FI100250B - Hirudiinijohdannaisten eritys - Google Patents

Description

* 100250

Hirudiinijohdannaisten eritys - Sekretion av hirudinderivat

Keksintö koskee menetelmää hirudiinijohdannaisten saamiseksi E. coli-eritysmutanteista sekä hirudiinijohdannaista, jonka 5 N-pään aminohapposekvenssi on Ala-Thr-Tyr-Thr-Asp.

Hirudiini on 65 aminohaposta koostuva polypeptidi ja se eristettiin alunperin verijuotikkaasta Hirudo medicinalis. Se on erittäin spesifinen trombiini-inhibiittori, koska se muodostaa 10 trombiinin kanssa stabiileja komplekseja, minkä lisäksi sillä on monia terapeuttisia käyttömahdollisuuksia, erityisesti anti-koagulaatioterapiassa (F. Markquardt, Biomed.Biochim.Acta 44 (1985) 1007 - 1013).

15 Sen jälkeen kun hirudiinin täydellinen aminohapposekvenssi oli julkistettu (J. Dodt et ai., FEBS LETTERS (2) (1984) 180 - 184), oli täytetty edellytys hirudiinin valmistamiseksi yhdistelmä-DNA-tekniikoilla ja sen ilmentämiseksi mikro-organismeissa .

20

Julkaisussa EP-A-0 158 564 (Transgene) julkistetaan kloonaus-V vektoreita hirudiinin tai hirudiinianalogien ilmentämiseksi :...· isäntäsolussa, erityisesti bakteerisolussa. Hirudiinin koodit- tava geeni saadaan tällöin cDNA-synteesillä lähtien verijuotik-25 kaasta Hirudo medicinalis eristetystä mRNA:sta. Erityisesti ·:**: kuvataan hirudiini johdannaista, jonka N-pääsekvenssi on

Ile-Thr-Tyr-Thr-Asp sekä menetelmää sen saamiseksi.

Julkaisussa EP-A-0 168 342 (Ciba Geigy) julkistetaan DNA-sek- 30 venssejä, jotka koodittavat hirudiinin luontaisen aminohappo- •t sekvenssin, jolloin N-pään aminohapposekvenssi on Val-Val-Tyr- • · « ·;;; Thr-Asp. Hirudiini ilmennetään solunsisäisesti E. coli - ja ’···’ Saccharomyces cerevisiae -mikro-organismeissa.

:’\:35 Julkaisussa EP-A-0 171 024 (Hoechst AG) julkistetaan menetelmä sellaisten polypeptidien geenitekniseksi valmistamiseksi, joil- 100250 2 la on hirudiiniaktiivisuutta, erityisesti E. coli-soluissa, jolloin (menetelmän mukaan) solut avataan ja polypeptidi, jolla on hirudiiniaktiivisuutta, eristetään solu-uutteesta. Mahdollisesti läsnä oleva fuusioproteiiniosa voidaan erottaa proteo-5 lyyttisesti tai kemiallisesti pilkkomalla, minkä jälkeen vapautettu hirudiinimolekyyli puhdistetaan.

Julkaisu DE-OS 34 45 571 (Gen-Bio-Tec) koskee DNA-sekvenssiä, joka koodittaa proteiinin, jolla on hirudiinin biologinen ak-10 tiivisuus, sekä menetelmää tällaisten proteiinien saamiseksi E. coli -soluista, jotka on transformoitu sopivalla yhdistelmä-vektorilla, suorittamalla solulyysi.

Myös ryhmän Bergmann et ai. (Biol.Chem.Hoppe Seyler 367 (1986) 15 731 - 740) työ kuvaa hirudiinisynteesiä E. colissa. Hirudiini vapautetaan soluista käsittelemällä niitä tolueenilla, jolloin päästään kuitenkin vain alhaisiin saantoihin, jotka ovat noin 500 ng/litra A578-yksikköä soluja.

20 Julkaisuissa EP-A-0 200 655 (Transgene), EP-A-0 252 854 (Trans-gene) ja EP-A-0 225 633 (Ciba Geigy) julkistetaan valmistus '·' ’ erittämällä proteiineja, joilla on hirudiiniaktiivisuutta, :...· eukaryoottisessa isäntäorganismissa, erityisesti hiivoissa, jolloin ilmennetään vektori, joka käsittää DNA-sekvenssin, joka 25 sisältää signaalipeptidin rakennegeenistä ylävirtaan. Julkiste-taan hirudiinijohdannaisten eritys, joiden N-pääsekvenssi on : Val-Val-Tyr-Thr-Asp, sekä N-pääsekvenssi Ile-Thr-Tyr-Thr-Asp hiivoissa. Tällöin ilmoitetaan saannoiksi aina 100 mg/litra.

• · • · • · a ·*·*j 3 0 Julkaisussa DE-OS 39 00 626 (Hoechst AG) julkistetaan hiru- *. diinijohdannainen, jonka N-pääsekvenssi on Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp.

• · · *;;; Ilmentäminen suoritetaan edullisesti hiivoissa, jolloin käyte-’··/’ tään hiivaferomonigeenin MF-alfa promoottoria ja signaalisek- • a venssiä hirudiini johdannaisen ilmentämiseksi ja erittämiseksi .

:' *.:3 S

100250 3

Kaikilla edellä kuvatuilla menetelmillä hirudiinijohdannaisten valmistamiseksi on kuitenkin huonoja puolia. Tällöin saadaan käytettäessä hiivoja isäntäorganismina ja erittämällä hirudiini kasvualustaan suhteellisen korkeita saantoja, jolloin kuitenkin 5 hiivasolujen viljely kestää kauemmin ja on vaativampaa kuin bakteerien, esim. E. colin. E. coli -soluissa sitä vastoin saanto kuitenkin on verraten alhainen ja/tai soluja rikottaessa joudutaan käyttämään mutkikkaita eristysmenettelyjä.

10 Täten esillä olevan keksinnön tehtävänä oli kehittää yksinkertainen menetelmä hirudiinijohdannaisten saamiseksi, jolla menetelmällä voidaan saada korkeita hirudiinijohdannaissaantoja bakteerisoluista ilman, että soluja tässä yhteydessä joudutaan rikkomaan.

15

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää hirudiinijohdannaisten saamiseksi E. coli-eritysmutanteista, jonka menetelmän mukaan: (1) rakennetaan yhdistelmävektori, jossa hirudiinijohdan- 20 naisen koodittava geeni sijaitsee DNA-palan jäljessä, joka koodittaa bakteerin signaalipeptidiä; (2) vaiheessa (1) rakennetulla yhdistelmävektorilla trans-formoidaan E. coli-eritysmutantti; 25 (3) transformoituja soluja viljellään kasvualustassa; ja « · « • · ♦ • · · (4) hirudiinijohdannainen otetaan talteen kasvualustasta.

• · • · • · ;**; 30 Ilmaisulla "hirudiinijohdannainen" tarkoitetaan tämän keksinnön « mukaan hirudiinista johdettuja proteiineja, jotka inhiboivat • · · ;;; trombiinia ja joiden spesifinen aktiivisuus on vähintään 10 000 : : ·;· AT-U/mg (antitrombiiniyksikköä) (Dodt et ai., Biol.Chem.Hoppe : Seyler 366 (1985) 379 - 385) . Ilmaisun "hirudiinijohdannainen" ’./•>35 piiriin kuuluvat myös fuusioproteiinit, joissa on aina noin 50 aminohapon mittainen N-pääfuusio-osa, joka voidaan poistaa 100250 4 osittain tai kokonaan proteolyyttisesti tai kemiallisesti pilkkomalla, jolloin pilkkomistuotteena saadaan hirudiinijohdannainen, jonka spesifinen aktiivisuus on vähintään 10 000 AT-U/mg.

5 Edullisesti keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetaan hirudiinijohdannaisia, joiden N-pään aminohapposekvenssi on seuraava: (X)m - Z - Thr - Tyr - Thr - Asp 10 jossa m = 0 - 50; X:t merkitsevät keskenään samanlaisia tai toisistaan poikkeavia, geneettisesti koodittuvia aminohappoja; Z merkitsee geneettisesti koodittuvaa aminohappoa, joka on 15 ryhmästä Leu, Ile, Ala, Vai, Gly, Ser, Asp, Glu, Asn, Gin, His, Met, Phe ja Tyr.

Jos m on suurempi kuin 0, sekvenssi X sisältää edullisesti pro-teolyyttisen tai kemiallisen lohkaisukeskuksen, erityisen edul-20 lisesti päässään. Jos esim. sekvenssin X viimeinen aminohappo on Arg-jäännös, fuusiosekvenssi X voidaan lohkaista trypsiini-'·' ' pilkkomisella (lohkaisu Arg:n jälkeen) ja puhdistaa aktiivinen hirudiini johdannainen. Fuusio-osa voidaan kuitenkin lohkaista :. pois myös muilla tunnetuilla proteolyyttisillä entsyymeillä tai '·"* 25 kemiallisilla pilkkomisreagensseilla. Jos esim. X:n aminohappo-sekvenssi päättyy Met-jäännökseen, fuusioproteiini voidaan loh- • · · ' kaista pilkkomalla halogeenisyaanilla (E. Gross ja B. Wittkop, J.Am.Chem.Soc. £2. (1961) 1510 - 1517). Jos X:n C-pään aminohap-posekvenssi sisältää esim. aminohapposekvenssin Ile-Glu-Gly-;”*;30 Arg, voidaan pilkkominen suorittaa tekijällä Xa (EP-A-0 025 190 ja EP-A-0 161 973).

• · · : : ··/ Jos keksinnön mukaisessa menetelmässä m = 0, Z merkitsee edul-lisesti aminohappo jäännöstä Gin, His, Phe, Tyr, Gly, Ser, Asp :’.:35 tai Asn, erityisen edullisesti Ala, Gly, Ser, Asp tai Asn.

100250 5

Yleensä ottaen edullinen on hirudiinijohdannainen, jossa τη on 0 ja Z on Ala.

Esillä oleva keksintö koskee täten myös hirudiinijohdannaisia, 5 joiden N-pääsekvenssi on A-Thr-Tyr-Thr-Asp, jossa A on Gin,

His, Phe, Tyr, Gly, Ser, Asp tai Asn, edullisesti Ala, Gly,

Ser, Asp tai Asn. Yleensä ottaen edullinen on johdannainen, jossa N-pääsekvenssi on Ala-Thr-Tyr-Thr-Asp. Tästä hirudiini-johdannaisesta voitiin yllättäen E. coli -eritysmutantin vil-10 jelmäsupernatantista saada aktiivista hirudiinia aina yli 2 g/litra kasvualustaa.

Keksinnön mukaisen menetelmän edelleen seuraava etu on, että hirudiinijohdannaisen erittyessä solukasvualustaan hirudiinin 15 disulfidisillat muodostuvat oikealla tavalla kasvualustan hapettavissa olosuhteissa.

Esillä olevan keksinnön mukaan ilmaisulla "E. coli-eritysmutan-tit" tarkoitetaan E. coli -kantoja, jotka osoittavat hyvin 20 runsasta proteiinien eritystä kasvualustaan. Menetelmä näiden eritysmutanttien valmistamiseksi on julkistettu julkaisussa '·' ' EP-A-0 338 410. Sopivien E. coli-eritysmutanttien hankkimiseksi voidaan lähteä erityisesti kannoista E. coli DS410 (DSM 4513) :. .' tai E. coli BW7261 (DSM 5231) . Kulloinenkin E. coli-kanta *·”· 25 transformoidaan ensin plasmidilla, joka sisältää erityskelpois-ta proteiinia koodattavan DNA-sekvenssin. Sen jälkeen transfor- • · · 1 : ' moitu E. coli -kanta mutatoidaan, esim. käsittelemällä sitä N-metyyli-N'-nitro-N-nitrosoguanidiinilla. Sitten valikoidaan esiin sopivat eritysmutanttikannat. Jos erittyvänä proteiinina :*·*: 30 käytetään esim. alfa-syklodekstriiniglykosyylitransferaasia, eritysmutantit voidaan tunnistaa vastustuskyvystä soluseinien • "*! suhteen aktiivista ainetta D-sykloseriini vastaan. Edelleen i : alfa-syklodekstriiniglykosyylitransferaasin (CGT-aasi) eritys • « aiheuttaa tärkkelyksen hydrolysoitumisen ympäröivässä kasvu- • * :-.:35 alustassa, mikä tarjoaa amylopektiiniasuurikasvualustaa käytettäessä toisenkin eritysmutanttien valikointimahdollisuuden.

100250 6

Yhdistelmävektoriksi esillä olevaan keksintöön soveltuvat vektorit, jotka joko kykenevät integroitumaan E. coli -genomiin (esim. bakteriofagi lambda) tai jotka ovat transformoiduissa 5 E. coli -soluissa kromosomin ulkopuolella (esim. plasmidit). Edullisesti käytetään plasmideja.

Geenirakennelma on yhdistelmävektorissa, joka koodittaa signaa-lipeptidistä ja hirudiinijohdannaisesta koostuvan proteiinin, 10 edullisesti indusoitavan promoottorin säätelyn alaisena, erityisen edullisesti trp-lac-fuusiopromoottorin, joka voidaan indusoida lisäämällä laktoosia tai IPTG:tä (isopropyyli-beta-D-tiogalaktosidi). Vektorin tulee edelleen sisältää valikoin-timerkkigeeni ja mahdollisesti lac-repressorigeeni.

15

Bakteerisignaalisekvenssiksi, joka mahdollistaa hirudiinijoh-dannaisen erityksen, sopivat periaatteessa kaikki tunnetut signaalipeptidit, jotka mahdollistavat E. coli-solumembraanin läpäisyn. Edullisesti käytetään siksi myös signaalipeptidejä 20 gram-negatiivisista bakteereista (esim. seuraavien E. coli-pro-teiinien signaalipeptidejä: ‘' ulkomembraaniproteiini OmpA (DiRienzo et ai., Ann.Rev.Biochem.

:···! 17 (1978) 481 - 532) ; 4 4« alkalinen fosfataasi PhoA (Inouye et ai., J.Bacteriol. 14 9 25 (1982) 434 - 439);

LamB-proteiini (Hedgpeth et ai., Proc.Nat .Acad.Sci. U.S.A. 77 **i’* (1980) 2621 - 2625); maltoosisideproteiini MalE (Bedouelle, H., et ai., Nature 285 (1980) 78 - 81) . Erityisen edullisesti käytetään alfa-CGT-aasi-30 signaalipeptidiä.

♦ « ♦ ♦ ♦ */.'. Keksinnön mukaiseen menetelmään sopiva vektori on esim. plas- i : midi pCM705 (kuvio 1), joka voidaan saada julkaisussa EP-A-·/.♦ 0 383 410 julkistetusta plasmidista pCM703 poistamalla noin 4 « *•/••35 1 ke:n pituinen NruI - fragmentti. Tämä vektori sisältää ampisil- liiniresistenssigeenin, lac-repressorigeenin ja CGT-aasi-geenin 100250 7 sekä signaalipeptidin koodittavan palasen 5'-päässä. Hirudii-nijohdannaisen koodittava geeni integroidaan vektoriin pCM705 siten, että solunsisäisesti muodostuu prekursorimolekyyli, jossa on alfa-CGT-aasin signaalipeptidi N-päässään. Geeniraken-5 nelma on tae-promoottorin säätelyn alaisena. Tällä tavalla saadulla plasmidilla voidaan transformoida E. coli-eritysmu-tanttikanta.

Transformaatiopositiiviseksi todettuja klooneja viljellään 10 ravistelukolveissa tai fermentorissa. Optisen tiheyden (O.D.600) saavuttaessa arvon noin 1 suoritetaan indusointi IPTG:llä (isopropyyli-beta-D-tiogalaktosidi) tai laktoosilla.

Sen jälkeen hirudiinijohdannaisen tuotannon sujuminen määrite-15 tään käyttämällä trombiini-inaktivaatiokoetta (Griesbach et ai., Thrombosis Research 37 (1985) 347 - 350). Fuusioproteii-nien akkumulaatiota analysoidaan HPLC-kromatografisesti (kään-teisfaasissa). Fuusioproteiinien pre-osat voidaan sitten lohkaista pois ja saatu aktiivinen hirudiinijohdannainen puhdis-20 taa.

• * i · '·' ' Seuraavien esimerkkien tarkoituksena on kuvioiden 1-5 ohella

• · I

f t '···' selvittää keksintöä tarkemmin.

« · « · *·' · 25 Kuviot esittävät: • · • « · · Kuvio 1: plasmidi pCM705;

Kuvio 2: synteettisen hirudiinigeenin pK152:sta DNA-sekvenssi ; ·"·*· 30 i · f w v *. Kuvio 3: oligonukleotidien HIR1, HIR2 ja HIR3 sekvenssit; « t · · Γ*':

Kuvio 4: plasmidi pCM7051; ja • · » % · : · ;35 Kuvio 5: plasmidi pCM7053.

100250 8

Esimerkki 1 Eritysvektorin rakentaminen 5 Plasmidi pK152 sisältää synteettisen hirudiinigeenin, jonka sekvenssi esitetään julkaisussa EP-A-0 171 024. Tästä plasmi-dista lähtien eristettiin agaroosi-geelielektroforeettisesti noin 200 ep:n kokoinen HinfI/HindiII-DNA-fragmentti, joka sisältää valtaosan hirudiinin koodittavasta DNA-sekvenssistä 10 (kuvio 2). Puuttuva 5'-pääsekvenssi muodostetaan käyttäen vartavasten syntetisoitua oligonukleotidia (HIR1). Oligonukleoti-din koodisekvenssi on esitetty kuviossa 3. Fuusioimalla Hinfl-päät saadaan hirudiinijohdannainen, jonka N-pääsekvenssi on Ala-Thr-Tyr-Thr-Asp.

15

Plasmidi pCM705 (kuvio 1) pilkotaan Pstl:llä ja HindIII:lla. Molemmat pilkkomiskeskukset ovat CGT-aasi-geenin koodialueella, josta tulee leikatuksi noin 1 ke:n kokoinen DNA-palanen. PstI pilkkoo täsmälleen aluekohdasta, joka koodittaa signaalipepti-20 daasilohkaisukeskuksen.

• · * · *·' ' Fragmentit pCM705 Pstl/Hindlll 6,3 ke; pK152 Hindl/Hindlll • « « « · 0,2 ke; ja oligonukleotidi HIR1 ligatoidaan toisiinsa, jolloin ’·. saadaan plasmidi pCM7051 (kuvio 4) . Ligatointiseoksella trans- ’·"* 25 formoidaan E. coli -kanta HB101 (DSM 1607). Pesäkkeet, jotka eivät selektiivisellä kasvualustalla, joka sisältää amylopek-' tiiniasuuria (värillinen amylopektiini), osoita tärkkelyshajo-amiskehiä ja siten alfa-CGT-aasi-ilmennystä, eristetään ja puhdistetaan homogeenisiksi. Useammasta puhdistetusta kloonista ·**; 30 eristetään plasmidi-DNA, jota karakterisoidaan restriktioana-*. lyysilla. Kahdesta plasmidista, jotka sisältävät hirudiini- *”*. insertin, suoritetaan fuusioalueen sekvenssianalyysi.

» : * * * • ·

Plasmidi-DNA, joka sisältää halutun, oikean hirudiinigeenira-’ j 35 kenteen, pilkotaan Nrul:llä ja Ndel:llä, minkä jälkeen aga- 100250 9 roosigeelielektroforeettisesti eristetään 5,18 ke:n kokoinen fragmentti.

Ndel-pilkkomisessa syntynyt ylijäämäsekvenssi täytetään käyttä-5 en Klenow-entsyymiä, minkä jälkeen fragmentista tehdään liga-toimalla ympyrän muotoinen. Saatu plasmidi nimetään pCM7053:ksi (kuvio 5).

Tällä plasmidilla pCM7053 transformoidaan eritysmutantti 10 E. coli WCM100, joka saatiin julkaisussa EP-A-0 338 410 kuvatun menetelmän mukaan.

Esimerkki 2 15 Hirudiinierityksen määritys ravistelukolvikokeissa

Kymmeneen (10) ml:aan LB-kasvualustaa, joka sisälsi 100 mikro-grammaa/ml ampisilliiniä, siirrostettiin tuoretta, yön yli kasvanutta WCM100-pCM7053-viljelmää optiseen tiheyteen O.D.420= 20 0,1. Viljelmää ravistellaan 30 °C:ssa. Kun optinen tiheys on , . saavuttanut arvon O.D.42o = 1»°/ lisätään indusoriksi laktoosia I f 1 %:n loppupitoisuuteen. 48 tunnin kuluttua viljelmästä otetaan « · *;;·* näytteitä, joista solut sentrifugoidaan eroon, ja määritetään • · '· ·* supernatantin hirudiinipitoisuus. Määritys suoritetaan käyttäen * * 25 trombiini-inaktivaatiokoetta. Saannoiksi määritettiin aina 4 000 AT-U/ml (antitrombiiniyksikköä) (vastaa noin 250 *.· : mg/litra) .

»·

Esimerkki 3 :T: 30

Hirudiinin tuottaminen 10 litran fermentorissa « » « · « » « i : *” Seitsemään (7) litraan minimivaatimuskasvualustaa, joka sisälsi « * V.· 100 mikrogrammaa/ml ampisilliiniä, siirrostetaan tuoretta, yön • · V'! 35 yli kasvanutta WCM100-pCM7053-viljelmää optiseen tiheyteen 0D-600 = 0/1· 100250 10

Fermentointiolosuhteet ovat:

Lämpötila: 30 °C

Sekoitusnopeus: 450 - 950 kierr./min 5 Ilmastus: 0,5 - 1,5 til./min pH-arvo: 7,0 +/- 0,1.

Kun optinen tiheys saavuttaa arvon O.D.600 = 1,0, lisätään IPTG:tä (isopropyyli-beta-D-tiogalaktosidi) pitoisuuteen 10 0,5 mM.

Kun IPTG-lisäyksestä oli kulunut 40 tuntia, supernatantista voitiin määrittää pitoisuus 36 000 AT-U/ml (vastaa noin 2,25 g/litra).

15

Esimerkki 4

Hirudiinin erittäminen, jonka N-pääsekvenssi on Ala-Thr-Arg-Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp 20

Meneteltäessä kuten esimerkissä 1, mutta käyttäen oligonukle- « 4 ’ otidin HIR1 asemesta oligonukleotidia HIR2 (kuvio 3) , saadaan » · *’··' signaalipeptidin poislohkaisun jälkeen hirudiinifuusioproteii- i i * ’· .* ni, jonka N-pääsekvenssi on Ala-Thr-Arg-Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp.

’·' * 25 Tämän fuusioproteiinin akkumulaatio supernatanttiin määritetään :"· HPLC-analyyttisesti käyttäen "käänteisfaasi"-olosuhteita (C18- * ·» *.·· kromatografiakolonni). Fermentoitaessa tämän geenirakenteen sisältävää kantaa WCM100 saatiin 25 mg:n/litra saanto fuusio-i**,. proteiinia.

»Ti 30

Pilkkomalla trypsiinillä voidaan saada aktiivista hirudiinia, « jonka N-pääsekvenssi on Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp.

« « • · • * » 9 • · 1 * » T * » « V i 35 100250 11

Esimerkki 5

Hirudiinin eritys eritysmutantilla WCM88 5 Eritysmutantti WCM88, joka samoin saatiin julkaisussa EP-A-0 338 410 kuvatulla tavalla, transformoidaan plasmidilla pCM7053 (katso esimerkki 1). Hirudiinin tuotanto kasvualustaan erittymällä testataan ravistelukolvikokeissa ja fermentoimalla.

a) Ravistelukolvikokeet 10

Esimerkkiin 2 nähden analogisesti viljellään kantaa WCM88-pCM7053. 48 tunnin kuluttua viljelmäsupernatantista määritetään hirudiinipitoisuus. Päästiin aina 1 800 AT-U/ml saantoihin (vastaa noin 110 mg/ml).

15 b) Tuotanto 10 litran fermentorissa

Kanta siirrostettiin kuten kuvataan esimerkissä 3. 45 tunnin kuluttua IPTG:n lisäämisestä voitiin supernatantista todeta 20 pitoisuus 21 000 AT-U/ml (vastaa noin 1,3 g/litra).

Esimerkki 6 ' Tetrasykliiniresistenssigeenin sisältävän eritysvektorin raken- *· ·' 25 taminen 1,1 ke:n NruI-fragmentti eristettiin plasmidista pBR322 • · · V · (F. Bolivar et ai., Gene 2 (1977) 95 - 113), ja ligatoitiin

Nrul:llä pilkkomalla linearisoituun plasmidiin pCM7051 (katso j 30 kuvio 4) . Ligaatioseoksella transformoitiin E. coli-kanta HBIOI, minkä jälkeen trans formant it seulottiin niiden tetrasyk-liini resistenssin nojalla. Valitusta kloonista eristettiin jälleen plasmidi-DNA, joka pilkottiin Ndel:llä ja Avalcllä.

• · • * DNA-fragment it erotettiin elektroforeettisesti agaroosigeelis-•.*.’35 sä. Eristettiin suurempi fragmentti, jonka yksisäie-ylijäämä-• · 100250 12 päät täytettiin Klenow-entsyymiä käyttäen, minkä jälkeen suoritettiin ligatointi.

Saatu plasmidi nimettiin pCMT203:ksi.

5

Esimerkki 7

Hirudiinin eritys pCMT203-eritysvektoria käyttäen 10 Eritysmutantti WCM100 (katso esimerkki 1) transformoitiin plas-midilla pCMT203. Saatua kantaa viljeltiin 10 litran fermento-rissa. 45 tunnin kuluttua IPTG-lisäyksestä voitiin määrittää pitoisuus 42 000 AT-U/ml hirudiinia (vastaa noin 2,63 g/litra).

* I < • · « · • · • ·♦ • * * * · · • · • · • · · » · · • · · • « · • *

Claims (11)

100250 13

1. Menetelmä hirudiinijohdannaisten, jotka sisältävät N-pääte-sekvenssin Ala-Thr-Tyr-Thr-Asp, saamiseksi E. coli-kannoista, 5 joilla on runsas proteiinieritys kasvualustaan, tunnet -t u siitä, että: (1) rakennetaan yhdistelmävektori, jossa hirudiinijohdan naisen koodittava geeni sijaitsee välittömästi DNA-pa-lan jälkeen, joka koodittaa bakteerin signaalipeptidiä; 10 (2) vaiheessa (1) rakennetulla yhdistelmävektorilla trans formoidaan E. coli-kanta, jolla on runsas proteiinieritys kasvualustaan; (3) transformoituja soluja viljellään kasvualustassa; ja (4) hirudiinijohdannainen otetaan talteen kasvualustasta. 15

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmävektorina käytetään plasmidia.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, t u n -20 n e t t u siitä, että rakennetaan yhdistelmävektori, jossa hirudiinijohdannaisen ja signaalipeptidin koodittavat DNA- . . sekvenssit ovat indusoitavan promoottorin säätelyn alaisina. « · • 4 t

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu • ’· ·* 25 siitä, että indusoitavana promoottorina käytetään trp-lac-fuusiopromoottoria.

• · • · · *.·' 5. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään gram-negatiivisista • · ♦ *.· 30 bakteereista peräisin olevaa signaalipeptidiä. • · · • · · # ♦ ♦ «

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu • · « · ···. siitä, että käytetään α-syklodekstriiniglykosyylitransferaasi-signaalipeptidiä. • · 35 100250 14

7. Jonkin edeltävän patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että E. coli-eritysmutantteina käytetään bakteerikantaa, joka on saatu mutatoimalla ja sitten valikoimalla eritysominaisuuksien suhteen E. coli -kannasta DS410 5 (DSM 4513) tai BW7261 (DSM 5231).

8. Yhdistelmä-DNA, tunnettu siitä, että se koodittaa jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukaan valmistettava hiru-diinijohdannaisen. 10

9. Yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se sisältää yhden tai useamman kopion geenirakenteesta, joka koodittaa proteiinin, joka muodostuu bakteeri-signaalipeptidistä ja hirudii-nijohdannaisesta, jossa on N-päätesekvenssi Ala-Thr-Tyr-Thr-

15 Asp.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että signaalipeptidi on peräisin gram-nega-tiivisista bakteereista. 20

11. Patenttivaatimuksen 9-10 mukainen yhdistelmä-vektori, tunnettu siitä, että signaalipeptidi on peräisin a-syk-lodekstriiniglykosyylitransferaasigeenistä. « · • · • · • · • · • · · · f · · i 1 1 • • · » · • · · • · · • · · « % · c : : • · · ♦ · · · · m · 100250 15