DE3900626A1 - Hirudin-derivat - Google Patents
Hirudin-derivatInfo
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
Aus der europäischen Patentanmeldung mit der
Veröffentlichungsnummer (EP-A) 01 71 024 sind Derivate des
Hirudin und ihre gentechnische Herstellung bekannt.
Es wurde nun gefunden, daß das Hirudin-Derivat der
Aminosäuresequenz
eine Reihe von Vorteilen aufweist. In dieser Sequenz wurde
die Numerierung gemäß EP-A 01 71 024 beibehalten.
Das Hirudin und seine Derivate weisen unterschiedliche
biologische Aktivität auf, was auf eine unterschiedliche
Affinität zum Thrombin und/oder eine unterschiedliche
Stabilität zurückgeführt werden kann. Das erfindungsgemäße
Hirudin-Derivat zeichnet sich überraschenderweise durch eine
besondere Aktivität aus.
Weiterhin wurde gefunden, daß das erfindungsgemäße Hirudin-
Derivat besonders vorteilhaft in Hefen exprimiert wird. Wie
Vergleichsversuche zeigten, erfolgt eine Expression von
analogen Hirudin-Derivaten, die N-terminal mit Thr-Tyr oder
Ile-Tyr beginnen, nur mit niedrigen Ausbeuten.
Die Expression aus Hefezellen ist nicht nur deshalb
vorteilhaft, weil das Hirudin-Derivat sekretiert wird,
sondern vor allem deshalb, weil es praktisch quantitativ in
richtig gefalteter Form vorliegt und hohe Aktivität zeigt.
Die Fig. 1 zeigt Klonierungsvektoren zur Gewinnung einer
Genstruktur, die für das Hefe-MFα-Vorläuferprotein und das
erfindungsgemäße Hirudinderivat codiert. Die Fig. 2 zeigt
einen Hefe-Expressionsvektor mit dieser Genstruktur.
Die Herstellung des erfindungsgemäßen Hirudin-Derivats kann
selbstverständlich auch nach anderen Methoden erfolgen,
beispielsweise durch Expression in Bakterien oder in höheren
eukaryotischen Zellen wie Insektenzellen oder tierischen
Zellen. Bevorzugt wird jedoch die Expression aus
Hefesystemen, beispielsweise unter Verwendung der Hefe-
Arten, wie sie in der EP-A 02 48 227 aufgeführt sind, z. B.
Pichia pastoris, Hansenula polymorphis, Schizosaccharomyces
pombe oder bevorzugt Saccharomyces cerevisiae.
Vektoren für die Expression in Hefen sind in großer Zahl
bekannt, beispielsweise aus EP-A 00 60 057, 00 88 632,
01 16 201, 01 21 884, 01 23 544 und 01 95 691. Die
Herstellung des erfindungsgemäßen Hirudin-Derivats wird im
folgenden anhand des Hefe-α-Faktorsystems beschrieben, was
jedoch nur als beispielhaft zu verstehen ist, da in an sich
bekannter Weise auch andere Expressionssysteme eingesetzt
werden können.
Die Struktur des Hefe-Pheromongens MFα ist bekannt aus
Kurjan und Hershkovitz, Cell 30 (1982) 933-943, wo auch die
Möglichkeit der Expression anderer Gene und die Sekretion
der Genprodukte diskutiert wird. Diesbezüglich kann auch auf
Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 4642-
4646, verwiesen werden.
Als Hefevektoren werden vorteilhaft sogenannte
"shuttle"-Vektoren verwendet, die einen bakteriellen
Plasmid- und einen Hefeplasmid-Replikationsursprung sowie
Gene zur Selektion in beiden Wirtssystemen aufweisen.
Ferner enthalten solche Vektoren die zur Expression fremder
Gene notwendigen Promotorsequenzen und gegebenenfalls zur
Verbesserung der Ausbeute eine Terminatorsequenz, so daß das
heterologe Gen - zweckmäßig fusioniert an sekretorische
Signale - zwischen Promotor und Terminator angeordnet ist.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher
erläutert. Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht.
Zunächst wird die DNA-Sequenz I (Tabelle 1) nach dem
Phosphitverfahren synthetisiert. Diese DNA-Sequenz codiert
für die Aminosäuren 49 bis 80 des MFα-Vorläuferproteins und
entspricht im wesentlichen der natürlichen DNA-Sequenz.
Die DNA-Sequenz I wird zunächst als Sonde zur Isolierung des
Gens für den α-Faktor verwendet und hierzu mit ³²P markiert.
Mit Hilfe dieser Sonde wird aus einer genomischen λgt11-
Hefegenbank (wie sie inzwischen handelsüblich und z. B. bei
Clontech Laboratories Inc., 4055 Fabian Way, Palo Alto,
CA94303 erhältlich sind) das Gen isoliert. Dazu werden
λgt11-Phagen, die das α-Faktorgen tragen, in einem Plaque-
Hybridisierungsexperiment identifiziert. Phagen aus als
positiv identifizierten Plaques werden isoliert, vermehrt
und die DNA gewonnen. Diese wird mit EcoRI gespalten und auf
einem 0,8%-igen Agarosegel analysiert. Nach einem "Southern
transfer"-Experiment wird die Membran gegen die
³²P-markierte DNA-Sequenz I hybridisiert. Phagen-DNA, die
ein ca. 1,75 kb-Fragment aufweist, das gegen die DNA-Sequenz
I hybridisiert, wird erneut mit dem Enzym gespalten und das
entsprechende Fragment isoliert. Der Vektor pUC 19 wird mit
EcoRI geöffnet und mit dem 1,75 kb-Fragment mit T4-Ligase
umgesetzt. Man erhält den Klonierungsvektor 1.
In der Tabelle 2 sind die Klonierungsvektoren aufgeführt,
die alle auf Basis eines pUC-Plasmids konstruiert wurden.
Die Tabelle zeigt hierbei nur die Polylinker-Region dieser
Vektoren in der üblichen 5′-3′-Richtung, wobei die
MFα-Sequenzen durch punktierte und die Hirudin-Sequenzen
durch gestrichelte Linien angedeutet sind. Durchgezogene
Linien bedeuten pUC- bzw. Linker-Sequenzen. Die Fig. 1
zeigt diese Klonierungsvektoren schematisch und nicht
maßstabsgetreu.
Mit dem Ligationsgemisch wird der Stamm E. coli 79/02
transformiert. Weiße Kolonien werden isoliert, hieraus die
Plasmid-DNA gewonnen und Plasmide, die das 1,75 kb-EcoRI-
Fragment enthalten, identifiziert.
Die natürliche DNA-Sequenz des Vorläuferproteins für MFα
enthält im Bereich der Codons für die Aminosäuren 8 bis 10
eine PstI-Schnittstelle und im Bereich der Codons für die
Aminosäuren 48/49 eine TaqI-Schnittstelle. Aus der
isolierten Plasmid-DNA wird nun durch Umsetzung mit PstI und
TaqI das Fragment isoliert, das für die Aminosäuren 9 bis 48
der MFα-Vorläufersequenz codiert. Der Vektor pUC18 wird mit
PstI und KpnI geöffnet und mit dem PstI-TaqI-Fragment sowie
mit der synthetischen DNA-Sequenz I mit Hilfe von T4-Ligase
umgesetzt. Mit dem Ligationsgemisch wird E. coli 79/02
transformiert. Das Transformationsgemisch wird auf
IPTG-Xgal-Ap-Platten ausplattiert. Weiße Kolonien werden
isoliert und die Plasmid-DNA dieser Klone durch
Restriktionsanalyse charakterisiert. Man erhält so den
Klonierungsvektor 2, der für die Aminosäuren 8 bis 80 der
MFα-Vorläufersequenz codiert.
Aus dem Klonierungsvektor 2 wird durch Umsetzung mit PstI
und KpnI die genannte codierende Sequenz ausgeschnitten und
in die im folgenden beschriebene Ligierung eingebracht.
Hierzu wird der Klonierungsvektor 1 mit EcoRI und partial
mit PstI umgesetzt und das die Codierungssequenz für die
ersten 8 Aminosäuren der MFα-Vorläufersequenz umfassende
Fragment isoliert. Weiterhin wird der Vektor pUC19 mit EcoRI
und KpnI geöffnet und mit den beiden beschriebenen
Fragmenten ligiert, wobei der Klonierungsvektor 3 entsteht.
Dieser codiert für die gesamte Vorläufersequenz des MFα bis
zur Aminosäure 80.
Als Ausgangsmaterial für den größten Teil der Hirudin-
Sequenz dient das in der EP-A 01 71 024 als "DNA-Sequenz I"
wiedergegebene synthetische Gen, das in der vorliegenden
Tabelle 1 als DNA-Sequenz IV aufgeführt ist. In dieser
Sequenz sind die Restriktionsenzym-Schnittstellen durch
Unterstreichung hervorgehoben: Im Bereich der Aminosäuren 1
bis 3 schneidet AccI, im Bereich der Aminosäuren 30/31
BamHI und, beginnend mit dem letzten Stop-Codon, SacI. Am
5′-Ende des Gens findet sich die überhängende Sequenz für
XbaI und am 3′-Ende die überhängende Sequenz für SalI.
Dieses synthetische Gen wurde in zwei Teilen subkloniert
(Fig. 1 und 2 in der EP-A 01 71 024). Diese
Subklonierungsvektoren sind in der Tabelle 2 unter Nr. 4
(entsprechend Fig. 2 von EP-A 01 71 024) bzw. 6
(entsprechend der Fig. 1 von EP-A 01 71 024) wiedergegeben.
Der Klonierungsvektor 4 wird mit HincII und
HindIII geöffnet und die linearisierte DNA wird mit der
DNA-Sequenz II (Tabelle 1) ligiert. In dem so erhaltenen
Klonierungsvektor 5 ist an der stumpfendig ligierten Stelle
eine NcoI-Schnittstelle gebildet worden.
Aus dem Klonierungsvektor 6 wird das für die Hirudin-
Teilsequenz codierende Fragment durch Totalverdauung mit
BamHI und AccI herausgeschnitten. Dieses Fragment wird dann
mit dem Klonierungsvektor 3, der mit BamHI und KpnI geöffnet
wurde, sowie mit der DNA-Sequenz III (Tabelle 1) ligiert. In
der DNA-Sequenz III sind die letzten drei Codons in der
gleichen Weise numeriert wie in der DNA-Sequenz IV (Tabelle
1). Man erhält so den Klonierungsvektor 7, der für die
ersten 80 Aminosäuren der Vorläufersequenz von MFα und die
ersten 30 Aminosäuren des erfindungsgemäßen Hirudin-Derivats
codiert, wie durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt wurde.
Aus dem Klonierungsvektor 5 wird mit BamHI und HindIII das
Fragment ausgeschnitten, das für die Aminosäuren 31 bis 64
von Hirudin codiert. Dieses Fragment wird in den mit den
gleichen Enzymen geöffneten Klonierungsvektor 7 ligiert,
wobei der Klonierungsvektor 8 erhalten wird, der für die
ersten 80 Aminosäuren der MFα-Vorläufersequenz und die
gesamte Sequenz des erfindungsgemäßen Hirudin-Derivats
codiert. Die Struktur dieses Plasmids wird durch
Restriktionsanalyse bestätigt.
Das Plasmid Yep13 (Broach et al., Gene 8 (1979) 121) wird
mit BamHI geöffnet und die überstehenden Enden mit Klenow-
Polymerase aufgefüllt. Die DNA wird mit Ethanol gefällt und
mit alkalischer Rinderphosphatase behandelt.
Aus dem Klonierungsvektor 8 (Tabelle 2) wird mit NcoI und
EcoRI das für das Hirudin-Derivat und die Vorläufersequenz
des MFα codierende Fragment ausgeschnitten und die
überstehenden Enden wie beschrieben aufgefüllt.
Die beiden stumpfendigen DNA-Sequenzen werden miteinander
ligiert, wobei die Plasmide pαfHir17 und pαfHir18 (Fig. 2)
entstehen. Diese beiden Plasmide unterscheiden sich nur in
der Orientierung des insertierten Fragmentes.
Wie in der EP-A 01 71 024 beschrieben, kann hinter die
insertierte Sequenz ein Terminator eingesetzt werden
(Fig. 4 bis 6 der EP-A 01 71 024). Hierfür eignen sich
die NcoI- und/oder die BamHI-Schnittstellen.
Nach Amplifikation der Plasmid-DNA in E. coli MM294 wird das
Plasmid pαfHir17 in die Leucin-bedürftigen Hefestämme Y79
(α, trp1-1, leu2-1) (Cantrell et al., Proc. Acad. Natl. Sci.
USA 82 (1985) 6250) und DM6-6(α/α leu2-3, 112::ura3⁺/
leu2::lys2⁺, trp1-/trp1-, his3-11, 15/his3-11, 15,
ura3-/ura3-, lys2-/lys2-, arg4-17/arg4⁺, ade1-/ade1⁺) (Maya
Hanna, Dept. Mol. Biol. Massachusetts General Hospital,
Boston, USA) nach der Lithium-Methode von Ito, H. et al., J.
Bacteriol., 153 (1983) 163 transformiert. Kolonien, die auf
selektivem Medium ohne Leucin-Zusatz wachsen können, werden
isoliert und vereinzelt. Hefe-Minimalmedium wird mit den
einzelnen Kolonien beimpft und 24 Stunden bei 28°C
inkubiert. Die Zellen werden abzentrifugiert und der
Überstand in einem Thrombin-Hemmtest auf Hirudinaktivität
überprüft. Aus Hefeklonen, deren Überstand Hirudin-
Aktivität zeigt, wird die Plasmid-DNA reisoliert und durch
Restriktionsanalyse charakterisiert. Die transformierten
Hefestämme werden für die folgenden Expressionsversuche
eingesetzt.
10 ml Hefevollmedium wird mit Zellen, die aus einer frischen
Übernachtkultur eines nach Beispiel 1 erhaltenen Stammes aus
selektivem Medium entnommen wurden, so beimpft, daß eine
optische Dichte OD₆₀₀ = 0,1 erreicht wird. Die Kultur wird
8 Stunden bei 28°C geschüttelt, worauf 90 ml frisches Medium
zugesetzt werden. Anschließend wird die Kultur für weitere
20 Stunden geschüttelt. Die Zellen werden abzentrifugiert
und die Hirudinaktivität im Überstand bestimmt.
Nach Beispiel 2 erhaltener Überstand wird auf pH 3 bis 5
angesäuert und auf eine mit 0,1 M Essigsäure äquilibrierte
Adsorptionssäule mit einem porösen Adsorberharz aus einem
Copolymer von Styrol und Divinylbenzol (®DIAION HP 20)
gegeben. Nach Waschen mit Tris · HCl (pH 8,5) und 50 mM
Essigsäure erfolgt die Elution mit 30%igem Isopropanol. Die
das Hirudin-Derivat enthaltenden Fraktionen werden vereinigt
und über eine Q-SEPHAROSE®-Säule gereinigt, die mit 20 mM
Piperazin · HCl (pH 6) äquilibriert wurde. Die Elution
erfolgt hierbei über einen 0-0,25 M NaCl-Gradienten. Die
das Hirudin-Derivat enthaltenden Fraktionen werden erneut
vereinigt und durch HPLC über eine C18-"Reversed Phase"-
Chromatographiesäule gereinigt. Das so erhaltene Reinprodukt
wird anschließend einer automatisierten
Proteinsequenzanalyse unterzogen.
Verfährt man gemäß Beispiel 1, setzt jedoch an Stelle der
DNA-Sequenz III (Tabelle 1) die folgenden Sequenzen ein, so
kann man im Überstand der Hefekultur nur eine minimale
Hirudin-Aktivität nachweisen.
Bei Verwendung der DNA-Sequenz IIIb enthalten die den
Klonierungsvektoren 7 und 8 (Tabelle 2) entsprechenden
Vektoren nicht die AccI-Schnittstelle.
Abkürzungen für Restriktionsenzyme | |
A | |
= AccI | |
B | = BamHI |
E | = EcoRI |
Hc | = HincII |
Hd | = HindIII |
K | = KpnI |
N | = NcoI |
P | = PstI |
S | = SalI |
T | = TaqI |
X | = XbaI |
Claims (6)
1. Hirudin-Derivat der Aminosäuresequenz
2. DNA, codierend für das Polypeptid mit der Aminosäure-
Sequenz nach Anspruch 1.
3. Vektoren, enthaltend eine DNA-Sequenz nach Anspruch 2.
4. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine DNA nach Anspruch 2
in einer Wirtszelle exprimiert.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß
die Wirtszelle eine Hefezelle ist.
6. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an dem
Polypeptid nach Anspruch 1.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
HU851341A HU198085B (en) | 1984-04-18 | 1985-04-11 | Process for producing new hirudine derivatives with anticoagulant effect and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3900626A1 true DE3900626A1 (de) | 1989-07-27 |
Family
ID=48669312
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE3900626A Withdrawn DE3900626A1 (de) | 1985-04-11 | 1989-01-11 | Hirudin-derivat |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE3900626A1 (de) |
ZA (1) | ZA89215B (de) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5919895A (en) * | 1990-03-22 | 1999-07-06 | Consortium Fur Elektrochemische Industrie Gmbh | Secretion of hirudin derivatives |
US6514730B1 (en) | 1991-03-21 | 2003-02-04 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Secretion of hirudin derivatives |
-
1989
- 1989-01-11 DE DE3900626A patent/DE3900626A1/de not_active Withdrawn
- 1989-01-11 ZA ZA89215A patent/ZA89215B/xx unknown
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5919895A (en) * | 1990-03-22 | 1999-07-06 | Consortium Fur Elektrochemische Industrie Gmbh | Secretion of hirudin derivatives |
US6514730B1 (en) | 1991-03-21 | 2003-02-04 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Secretion of hirudin derivatives |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ZA89215B (en) | 1993-12-23 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8130 | Withdrawal |