に使用することができる。
分野に広く使用することができる。市販に有用な蛋白質
に関する遺伝情報を有する所望の組換プラスミドを本発
明ひよる突然変異体中に組換DNA法を用いて挿入するこ
とができる。細菌増殖の静止期においては、エキソ蛋白
質は本発明による突然変異体により特異的に培地中に分
泌される。こうして簡単で、迅速で、かつ安価な所望の
蛋白質の精製が可能である。エキソ蛋白質が酵素である
場合、例えば250mg/又はそれ以上の高い酵素収率のた
めに培地上澄を直接酵素反応に使用することができる。
実施例 次に実施例につき本発明を詳細に説明する。
例１（本発明による大腸菌突然変異体の製造） 分泌突然変異体の製造のためにCGTに関する遺伝情報
を含有するプラスミドpCM703及び大腸菌DS410を選択す
る。改良された酵素分泌を有する突然変異体に関する指
示体としてCGTを選択した。これに応じて、大腸菌DS410
（pCM703）を完全培地の液体培地中で37℃で培養した。
光学密度１が達せられた後、この培地懸濁液にＮ−メチ
ル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（MNNG）20
μg/mlを添加し、その後更に30分間37℃で恒温保持した
（約90％殺菌）。細胞を燐酸塩緩衝液（pH7.0）で洗浄
することにより、突然変異誘発物質の作用を中断した。
細胞懸濁液の部分量をLB−プレート（デンプン２％、ラ
クトース0.5％及びＤ−サイクロセリンの上昇濃度）に
ひろげる。選択のために使用した抗生物質濃度はＤ−サ
イクロセリン200〜1000μg/mlを有し、この際この濃度
は各突然変異誘発工程の後２倍になつた。37℃で48時間
培養した後、分泌されたCGTの活性に起因するデンプン
加水分解領域（Strkehydrolyseh of）の大きさにより
突然変異体の選択を行なつた。プラスミドをコードする
酵素の改良された保有する分泌能を、指示プレート（ア
ミロペクチンアズール0.5％）上に塗ることにより試験
し、酵素テストにおいて確かめる。多数の突然変異体か
ら最高細胞外酵素活性を示す大腸菌株を選択した（大腸
菌DS410K5とする）。抗生物質不含培地中で多数回培養
することにより、突然変異体をプラスミド不含にするこ
とができた。
を含有するプラスミドpCM703及び大腸菌DS410を選択す
る。改良された酵素分泌を有する突然変異体に関する指
示体としてCGTを選択した。これに応じて、大腸菌DS410
（pCM703）を完全培地の液体培地中で37℃で培養した。
光学密度１が達せられた後、この培地懸濁液にＮ−メチ
ル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（MNNG）20
μg/mlを添加し、その後更に30分間37℃で恒温保持した
（約90％殺菌）。細胞を燐酸塩緩衝液（pH7.0）で洗浄
することにより、突然変異誘発物質の作用を中断した。
細胞懸濁液の部分量をLB−プレート（デンプン２％、ラ
クトース0.5％及びＤ−サイクロセリンの上昇濃度）に
ひろげる。選択のために使用した抗生物質濃度はＤ−サ
イクロセリン200〜1000μg/mlを有し、この際この濃度
は各突然変異誘発工程の後２倍になつた。37℃で48時間
培養した後、分泌されたCGTの活性に起因するデンプン
加水分解領域（Strkehydrolyseh of）の大きさにより
突然変異体の選択を行なつた。プラスミドをコードする
酵素の改良された保有する分泌能を、指示プレート（ア
ミロペクチンアズール0.5％）上に塗ることにより試験
し、酵素テストにおいて確かめる。多数の突然変異体か
ら最高細胞外酵素活性を示す大腸菌株を選択した（大腸
菌DS410K5とする）。抗生物質不含培地中で多数回培養
することにより、突然変異体をプラスミド不含にするこ
とができた。
例２（CGT−分泌） 本発明によるプラスミド不含突然変異体大腸菌DS410K
5をプラスミドpCM703（CGTをコードする）で再形質転換
した。この組換え菌株をLB−液体培地（ラクトース0.5
％及びグルコース0.2％）中で30℃で培養した。24時
間、48時間もしくは72時間恒温保持した後、そのつど細
胞懸濁液の部分量を取り出した。その後、細胞を遠心分
離し、10％デンプン溶液同量で希釈した培地上澄を40℃
で恒温保持した。５分間恒温保持の後、メタノール1.5
容量を添加した。このことは未反応デンプンの沈殿に導
びいた。沈殿したデンプンを遠心分離し、上澄中のシク
ロデキストリン含量をHPCL装置で調べた。次の結果を得
た。
5をプラスミドpCM703（CGTをコードする）で再形質転換
した。この組換え菌株をLB−液体培地（ラクトース0.5
％及びグルコース0.2％）中で30℃で培養した。24時
間、48時間もしくは72時間恒温保持した後、そのつど細
胞懸濁液の部分量を取り出した。その後、細胞を遠心分
離し、10％デンプン溶液同量で希釈した培地上澄を40℃
で恒温保持した。５分間恒温保持の後、メタノール1.5
容量を添加した。このことは未反応デンプンの沈殿に導
びいた。沈殿したデンプンを遠心分離し、上澄中のシク
ロデキストリン含量をHPCL装置で調べた。次の結果を得
た。
単位/ml mg蛋白質／ 24時間 16〜20 64〜 80 48時間 45〜50 180〜200 72時間 55〜60 220〜240 比較例 例２を繰り返したが、大腸菌HB101中にプラスミドpCM
703を形質転換した。培養及び細胞外酵素活性の測定を
同様にして行なつた。次の結果が得られた： 単位/ml mg蛋白質／ 24時間 0.5 ２ 例３（β−ラクタマーゼの分泌） 本発明による突然変異体である大腸菌DS410K5をβ−
ラクタマーゼに関する遺伝情報を有するプラスミドpAP5
で形質転換した。この組換プラスミド中ではβ−ラクタ
マーゼ遺伝子は例えばラクトースでの誘発によりβ−ラ
クタマーゼの過剰表現に作用するtac−プロモーターの
制御下にある。大腸菌DS410 K5（pAP5）の培養及び細
胞外β−ラクタマーゼ−活性の測定のための48時間恒温
保持後の試料採取は例２により行なつた。細胞外β−ラ
クタマーゼ活性は色原体基質、すなわちニトロセフイン
を用いて、480nmにおける分光光度測定法により測定し
た;Biochemistry、第23巻（1984年）、第1282〜1287
頁。次の結果が得られた： 恒温保持時間 上澄中の酵素活性 （相対数値） 48時間 86 比較例２ 例３と同様に行なつたが、組換菌株大腸菌HB101（pAP
5）を使用した。次の結果が得られた： 恒温保持時間 上澄中の酵素活性 （相対数値） 48時間 0.1 例４ 例１及び２による方法を繰り返したが、大腸菌DS410
のかわりに大腸菌株BW7261（tonA22、ompF 627）をプラ
スミドpCM703と共に使用した。これから得られた突然変
異体をプラスミド不含とし、プラスミドpCM703で形質転
換した。この菌株をラクトース0.5％及びグルコース0.2
％を含有する液状完全培地（LB）中で30℃で培養した。
48時間もしくは72時間の恒温保持後、上澄中の酵素活性
を測定した（例２参照） 単位/ml 蛋白質mg/ 48時間 28 140 72時間 42 210 用語解説 minAB−突然変異を有する大腸菌:Davie等著、Bacterio
l.、第158巻（1984年）、第1202〜1203頁。
703を形質転換した。培養及び細胞外酵素活性の測定を
同様にして行なつた。次の結果が得られた： 単位/ml mg蛋白質／ 24時間 0.5 ２ 例３（β−ラクタマーゼの分泌） 本発明による突然変異体である大腸菌DS410K5をβ−
ラクタマーゼに関する遺伝情報を有するプラスミドpAP5
で形質転換した。この組換プラスミド中ではβ−ラクタ
マーゼ遺伝子は例えばラクトースでの誘発によりβ−ラ
クタマーゼの過剰表現に作用するtac−プロモーターの
制御下にある。大腸菌DS410 K5（pAP5）の培養及び細
胞外β−ラクタマーゼ−活性の測定のための48時間恒温
保持後の試料採取は例２により行なつた。細胞外β−ラ
クタマーゼ活性は色原体基質、すなわちニトロセフイン
を用いて、480nmにおける分光光度測定法により測定し
た;Biochemistry、第23巻（1984年）、第1282〜1287
頁。次の結果が得られた： 恒温保持時間 上澄中の酵素活性 （相対数値） 48時間 86 比較例２ 例３と同様に行なつたが、組換菌株大腸菌HB101（pAP
5）を使用した。次の結果が得られた： 恒温保持時間 上澄中の酵素活性 （相対数値） 48時間 0.1 例４ 例１及び２による方法を繰り返したが、大腸菌DS410
のかわりに大腸菌株BW7261（tonA22、ompF 627）をプラ
スミドpCM703と共に使用した。これから得られた突然変
異体をプラスミド不含とし、プラスミドpCM703で形質転
換した。この菌株をラクトース0.5％及びグルコース0.2
％を含有する液状完全培地（LB）中で30℃で培養した。
48時間もしくは72時間の恒温保持後、上澄中の酵素活性
を測定した（例２参照） 単位/ml 蛋白質mg/ 48時間 28 140 72時間 42 210 用語解説 minAB−突然変異を有する大腸菌:Davie等著、Bacterio
l.、第158巻（1984年）、第1202〜1203頁。
大腸菌DS410:DSM4513、ドイツ微生物保存機関（Deutsch
e Sammlung von Microorganismen、Mascherorder Weg1
b、3300 Braunschweig. 外膜中の蛋白質の突然変異を有する大腸菌株:Wanner、
J.Mol.Biol.、第191巻（1986年）、第39頁。
e Sammlung von Microorganismen、Mascherorder Weg1
b、3300 Braunschweig. 外膜中の蛋白質の突然変異を有する大腸菌株:Wanner、
J.Mol.Biol.、第191巻（1986年）、第39頁。
大腸菌BW7261:DSM5231、ドイツ微生物保存機関 大腸菌HB101:例えばDSM1607 pJF 118 ut:第１図 pCM 703 ：第２図 pAP ５ ：第３図 tac:tac−プロモーター;De Boer等著、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA、第80巻（1983年）第21〜25頁 CGT:CGT（シクロデキストリングリコシルトランスフエ
ラーゼ）に関する構造遺伝子（シグナル配例を包含す
る） t ：ターミネーター amp ： アンピシリン耐性 tet ：テトラサイクリン耐性 lac I:lac−リプレツサー BamH I、Cla I、EcoR I、Hind III、Nru I、Pst I、Pvu
I、Sca I:制限酵素
Sci.USA、第80巻（1983年）第21〜25頁 CGT:CGT（シクロデキストリングリコシルトランスフエ
ラーゼ）に関する構造遺伝子（シグナル配例を包含す
る） t ：ターミネーター amp ： アンピシリン耐性 tet ：テトラサイクリン耐性 lac I:lac−リプレツサー BamH I、Cla I、EcoR I、Hind III、Nru I、Pst I、Pvu
I、Sca I:制限酵素
第１図はpJF118utを示す図であり、第２図はpCM703を示
す図であり、第３図はpAPを示す図である。
す図であり、第３図はpAPを示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヴイープケ・ザイデル ドイツ連邦共和国ヴアルトハウゼン‐ビ ルケンハルト・レーメルベルクシユトラ ーセ 10 (72)発明者 ゲルハルト・シユミート ドイツ連邦共和国ミユンヘン60・ドルフ シユトラーセ ９アー (72)発明者 ガブリエレ・ミユラー ドイツ連邦共和国アシユハイム・ヴエン デルシユタイン シユトラーセ ７ (56)参考文献 特開 昭62−166881（ＪＰ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】（ａ）発現すべきエキソ蛋白質の構造遺伝
子を、発現のために好適なプラスミド中に自体公知法で
統合してハイブリッドプラスミドとし、 （ｂ）この形成されたハイブリッドプラスミドで、minA
−及び／又はminB−突然変異を有する大腸菌株又は外膜
の１種又は複数種の蛋白質に突然変異を有する大腸菌株
を自体公知法で形質転換し、 （ｃ）この形質転換大腸菌株に自体公知法で突然変異誘
発を行ない、かつ （ｄ）その後細胞壁活性物質サイクロセリンにさらし、 （ｅ）行程（ｃ）及び行程（ｄ）を行なった細胞材料
を、自体公知法で、使用した大腸菌株に対して高められ
た蛋白質分泌を有する大腸菌突然変異体に関するスクリ
ーニングにかけ、かつ （ｆ）場合により、行程（ｅ）により得られた高められ
た蛋白質分泌を有する大腸菌突然変異体を自体公知法
で、プラスミド不含にすることを特徴とする、48時間以
内に少なくとも蛋白質140mg/を培地中に分泌する大腸
菌株の製法。 - 【請求項２】48時間以内に少なくとも蛋白質140mg/を
培地中に分泌する、minA−及び／又はminB−突然変異を
有するか、又は外膜の１種又は複数種の蛋白質に突然変
異を有する請求項１により製造された大腸菌株。
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|---|---|---|---|
| DE3813107.2 | 1988-04-19 | ||
| DE3813107A DE3813107A1 (de) | 1988-04-19 | 1988-04-19 | Sekretormutante von escherichia coli |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0235077A JPH0235077A (ja) | 1990-02-05 |
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ID=6352379
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| JPS62166881A (ja) * | 1986-01-16 | 1987-07-23 | Michio Matsuhashi | 大腸菌のペリプラズム蛋白質分泌変異株 |
| ATE122391T1 (de) * | 1987-01-30 | 1995-05-15 | Harvard College | Periplasmische protease-mutanten von escherichia coli. |
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-
1989
- 1989-04-13 EP EP89106554A patent/EP0338410B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-04-13 AT AT89106554T patent/ATE112320T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-04-13 DE DE58908428T patent/DE58908428D1/de not_active Expired - Lifetime
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- 1989-04-18 DK DK198901865A patent/DK174508B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-04-19 JP JP1097687A patent/JP3040402B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| DE3813107A1 (de) | 1989-11-02 |
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