JPS5921389A - クロ−ン化ストレプトマイセス属菌遺伝子 - Google Patents
クロ−ン化ストレプトマイセス属菌遺伝子Info
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はバイオテクノロジイ、とくに遺伝子工学に関す
る。さらに詳しくは、本発明はストレプトマイセス菌種
からのβ−ガラクトシダーゼおよび他の分泌タンパク質
をコードする遺伝子のクローン化、適当なベクターに対
するそのプロモーター、そのクローン化遺伝子の他の微
生物への発現、生育培地中に分泌されるβ−ガラクトシ
ダーゼをモニターすることによりβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子を検出および同定する方法、およびそのクローン
化遺伝子を各種遺伝子工学の目的に使用することに関す
る。
る。さらに詳しくは、本発明はストレプトマイセス菌種
からのβ−ガラクトシダーゼおよび他の分泌タンパク質
をコードする遺伝子のクローン化、適当なベクターに対
するそのプロモーター、そのクローン化遺伝子の他の微
生物への発現、生育培地中に分泌されるβ−ガラクトシ
ダーゼをモニターすることによりβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子を検出および同定する方法、およびそのクローン
化遺伝子を各種遺伝子工学の目的に使用することに関す
る。
従来技術
放線菌類の微生物は二次代謝産物として臨床的にあるい
は他の用途に有用な公知の抗生物質の大半を産生し、そ
のために、遺伝子操作を適用する対象として注目されて
いるが、特定の有用な遺伝子を同定およびクローン化す
る前に解決すべき多くの問題を残している（‘Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍｓ’Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ａｎｄ ０ｋａｎｉｓｈｉ
著、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）
講談者（東京）、１９８０、１３０〜１３１頁を参照）
。これまでに、ストレプトマイセス菌種からのβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子を適当なベクターにてクローニング
し、ついでそのベクターを導入、発現させることが報告
されている。これまでの仕事は、ストレプトマイセス属
のための他のクローニング系およびベクターの開発に関
するもの〔Ｂｉｂｂ ｅｔ ａｌ（１９７８），Ｎａｔ
ｕｒｅ ２７４，３９８−４００；Ｈａｙａｋａｗａ
ｅｔ ａｌ（１９７９），Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．ＸＸ
ＸＩＩ（１２），１３４８１３５０；Ｏｋａｎｉｓｈｉ
ｅｔ ａｌ（１９８０）．Ｊ−Ａｎｔｉｂｉｏｔ．Ｘ
ＸＸＩＩＩ（１），８８−９１；Ｂｉｂｂ ｅｔ ａｌ
（１９８０），Ｎａｔｕｒｅ ２８４，５２６−５３１
；Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔ ａｌ（１９８０），Ｎａｔｕ
ｒｅ ２８６，５２５−５２７；Ｓｕａｒｅｚ ｅｔ
ａｌ（１９８０），Ｎａｔｕｒｅ ２８６，５２７−５
２９；Ｂｉｂｂ ｅｔ ａｌ（１９８１），Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８４，２３０−２４０；Ｂｉｂｂ
（１９８１），‘Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８１
’，Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ，（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）１９８１，３
６７ ３７０；およびＨｏｐｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ（１
９８１），‘Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８１’，
上記，．３７６−３７９〕，大腸菌から誘導された遺伝
子のストレプトマイセス菌種でのクローニングおよび発
現に関するもの〔Ｓｃｈｏｔｔｅｌ ｅｔ ａｌ（１９
８１），Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４６，３６０−３
６８〕、およびストレプトマイセス属菌からの遺伝子の
大腸菌でのクローニングに関するもの〔‘Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
ｏｆＡｐｐｌｉｃｄ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ
’前記、１３０−１３７〕などである。チャターら〔Ｃ
ｈａｔｅｒ ｅｒ ａｌ（１９８２），Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６，６９−９５）はストレプトマイ
セス属菌における遺伝子クローニングについて評論を加
え上記の文献を引用している。
は他の用途に有用な公知の抗生物質の大半を産生し、そ
のために、遺伝子操作を適用する対象として注目されて
いるが、特定の有用な遺伝子を同定およびクローン化す
る前に解決すべき多くの問題を残している（‘Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍｓ’Ｓａｋａｇｕｃｈｉ ａｎｄ ０ｋａｎｉｓｈｉ
著、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）
講談者（東京）、１９８０、１３０〜１３１頁を参照）
。これまでに、ストレプトマイセス菌種からのβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子を適当なベクターにてクローニング
し、ついでそのベクターを導入、発現させることが報告
されている。これまでの仕事は、ストレプトマイセス属
のための他のクローニング系およびベクターの開発に関
するもの〔Ｂｉｂｂ ｅｔ ａｌ（１９７８），Ｎａｔ
ｕｒｅ ２７４，３９８−４００；Ｈａｙａｋａｗａ
ｅｔ ａｌ（１９７９），Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．ＸＸ
ＸＩＩ（１２），１３４８１３５０；Ｏｋａｎｉｓｈｉ
ｅｔ ａｌ（１９８０）．Ｊ−Ａｎｔｉｂｉｏｔ．Ｘ
ＸＸＩＩＩ（１），８８−９１；Ｂｉｂｂ ｅｔ ａｌ
（１９８０），Ｎａｔｕｒｅ ２８４，５２６−５３１
；Ｔｈｏｍｐｓｏｎｅｔ ａｌ（１９８０），Ｎａｔｕ
ｒｅ ２８６，５２５−５２７；Ｓｕａｒｅｚ ｅｔ
ａｌ（１９８０），Ｎａｔｕｒｅ ２８６，５２７−５
２９；Ｂｉｂｂ ｅｔ ａｌ（１９８１），Ｍｏｌ．Ｇ
ｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８４，２３０−２４０；Ｂｉｂｂ
（１９８１），‘Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８１
’，Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ，（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）１９８１，３
６７ ３７０；およびＨｏｐｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ（１
９８１），‘Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８１’，
上記，．３７６−３７９〕，大腸菌から誘導された遺伝
子のストレプトマイセス菌種でのクローニングおよび発
現に関するもの〔Ｓｃｈｏｔｔｅｌ ｅｔ ａｌ（１９
８１），Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４６，３６０−３
６８〕、およびストレプトマイセス属菌からの遺伝子の
大腸菌でのクローニングに関するもの〔‘Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
ｏｆＡｐｐｌｉｃｄ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ
’前記、１３０−１３７〕などである。チャターら〔Ｃ
ｈａｔｅｒ ｅｒ ａｌ（１９８２），Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６，６９−９５）はストレプトマイ
セス属菌における遺伝子クローニングについて評論を加
え上記の文献を引用している。
各種のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、それらの発現なら
びにその発現の試験および検定法に適用する研究につい
て報告がなされており、例えば、大腸菌からのβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子に融合した酵母遺伝子の酵母での発
現について〔Ｒｏｓｅｅｔ ａｌ（１９８１），Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８（４），
２４６０−２４６４〕、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の
大腸菌のプロモーターへの融合とその試験ならびに形質
転換について〔Ｃａｓａｄａｂａｎ ｅｔａｌ（１９８
０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３８，１７９−２０７
〕、β−ガラクトシダーゼ−プレプロインシュリン融合
タンパク質をコードするプラスミドを含む大腸菌の構築
について〔Ｔａｌｍａｄｇｅ ｅｔ ａｌ（１９８１）
，Ｎａｒｕｒｅ ２９４，１７６−１７８〕などがある
。
びにその発現の試験および検定法に適用する研究につい
て報告がなされており、例えば、大腸菌からのβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子に融合した酵母遺伝子の酵母での発
現について〔Ｒｏｓｅｅｔ ａｌ（１９８１），Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８（４），
２４６０−２４６４〕、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の
大腸菌のプロモーターへの融合とその試験ならびに形質
転換について〔Ｃａｓａｄａｂａｎ ｅｔａｌ（１９８
０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３８，１７９−２０７
〕、β−ガラクトシダーゼ−プレプロインシュリン融合
タンパク質をコードするプラスミドを含む大腸菌の構築
について〔Ｔａｌｍａｄｇｅ ｅｔ ａｌ（１９８１）
，Ｎａｒｕｒｅ ２９４，１７６−１７８〕などがある
。
一般に、プロモーターの活性は、特定のプロモーターか
ら出発して転写の結果形成される遺伝子生成物の量を測
ることにより調べることができる。
ら出発して転写の結果形成される遺伝子生成物の量を測
ることにより調べることができる。
形成された遺伝子生成物の量は、その遺伝子生成物の特
定の性質、例えば酵素活性を利用して測定することがで
きる。遺伝子の発現の研究または高発現ベクターの構築
（それは高効率プロモーターに依存する）においては、
そのようなプロモーターから自然に発現される遺伝子を
構造遺伝子で置き換えることが行なわれ、その生成物は
より容易にモニターできる。大腸菌からのｌａｃＺ遺伝
子（前記Ｃａｓａｄａｂａｎ ｅｔ ａｌ（１９８０）
の文献を参照）はこの目的に汎用されている。
定の性質、例えば酵素活性を利用して測定することがで
きる。遺伝子の発現の研究または高発現ベクターの構築
（それは高効率プロモーターに依存する）においては、
そのようなプロモーターから自然に発現される遺伝子を
構造遺伝子で置き換えることが行なわれ、その生成物は
より容易にモニターできる。大腸菌からのｌａｃＺ遺伝
子（前記Ｃａｓａｄａｂａｎ ｅｔ ａｌ（１９８０）
の文献を参照）はこの目的に汎用されている。
各種の染色体遺伝子基質、例えば５−プロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（以下、“
Ｘ−ｇａｌ”と略称する）またはｏ−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトシド（以下、“ＯＮＰＧ”と略称する
）などは、ミラーの文献に示されるように酵素活性をモ
ニターするのに用いられる〔Ｍｉｌｌｅｒ（１９７２）
，“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎＭｏｌｃｃｕｌａｒ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ）〕。これらの
基質は、ｌａｃＺ遺伝子のようなその基質と反応し得る
酵素をコードする遺伝子に融合したプロモーターの効率
を、その基質を含む固形寒天培地に生物を生育させその
酵素−基質反応を観察することによりモニターできるた
め有利に用いられる。この方法では、数百ものコロニー
について、その遺伝子を発現する能力を一度に判別する
ことができる。このように、高効率のプロモーターの発
生のような比較的まれな場合にも検出できる。β−ガラ
クトシダーゼの発現は、遺伝子転写の試験法や抗生物質
の製造における酵素のような所望のタンパク質を過剰に
生産する変異体の検出単離法などに用いられる。
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（以下、“
Ｘ−ｇａｌ”と略称する）またはｏ−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトシド（以下、“ＯＮＰＧ”と略称する
）などは、ミラーの文献に示されるように酵素活性をモ
ニターするのに用いられる〔Ｍｉｌｌｅｒ（１９７２）
，“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎＭｏｌｃｃｕｌａｒ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ）〕。これらの
基質は、ｌａｃＺ遺伝子のようなその基質と反応し得る
酵素をコードする遺伝子に融合したプロモーターの効率
を、その基質を含む固形寒天培地に生物を生育させその
酵素−基質反応を観察することによりモニターできるた
め有利に用いられる。この方法では、数百ものコロニー
について、その遺伝子を発現する能力を一度に判別する
ことができる。このように、高効率のプロモーターの発
生のような比較的まれな場合にも検出できる。β−ガラ
クトシダーゼの発現は、遺伝子転写の試験法や抗生物質
の製造における酵素のような所望のタンパク質を過剰に
生産する変異体の検出単離法などに用いられる。
上記のような有益な用途に効果的に利用するためには、
その選択した基質が酵素と反応する機会を有することが
重要である。大腸菌により生産されるβ−ガラクトシダ
ーゼの場合のように、その酵素が細胞内にある場合には
、その基質は、酵素−基質反応を起すためには、細胞内
に入らなければならない。しかしながら、放線菌類の微
生物では、一般に用いられている基質、Ｘ−ｇａｌやＯ
ＮＰＧはほとんど細胞内に入らないことが、プレート上
の染料形成により過当な微生物の細胞内β−ガラクトシ
ダーゼ活性を比較して証明されている。例えば、本発明
者らの実験によれば、細胞抽出物について細胞内活性を
測定したところＯＮＰＧ基質では非常に高い活性（３０
０ｎｍｏｌｅｓ／ｍｇタンパク質／分）を示すが、呈色
反応はすべての細胞についてＯＮＰＧまたはＸ−ｇａｌ
のいずれの基質でもほとんど認められなかった。さらに
、放線菌類は、細胞を基質から物理的に分離する菌糸体
の形成において他の多くの微生物と異なっており、その
基質の細胞への接近が制限される〔Ｋａｌａｋｏｕｔｓ
ｋｉｉ ｅｔａｌ（１９７６），Ｂｓａｃｔｅｒｉｏｌ
．Ｒｅｖ．４０（２）４６９−５２４〕。
その選択した基質が酵素と反応する機会を有することが
重要である。大腸菌により生産されるβ−ガラクトシダ
ーゼの場合のように、その酵素が細胞内にある場合には
、その基質は、酵素−基質反応を起すためには、細胞内
に入らなければならない。しかしながら、放線菌類の微
生物では、一般に用いられている基質、Ｘ−ｇａｌやＯ
ＮＰＧはほとんど細胞内に入らないことが、プレート上
の染料形成により過当な微生物の細胞内β−ガラクトシ
ダーゼ活性を比較して証明されている。例えば、本発明
者らの実験によれば、細胞抽出物について細胞内活性を
測定したところＯＮＰＧ基質では非常に高い活性（３０
０ｎｍｏｌｅｓ／ｍｇタンパク質／分）を示すが、呈色
反応はすべての細胞についてＯＮＰＧまたはＸ−ｇａｌ
のいずれの基質でもほとんど認められなかった。さらに
、放線菌類は、細胞を基質から物理的に分離する菌糸体
の形成において他の多くの微生物と異なっており、その
基質の細胞への接近が制限される〔Ｋａｌａｋｏｕｔｓ
ｋｉｉ ｅｔａｌ（１９７６），Ｂｓａｃｔｅｒｉｏｌ
．Ｒｅｖ．４０（２）４６９−５２４〕。
発明の要旨
本発明は、ストレプトマイセス菌種のある菌株が分泌性
β−ガラクトシターゼを産生することの発現に基づいて
なされたものである。この酵素はある神のβ−ガラクト
シド類、例えばラクトース、を分解するのに有用であっ
て、診断用または実験室用試薬として用いられる。
β−ガラクトシターゼを産生することの発現に基づいて
なされたものである。この酵素はある神のβ−ガラクト
シド類、例えばラクトース、を分解するのに有用であっ
て、診断用または実験室用試薬として用いられる。
本発明の他の態様は、ストレプトマイセス菌種に自然に
存在し分泌性β−ガラクトシダーゼをコードし得る遺伝
子からなるＤＮＡフラグメントを提供するものである。
存在し分泌性β−ガラクトシダーゼをコードし得る遺伝
子からなるＤＮＡフラグメントを提供するものである。
この遺伝子は、適当なベクターに挿入することにより各
種のストレプトマイセス属の菌に容易に発現され得る。
種のストレプトマイセス属の菌に容易に発現され得る。
このＤＮＡフラグメントは少なくとも分泌性β−ガラク
トシダーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでいる
。
トシダーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでいる
。
供与菌または他の物質由来の、例えばプロモーター配列
などを含む他のヌクレオチドも存在し得る。
などを含む他のヌクレオチドも存在し得る。
本発明の他の態様は、分泌性タンパク質、Ｂｇｌタンパ
ク質をコードし得る、ストレプトマイセス菌種中にスト
レプトマイセスβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のすぐ上流
に位置して自然に存在する遺伝子からなるストレプトマ
イセス菌種からのＤＮＡフラグメントを提供するもので
ある。
ク質をコードし得る、ストレプトマイセス菌種中にスト
レプトマイセスβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のすぐ上流
に位置して自然に存在する遺伝子からなるストレプトマ
イセス菌種からのＤＮＡフラグメントを提供するもので
ある。
本発明の他の態様は、ストレプトマイセスβ−ガラクト
シダーゼプロモーターからなるＤＮＡフラグメントを提
供するものである。
シダーゼプロモーターからなるＤＮＡフラグメントを提
供するものである。
本発明の他の態様は、プロモーターに融合したβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子を用いて微生物を形質転換させ、宿
主細胞に容易に取込まれない染色体遺伝子の基質を用い
て分泌されたβ−ガラクトシダーゼを検査することから
なる遺伝子発現の促進を検査する方法を提供するもので
ある。本発明のβ−ガラクトシダーゼは微生物により分
泌されるため、この酵素の検出、検査は、例えば非分泌
性β−ガラクトシダーゼの検出検査には見られない著し
い利点を有する。種々の染色体遺伝子基質がプレート上
で用い得るβ−ガラクトシダーゼに利用され得るため、
ベクターや強力なプロモーターをクローニングする高い
発現の検査、同定および人手が容易である。そのクロー
ン化ＤＮＡフラグメントは各種のストレプトマイセス菌
種や他の微生物で容易に発現され、高発現ベクターの構
築に容易に用いられる。
クトシダーゼ遺伝子を用いて微生物を形質転換させ、宿
主細胞に容易に取込まれない染色体遺伝子の基質を用い
て分泌されたβ−ガラクトシダーゼを検査することから
なる遺伝子発現の促進を検査する方法を提供するもので
ある。本発明のβ−ガラクトシダーゼは微生物により分
泌されるため、この酵素の検出、検査は、例えば非分泌
性β−ガラクトシダーゼの検出検査には見られない著し
い利点を有する。種々の染色体遺伝子基質がプレート上
で用い得るβ−ガラクトシダーゼに利用され得るため、
ベクターや強力なプロモーターをクローニングする高い
発現の検査、同定および人手が容易である。そのクロー
ン化ＤＮＡフラグメントは各種のストレプトマイセス菌
種や他の微生物で容易に発現され、高発現ベクターの構
築に容易に用いられる。
本発明の他の態様は、上記ＤＮＡフラグメントの１また
はそれ以上を含むベクター、すなわち組換えＤＮＡ分子
を提供するものである。本発明はまた、該ベクターを含
むＤＮＡフラグメントにより形質転換した微生物を含む
。
はそれ以上を含むベクター、すなわち組換えＤＮＡ分子
を提供するものである。本発明はまた、該ベクターを含
むＤＮＡフラグメントにより形質転換した微生物を含む
。
本発明の他の態様は、ストレプトマイセスβ−ガラクト
シダーゼプロモーターをタンパク質をコードする遺伝子
に融合させ、該融合プロモーターにて適当な微生物を形
質転換させることからなる微生物に遺伝子を発現する方
法を提供するものである。
シダーゼプロモーターをタンパク質をコードする遺伝子
に融合させ、該融合プロモーターにて適当な微生物を形
質転換させることからなる微生物に遺伝子を発現する方
法を提供するものである。
本発明のさらに他の態様は、分泌性β−ガラクトシダー
ゼをコードする遺伝子を担ったＤＮＡフラグメントまた
はＢｇｌタンパク質をコードする遺伝子を担ったＤＮＡ
フラグメントもしくはそのいずれかから誘導される分泌
信号を他のタンパク質をコードする遺伝子に融合させ、
この融合遺伝子を用いて適当な宿主を形質転換させて製
造される分泌性タンパク質融合体を提供するものである
。
ゼをコードする遺伝子を担ったＤＮＡフラグメントまた
はＢｇｌタンパク質をコードする遺伝子を担ったＤＮＡ
フラグメントもしくはそのいずれかから誘導される分泌
信号を他のタンパク質をコードする遺伝子に融合させ、
この融合遺伝子を用いて適当な宿主を形質転換させて製
造される分泌性タンパク質融合体を提供するものである
。
本発明により単離およびクローン化されるβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子およびＢｇｌタンパク質遺伝子にある分
泌に必要な情報を与えることにより、他の遺伝子生成物
が発生し、同様に生育培地中に分泌されるため、非分泌
性遺伝子生成物よりも容易に菌体物置から回収される。
シダーゼ遺伝子およびＢｇｌタンパク質遺伝子にある分
泌に必要な情報を与えることにより、他の遺伝子生成物
が発生し、同様に生育培地中に分泌されるため、非分泌
性遺伝子生成物よりも容易に菌体物置から回収される。
本発明のさらに他の態様は、β−ガラクトシダーゼをコ
ードする遺伝子またはＢｇｌタンパク賀をコードする遺
伝子を担ったＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡ雑種形成（
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）技術によりいかなる起源
からも相同ＤＮＡ配列を提供するためのプローブとして
使用する方法を提供するものである。これらすべての態
様ならびに本明細書に記載の他の態様は本発明により容
易に達し得るものであり、本発明の目的である。
ードする遺伝子またはＢｇｌタンパク賀をコードする遺
伝子を担ったＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡ雑種形成（
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）技術によりいかなる起源
からも相同ＤＮＡ配列を提供するためのプローブとして
使用する方法を提供するものである。これらすべての態
様ならびに本明細書に記載の他の態様は本発明により容
易に達し得るものであり、本発明の目的である。
本発明により単離されるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を
担ったＤＮＡフラグメントは、プラスミドの標識、およ
び治療工程でのプラスミドの働き、安定性、不安定性の
機構、プラスミドの不適合性などの研究のために容易に
同定し得る遺伝学的形質（ｔｒａｉｔ）としても有用で
ある。また、このＤＮＡを削除したり遺伝子中に挿入す
ることが容易に同定できるため、各種の組換えＤＮＡの
実験において、例えば遺伝子クローニングのための標識
として、有用である。
担ったＤＮＡフラグメントは、プラスミドの標識、およ
び治療工程でのプラスミドの働き、安定性、不安定性の
機構、プラスミドの不適合性などの研究のために容易に
同定し得る遺伝学的形質（ｔｒａｉｔ）としても有用で
ある。また、このＤＮＡを削除したり遺伝子中に挿入す
ることが容易に同定できるため、各種の組換えＤＮＡの
実験において、例えば遺伝子クローニングのための標識
として、有用である。
詳細な説明
本発明によって製造されるβ−ガラクトシダーゼはβ−
ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質である。この
ものは、用いる菌株により異なった分子量を有すること
もあり、種々の形態でストレプトマイセス属菌の培養物
中に分泌され、他の分泌生成物から単離され得る。
ガラクトシダーゼ活性を有するタンパク質である。この
ものは、用いる菌株により異なった分子量を有すること
もあり、種々の形態でストレプトマイセス属菌の培養物
中に分泌され、他の分泌生成物から単離され得る。
分泌性β−ガラクトシダーゼを産生することが見出され
たストレプトマイセス属菌からの各種ＤＮＡフラグメン
トについて以下に説明する。開示するフラグメントの誘
導体もβ−ガラクトシダーゼを産生し得る。そのような
誘導体も本発明に含まれる。さらに、本明細書に開示し
たものに類似したフラグメント、例えば、１またはそれ
以上のデオキシリボヌクレオチドが存在したり不存在で
ある点で異なり、多分、１またはそれ以上の制限酵素サ
イトを含むが、そのような差異は該フラグメントに本質
的な影響を与えないようなフラグメントも本発明の範囲
に含まれる。
たストレプトマイセス属菌からの各種ＤＮＡフラグメン
トについて以下に説明する。開示するフラグメントの誘
導体もβ−ガラクトシダーゼを産生し得る。そのような
誘導体も本発明に含まれる。さらに、本明細書に開示し
たものに類似したフラグメント、例えば、１またはそれ
以上のデオキシリボヌクレオチドが存在したり不存在で
ある点で異なり、多分、１またはそれ以上の制限酵素サ
イトを含むが、そのような差異は該フラグメントに本質
的な影響を与えないようなフラグメントも本発明の範囲
に含まれる。
本発明のＤＮＡフラグメントは組換えＤＮＡ分子、すな
わち、天然に存在するより大きい分子、例えば染色体Ｄ
ＮＡから単離されるかまたはそれら天然の宿主から単離
される単一または２重ストランドのＤＮＡ配列を有し、
それらは他のＤＮＡフラグメントと融合し、例えば発現
単位またはクローニングまたは発現ベクターを形成して
いてもよい。
わち、天然に存在するより大きい分子、例えば染色体Ｄ
ＮＡから単離されるかまたはそれら天然の宿主から単離
される単一または２重ストランドのＤＮＡ配列を有し、
それらは他のＤＮＡフラグメントと融合し、例えば発現
単位またはクローニングまたは発現ベクターを形成して
いてもよい。
このβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、すなわち、β−ガラ
クトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝
子は、１０．３ｋｂＳｐｈＩフラグメントに位置してい
る。このフラグメントはストレプトマイセス・リビダン
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）１３
２６株に自然に存在し、その染色体ＤＮＡが単離された
ものである。その８．７ｋｂＳｐｈＩ−ＰｓｔＩフラグ
メント（第１図を参照）も分泌β−ガラクトシダーゼを
コードする。このＳｐｈＩ−ＰｓｔＩフラグメントは下
記の制限酵素地図を有する。
クトシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝
子は、１０．３ｋｂＳｐｈＩフラグメントに位置してい
る。このフラグメントはストレプトマイセス・リビダン
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）１３
２６株に自然に存在し、その染色体ＤＮＡが単離された
ものである。その８．７ｋｂＳｐｈＩ−ＰｓｔＩフラグ
メント（第１図を参照）も分泌β−ガラクトシダーゼを
コードする。このＳｐｈＩ−ＰｓｔＩフラグメントは下
記の制限酵素地図を有する。
制限酵素 位置（ｋｂ）
ＳｐｈＩ ０
ＢａｍＨＩ ０．５０
ＰｖｕＩＩ ０．７２
ＢａｌＩ １．１９
ＳｔｕＩ １．３７
ＳａｌＩ １．７０
ＢｃｌＩ ２．１０
ＢｇｌＩＩ ２．４７
ＢｇｌＩＩ ３．３９
ＰｖｕＩＩ ５．５０
ＮｒｕＩ ６．２５
ＰｖｕＩＩ ７．００
ＢｃｌＩ ７．４５
ＳｔｕＩ ７．５０
ＰｓｔＩ ８．６９
上記表示の地図はＳｐｈＩ−ＰｓｔＩフラグメント内に
自然に存在するＤＮＡフラグメントにも引用される。例
えば、０．６５ｋｂＰｖｕＩＩ（０．７２）−ＳｔｕＩ
（１．３７）フラグメントは、その上流および／または
下流に他のデオキシリボヌクレオチドかあるかないかを
示して引用される。
自然に存在するＤＮＡフラグメントにも引用される。例
えば、０．６５ｋｂＰｖｕＩＩ（０．７２）−ＳｔｕＩ
（１．３７）フラグメントは、その上流および／または
下流に他のデオキシリボヌクレオチドかあるかないかを
示して引用される。
この５．３ｋｂＢｇｌＩＩ（３．３９）−ＰｓｔＩフラ
グメントは分泌性β−ガラクトシダーゼをコードし、ま
たより大きな６．９ｋｂＢｇｌＩＩ（３．３９）−Ｓｐ
ｈＩ（１０．３）フラグメントも同様である。０．９２
ｋｂＢｇｌＩＩフラグメントはβ−ガラクトシダーゼで
はない分泌タンパク質を産生する。このタンパク質を以
下Ｂｇｌタンパク質という。
グメントは分泌性β−ガラクトシダーゼをコードし、ま
たより大きな６．９ｋｂＢｇｌＩＩ（３．３９）−Ｓｐ
ｈＩ（１０．３）フラグメントも同様である。０．９２
ｋｂＢｇｌＩＩフラグメントはβ−ガラクトシダーゼで
はない分泌タンパク質を産生する。このタンパク質を以
下Ｂｇｌタンパク質という。
このＢｇｌタンパク質遺伝子はβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子のすぐ上流にあり、そのβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子はＳｐｈＩ−ＢｇｌＩＩ（２．４７）フラグメントか
らプロモートされる多シストロン性の伝令からなってい
る。ＳｔｕＩ（１．３７）サイトまたはＳｐｈＩ（０）
サイトからの発現に関連したＰｖｕＩＩ（７．２０）サ
イトからの発現に基づいて、該プロモーターはＰｖｕＩ
Ｉ（０．７２）ＳｔｕＩ（７．２０）フラグメントの中
またはその近辺に位置していることが明らかである。
伝子のすぐ上流にあり、そのβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子はＳｐｈＩ−ＢｇｌＩＩ（２．４７）フラグメントか
らプロモートされる多シストロン性の伝令からなってい
る。ＳｔｕＩ（１．３７）サイトまたはＳｐｈＩ（０）
サイトからの発現に関連したＰｖｕＩＩ（７．２０）サ
イトからの発現に基づいて、該プロモーターはＰｖｕＩ
Ｉ（０．７２）ＳｔｕＩ（７．２０）フラグメントの中
またはその近辺に位置していることが明らかである。
Ｂｇｌタンパク質遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子の両者、またはそれらからの分泌信号を含む部分は
、通常は分泌されないタンパク質に融合して分泌される
融合タンパク質を生成することもできる。このような技
術は、例えば、シルハヴィら（Ｓｉｌｈａｖｙ ｅｔ
ａｌ）の米国特許第４，３３６，３３６号に記載されて
いる。
伝子の両者、またはそれらからの分泌信号を含む部分は
、通常は分泌されないタンパク質に融合して分泌される
融合タンパク質を生成することもできる。このような技
術は、例えば、シルハヴィら（Ｓｉｌｈａｖｙ ｅｔ
ａｌ）の米国特許第４，３３６，３３６号に記載されて
いる。
この両者ともプロモーター活性を試験するために用い得
る。β−ガラクトシダーゼは、その発現が容易に検出で
きるためそのような方法に好ましく用いられる。このβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子は選択マーカーとしても用い
られる。
る。β−ガラクトシダーゼは、その発現が容易に検出で
きるためそのような方法に好ましく用いられる。このβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子は選択マーカーとしても用い
られる。
このβ−ガラクトシダーゼプロモーターは、ストレプト
マイセス属菌および他の微生物に、異種遺伝子を含めて
、遺伝子を発現するのにも用いられる。
マイセス属菌および他の微生物に、異種遺伝子を含めて
、遺伝子を発現するのにも用いられる。
本発明を実施するには、ストレプトマイセス・リビダン
ス１３２６株〔Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ ｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ａ
ｂｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ｎｕｍｂｅｒ １
１４１６；Ｂｉｂｂ ｅｔ ａｌ（１９８１），Ｍｏｌ
．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８４，２３０−２４０
；Ｋｒａｓｉｌｎｉｋｏｖｅｔ ａｌ，“Ｔｈｅ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｅｒｔａｉｎ Ｃｒｏｕｐｓ ｏ
ｆＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ”，ｋｒａｓｉｌｎｉｋ
ｏｖ，ｅｄ．，ＳｃｉｅｎｃｅＰｒｅｓｓ（Ｍｏｓｃｏ
ｗ）１９６５，１０９−１１０を参照〕からのＤＮＡ（
このものは元の菌株に自然に分泌されるβ−ガラクトシ
ダーゼをコードする遺伝子を含む）を通常の技術、例え
ば前記チャターらの文献に記載の方法により収集する。
ス１３２６株〔Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ ｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ａ
ｂｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ｎｕｍｂｅｒ １
１４１６；Ｂｉｂｂ ｅｔ ａｌ（１９８１），Ｍｏｌ
．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８４，２３０−２４０
；Ｋｒａｓｉｌｎｉｋｏｖｅｔ ａｌ，“Ｔｈｅ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｅｒｔａｉｎ Ｃｒｏｕｐｓ ｏ
ｆＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ”，ｋｒａｓｉｌｎｉｋ
ｏｖ，ｅｄ．，ＳｃｉｅｎｃｅＰｒｅｓｓ（Ｍｏｓｃｏ
ｗ）１９６５，１０９−１１０を参照〕からのＤＮＡ（
このものは元の菌株に自然に分泌されるβ−ガラクトシ
ダーゼをコードする遺伝子を含む）を通常の技術、例え
ば前記チャターらの文献に記載の方法により収集する。
この分泌性β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子を
含むＤＮＡフラグメントは該ＤＮＡを制限エンドヌクレ
ア−ゼで処理して単離される。
含むＤＮＡフラグメントは該ＤＮＡを制限エンドヌクレ
ア−ゼで処理して単離される。
その酵素一基質反応がほとんど拡散しない染料を生じる
場合には、この方法で試験したときに寒天板上に生じた
コロニーの囲りの発色した染料の光輪の形成によってそ
の酵素活性はモニターできる。好ましい染色体遺伝子の
基質は、Ｘ−ｇａｌであり、それはほとんど拡散しない
染料を生成する。
場合には、この方法で試験したときに寒天板上に生じた
コロニーの囲りの発色した染料の光輪の形成によってそ
の酵素活性はモニターできる。好ましい染色体遺伝子の
基質は、Ｘ−ｇａｌであり、それはほとんど拡散しない
染料を生成する。
この方法の感度は、３００〜５００コロニーの中から１
個の生産コロニーを１つのぺトリ皿（直径９０ｍｍ）の
うえで同定できる程度である。
個の生産コロニーを１つのぺトリ皿（直径９０ｍｍ）の
うえで同定できる程度である。
上記のストレプトマイセス・リビダンス１３２６株から
の単離遺伝子は、ストレプトマイセス属の他の種または
株、例えばストレプトマイセス・グリセウス（Ｓ．ｇｒ
ｉｓｕｓ）、ストレプトマイセス・オーレオフアシエン
ス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイ
セス・フラディ（Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ）、ストレプトマ
イセス・二ヴアス（Ｓ．ｎｉｖｅｕｓ）などおよび他の
微生物に容易に発現される。ストレプトマイセス・リビ
ダンスおよびストレプトマイセス・グリセウスが好まし
い宿主菌種である。
の単離遺伝子は、ストレプトマイセス属の他の種または
株、例えばストレプトマイセス・グリセウス（Ｓ．ｇｒ
ｉｓｕｓ）、ストレプトマイセス・オーレオフアシエン
ス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイ
セス・フラディ（Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ）、ストレプトマ
イセス・二ヴアス（Ｓ．ｎｉｖｅｕｓ）などおよび他の
微生物に容易に発現される。ストレプトマイセス・リビ
ダンスおよびストレプトマイセス・グリセウスが好まし
い宿主菌種である。
本発明には各種のベクターが用いられ、当該技術分野の
技術考は有利なベクターの選択は容易になし得る。用い
られるベクターの例としては、プラスミドｐＩＪ６〔Ｔ
ｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８０），Ｎａｔｕｒ
ｅ ２８６，５２５−５２７〕、ｐＩＪ１０１〔Ｃｈａ
ｔｅｒｅｔ ａｌ、前掲の文献〕などのほか、最終の宿
主株で複製でき、その菌株でベクターの存在を容易に選
択し得るようなものが挙げられる。同様に、各種の標準
的な生育用培地が用いられる。プラスミドｐＩＪ６が好
ましいベクターである。
技術考は有利なベクターの選択は容易になし得る。用い
られるベクターの例としては、プラスミドｐＩＪ６〔Ｔ
ｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８０），Ｎａｔｕｒ
ｅ ２８６，５２５−５２７〕、ｐＩＪ１０１〔Ｃｈａ
ｔｅｒｅｔ ａｌ、前掲の文献〕などのほか、最終の宿
主株で複製でき、その菌株でベクターの存在を容易に選
択し得るようなものが挙げられる。同様に、各種の標準
的な生育用培地が用いられる。プラスミドｐＩＪ６が好
ましいベクターである。
所望のＤＮＡフラグメントを含むプラスミドベクターを
微生物中に導入するには通常の形質転換法が用いられる
。形質導入や接合などの他の方法も適当な宿主で用いら
れ得る。このような方法はよく知られている。
微生物中に導入するには通常の形質転換法が用いられる
。形質導入や接合などの他の方法も適当な宿主で用いら
れ得る。このような方法はよく知られている。
つぎに実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
が本発明の範囲および適用などはそれらに限定されない
。
が本発明の範囲および適用などはそれらに限定されない
。
実施例１
ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株（前記Ｂｉ
ｂｂ ｅｔ ａｌ（１９８１）の文献を参照）から、前
記チャターらの文献に記載の方法により染色体ＤＮＡを
単離した。ストレプトマイセス・リビダンス（前記Ｔｈ
ｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８０）の文献を参照）
から単離したプラスミドｐＩＪ６（約２１ｋｂ）は、１
３２６株およびその誘導体のようなチオストレプトン（
ｔｈｉｏｓｔｒｅｐｔｏｎ）感受性株において該プラス
ミドの選択に選択マーカーとして有用なチオストレプト
ン抵抗の遺伝子を担っているため、そのプラスミドをク
ローニングベクターとして用いた。この染色体ＤＮＡお
よびｐＩＪ６ＤＮＡをＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ
またはＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼで処理して、突
出した相補性の３′ＤＮＡ配列を有するＤＮＡフラグメ
ントを得た。
ｂｂ ｅｔ ａｌ（１９８１）の文献を参照）から、前
記チャターらの文献に記載の方法により染色体ＤＮＡを
単離した。ストレプトマイセス・リビダンス（前記Ｔｈ
ｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８０）の文献を参照）
から単離したプラスミドｐＩＪ６（約２１ｋｂ）は、１
３２６株およびその誘導体のようなチオストレプトン（
ｔｈｉｏｓｔｒｅｐｔｏｎ）感受性株において該プラス
ミドの選択に選択マーカーとして有用なチオストレプト
ン抵抗の遺伝子を担っているため、そのプラスミドをク
ローニングベクターとして用いた。この染色体ＤＮＡお
よびｐＩＪ６ＤＮＡをＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼ
またはＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼで処理して、突
出した相補性の３′ＤＮＡ配列を有するＤＮＡフラグメ
ントを得た。
このｐＩＪ６をさらにアルカリホスファターゼで処理し
て、追加のＤＮＡ挿入なしにクローニングベクターを再
生することを防いだ。このＳｐｈＩおよびＰｓｔＩ処理
で生じたＤＮＡ（染色体ＤＮＡ５μｇ、ｐＩＪ６ＤＮＡ
１μｇ）を別々に常法によって１６℃で７日間結紮した
。この結紮ＤＮＡを、前記チャターらの文献に記載の方
法により、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６−
９株（分泌β−ガラクトシダーゼ活性を欠いた１３２６
株のニトロソグアニジン誘引変異株）から誘導されるプ
ロトプラスト約２×１０７を用いて形質転換した。この
プロトプラストを再生培地プレート上に拡げ、２８℃に
て１８〜２４時間インキュベートした。このプレートを
、チオストレプトン１００μｇ／ｍｌを含む軟質寒天混
合物（０．４％水性寒天）上に置き、形質転換された子
（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）およびＸ−ｇａｌ１５０μｇ／
ｍｌを選択した。このプレートを２８℃でさらに２〜６
日間インキュベートし、特徴ある青色コロニーの発現を
記録した。
て、追加のＤＮＡ挿入なしにクローニングベクターを再
生することを防いだ。このＳｐｈＩおよびＰｓｔＩ処理
で生じたＤＮＡ（染色体ＤＮＡ５μｇ、ｐＩＪ６ＤＮＡ
１μｇ）を別々に常法によって１６℃で７日間結紮した
。この結紮ＤＮＡを、前記チャターらの文献に記載の方
法により、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６−
９株（分泌β−ガラクトシダーゼ活性を欠いた１３２６
株のニトロソグアニジン誘引変異株）から誘導されるプ
ロトプラスト約２×１０７を用いて形質転換した。この
プロトプラストを再生培地プレート上に拡げ、２８℃に
て１８〜２４時間インキュベートした。このプレートを
、チオストレプトン１００μｇ／ｍｌを含む軟質寒天混
合物（０．４％水性寒天）上に置き、形質転換された子
（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）およびＸ−ｇａｌ１５０μｇ／
ｍｌを選択した。このプレートを２８℃でさらに２〜６
日間インキュベートし、特徴ある青色コロニーの発現を
記録した。
ＳｐｈＩクローニングで得た１０，０００以上のチオス
トレプトン抵抗性コロニーのうち、９コロニーが青色に
なり、またＰｓｔＩクローニングで得た同数のコロニー
のうち、Ｉコロニーが青色になった。
トレプトン抵抗性コロニーのうち、９コロニーが青色に
なり、またＰｓｔＩクローニングで得た同数のコロニー
のうち、Ｉコロニーが青色になった。
この全青色コロニーのプラスミドＤＮＡを単離し、分析
した。このＳｐｈＩおよびＰｓｔＩクローニングからの
両プラスミドＤＮＡともに、ｐＩＪ６プラスミドにはな
かった、染色体から誘導された共通した１個の８ｋｂＤ
ＮＡフラグメントを有していた。
した。このＳｐｈＩおよびＰｓｔＩクローニングからの
両プラスミドＤＮＡともに、ｐＩＪ６プラスミドにはな
かった、染色体から誘導された共通した１個の８ｋｂＤ
ＮＡフラグメントを有していた。
この標準的方法で調製した、分泌β−ガラクトシダーゼ
のクローン化遺伝子を担った８ｋｂＤＮＡフラグメント
の制限エンドヌクレアーゼによる開裂地図を第１図に示
す。ＳｐｈＩクローニングで誘導される２９ｋｂプラス
ミドは、上記８．６９ｋｂＳｐｈＩ−ＰｓｔＩフラグメ
ントを含むことがわかり、「ｐＳＫＬ−１」と命名した
。制限エンドヌクレアーゼによる開裂は標準的な方法で
行なった。ＰｓｔＩクローニングから誘導されたプラス
ミドを「ｐＸ」と命名した。ｐＳＫＬ−１は第２図に示
すような制限エンドヌクレアーゼ開裂地図で表わされる
。
のクローン化遺伝子を担った８ｋｂＤＮＡフラグメント
の制限エンドヌクレアーゼによる開裂地図を第１図に示
す。ＳｐｈＩクローニングで誘導される２９ｋｂプラス
ミドは、上記８．６９ｋｂＳｐｈＩ−ＰｓｔＩフラグメ
ントを含むことがわかり、「ｐＳＫＬ−１」と命名した
。制限エンドヌクレアーゼによる開裂は標準的な方法で
行なった。ＰｓｔＩクローニングから誘導されたプラス
ミドを「ｐＸ」と命名した。ｐＳＫＬ−１は第２図に示
すような制限エンドヌクレアーゼ開裂地図で表わされる
。
ｐＳＫＬ−１から単離されたプラスミドＤＮＡをストレ
プトマイセス・リビダンス１３２６−９株の形質転換に
用いた。チオストレプトン抵抗性の子の７０％以上が分
泌β−ガラクトシダーゼ活性を示し、このことはこのプ
ラスミドに遺伝子の存在および発現があることを示して
いる。ｐＳＫＬ−１形質転換株（１３２６−９／ｐＳＫ
Ｌ−１株）の菌体抽出物の酵素濃度はしばしば１００倍
に増加しており、それはプラスミドに遺伝子の存在する
ことを示している。１つの実験結果を第１表に示す。
プトマイセス・リビダンス１３２６−９株の形質転換に
用いた。チオストレプトン抵抗性の子の７０％以上が分
泌β−ガラクトシダーゼ活性を示し、このことはこのプ
ラスミドに遺伝子の存在および発現があることを示して
いる。ｐＳＫＬ−１形質転換株（１３２６−９／ｐＳＫ
Ｌ−１株）の菌体抽出物の酵素濃度はしばしば１００倍
に増加しており、それはプラスミドに遺伝子の存在する
ことを示している。１つの実験結果を第１表に示す。
第１表
第１表に示すように、１３２６−９培養物では１３２６
培養物よりも、ガラクトースの存在で非分泌性β−ガラ
クトンダーゼをより多量に産生した。
培養物よりも、ガラクトースの存在で非分泌性β−ガラ
クトンダーゼをより多量に産生した。
ｐＳＫＬ−１プラスミドを内包する形質転換体は元の１
３２６株よりもより濃い青色コロニーを作った。このこ
とは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグ
メントが高い発現ベクターの構築に利用されることを示
している。培養液中に生育した１３２６−９／ｐＳＫＬ
−１株は、その上清濃縮液をポリアクリルアミドゲル電
気泳動で調べたところ、Ｂｇｌタンパク質を分泌した。
３２６株よりもより濃い青色コロニーを作った。このこ
とは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグ
メントが高い発現ベクターの構築に利用されることを示
している。培養液中に生育した１３２６−９／ｐＳＫＬ
−１株は、その上清濃縮液をポリアクリルアミドゲル電
気泳動で調べたところ、Ｂｇｌタンパク質を分泌した。
１３２６株および１３２６−９株ではそのようなＢｇｌ
タンパク質の産生は認められなかった。
タンパク質の産生は認められなかった。
プラスミドからのβ−ガラクトシダーゼ発現は１３２６
−９株では１３２６株に比べてより不安定であった。こ
れは染色体ＤＮＡによる組換えに起因するものと考えら
れる。
−９株では１３２６株に比べてより不安定であった。こ
れは染色体ＤＮＡによる組換えに起因するものと考えら
れる。
実施例２
上記の方法により、プラスミドｐＳＫＬ−１をストレプ
トマイセス・グリセウスＢＣ６株（ＡＴＣＣ１０１３７
）（分泌β−ガラクトシダーゼを有しない菌株）に形質
転換させた。このｐＳＫＬ１を含むＢＣ６株（ＢＣ６／
ｐＳＫＬ−１株）の子は分泌β−ガラクトシダーゼを産
生した。このことは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を他
のストレプトマイセス属宿主に適用し得ることを示すも
のである。
トマイセス・グリセウスＢＣ６株（ＡＴＣＣ１０１３７
）（分泌β−ガラクトシダーゼを有しない菌株）に形質
転換させた。このｐＳＫＬ１を含むＢＣ６株（ＢＣ６／
ｐＳＫＬ−１株）の子は分泌β−ガラクトシダーゼを産
生した。このことは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を他
のストレプトマイセス属宿主に適用し得ることを示すも
のである。
実施例３
ｐＳＫＬ−１からＢｇｌＩＩ２．４７−３．３９フラグ
メントを削除してｐＢＢ２Ｂを調製した。このプラスミ
ドｐＢＢ２Ｂは、ＢｇｌＩＩフラグメントを除いた以外
はｐＳＫＬ−１と同じである。このｐＢＢ２Ｂにてスト
レプトマイセス・リビダンス１３２６株を形質転侯させ
、その１４時間および２４時間後のβガラクトシダ−セ
分泌を、ｐＳＫＬ−１で形質転換した１３２６株のもの
と比較した。その結果を第２表に示す。
メントを削除してｐＢＢ２Ｂを調製した。このプラスミ
ドｐＢＢ２Ｂは、ＢｇｌＩＩフラグメントを除いた以外
はｐＳＫＬ−１と同じである。このｐＢＢ２Ｂにてスト
レプトマイセス・リビダンス１３２６株を形質転侯させ
、その１４時間および２４時間後のβガラクトシダ−セ
分泌を、ｐＳＫＬ−１で形質転換した１３２６株のもの
と比較した。その結果を第２表に示す。
第２表
１３２６／ｐＳＫＬ−１培養物の上清には、ポリアクリ
ルアミドゲルの電気泳動により、Ｂｇｌタンパク質を含
んでいることが判明した。１３２６／ｐＢＢ２Ｂ培養物
の上清には含んでいなかった。
ルアミドゲルの電気泳動により、Ｂｇｌタンパク質を含
んでいることが判明した。１３２６／ｐＢＢ２Ｂ培養物
の上清には含んでいなかった。
上記結果は、ＢｇｌＩＩ（３．３９）−ＳｐｈＩフラグ
メントは分泌β−ガラクトシダーゼをコードすることが
でき、またＢｇｌＩＩフラグメントはＢｇｌタンパク質
をコードすることができることを示している。
メントは分泌β−ガラクトシダーゼをコードすることが
でき、またＢｇｌＩＩフラグメントはＢｇｌタンパク質
をコードすることができることを示している。
実施例４
分泌性β−ガラクトシダーゼをコードし得る遺伝子を含
むストレプトマイセス菌種からのＤＮＡフラグメントを
下記のようにクローン化した。
むストレプトマイセス菌種からのＤＮＡフラグメントを
下記のようにクローン化した。
プラスミドｐＩＪ６（約２１ｋｂ）をＢａｍＨＩにて部
分的に消化して、第２図に示すように、ＢｇｌＩＩサイ
トとＢａｍＨＩサイトの間のＢａｍＨＩフラグメントを
削除した。したがって、得られたプラスミドｐＳＫＴは
３個のＢａｍＨＩサイトの代りに２個のＢａｍＨＩサイ
トを有している。ＳｐｈＩサイトを含んで、ｐＩＪ６に
おける他のすべての制限サイトは残っている。
分的に消化して、第２図に示すように、ＢｇｌＩＩサイ
トとＢａｍＨＩサイトの間のＢａｍＨＩフラグメントを
削除した。したがって、得られたプラスミドｐＳＫＴは
３個のＢａｍＨＩサイトの代りに２個のＢａｍＨＩサイ
トを有している。ＳｐｈＩサイトを含んで、ｐＩＪ６に
おける他のすべての制限サイトは残っている。
β−ガラクトシダーゼ遺伝子を担ったＢｇｌＩＩ（３．
３９）−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＳＫＬ−１から除
き、ｐＳＫＴのＢａｍＨＩサイトに両方向に挿入した。
３９）−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＳＫＬ−１から除
き、ｐＳＫＴのＢａｍＨＩサイトに両方向に挿入した。
得られたプラスミドをストレプトマイセス・リビダンス
１３２６−９株に形質転換させてそのチオストレプトン
抵抗性のものを選択したところ、いずれのプラスミドも
有意な量の細胞内β−ガラクトシダーゼの産生は認めら
れなかった。
１３２６−９株に形質転換させてそのチオストレプトン
抵抗性のものを選択したところ、いずれのプラスミドも
有意な量の細胞内β−ガラクトシダーゼの産生は認めら
れなかった。
例えば、ｐＳＫＬ−１と同じ方向でＳｐｈＩサイトに最
も近接したＢａｍＨＩサイトにＢｇｌＩＩ（３．３９）
−ＢａｍＨＩフラグメントを挿入した２つのクローンの
菌体抽出物を分析したところ、単一炭素源としてガラク
トースを用いて１５時間培養した場合、それらのクロー
ンは４および８ｎｍｏｌｅ／ｍｇタンパク質／分の程度
でβ−ガラクトシダーゼを産生した。対照として、１３
２６／ｐＳＫＬ−１を同条件で同時間培養した場合には
、２１３ｎｍｏｌｅ／ｍｇタンパク値／分の程度でβ−
ガラクトシダーゼを産生した。
も近接したＢａｍＨＩサイトにＢｇｌＩＩ（３．３９）
−ＢａｍＨＩフラグメントを挿入した２つのクローンの
菌体抽出物を分析したところ、単一炭素源としてガラク
トースを用いて１５時間培養した場合、それらのクロー
ンは４および８ｎｍｏｌｅ／ｍｇタンパク質／分の程度
でβ−ガラクトシダーゼを産生した。対照として、１３
２６／ｐＳＫＬ−１を同条件で同時間培養した場合には
、２１３ｎｍｏｌｅ／ｍｇタンパク値／分の程度でβ−
ガラクトシダーゼを産生した。
このＢｇｌＩＩ（３．３９）−ＢａｍＨＩ含有クローン
は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で検査したところ
、Ｂｇｌタンパク質は産生しなかった。一方、１３２６
／ｐＳＫＬ−１は産生した。
は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で検査したところ
、Ｂｇｌタンパク質は産生しなかった。一方、１３２６
／ｐＳＫＬ−１は産生した。
これらの結果と前記結果とを合せて考慮すると、Ｓｐｈ
Ｉ−ＢｇｌＩＩ（２．４７）領域は遺伝子発現を促進す
るのに用いることができる。
Ｉ−ＢｇｌＩＩ（２．４７）領域は遺伝子発現を促進す
るのに用いることができる。
ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株および１３
２６−９株ならびにｐＩＪ６を含む菌株は種々の所から
公に入手可能である。入手性をより確実にするために、
これらの菌株は１９８２年６月１日付にてＡＲＣＣ（Ａ
ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ＲｅｓｅａｒｃｈＣｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉ
ｎｏｉｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に寄託番号がそれぞれ１５０
９１、１５０９０および１５０９２として寄託された。
２６−９株ならびにｐＩＪ６を含む菌株は種々の所から
公に入手可能である。入手性をより確実にするために、
これらの菌株は１９８２年６月１日付にてＡＲＣＣ（Ａ
ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ＲｅｓｅａｒｃｈＣｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐｅｏｒｉａ，Ｉｌｌｉ
ｎｏｉｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に寄託番号がそれぞれ１５０
９１、１５０９０および１５０９２として寄託された。
これらの菌株は米国特許の発行またはヨーロッパ特許出
願もしくは日本特許出願の公告後に、米国特許法または
各特許出願された国の規定にしたがって入手し得る。
願もしくは日本特許出願の公告後に、米国特許法または
各特許出願された国の規定にしたがって入手し得る。
第１図は、分泌性β−ガラクトシダーゼの遺伝子を担っ
た、ストレプトマイセス−リビダンスからの８ｋｂＤＮ
Ａフラグメントの制限エンドヌクレアーゼ開裂地図、第
２図はｐＳＫＬ−１の制限エンドヌクレアーゼ開裂地図
を示す。 特許出願人スミスクライン・ベックマン・コーポレイシ
ョン 代理人弁埋士青山 葆ほか２名 第１図 第２図 アメリカ合衆国剰ンシルベニア リ・旧９４４４ラファイエツ１−・ヒル・つｆステリア
・レイン２０１８番 手続補正書（帥） 昭和５８年７月Ｉ ＩＩ 特許庁１（宮 殿 １ 事件の表示 昭和５８年特許願第 ０９８７５２ 弓・２発明の
名称 クローン化ストレプトマイセス ３補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 スミスクライン・ベックマン・コーポレイショ
ン・１代理人 ５、補正命令の［１付 自発 ７ｆ＋ｌｉ ｉ＋：の内界 （１）明１ｈ１１と第１〜９頁の特許請求の範囲全別紙
のとおり補正する。 （２珪ｈ！ｊ第ｚ２頁木行〜第２３頁２行、「０９２ｋ
ｂ ・・・（中略）・・・ｐｒ・生する。」とある金、
つぎのとおり仙１１．する。 １−２２０ ｋｂ ｌ（１１１ Ｉ〜Ｉ（ｇｌ ＩＩ
（ ３．３ ９ ）フ”ノグメントはβーガワクトン
ダーゼではない分１必タンパク質をコー用−′する。該
ｔ（ｇ！タンパク質の出発コタンは１籟１１ザイトの約
３０へース下流にあるものと４えら７Ｌる。−］ （３）同１１）第３３頁７行、「コードすることができ
る」とあるを、（−表現するために必要な」と補正する
。 以上 捕市した特許ｎｊ’ｆ求の範囲 中伸の分泌物から（［１離さオ］た分泌＋１１β−がラ
クトシダーヤ （２）スト１ノプトマイセス菌神から得ら才する第ｎｕ
。 のβ−がラクトシターゼ。 （３）ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株から
得ら第１る第（１）丁自のβーガラクトシタ゛−ゼ。 （４）分泌性β−がラクトシターゼをコードし１１）る
ストｌ／ブトマイセス菌種に自然に存在するＪｒｔ伝ｒ
からｔ３Ｃるｌ） Ｎ Ａフラグメント。 （５＋該遺伝イかストレプトマイセスーリビタンス１３
２６株染色体１） Ｎ Ａ ｉこ自然にイｒイ１する第
（４）川のＩ） Ｎ Ａフラグメント。 （６）該遺伝ｆがＩ’ｓｔ■フラグメントに世．われで
いる第（５（頃のＩ） Ｎ Ａフラグメント。 （７）該遺伝イがＳｐｈｉフラグメントに担われている
第（５）頃のｌ） Ｎ Ａフラグメント。 （８）該遺伝イかトＪ１！のＩζｇ’ｒｌ−１’ｓｔｌ
フラグメントハＩＪ図： ＩＳｇＩ■ 、−３，３９ Ｐｖｕｌ 、 ５．５Ｏ Ｎｒｕｌ 、 ６．２５ Ｐｖｕｌ ７，０（１ １ミＣＩＩ ７．４５ＳＬｕ）
７．’５０１’ｓｔＩ ８
．６９ からｆ、ｉる６、９ ｋ ｌ） Ｉｓ ｇ璽 １− Ｓ
ｐｈ ［フラグメント１こ担わわている第（５）項のＤ
ＮＡフラグメント。 （９）該遺伝「−が）記の４１１図： ’ｇｌ １１ ３．３９ １’ｖｕ ｌ ５．５１１ Ｎｒｕ ■（、２５ Ｊ’ｖｕ ｌ ７．００ １％ｃｌｉ ７．４５ Ｓｔｕｉ ７．５０ １’ｓＬ） ８．６９ からなる５、ａｋ’ｂ！λｇ、１■−Ｐｓｔ■ フラグ
メントに担わわでいる第（５）項のＩ） Ｎ Ａフラグ
メント。 Ｇｒｉｔ該５））ＩＩＩ フラグメントか１０．３ｋ
ｂで下記のＳｐ ■−ＰｓｔＩフラグメント地図：
：・ 。 ５ｐｈｉ ” Ｏ Ｂａｍｌ” Ｉ Ｏ，５０ Ｐｖｕｉｌ Ｏ，７２ ＢａｌＩ １．１９ Ｓｔｕｌ １．３７ ＳａｌＩ １．７０ １１ｃｌ■２．１０ Ｂｇｌ 口 ２．４７
Ｂｇ１１ ３．３９ Ｐｖｕｌ ５．５Ｏ ＮｒｕＩ ６．２５ Ｐｖｕｌ ７．００ １１ｃｌｉ ７．４５ Ｓｔｕｌ ７，５０ １”ｓｔＩ ８゜６９ ヲ含む第（７１項のＩ） Ｎ Ａフラグメント。 （１１）ストレプトマイセス菌種において分泌性β−ガ
ラクトシダーゼをコードし得る遺伝子のすぐ上流に自然
に存在し％ １％ｇｌタンパク質をコードし得る遺伝子
からなるＩ） Ｎ Ａフラグメント。 Ｑ２１該遺伝子がストレプトマイセス・リビダンス１３
２６株染色体１） Ｎ Ａに自然に存在する第曲項のフ
ラグメント。 （１３）該１４ｇ１タンパク質遺伝子が下記の地図：■
弘ａ遍 １ １ＬＩ ９Ｓｔｉ＋
ｉ １．３７ Ｓ ａＩＴ １．７０１１ｃｌ［
２，１０ １鷺ｇｌ１１ ２．４７ １１ｇ１ｌｌ ３．３９ の２．２０ Ｊｌｏａｔ Ｔ −、Ｂｇｌ ｌ ７ラグ
メントに担われている第（１２１項のフラグメント。 ０４）ストレプトマイセスβ−ガラクトシダ、セプロモ
・−ターからなるＩ） Ｎ Ａフラグメント。 （１５）該プロモーターがストレプトマイセスーリピタ
ンス１３２６株染色体ＤＮＡに自然に存在し。 ｌｓｇ＋ タンパク質遺伝子とβ−がラクトシタ：−
ゼ遺壬子の上流にある第（１４）頃のフラグメント。 （１の該プロモーターが下記の」１１１図：５ｐｂ（Ｏ Ｈ３ｍ■ｉ ０．５０ Ｐｖｕｌｌ ｉ Ｏ，７２ １Ｓａ＋ １１．１９ Ｓ ｒ、ｕ １１．３７ Ｓａｌｌ 、１．７０ １％ＣＩＩ’ ２．１０ ’ Ｂｇｌ［２，４７ のｓｐｈ Ｉ −Ｂｇｌ ｒｌフラグメントＩＣ担わ才
１ている第（１５）項のフラグメント。 ＋＋７１該プロモーターが下記の１１１１図ニー制ヱ灯
色止−位置（ｋｈ） Ｐｖｕ ｌｉ ０．７２ Ｂａｌ Ｉ １．１９ ＳｔｕＩ １．３７ のＰｖｕ ｌ−５ｔｕ （フラグメントに担わねでいる
第（１５）項のフラグメント。 （１８）第（１）〜（１７１項のいずれかのｌ） Ｎ
Ａフラグメントて形質転換さオフた微生物。 （１９）β−カラクトシダーゼを産生ずるスト１プトマ
イセス菌種の１菌株から遺伝子をｔ＋ｓ ｘ＋ｔするこ
とを特徴１トする、分泌性β−ガラクトシダーゼをコー
ドＩｊｌ ル１ｌＩｆｌニーｒヲｔ［］ツタり Ｎ Ａ
７ ラフ、ｌ ７ ） （Ｄｑ棗Ｗ］？与方ンノー。 ｃｌｌ’ 該１＜ 伝−ｒラスｌ−レフトマイセス・リ
ビタンス１３２６株染色体１） Ｎ Ａから？１１離す
る第（Ｉ９）項の方法。 （１１１１該染色体１） Ｎ ＡをＳｐｈ ｉ、Ｐｓｔ
Ｉｉたはその両苦で処理することからなる第λ項の方
法。 の株ｔ４ｑ色体１） Ｎ Ａから中乱されたフラグメン
トをＩ−ｇｉｌｌで処理して、下記のＢｇｌ １ｌ−Ｐ
ｓｔ （フラグメントＪ１１」図： １％ｇｌｌ＋ ３．３９ Ｐ〜ｕＵ１ ５．５Ｏ Ｎｒｕｌ ６．２５ Ｂｃｌ［７，４５ Ｓｌｕ １ ７．５０ Ｉ’ｓ ｔ ■３．６ ｇ を含む５．３ ｋｌ）Ｂｇｌ １１ ＰｓＬ ｌ
／ラグ〆ントまたは６．９ｋｂ１％ｇｌ ｉｌ −５ｐ
ｌｉ １フラグメントを中乱する第Ｃａ１１項の方法。 ＋２３１分泌性β−がラクトシターゼをコードし？１）
る。 ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株染色１］フ
ラグメントを？ｌ卑ｉＦすることをｉ＃ Ｉ＆とする咋
１タンパク質をコード（、？−＋る遺伝了を１１１つだ
ｉ、） Ｎ Ａフラグメントの製造方法。 （２４＋分泌性だ一カラクトシダーゼをフードし？ｊｉ
るストレプトマイセス・リビダンス＋３２１１染色体１
） Ｎ Ａの５１）１１ ■７ ラグメント捷たはＰｓ
ｔ１７ラグメントを、Ｐｖｕｌおよび５Ｌｕｉ′ｃ処理
して下記の地図ニ ー但辻匡ｉ土−位置（ｋｂ） １）ＶＬｌ ｉ ０．７２ｌ％ａｌｌ
’ 、１．１９ＳＬＬＩＴ
１．３７ のフラグメントを中綿することを特徴とするストレプト
マイセスβ−ガラクトシダーゼプロモーターを４１１つ
たＩ） Ｎ Ａフラグメントの製ａ 方ン１：。 （２５）微生物を第（４）川のＩ） Ｎ Ａフラグメン
トて形質転呻さぜ、宿を細胞に容易に取込寸Ａ］ない染
色体債伝ｊ′基負をＪｌｌいて分泌さ第１たβ−カラク
トシターゼ４試験することを特徴とする」１１伝ｒの発
甲を１ξ□（験−４−る 方ンノ”。 Ｒ６）スト１ノプトマイセスβ−ガラクトシダーゼまた
（９■そのｌ５ｇ１ タンパク質遺伝子もしくはそれ
らい１才１かから誘導さ第１た分泌信シーシーを↑［１
つたＬ） Ｎ Ａフラグメントを他のタンパクｒ１をコ
ードする遺伝ｌ′ｌこ融合させ、その融合遺伝子で適当
な微生物をＩｆ’−？Ｉ’ ｉ’、ｃ 押させることを
特徴とする分泌性タンパクτ１融合遺ｆムーｒ生成物の
製偕方法。 Ｑ７１スト１ノブ１−マイセスβ−カラクトシダーゼプ
ロモーター苓タンパク質をコートする遺伝イに融合さ−
（１、その融合遺伝子て適当な微／１−物苓」３質４９
、換させることを特徴とする微生物に遺伝了す発現させ
る方法。 ２ｓ第４〜＋＋７′ｌＦ白のいず才１かの１−） Ｎ
、ヘソラグメント番こてｌ） Ｎ Ａを肩（挿形成にイ
；１４″ことを特徴とする１１１同１）へＡ配列を提供
するため１（１） Ｎ Ａをプローブする方ｎ−０
た、ストレプトマイセス−リビダンスからの８ｋｂＤＮ
Ａフラグメントの制限エンドヌクレアーゼ開裂地図、第
２図はｐＳＫＬ−１の制限エンドヌクレアーゼ開裂地図
を示す。 特許出願人スミスクライン・ベックマン・コーポレイシ
ョン 代理人弁埋士青山 葆ほか２名 第１図 第２図 アメリカ合衆国剰ンシルベニア リ・旧９４４４ラファイエツ１−・ヒル・つｆステリア
・レイン２０１８番 手続補正書（帥） 昭和５８年７月Ｉ ＩＩ 特許庁１（宮 殿 １ 事件の表示 昭和５８年特許願第 ０９８７５２ 弓・２発明の
名称 クローン化ストレプトマイセス ３補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 スミスクライン・ベックマン・コーポレイショ
ン・１代理人 ５、補正命令の［１付 自発 ７ｆ＋ｌｉ ｉ＋：の内界 （１）明１ｈ１１と第１〜９頁の特許請求の範囲全別紙
のとおり補正する。 （２珪ｈ！ｊ第ｚ２頁木行〜第２３頁２行、「０９２ｋ
ｂ ・・・（中略）・・・ｐｒ・生する。」とある金、
つぎのとおり仙１１．する。 １−２２０ ｋｂ ｌ（１１１ Ｉ〜Ｉ（ｇｌ ＩＩ
（ ３．３ ９ ）フ”ノグメントはβーガワクトン
ダーゼではない分１必タンパク質をコー用−′する。該
ｔ（ｇ！タンパク質の出発コタンは１籟１１ザイトの約
３０へース下流にあるものと４えら７Ｌる。−］ （３）同１１）第３３頁７行、「コードすることができ
る」とあるを、（−表現するために必要な」と補正する
。 以上 捕市した特許ｎｊ’ｆ求の範囲 中伸の分泌物から（［１離さオ］た分泌＋１１β−がラ
クトシダーヤ （２）スト１ノプトマイセス菌神から得ら才する第ｎｕ
。 のβ−がラクトシターゼ。 （３）ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株から
得ら第１る第（１）丁自のβーガラクトシタ゛−ゼ。 （４）分泌性β−がラクトシターゼをコードし１１）る
ストｌ／ブトマイセス菌種に自然に存在するＪｒｔ伝ｒ
からｔ３Ｃるｌ） Ｎ Ａフラグメント。 （５＋該遺伝イかストレプトマイセスーリビタンス１３
２６株染色体１） Ｎ Ａ ｉこ自然にイｒイ１する第
（４）川のＩ） Ｎ Ａフラグメント。 （６）該遺伝ｆがＩ’ｓｔ■フラグメントに世．われで
いる第（５（頃のＩ） Ｎ Ａフラグメント。 （７）該遺伝イがＳｐｈｉフラグメントに担われている
第（５）頃のｌ） Ｎ Ａフラグメント。 （８）該遺伝イかトＪ１！のＩζｇ’ｒｌ−１’ｓｔｌ
フラグメントハＩＪ図： ＩＳｇＩ■ 、−３，３９ Ｐｖｕｌ 、 ５．５Ｏ Ｎｒｕｌ 、 ６．２５ Ｐｖｕｌ ７，０（１ １ミＣＩＩ ７．４５ＳＬｕ）
７．’５０１’ｓｔＩ ８
．６９ からｆ、ｉる６、９ ｋ ｌ） Ｉｓ ｇ璽 １− Ｓ
ｐｈ ［フラグメント１こ担わわている第（５）項のＤ
ＮＡフラグメント。 （９）該遺伝「−が）記の４１１図： ’ｇｌ １１ ３．３９ １’ｖｕ ｌ ５．５１１ Ｎｒｕ ■（、２５ Ｊ’ｖｕ ｌ ７．００ １％ｃｌｉ ７．４５ Ｓｔｕｉ ７．５０ １’ｓＬ） ８．６９ からなる５、ａｋ’ｂ！λｇ、１■−Ｐｓｔ■ フラグ
メントに担わわでいる第（５）項のＩ） Ｎ Ａフラグ
メント。 Ｇｒｉｔ該５））ＩＩＩ フラグメントか１０．３ｋ
ｂで下記のＳｐ ■−ＰｓｔＩフラグメント地図：
：・ 。 ５ｐｈｉ ” Ｏ Ｂａｍｌ” Ｉ Ｏ，５０ Ｐｖｕｉｌ Ｏ，７２ ＢａｌＩ １．１９ Ｓｔｕｌ １．３７ ＳａｌＩ １．７０ １１ｃｌ■２．１０ Ｂｇｌ 口 ２．４７
Ｂｇ１１ ３．３９ Ｐｖｕｌ ５．５Ｏ ＮｒｕＩ ６．２５ Ｐｖｕｌ ７．００ １１ｃｌｉ ７．４５ Ｓｔｕｌ ７，５０ １”ｓｔＩ ８゜６９ ヲ含む第（７１項のＩ） Ｎ Ａフラグメント。 （１１）ストレプトマイセス菌種において分泌性β−ガ
ラクトシダーゼをコードし得る遺伝子のすぐ上流に自然
に存在し％ １％ｇｌタンパク質をコードし得る遺伝子
からなるＩ） Ｎ Ａフラグメント。 Ｑ２１該遺伝子がストレプトマイセス・リビダンス１３
２６株染色体１） Ｎ Ａに自然に存在する第曲項のフ
ラグメント。 （１３）該１４ｇ１タンパク質遺伝子が下記の地図：■
弘ａ遍 １ １ＬＩ ９Ｓｔｉ＋
ｉ １．３７ Ｓ ａＩＴ １．７０１１ｃｌ［
２，１０ １鷺ｇｌ１１ ２．４７ １１ｇ１ｌｌ ３．３９ の２．２０ Ｊｌｏａｔ Ｔ −、Ｂｇｌ ｌ ７ラグ
メントに担われている第（１２１項のフラグメント。 ０４）ストレプトマイセスβ−ガラクトシダ、セプロモ
・−ターからなるＩ） Ｎ Ａフラグメント。 （１５）該プロモーターがストレプトマイセスーリピタ
ンス１３２６株染色体ＤＮＡに自然に存在し。 ｌｓｇ＋ タンパク質遺伝子とβ−がラクトシタ：−
ゼ遺壬子の上流にある第（１４）頃のフラグメント。 （１の該プロモーターが下記の」１１１図：５ｐｂ（Ｏ Ｈ３ｍ■ｉ ０．５０ Ｐｖｕｌｌ ｉ Ｏ，７２ １Ｓａ＋ １１．１９ Ｓ ｒ、ｕ １１．３７ Ｓａｌｌ 、１．７０ １％ＣＩＩ’ ２．１０ ’ Ｂｇｌ［２，４７ のｓｐｈ Ｉ −Ｂｇｌ ｒｌフラグメントＩＣ担わ才
１ている第（１５）項のフラグメント。 ＋＋７１該プロモーターが下記の１１１１図ニー制ヱ灯
色止−位置（ｋｈ） Ｐｖｕ ｌｉ ０．７２ Ｂａｌ Ｉ １．１９ ＳｔｕＩ １．３７ のＰｖｕ ｌ−５ｔｕ （フラグメントに担わねでいる
第（１５）項のフラグメント。 （１８）第（１）〜（１７１項のいずれかのｌ） Ｎ
Ａフラグメントて形質転換さオフた微生物。 （１９）β−カラクトシダーゼを産生ずるスト１プトマ
イセス菌種の１菌株から遺伝子をｔ＋ｓ ｘ＋ｔするこ
とを特徴１トする、分泌性β−ガラクトシダーゼをコー
ドＩｊｌ ル１ｌＩｆｌニーｒヲｔ［］ツタり Ｎ Ａ
７ ラフ、ｌ ７ ） （Ｄｑ棗Ｗ］？与方ンノー。 ｃｌｌ’ 該１＜ 伝−ｒラスｌ−レフトマイセス・リ
ビタンス１３２６株染色体１） Ｎ Ａから？１１離す
る第（Ｉ９）項の方法。 （１１１１該染色体１） Ｎ ＡをＳｐｈ ｉ、Ｐｓｔ
Ｉｉたはその両苦で処理することからなる第λ項の方
法。 の株ｔ４ｑ色体１） Ｎ Ａから中乱されたフラグメン
トをＩ−ｇｉｌｌで処理して、下記のＢｇｌ １ｌ−Ｐ
ｓｔ （フラグメントＪ１１」図： １％ｇｌｌ＋ ３．３９ Ｐ〜ｕＵ１ ５．５Ｏ Ｎｒｕｌ ６．２５ Ｂｃｌ［７，４５ Ｓｌｕ １ ７．５０ Ｉ’ｓ ｔ ■３．６ ｇ を含む５．３ ｋｌ）Ｂｇｌ １１ ＰｓＬ ｌ
／ラグ〆ントまたは６．９ｋｂ１％ｇｌ ｉｌ −５ｐ
ｌｉ １フラグメントを中乱する第Ｃａ１１項の方法。 ＋２３１分泌性β−がラクトシターゼをコードし？１）
る。 ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株染色１］フ
ラグメントを？ｌ卑ｉＦすることをｉ＃ Ｉ＆とする咋
１タンパク質をコード（、？−＋る遺伝了を１１１つだ
ｉ、） Ｎ Ａフラグメントの製造方法。 （２４＋分泌性だ一カラクトシダーゼをフードし？ｊｉ
るストレプトマイセス・リビダンス＋３２１１染色体１
） Ｎ Ａの５１）１１ ■７ ラグメント捷たはＰｓ
ｔ１７ラグメントを、Ｐｖｕｌおよび５Ｌｕｉ′ｃ処理
して下記の地図ニ ー但辻匡ｉ土−位置（ｋｂ） １）ＶＬｌ ｉ ０．７２ｌ％ａｌｌ
’ 、１．１９ＳＬＬＩＴ
１．３７ のフラグメントを中綿することを特徴とするストレプト
マイセスβ−ガラクトシダーゼプロモーターを４１１つ
たＩ） Ｎ Ａフラグメントの製ａ 方ン１：。 （２５）微生物を第（４）川のＩ） Ｎ Ａフラグメン
トて形質転呻さぜ、宿を細胞に容易に取込寸Ａ］ない染
色体債伝ｊ′基負をＪｌｌいて分泌さ第１たβ−カラク
トシターゼ４試験することを特徴とする」１１伝ｒの発
甲を１ξ□（験−４−る 方ンノ”。 Ｒ６）スト１ノプトマイセスβ−ガラクトシダーゼまた
（９■そのｌ５ｇ１ タンパク質遺伝子もしくはそれ
らい１才１かから誘導さ第１た分泌信シーシーを↑［１
つたＬ） Ｎ Ａフラグメントを他のタンパクｒ１をコ
ードする遺伝ｌ′ｌこ融合させ、その融合遺伝子で適当
な微生物をＩｆ’−？Ｉ’ ｉ’、ｃ 押させることを
特徴とする分泌性タンパクτ１融合遺ｆムーｒ生成物の
製偕方法。 Ｑ７１スト１ノブ１−マイセスβ−カラクトシダーゼプ
ロモーター苓タンパク質をコートする遺伝イに融合さ−
（１、その融合遺伝子て適当な微／１−物苓」３質４９
、換させることを特徴とする微生物に遺伝了す発現させ
る方法。 ２ｓ第４〜＋＋７′ｌＦ白のいず才１かの１−） Ｎ
、ヘソラグメント番こてｌ） Ｎ Ａを肩（挿形成にイ
；１４″ことを特徴とする１１１同１）へＡ配列を提供
するため１（１） Ｎ Ａをプローブする方ｎ−０
Claims (28)
- （１）他の分泌物から単離された分泌性β−ガラクトシ
ダーゼ。 - （２）ストレプトマイセス菌種から得られる第（１）項
のβ−ガラクトシダーゼ。 - （３）ストレプトマイセス・リジダンス１３２６株から
得られる第（１）項のβ−ガラクトシダーゼ。 - （４）分泌性β−ガラクトシダーゼをコードし得るスト
レプトマイセス菌種に自然に存在する遺伝子からなるＤ
ＮＡフラグメント。 - （５）該遺伝子がストレプトマイセス・リビダンス１３
２６株染色体ＤＮＡに自然に存在する第（４）項のＤＮ
Ａフラグメント。 - （６）該遺伝子がＰｓｔＩフラグメントに担われている
第（５）項のＤＮＡフラグメント。 - （７）該遺伝子がＳｐｈＩフラグメントに担われている
第（５）項のＤＮＡフラグメント。 - （８）該遺伝子が下記のＢｇｌＩＩ−ＰｓｔＩフラグメ
ント地図： 制限酵素 位置（ｋｂ） ＢｇｌＩＩ ３．３９ ＰｖｕＩＩ ５．５０。 ＮｒｕＩ ６．２５ ＰｖｕＩＩ ７．００ ＢｃｌＩ ７．４５ ＳｔｕＩ ７．５０ ＰｓｔＩ ８．６９ からなる６．９ｋｂＢｇｌＩＩ−ＳｐｈＩフラグメント
に担われている第（５）項のＤＮＡフラグメント。 - （９）該遺伝子が下記の地図： 制限酵素 位置（ｋｂ） ＢｇｌＩＩ ３．３９ ＰｖｕＩＩ ５．５Ｏ ＮｒｕＩ ６．２５ ＰｖｕＩＩ ７．００ ＢｃｌＩ ７．４５ ＳｔｕＩ ７．５０ ＰｓｔＩ ８．６９ からなる５．３ｋｂＢｇｌＩＩ−ＰｓｔＩフラグメント
に担われている第（５）項のＤＮＡフラグメント。 - （１０）該ＳｐｈＩフラグメントが１０．３ｋｂで下記
のＳｐｈＩ−ＰｓｔＩフラグメント地図：制限酵素
位置（ｋｂ） ＳｐｈＩ ０ ＢａｍＨＩ ０．５０ ＰｖｕＩＩ ０．７２ ＢａｌＩ １．１９ ＳｔｕＩ １．３７ ＳａｌＩ １．７０ ＢｃｌＩ ２．１０ ＢｇｌＩＩ ２．４７ ＢｇｌＩＩ ３．３９ ＰｖｕＩＩ ５．５０ ＮｒｕＩ ６．２５ ＰｖｕＩＩ ７．００ ＢｃｌＩ ７．４５ ＳｔｕＩ ７．５０ ＰｓｔＩ ８．６９ を含む第（７）項のＤＮＡフラグメント。 - （１１）ストレプトマイセス菌種において分泌性β−ガ
ラクトシダーゼをコードし得る遺伝子のすぐ上流に自然
に存在し、Ｂｇｌタンパク質をコードし得る遺伝子から
なるＤＮＡフラグメント。 - （１２）該遺伝子がストレプトマイセス・リビダンス１
３２６株染色体ＤＮＡに自然に存在する第（１１）項の
フラグメント。 - （１３）該Ｂｇｌタンパク質遺伝子が０．９２ｋｂＢｇ
ｌＩＩフラグメントに担われている第（１２）項のフラ
グメント。 - （１４）ストレプトマイセスβ−ガラクトシダーゼプロ
モーターからなるＤＮＡフラグメント。 - （１５）該プロモーターがストレプトマイセス・リビダ
ンス１３２６株染色体ＤＮＡに自然に存在し、Ｂｇｌタ
ンパク質遺伝子とβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の上流に
ある第（１４）項のフラグメント。 - （１６）該プロモーターが下記の地図：制限酵素 位
置（ｋｂ） ＳｐｈＩ ０ ＢａｍＨＩ ０．５０ ＰｖｕＩＩ ０．７２ ＢａｌＩ １．１９ ＳｔｕＩ １．３７ ＳａｌＩ １．７０ ＢｃｌＩ ２．１０ ＢｇｌＩＩ ２．４７ のＳｐｈＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントに担われている第
（１５）項のフラグメント。 - （１７）該プロモーターが下記の地図：制限酵素 位
置（ｋｂ） ＰｖｕＩＩ ０．７２ ＢａｌＩ １．１９ ＳｔｕＩ １．３７ のＰｖｕＩＩ−ＳｔｕＩフラグメントに担われている第
（１５）項のフラグメント。 - （１８）第（１）〜（１７）項のいずれかのＤＮＡフラ
グメントで形質転換された微生物。 - （１９）β−ガラクトシダーゼを産生するストレプトマ
イセス菌種の１菌株から遺伝子を単離することを特徴と
する、分泌性β−ガラクトシダーゼをコードし得る遺伝
子を担ったＤＮＡフラグメントの製造方法。 - （２０）該遺伝子をストレプトマイセス・リビダンス１
３２６株染色体ＤＮＡから単離する第（１９）項の方法
。 - （２１）該染色体ＤＮＡをＳｐｈＩ、ＰｓｔＩまたはそ
の両者で処理することからなる第（２０）項の方法。 - （２２）該染色体ＤＮＡから単離されたフラグメントを
ＢｇｌＩＩで処理して、下記のＢｇｌＩＩ−ＰｓｔＩフ
ラグメント地図： 制限酵素 位置（ｋｂ） ＢｇｌＩＩ ３．３９ ＰｖｕＩＩ ５．５０ ＮｒｕＩ ６．２５ ＰｖｕＩＩ ７．００ ＢｃｌＩ ７．４５ ＳｔｕＩ ７．５０ ＰｓｔＩ ８．６９ を含む５．３ｋｂＢｇｌＩＩ−ＰｓｔＩフラグメントま
たは６．９ｋｂＢｇｌＩＩ−ＳｐｈＩフラグメントを単
離する第（２１）項の方法。 - （２３）分泌性β−ガラクトシダーゼをコードし得る、
ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株染色体ＤＮ
ＡのＳｐｈＩフラグメントまたはＰｓｔＩフラグメント
を、ＢｇｌＩＩで処理して０．９２ｋｂＢｇｌＩＩフラ
グメントを単離することを特徴とするＢｇｌタンパク質
をコードし得る遺伝子を担ったＤＮＡフラグメントの製
造方法。 - （２４）分泌性β−ガラクトシダーゼをコードし得る、
ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株染色体ＤＮ
ＡのＳｐｈＩフラグメントまたはＰｓｔＩフラグメント
を、ＰｖｕＩＩおよびＳｔｕＩで処理して下記の地図： 制限酵素 位置（ｋｂ） ＰｖｕＩＩ ０．７２ ＢａｌＩ １．１９ ＳｔｕＩ １．３７ のフラグメントを単離することを特徴とするストレプト
マイセスβ−ガラクトシダーゼプロモーターを担ったＤ
ＮＡフラグメントの製造方法。 - （２５）微生物を第（４）項のＤＮＡフラグメントで形
質転換させ、宿主細胞に容易に取込まれない染色体遺伝
子基質を用いて分泌されたβ−ガラクトシダーゼを試験
することを特徴とする遺伝子の発現を試験する方法。 - （２６）ストレプトマイセスβ−ガラクトシダーゼまた
はそのＢｇｌタンパク質遺伝子もしくはそれらいずれか
から誘導された分泌信号を担ったＤＮＡフラグメントを
他のタンパク質をコードする遺伝子に融合させ、その融
合遺伝子で適当な微生物を形質転換させることを特徴と
する分泌性タンパク質融合遺伝子生成物の製造方法。 - （２７）ストレプトマイセスβ−ガラクトシダーゼプロ
モーターをタンパク質をコードする遺伝子に融合させ、
その融合遺伝子で適当な微生物を形質転換させることを
特徴とする微生物に遺伝子を発現させる方法。 - （２８）第（１）〜（１７）項のいずれかのＤＮＡフラ
グメントにてＤＮＡを雑種形成に付すことを特徴とする
相同ＤＮＡ配列を提供するためにＤＮＡをプローブする
方法。
Applications Claiming Priority (3)
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| US38465082A | 1982-06-03 | 1982-06-03 | |
| US384650 | 1982-06-03 | ||
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|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0187630A2 (en) * | 1984-12-14 | 1986-07-16 | Smithkline Beecham Corporation | Cloned streptomyces beta-galactosidase promoter fragment |
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| KR101457330B1 (ko) * | 2011-08-23 | 2014-11-04 | 후루카와 덴키 고교 가부시키가이샤 | 해중 케이블, 그 차수층용 복층 테이프 및 해중 케이블의 피로특성 향상방법 |
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-
1985
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Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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| EP0187630A3 (en) * | 1984-12-14 | 1988-01-27 | Smithkline Beckman Corporation | Cloned streptomyces beta-galactosidase gene |
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