DK174508B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af en E. coli-stamme til proteinsekretion af mindst 140 mg protein pr. liter i løbet af 48 timer i dyrkningsmediet, ved fremgangsmåden fremstillelig E. coli-stamme og dennes anvendelse - Google Patents

Description

i DK 174508 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af en E. coli-stamme til proteinsekretion af mindst 140 mg protein pr. liter i løbet af 48 timer i dyrkningsmediet, ved fremgangsmåden fremstillelig E. coli-stamme og dennes anven-5 delse til produktion af et ønsket protein ved massiv sekretion i dyrkningsmediet.

På grund af gramnegative bakteriers cellevægsstruktur er man hidtil gået ud fra, at der ikke kan finde en effektiv sekretion af proteiner over i dyrkningsmediet sted, da den 10 ydre membran udgør en kraftig permeabilitetsbarriere. Naturligvis er bakterien E. coli ikke i stand til at sekretere eller udsluse proteiner til dyrkningsmediet. Kun proteinud-. førsel til periplasmaet er mulig ved E. coli. Proteinerne hæmolysin og colicin er to undtagelser. Disse exoproteiner 15 er dog særtilfælde, da der for det foreliggende exoprotein deltager specifikke sekretionsproteiner ved udslusningsprocessen; jf. Wagner et al., J. Biol. Chem. 369. 39-46 (1988).

Der er endvidere i litteraturen beskrevet artificielle sekretionssystemer for E. coli, hvilke dog kun fører til 20 ringe exoproteinudbytter i dyrkningsmediet eller hvor systemernes anvendelighed er begrænset.

(a) Såkaldte "leaky"-mutanter. Sådanne mutanter kendes f.eks. fra E. coli K12, hvorved periplasmatiske eller peri-plasmatisk berigede proteiner når dyrkningsmediet på grund 25 af en defekt i den ydre membran. Der er tale om en ikke-specifik mekanisme; jf. Lazzosoni & Portalier, J. Bact.

145, 1351-1358 (1981) . Ved disse "leaky"-mutanter er der til dels tale om stammer med forandret lipopolysaccharid- •i struktur, til dels om stammer med ændrede lipopolyprotein-j 30 dele i den ydre membran; jf. Hirota et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 7£, 1417-1420 (1977), samt Yem og Wu, J.

Bacteriol. 133. 1419-1426 (1978). Også mutationer i de såkaldte "tol"-loci fører via aktivering af phospholipase A til "leaky"-fænotypen. Der kan herved være tale om specifik 35 eller ikke-specifik "leakage".

(b) Proteinsekretion ved protein A-fusion ifølge 1 2 DK 174508 B1 EP-A-0.225.860. Til grund for denne kendte teknik ligger den iagttagelse, at induktionen af filamentvækst i E. coli fører til sekretion af periplasmatiske proteiner i dyrkningsmediet.

E. coli udviser filamentvækst, når der induceres den såkaldte 5 varme-chok-reaktion. Når det ønskede genprodukts ekspression altså gøres afhængig af varme-chok-reaktionen, kan der opnås en sekretion af det ønskede, i periplasmaet berigede protein.

Ved denne fremgangsmåde benytter man sig af, at protein A fra Staphylococcus aureus samt fragmenter af dette protein ud-10 løser en varme-chok-reaktion i E. coli. Sandsynligvis udgør protein A i E. coli endog selv et varme-chok-protein, da det besidder en sigma-32-agtig promotorstruktur opstrøms fra den egentlige promotor, hvorved virkningen yderligere potenseres. Forbinder man altså promotorsekvens, signalse-15 kvens og N-terminale fragmenter fra protein A med det ønskede proteins genetiske information, kan der via varme-chok-reak-tionen og filamentvækst ske en sekretion af periplasmatiske proteiner i dyrkningsmediet. Dette system er ganske vist problematisk, for så vidt som der ved varme-chok-reaktionen 20 yderligere induceres den ATP-afhængige protease La. Der fås således en proteolytisk nedbrydning af det ønskede protein.

Det ville således være ønskeligt at anvende en La-deficient stamme (Ion"; jf. Young og Davis, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 80, 1194-1198 (1983)) til produktionen. Der er dog ikke 25 hidtil blevet tilvejebragt en sådan stamme.

(c) Ekstracellulær fremstilling af penicillinase og xylanase ifølge EP-A-0.121.138. Denne kendte teknik angår en fremgangsmåde under anvendelse af specielle E. coli-kon-struktioner til sekretion af penicillinase og xylase i dyrk- 30 ningsmediet. Denne kendte fremgangsmåde er altså begrænset til udvindingen af specielle proteiner.

(d) I Patent Abstracts of Japan, bd. 12, nr. 11 (C 468) [2858] fra 13. januar 1988 er der beskrevet en E. coli--stamme, der fås ved mutation af stammen E. coli HJ-2 med 35 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin. Denne stamme kan temperaturkontrolleret sekretere periplasmatiske proteiner såsom ....... .............—..... .................................. »! Mill·*··™ Hin 3 DK 174508 B1 Ø-lactamase fra cellen.

Det er formålet med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe E. coli-stammer til proteinsekretion af mindst 140 mg protein pr. liter i løbet af 48 timer i dyrknings-5 mediet samt en fremgangsmåde til deres fremstilling og anvendelse. Det er endvidere formålet at opnå - en exoprotein-produktion i E. coli som en ikke-patogen organisme, - en højest mulig sekretionshastighed og 10 - en enkel oparbejdning af exoproteinet fra dyrkningsmediet (eventuelt efter filtrering).

i

Dette formål opnås ifølge en udførelsesform for opfindelsen ved en fremgangsmåde af den allerede angivne art, 15 hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man (a) på i og for sig kendt måde integrerer strukturgenet for et exoprotein, der skal eksprimeres, i et til ekspressionen egnet plasmid til et hybridplasmid, (b) på i og for sig kendt måde transformerer en E.

20 coli-stamme med minA- og/eller minB-mutation eller en E.

coli-stamme med én mutation i ét protein eller i flere proteiner i den ydre membran med det dannede hybridplasmid, (c) på i og for sig kendt måde underkaster den transformerede E. coli-stamme en mutagenese og 25 (d) derefter eventuelt udsætter den for cellevægs aktive stoffer, (e) på i og for sig kendt måde underkaster det cellemateriale, der er blevet underkastet trin (c) og eventuelt (d), en screening for E. coli-mutanter med forhøjet protein- 30 sekretion i forhold til den anvendte E. coli-stamme, og (f) eventuelt på i og for sig kendt måde gør de/den i trin (e) udvundne E. coli-mutant(er) med forhøjet proteinsekretion plasmidfri(e).

Ved begrebet strukturgenet for et exoprotein forstås 35 her (trin a) og i det følgende den for det ønskede protein kodende DNA-sekvens inklusive dens eller en for udførslen i 4 DK 174508 B1 essentiel signalsekvens (leadersekvens).

Mutagenesen kan gennemføres kemisk, f.eks. med N-methyl-N1-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG).

Et eksempel på et cellevægsaktivt stof er D-cyclo- 5 serin.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen gås der fortrinsvis ud fra E. coli DS 410 eller E.coli BW 7261.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan udgangs-stammen transformeres med et hybridplasmid, som omfatter 10 strukturgenet for det protein, hvis produktion er ønsket.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan dog også gennemføres således, at udgangsstammen først transformeres med et hybridplasmid, som omfatter strukturgenet for et indikatorprotein, ved hjælp af hvilket man på enkel måde kan 15 screene mutanter, der besidder den ønskede egenskab, en massiv proteinsekretion i dyrkningsmediet. Har man ved hjælp af indikatorproteinet opnået en sådan mutant, gøres denne mutant ifølge den her beskrevne variant af fremgangsmåden ifølge opfindelsen plasmidfri, hvorefter den plasmidfri 20 mutant transformeres med et andet hybridplasmid, som indeholder strukturgenet for et protein, hvis tekniske produktion er ønsket.

Et eksempel på et indikatorprotein er CGT, da dets evne til polysaccharid-hydrolyse (stivelseshydrolyse) som 25 indikatorreaktion tillader en bekvem screening. Ved anvendelse af CGT sættes det for exoproteinet kodende DNA-fragment sammen med den essentielle egensignalsekvens for udførslen under en kraftig promotors kontrol, hvis aktivitet let og målrettet kan reguleres, f.eks. under tac-promotorens kon-30 trol. Hertil kan det nævnte DNA-afsnit integreres i "multi-copi-number"-plasmidet pJF118ut. Efter transformation af en E. coli-stamme med minA- og/eller minB-mutation (minicellestamme) , såsom E. coli DS 410, eller med en mutation i ét protein eller i flere proteiner i den ydre membran, såsom 35 E.coli BW 7261, med det rekombinante plasmid underkastes recipienten en kemisk mutagenese og udsættes derefter for ...........................................— ——---.——».I I MM' Ml IMI Ml) RI III III mi HIM III lUMMBIIIMniUi DK 174508 61 5 membran- eller cellevægsaktive stoffer. En resistens mod D-cycloserin er erfaringsmæssigt et brugbart indicium på en forbedret udslusning. Behandlingen med et cellevægsaktivt stof gentages hensigtsmæssigt flere gange. Potentielle sekre-5 tormutanter udvælges fra det store antal af de opnåede mutanter ved hjælp af et enkelt screeningssystem. Den kvantitative vurdering af mutanterne sker ved hjælp af en enzymanalyse eller immunoblotting.

I øvrigt kan fagmanden med hensyn til hybridplasmid-10 dannelsen, transformationen, mutagenesen, behandlingen med cellevægsaktive stoffer, screeningen, plasmid-fjernelsen, dyrkningen af bakterierne samt proteinudvindingen henholde sig til den pågældende kendte teknik, f.eks. til den indledningsvis citerede litteratur.

15 Det allerede angivne formål opnås endvidere ifølge opfindelsen med en E. coli-stamme med en minA- og/eller minB-mutation eller en mutation i ét protein eller i flere proteiner i den ydre membran til proteinsekretion af mindst 140 mg protein pr. liter i løbet af 48 timer i dyrknings-20 mediet, således som denne stamme kan fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Opfindelsen giver følgende fordele: (a) E. coli-stammerne ifølge opfindelsen producerer exoproteiner i industriel interessant målestok.

25 (b) det af mutanterne ifølge opfindelsen fremstillede exoprotein kan oprenses billigt og med et ringe forbrug af tid eller kan videreanvendes direkte.

Medens kendte bakterier, der har en overproduktion af exoproteiner, aggregerer deres produkter til "Indusionsbo-30 dies" (indesluttede legemer), der aflejres intracellulært, sluser mutanterne ifølge opfindelsen kvantativt en overproduktion af exoprotein ud i dyrkningsmediet. Dermed bortfalder den tidsforbrugende og delvis komplicerede celleåbningsproces og renatureringen af "Inclusionsbodies". "In-35 clusionsbodies" består som oftest af præ-former af det protein, der skal føres ud, og har altså endnu signalsekven- DK 174508 B1 6 sen og har dermed ingen fuldstændig katalytisk funktion. Da renatureringen i få tilfælde lykkedes i tilfredsstillende udstrækning, gør exoproteinproduktionen ved hjælp af mutanterne ifølge opfindelsen fremgangsmåden meget lettere. Exo-5 proteinet skal kun oprenses fra dyrkningsmediet (eventuelt efter filtrering) eller kan på grund af de høje udbytter anvendes direkte i tilfælde af exoenzymer til den ønskede enzymreaktion.

Mutanterne ifølge opfindelsen kan finde bred anven-10 delse inden for området bakteriel exoprotein-produktion. Et ønsket rekombinant plasmid, der bærer den genetiske information for et kommercielt interessant protein, kan indføres i mutanterne ifølge opfindelsen ved hjælp af den rekombinante DNA-tekniks metoder. I løbet af bakterievækstens stationære 15 fase secerneres exoproteinet specifikt ved hjælp af mutanterne ifølge opfindelsen i dyrkningsmediet. Dermed er en enkel, hurtig og billig oprensning af det ønskede protein mulig. Er der ved exoproteinet tale om et enzym, kan dyrkningsmediets overstående væske anvendes direkte til den 20 efterfølgende enzymreaktion på grund af de store enzymudbytter på f.eks. 250 mg/1 eller mere.

Opfindelsen illustreres yderligere nedenfor ved hjælp af eksempler.

25 Eksempel 1 (fremstilling af en E. coli-mutant ifølge opfindelsen)

Til fremstilling af en sekretormutant udvælges plas-midet pCM703, hvilket indeholder den genetiske information 3 0 for en CGT, og E. coli DS 410. CGT udvælges som indikator for mutanter med forbedret enzymsekretion. Dertil svarende dyrkes E. coli DS 410 (pCM703) i bouillonkultur i fuldmedium ved 37*C. Når man har opnået en optisk tæthed på 1 sættes 20 Mg/ml N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) til 35 dyrkningssuspensionen, hvorefter der inkuberes i yderligere 30 minutter ved 37*c (drab på ca. 90%). Ved vask af cellerne ...................................................ιτ,ιι mi lim Ί1·Ι ι » n· mil ill 11 Bil) | »m | || ;| | |, , „HW IΙΙΙΙΗ |||, 7 DK 174508 B1 med phosphatpuffer (pH 7,0) afbrydes mutagenets virkning. Alikvoter af cellesuspensionen spredes på LD-plader (2% stivelse, 0,5% lactose og stigende koncentrationer D-cyclo-serin). De til selektionen anvendte antibiotikum-koncentra-5 tioner udgør 200 til 1000 μg D-cycloserin/ml, idet koncentrationen efter hvert mutagenesetrin fordobles. Efter 48 timers inkubation med 37"C udføres udvælgelsen af mutanterne på baggrund af stivelsehydrolyseringenes størrelse, hvilke hidrører fra den secernerede CGT's aktivitet. Poten-10 tiel forbedret udslusning af det enzym, som plasmidet koder for, undersøges ved hjælp af udstrygning på indikatorplader (0,5% amylopektinazur), og det bekræftes ved en enzymatisk analyse. Ud fra mange mutanter udvælges den E. coli-stamme, der har den højeste ekstracellulære enzymaktivitet (betegnet: 15 E. coli DS 4io K5) . Ved dyrkning flere gange i antibiotikumfrit medium kan mutanten gøres plasmidfri-

Eksempel 2 (CGT-sekretion) 20 Den plasmidfrie mutant E. coli DS 410 K5 ifølge op findelsen retransformeres med plasmidet pCM703 (der koder for en CGT). Den rekombinante stamme dyrkes i LB-bouillon-medium (0,5% lactose og 0,2% glucose) ved 30*C. Efter inkubation i 24 timer, 48 timer og 72 timer udtages hver gang 25 en alikvot af cellesuspensionen. Herefter fracentrifugeres cellerne, hvorefter den fortyndede ovenstående dyrkningsvæske inkuberes med et lignende rumfang af en 10%*s stivelsesopløsning ved 40*0. Efter en inkubationsvarighed på 5 minutter tilsættes 1,5 rumfangsdele methanol, hvilket fører til ud-j 30 fældning af ikke-omsat stivelse. Den udfældede stivelse fracentrifugeres, hvorefter cyclodextrinindholdet i den ovenstående væske måles ved hjælp af et HPLC-anlæg. Der fås følgende resultater: 8 DK 174508 B1

Enheder/ml mg protein/1 24 t 16-20 64-80 48 t 45-50 180-200 5 72 t 55-60 220-240

Sammenligningseksempel 1

Eksempel 2 gentages med den undtagelse, at plasmidet 10 pCM703 transformeres i E. coli HB101. Dyrkning og bestemmelse af den ekstracellulære enzymaktivitet sker analogt roed eksempel 2. Der fås følgende resultaters 15 Enheder/ml mg protein/1 24 t 0,5 2

Eksempel 3 (sekretion af /3-lactamase) 20 Mutanten E. coli DS 410 K5 ifølge opfindelsen trans formeres med plasmidet pAP5, der bærer den genetiske information for /3-lactamase. I dette rekombinante plasmid er /3-lactaroase-genet styret af tac-promotoren, der ved induktion med f.eks. lactose bevirker overekspression af /3-lactamase.

25 Dyrkning af E. coli DS 410 K5 (pAP5) og prøveudtagelsen efter 48 timers inkubation til bestemmelse af den ekstracel-lulære /3-lactamase-aktivitet sker som anført i eksempel 2.

Den ekstracellulære /3-lactamase-aktivitet bestemmes spektral-fotometrisk ved 480 nm ved hjælp af et chromogent substrat, 30 nemlig Nitrocefin; jf. Biochemistry 22, 1282-1287 (1984).

Der fås følgende resultat: /

Enzymaktivitet

Inkubationsvarighed i den ovenstående væske 35 (relative tal) 48 t 86 40 ~ ......... ' 1 mm MiMiiMiniiimmun nm Ml mil ilIMlMHii IH ·ΐ ·Η·Ι I I BOM ΙΗΒΜΗΗ 9 DK 174508 B1

Sammenligningseksempel 2

Eksempel 3 efterlignes med den ændring, at den rekom-binante stamme E. coli HB101 (pAP5) anvendes. Der fås føl-5 gende resultat:

Enzymaktivitet

Inkubationsvarighed i den ovenstående væske (relative tal) 10 48 t 0,1

Eksempel 4 15 Fremgangsmåden ifølge eksemplerne 1 og 2 gentages med den ændring, at der i stedet for E.coli DS 410 anvendes E.coli-stammen BW 7261 (ton A22, ompF 627) med plasmidet pCM 703. De derudfra opnåede mutanter gøres plasmidfrie og retransformeres med plasmidet pCM 703. Denne stamme dyrkes 20 i et flydende fuldmedium (LB), der indeholder 0,5% lactose og 0,2% glucose, ved 30*C. Eter inkubation i 48 timer og 72 timer, bestemmes enzymaktiviteten i den ovenstående væske (se eksempel 2).

25 Enheder/ml mg protein/1 i 48 t 28 140 ; 72 t 42 210 ! ! i 10 DK 174508 B1

Gloser E. coli-stamme med minAB-mutation: Davis et al., J. Bac-teriol. 158, 1202-1203 (1984).

E. coli DS 410: DSM 4513, Deutsche Sammlung von Mikroorga-5 nismen, Mascheroder Weg lb, 3300 Braunschweig E.coli-stamme med en mutation af protein i den ydre membran:

Wanner, J. Mol. Biol 191. 39 (1986).

E.coli BW 7261, DSM 5231, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Mascheroder Weg lb, 3300 Braunschweig.

10 E. Coli HB101: f.eks. DSM 1607 pJFlieut: Fig. 1 pCM703: Fig. 2 pAP5: Fig. 3 tac: tac-promotor? jf. De Boer et al., Proc. Natl. Acad.

15 Sci. USA 80, 21-25 (1983).

CGT: Strukturgen for CGT (cyclodextringlycosyltransferase) (inklusiv signalsekvens) t: Terminator amp: Ampicillin-resistens 20 tet: Tetracyclin-resistens lacl: lac-repressor

Liste over anførte restriktionsenzymer:

BamH I 25 Cla I

EcoR I Hind III Nru I Pst I 30 Pvu I

V

Sea I

..........................................—~ " - " ........ " i" .....-*«· mu imr ιι ·ι·πι i ,ιιπ m mmmm hi il mm I

Claims (8)

11 DK 174508 B1 Patentkrav.

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en E. coli-stamme til proteinsekretion af mindst 140 mg protein pr. liter i løbet af 48 timer i dyrkningsmediet, kendetegnet 5 ved, at man (a) på i og for sig kendt måde integrerer strukturgenet for et exoprotein, der skal eksprimeres, i et til ekspressionen egnet plasmid til et hybridplasmid, (b) på i og for sig kendt måde transformerer en E. 10 coli-stamme med minA- og/eller minB-mutation eller en E. coli-stamme med én mutation i ét protein eller i flere proteiner i den ydre membran med det dannede hybridplasmid, (c) på i og for sig kendt måde underkaster den transformerede e. coli-stamme en mutagenese og 15 (d) derefter eventuelt udsætter den for cellevægs aktive stoffer, (e) på i og for sig kendt måde underkaster det cellemateriale, der er blevet underkastet trin (c) og eventuelt (d), en screening for E. coli-mutanter med forhøjet protein- 20 sekretion i forhold til den anvendte E. coli-stamme, og (f) eventuelt på i og for sig kendt måde gør de/den i trin (e) udvundne E. coli-mutant(er) med forhøjet proteinsekretion plasmidfri(e).

2. Fremgangsmåde ifølge krav i, kendete g- 25. e ved, at man i trin (c) ifølge krav 1 mutageniserer kemisk, f.eks. med N-methyl-N1-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG).

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kende tegnet ved, at man i trin (d) ifølge krav 1 som cel- 30 levægsaktivt stof anvender D-cycloserin.

4. Fremgangsmåde ifølge krav i, kendeteg net ved, at man anvender E. coli DS 410 (DSM 4513).

5. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendeteg net ved, at man anvender E. coli BW 7261 (DSM 5231).

6. Fremgangsmåde ifølge et af kravene 1-5, ken detegnet ved, at man i trin (a) ifølge krav l an- DK 174508 B1 12 vender CGT-strukturgenet, i trin (e) ifølge krav 1 vælger en polysaccharid-hydrolyse af den dannede CGT som indikatorreaktion for E. coli-mutanter med forøget proteinsekretion og herefter udfører trin (f) ifølge krav 1. 5 7. E. Coli-stamme med en minA- og/eller minB-mutation eller en mutation i ét protein eller i flere proteiner i den ydre membran til proteinsekretion af mindst 140 mg protein pr. liter i løbet af 48 timer i dyrkningsmediet, hvilken stamme kan fremstilles ifølge et eller flere af kravene 1-6.

8. Anvendelse af en E. coli-stamme ifølge krav 7 til produktion af et ønsket protein ved massiv sekretion i dyrkningsmediet. ....................-............................— ......-......... -........" ....................1.......mm ...............il Hin· i I i. I am·« Ml ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙ·ΙΙ·ΒΒ»