KR100737189B1 - 배양 배지에서 대장균에 의한 분비를 통한 Ｌｅｕ-히루딘의 제조를 위한 시그날 서열 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 시그날 서열을 포함하는 히루딘 전구체, 및 이러한 Leu-히루딘의 이의 제조 방법 및 용도, 및 대장균에서의 목적하는 임의의 단백질의 분비성 발현을 위한 시그날 서열을 발견하기 위한 방법, 및 대장균에서의 목적하는 임의의 단백질의 분비성 발현을 위한 방법에 관한 것이다.
시그날 서열, Leu-히루딘, 히루딘 전구체, 분비성 발현, 대장균
Description
거머리-유래된 제품 레플루단(RefludanR)이 임상 실험에서 우수한 치료학적 특성을 보여 주었다[참조 문헌: The Lancet, Vol. 353, p.429-438]. 이로 부터, 상기 제품이 장래에 대량으로 요구될 것이라는 결론에 이르렀다. 상기 제품중의 생물학적 활성 성분은 [Leu1, Thr2]-63-데설파토히루딘이며, 이는 유럽 특허 제0 324 712호에 기재되어 있으며, 본원에서는 이후 "Leu-히루딘"으로 약칭할 것이다.
유럽 특허 제0 448 093호에는 히루딘 제조 방법이 기재되어 있다. 당해 특허의 바람직한 태양은, N-말단 아미노산이 알라닌으로 이루어진 히루딘을 포함한다. 이러한 히루딘을 α-사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라제(CGTase)의 시그날 서열에 융합시키고, 이러한 융합 단백질을 암호화하는 발현 벡터(상기 특허 참조)를 이. 콜라이 분비인자 돌연변이체 속에 형질전환시켜, Ala-히루딘을 리터당 2g 이상의 원(crude) 수율로 제조할 수 있다. 유럽 특허 제0 549 915호에는 안정성이 향상된 Ala-히루딘의 변이체가 기재되어 있다. 이. 콜라이 분비인자 시스템을 사용하여 이들 변이체를 제조함으로써, 리터당 수 g의 수율로 수득하게 되었다. 따라서, 이러한 수율은 히루딘 변이체 HV1에 관한 문헌[Dodt et al., FEBS LETTERS vol. 202 373-377 1986]에 기술된 것 보다 현저하게 더 높다. 이와 비교하여 수율면에서 거의 차이가 없는 증가가 미국 특허 제5,573,929호에 기술되어 있으며, 이는 도트 등의 pBR322-유래된 벡터 대신에 공지된 방법으로 pUC 벡터를 통해 발현 카셋트를 발현시키는 방법에 의한다. 문헌[Bender et al., Appl. Microbiol Biotechnol 34, p. 203-207 1990]은 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)에 의한 Thr-히루딘(이는 유럽 특허 제0 171 024호에 기술되어 있음)의 분비를 기술하고 있다. 그러나, 유럽 특허 제0 448 093호 및 제0 549 915호에 언급된 수율과 비교된 수율은 분명히 적다. 이는 또한 이. 콜라이의 시그날 서열 Ompa를 통한 히루딘 변이체 HV1의 분비에 관하여 피 데 탁시스 두 포이트 등[P. de Taxis du Poet et al.]에 의해 발견된 바와 같이 대장균 B에서의 발현에 적용된다. 상기 저자들은 수율이 원형질막주위공간(periplasm)에서 300mg/1(히루딘)이고, 세포 상청액에서 약 40mg/l 이라는 것을 발견하였다. 상기 문헌에 역시 기재된 곤충 세포 시스템에서의 발현은 낮다(400μg/l).
효모 발현 시스템 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 사용하여 달성될 수 있는 수율은, 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)를 사용하여 달성된 수준과는 달리, 유럽 특허 제0 448 093호 및 제0 549 915호에 기재된 수율과 가장 근사하다.
문헌[Rosenfeld et al., Protein Expression and Purification 8, 476-482, 1996]에는 효모 피치아 파스토리스를 이용한 히루딘의 발현 및 분비가 기재되어 있다. 이 경우에 배양 브로쓰 ℓ당 약 1.5g의 수율이 달성된다. 효모 한세눌라 폴리모르파를 사용하여, 유사한 정도의 수율을 달성할 수 있다[참조 문헌: Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 377-385 1995]. 그러나, 이러한 발현 시스템의 중요한 단점은, 대장균 (E. coli) 시스템에 비교해 발현 시간이 현저하게 길다는 점이다. 따라서, Ala-히루딘과 마찬가지로 Leu-히루딘이 대장균에 의한 분비에 의해 제조될 수 있다면, 유익할 것이다.
그러나, 이는, 유럽 특허 제0 448 093호에 기재된 시스템을 사용하는 경우 불가능하다. 이러한 이유 때문에, 상기 특허에서는 Leu-히루딘 서열을 트리펩티드 Ala-Thr-Arg에 의해 연장하여 프리(pre)-Leu-히루딘(이는 최종적으로 트립신과의 반응 후 고유 활성 성분인 Leu-히루딘으로 전환된다)을 제조하는 것이 제안되었다. 진탕 플라스크 실험에서 이러한 제안을 수행한 결과, Ala-히루딘에 대해 기술된 것 보다 현저하게 저조한 원 수율이 얻어졌다. 따라서, 한눈에 후자의 효모 발현 시스템과 비교하여 뚜렷한 이점이 없음이 명백하다.
따라서, 본 발명의 목적은, 시그날 서열과 Leu-히루딘의 조합이 Leu-히루딘으로의 직접적 프로세싱을 가능케하여, 후속적으로 대장균에 의해 고유 Leu-히루딘을 고수율로 분비하도록 하는, 융합 단백질을 제조하는 것이다. 이는, 향상된 초기 히루딘 농도에 기인한, 발효 및 후속적인 정제 모두에서 레플루단(Refludan)의 제조 원가면에서 유리한 효과를 갖는 방법을 개발하기 위한 필요조건이다. 놀랍게도, 본 발명에 이르러, 대장균에 의한 Leu-히루딘의 직접적 분비를 가능케 하는 시그날 서열이 존재하며, 이 경우에 이러한 분비가 유럽 특허 제0 448 093호에 기재된 것 보다 더 효율적이라는 것이 실제 관찰되었다. 따라서, 막대한 지출 없이, 다량의 Leu-히루딘을 이용할 수 있는 방법을 개발할 수 있다.
이로운 시그날 서열을 발견하기 위하여, PCR-지원 시그날 서열 스크리닝 방법이 도입되었다. 이 방법은, 주형으로서 목적 단백질을 암호화하는 DNA, 규정된 역방향 PCR 프라이머, 및 목적 유전자에 결합된 시그날 서열을 암호화하는 DNA 절편의 합성을 가능케하는 다양한 정방향 프라이머를 사용한다. 반응을 도 1에 도시된바와 같이 진행한다. 반응 단계의 수가 합성하고자 하는 시그날 서열의 길이에 따라 달라질 수 있음은 당업자에게 명백하다. 단쇄 시그날 서열은 1 반응 단계로 제조될 수 있고, 보다 긴 서열은 2, 3 또는 그 이상의 반응으로 제조될 수 있다. 또한, 반응의 수는, 프라이머로서 사용된 올리고뉴클레오티드를 합성하는데 사용되는 장치에 따라 달라진다. 이러한 방법으로 합성된 시그날 펩티드 유전자 융합체는 제한 부위 1 및 2를 인식하는 효소에 의해 특이적으로 절단될 수 있으며, 상응하게 개방된 발현 벡터속에 삽입될 수 있다. 히루딘이 목적 유전자로서 선택되는 경우, 상기 시스템이 전반적으로 중요시된다. 히루딘의 N-말단 아미노산의 다양한 선택이 또한 가능하다. 비록 이것이 트롬빈에 히루딘이 결합하는 것에 대해 특정 효과(결합 상수의 변화)를 미칠지라도, 트롬빈 활성에 대한 히루딘의 억제 효과는 측정가능하게 유지된다.
상기 특허 EP-B1 0 448 093는 배양 상청액으로 분비되는 히루딘을 기술하고 있다. 이 경우에 히루딘 농도는 익히 공지된 트롬빈 억제 분석을 통해 직접 측정될 수 있다. 히루딘 농도는 분비 효율의 직접적 척도이므로, 시그날 서열의 제거 에 대한 척도이다. 그러나, 상기 특허는, 예를 들면 아미노산 루신으로 개시된 히루딘이 CGTase의 시그날 서열을 통해 상청액으로 효율적으로 분비될 수 없음을 기술한다. 현재, 상기 방법을 사용하여, 이를 효과적으로 가능케 하는 시그날 서열을 조사할 수 있다. 현재, 유사한 방법으로, 다른 19개의 아미노산중 하나로 개시된 히루딘의 분비를 연구할 수 있다. 이 결과로써, 각 경우에 전형적으로 시그날 펩티드의 카복실-말단 아미노산 및 이에 결합된 펩티드 잔기의 효율적인 프로세싱을 가능케하는 광범위한 시그날 서열이 수득된다. 따라서, 임의의 목적 단백질을 원형질막주위로 효율적으로 분비하기 위한 시그날 펩티드를 미리 선택할 수 있으므로, 유리한 단백질 제조 방법을 개발할 기회가 많아진다. 본 발명은 또한 이에 관한 것이다. 당해 방법은, 선택 배지중의 액체 배양으로서 리간드 혼합물과 수용적격(competent) 세포로 이루어진 형질전환 혼합물을 밤새 진탕시키고, 다음 날, 유도를 수행하기 위한 유도제를 함유하는 배지를 실시예 11에 기술된 바와 같은 세포의 분액으로 접종시키고, 배양물의 대부분을 원심분리하고, 동결시켜 세포 펠릿을 수득하는 식으로 수행하거나 자동화된다. 히루딘 활성이 발현시 발견되는 경우, 상응하는 발현 플라스미드를 세포로 부터 재-분리하여, 선형화하고, 모든 자동결합 생성물로 부터 겔 전기영동에 의해 분리할 수 있다. 이어서, 선형 플라스미드 DNA를 재결합시키고 숙주 균주속에 새로이 형질전환시킨다. 이어서, 개개의 콜로니를 분리하여 이들의 발현 효율성에 대해 시험할 수 있다. 이 경우에, 당해 방법이 약제학적 승인 기준을 충족하는 방식으로 진행시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 이점은, 개개의 종간의 아미노산 교체에 의한 발생 과정 중에 발생한 시그날 펩티드의 상이한 변이체에 대한 연구가 용이하고, 또한 히루딘을 효율적으로 분비할 수 있는 이들의 능력에 대한 연구가 용이하다는 점이다.
또한, 상기 방법은 문헌[Nielsen et al., Protein Engineering 10, 1-6, 1997]에 기술된 컴퓨터 프로그램을 이용한 비교를 통해, 시그날 서열과 목적 단백질간의 절단 부위를 예측할 수 있다는 점에서 유리하다. 그러나, 이들간에 이루어진 이러한 예측은 모든 경우에 정확한 것은 아니므로, 유리한 조합이 쉽게 간과될 수 있다. 또한, 정확한 프로세싱의 예측과 실제 달성될 수 있는 수율간에는 관계가 없다.
본 발명의 일 양상은, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)의 외막 단백질, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)의 oprF 단백질, 에스체리키아 콜라이의 lamb B 단백질(람다 수용체(lamB) 유전자에 의해 암호화됨), 및 쉬완넬라 푸트리파시엔스(Shewanella putrifaciens)의 푸마레이트 리덕타제의 시그날 서열을 포함하는 그룹중에서 선택된 시그날 서열, 바람직하게는 세라티아 마르세센스의 외막 단백질 및 쉬완넬라 푸트리파시엔스의 푸마레이트 리덕타제의 시그날 서열을 포함하는 그룹중에서 선택된 시그날 서열(이의 C-말단에는 Leu-히루딘의 서열이 결합된다)을 포함하는 히루딘 전구체이다.
본 발명의 또 다른 양상은,
(a) 히루딘 전구체를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 발현 플라스미드를 제조하고;
(b) 단계(a)로 부터의 발현 플라스미드를 적합한 대장균 세포에서 발현시키고;
(c) 히루딘 전구체가 대장균으로 부터 분비됨과 동시에 프로세싱된 후;
(d) Leu-히루딘을 배양 배지로 부터 직접 분리하는 단계를 포함하는, 상기한 바와 같은 히루딘 전구체가 중간체로서 존재하는, Leu-히루딘의 제조 방법이다.
마찬가지로, 본 발명의 일 양상은, 바람직하게는 상기한 바와 같은 방법에서 Leu-히루딘을 제조하기 위한 상기한 바와 같은 히루딘 전구체의 용도이다.
본 발명의 또 다른 양상은,
(a) 시험하고자 하는 시그날 펩티드에 N-말단으로 연결되고 N 말단상에 규정된 아미노산 aax를 가지며 항혈전성 효능을 갖는 히루딘 또는 히루딘 유도체를 대장균에서 발현시키고;
(b) 배양 상청액중의 히루딘 활성을 측정하여 발현 속도를 결정하고;
(c) 단계 (a) 및 단계 (b)를 다양한 시그날 펩티드를 사용하여 반복하고;
(d) 단계 (b)에서 발견된 히루딘 활성에 의해 제시된 발현 속도를 비교하여 적합한 시그날 펩티드를 선택하는 단계를 포함하는, 대장균에서 목적하는 임의의 단백질의 분비성 발현에 적합한 시그날 펩티드를 발견하기 위한 방법이다.
마찬가지로, 본 발명의 일 양상은, 시그날 펩티드 및 N-말단 아미노산 aax(특히 aax가 루신인 경우)를 갖는 다른 목적하는 임의의 단백질로 이루어진 전구체 단백질을 효율적으로 분비하고, 동시에 대장균으로 부터 시그날 펩티드를 제거할 수 있도록 해주는 시그날 펩티드를 발견하기 위한, N 말단상에 규정된 아미노산 aax를 갖고 항혈전성 효능을 갖는 히루딘 또는 히루딘 유도체의 용도이다.
본 발명의 또 다른 양상은,
(a) 적합한 시그날 펩티드를 발견하기 위한 방법에 의해 적합한 시그날 펩티드를 발견하고;
(b) 단계 (a)로 부터의 적합한 시그날 펩티드 및 목적하는 단백질로 이루어진 전구체 단백질을 암호화하는 핵산 작제물을 대장균에서 발현시키고;
(c) 목적하는 단백질을 배양 상청액으로 부터 분리하는 단계를 포함하는, 대장균에서 분비성 발현에 의해 목적하는 임의의 단백질을 제조하는 방법이며, 여기서 특히, 목적하는 단백질의 N-말단 아미노산이 루신이고; 핵산 작제물중 시그날 펩티드를 포함하는 서열이 세라티아 마르세센스의 외막 단백질, 슈도모나스 플루오레센스의 oprF 단백질, 에스체리키아 콜라이의 lamb B 단백질 및 쉬완넬라 푸트리파시엔스의 푸마레이트 리덕타제를 포함하는 그룹중에서 선택된 시그날 펩티드를 암호화하는 핵산 작제물을 통해 발현이 일어난다.
Leu-히루딘의 효율적인 합성 및 분비를 가능케하는 시그날 서열의 합성이 예로써 기술될 것이다. 또한, 목표한 수율로 유도되지 않거나 목표한 수율에 비해 저조한 결과를 보이는 다른 시그날 서열의 합성도 기술될 것이다. 이와 관련하여, 실시예들은 Leu-히루딘을 기초로한 시그날 서열의 선택을 토대로 하는 본 발명의 개념을 설명하고자 하는 것이므로, 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
상기 방법은 레플루단의 정제에 사용될 수 있다; 이는 예컨대 실시예 11에 기술되어 있다.
실시예 1
Leu-히루딘 및 세라티아 마르세센스로 부터의 외막 단백질의 시그날 서열로 이루어진 융합 단백질을 암호화하는 융합 유전자의 합성
사용된 발현 플라스미드는 pJF 118이며, 이는 유럽 특허 제0 468 539호의 도 1에 기재되어 있으며, 이의 기본 구조는 유럽 특허 제0 448 093호에 기재된 벡터 pCM7053과 동일하다.
사용된 주형은 플라스미드 pK152이며, 이는 유럽 특허 제0 448 093호의 실시예 1에 언급되어 있으며, 유럽 특허 제0 171 024호에 상응하는 히루딘 서열을 포함한다.
상기 막 단백질은 문헌[Braun, G. and Cole, S.T: Mol. Gen. Genet. 195, 321-328, 1984]에 기재되어 있다.
요구되는 DNA 절편을 합성하기 위하여, 3개의 올리고뉴클레오티드를 제조한다.
올리고뉴클레오티드 hirrev는 다음 서열을 갖는다:
.
당해 프라이머는 표 1에 제시된 히루딘 유전자의 227 - 210bp 영역과 하이브리드를 형성한다.
프라이머 smompaf1은 다음 서열을 갖는다:
당해 프라이머는 표 1에 제시된 히루딘 서열의 뉴클레오티드 1 - 19bp와 하이브리드를 형성한다. 프라이머 서열의 하이브리드 형성 부분은 소문자로 표시된다. 당해 서열의 나머지는 문헌[Braun, G. and Coles, S.T., Mol. Gen. Genet. 195, 321-328, 1984]에 공개된 서열의 229bp - 263bp 영역과 하이브리드를 형성한다.
프라이머 smompaf2은 다음 서열을 갖는다:
당해 프라이머 서열은 13bp 위치의 앞부분 부터 브라운(Braun) 및 쿨(Cole)에 의해 공개된 201bp -245bp 서열과 하이브리드를 형성하므로, 프라이머 서열 smompaf2와 중첩된다. 당해 프라이머의 1 - 12 위치는 제한효소 EcoRI에 대한 제한 부위를 포함하고, 가능한한 효소가 인식할 수 있도록 하기 위한 6T 뉴클레오티드가 결합되어 있다.
표준 PCR(예를 들면, 94℃:10", 50℃:30", 72℃:45", 25 사이클)하에서, 주형으로서 표 1에 제시된 서열을 보유하는 플라스미드 pK152의 DNA 및 프라이머 hirrev 및 smompaf1을 사용하여, 히루딘 서열을 세균의 부분적 시그날 서열에 의해 연장한다. 이어서, 반응 생성물을 동일한 조건하의 제2 PCR에서 주형으로서 사용하여 프라이머 hirrev 및 smompaf2와 반응시킨다. 반응 생성물은, 목적하는 시그 날 서열에 의해 연장된 히루딘 서열로 이루어진 융합 단백질을 암호화하는 DNA 단편이다. 5' 말단에 제한효소 EcoRI에 대한 제한 부위가 존재하고, 3' 말단에 제한효소 HindIII에 대한 제한 부위가 존재한다.
제2 PCR로 부터의 반응 생성물을 이중-분해 혼합물로 상기 2개의 제한효소와 반응시키고, 상기 2개의 효소에 의해 개방된 벡터 DNA 내에 EcoRI/HindIII 단편으로서 T4 DNA 리가제 반응으로 삽입시킨다. 대장균 균주 Mc1061의 수용적격 세포 또는 분비인자 돌연변이체 WCM100을 결합 혼합물로 형질전환시키고, 앰피실린-함유 플레이트상에서 선별압하에 성장시킨다. 다음날 아침, 실시예 6에 기재된 바와 같이 발현을, 대장균 균주 WCM100/pCM7053을 사용한 Ala-히루딘 발현과 비교한다. 수득된 발현이 비교 시험에서 보다 약 1.5배 우수하다는 것이 밝혀졌다.
실시예 2
Leu-히루딘 및 슈도모나스 플루오레센스로 부터의 oprF 유전자 산물의 시그날 서열의 융합 단백질의 합성
작제를 실시예 1에 기술된 방법에 따라 수행하나, 단 프라이머 smompaf1 /f2 대신에, 히루딘 유전자에 대한 특이성 및 제한효소 EcoRI에 의한 인식을 위한 서열 면에서 smompa 프라이머와 동일한 특성을 가지면서도 oprF 유전자의 필수 시그날 서열을 암호화하는 두 개의 새로운 프라이머를 사용한다[참조 문헌: De, E. et al: FEMS Microbial. Lett. 127, 262-272, 1995].
프라이머 pfuf1은 다음 서열을 갖는다:
프라이머 pfuf2는 다음 서열을 갖는다:
이 경우에, 프라이머 pfuf1은 PCR1에서 실시예 1에 따라 사용하고, 프라이머 pfuf2는 PCR2에서 상응하게 사용한다. 발현을 수행하여, 대장균 균주 WCM100/pCM7053을 사용한 Ala-히루딘 발현과 비교한다. 수득된 발현이 비교 시험에서 보다 약 1.1배 우수하다는 것이 밝혀졌다. SDS-PAGE 시스템에서 겔 전기영동에 의해 분획시킨 후, 히루딘 밴드를 분리하고, 히루딘의 N-말단 서열을 결정한다. 당해 서열이 완전히 온전하고 아미노산 루신으로 부터 개시된다는 것이 밝혀졌다. 이러한 결과는, 추정상의 시그날 펩티다제 인식 부위를 동정하기 위한 프로그램이 발린에 의한 히루딘의 연장을 예견했기 때문에 놀라운 것이다.
실시예 3
Leu-히루딘 및 대장균으로 부터의 lamB 유전자 산물의 시그날 서열의 융합 단백질의 합성
작제를 실시예 1에 기술된 방법에 따라 수행하나, 단 프라이머 smompaf1 /f2 대신에, 히루딘 유전자에 대한 특이성 및 제한효소 EcoRI에 의한 인식을 위한 서열 면에서 smompa 프라이머와 동일한 특성을 가지면서도 lamb 유전자의 필수 시그날 서열을 암호화하는 두 개의 새로운 프라이머를 사용한다[참조 문헌: Clement, J.M. and Hofnung, M.: Cell 27, 507-514, 1981].
프라이머 lambbf1은 다음 서열을 갖는다:
프라이머 lambbf2는 다음 서열을 갖는다:
이 경우에, 프라이머 lambbf1은 PCR1에서 실시예 1에 따라 사용하고, 프라이머 lambbf2는 PCR2에서 상응하게 사용한다. 발현을 수행하여, 대장균 균주 WCM100/pCM7053을 사용한 Ala-히루딘 발현과 비교한다. 수득된 발현이 비교 시험에서와 동일한 수준이라는 것이 밝혀졌다. SDS-PAGE 시스템에서 겔 전기영동에 의해 분획시킨 후, 히루딘 밴드를 분리하고, 히루딘의 N-말단 서열을 결정한다. 당해 서열이 완전히 온전하고 아미노산 루신으로 부터 개시된다는 것이 밝혀졌다. 이러한 결과는, 추정상의 시그날 펩티다제 인식 부위를 동정하기 위한 프로그램이 히루딘의 정확한 프로세싱을 예견하지 못했기 때문에 놀라운 것이다.
실시예 4
Leu-히루딘 및 쉬완넬라 푸트리파시엔스로 부터의 푸마레이트 리덕타제 플라보단백질 아단위의 전구체의 시그날 서열의 융합 단백질의 합성
작제를 실시예 1에 기술된 방법에 따라 수행하나, 단 프라이머 smompaf1 /f2 대신에, 히루딘 유전자에 대한 특이성 및 제한효소 EcoRI에 의한 인식을 위한 서열 면에서 smompa 프라이머와 동일한 특성을 가지면서도 쉬완넬라 푸트리파시엔스로 부터의 필수 시그날 서열을 암호화하는 두 개의 새로운 프라이머를 사용한다[참조 문헌: Pealing S.L. et al.: Biochemistry 31, 12132-12140, 1992]. 단지 단백질 서열만이 공개되었기 때문에, 아미노산 서열을 코돈 표에 따라 DNA 서열로 해독한다.
따라서, 프라이머 spfccf1에 대한 서열은 다음과 같다:
프라이머 spfccf2는 다음 서열을 갖는다:
이 경우에, 프라이머 spfccf1은 PCR1에서 실시예 1에 따라 사용하고, 프라이머 spfccf2는 PCR2에서 상응하게 사용한다. 발현을 수행하여, 대장균 균주 WCM100/pCM7053을 사용한 Ala-히루딘 발현과 비교한다. 수득된 발현이 비교 시험에서 보다 약 1.5배 우수하다는 것이 밝혀졌다. SDS-PAGE 시스템에서 겔 전기영동에 의해 분획시킨 후, 히루딘 밴드를 분리하고, 히루딘의 N-말단 서열을 결정한다. 당해 서열이 완전히 온전하고 아미노산 루신으로 부터 개시된다는 것이 밝혀졌다. 이러한 결과는, 추정상의 시그날 펩티다제 인식 부위를 동정하기 위한 프로그램이 히루딘 서열의 위치 6의 시스테인의 카복실 측쇄상에서 프로세싱이 일어남을 예견했기 때문에 놀라운 것이다.
실시예 5
Leu-히루딘 및 pBR322로 부터의 β-락타마제 전구체의 시그날 서열의 융합 단백질의 합성
작제를 실시예 1에 기술된 방법에 따라 수행하나, 단 프라이머 smompaf1 /f2 대신에, 히루딘 유전자에 대한 특이성 및 제한효소 EcoRI에 의한 인식을 위한 서열 면에서 smompa 프라이머와 동일한 특성을 가지면서도 β-락타마제 전구체 단백질의 필수 시그날 서열을 암호화하는 두 개의 새로운 프라이머를 사용한다[참조 문헌: Sutcliffe J.G.; Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43:77-90 (1978)].
프라이머 blatf1은 다음 서열을 갖는다:
프라이머 blatf2는 다음 서열을 갖는다:
이 경우에, 프라이머 blatf1은 PCR1에서 실시예 1에 따라 사용하고, 프라이머 blatf2는 PCR2에서 상응하게 사용한다. 발현을 수행하여, 대장균 균주 WCM100/pCM7053을 사용한 Ala-히루딘 발현과 비교한다. 수득된 발현 수율이 비교 시험에서 수득된 수율의 단지 50% 내지 90%이라는 것이 밝혀졌다. SDS-PAGE 시스템에서 겔 전기영동에 의해 분획시킨 후, 히루딘 밴드를 분리하고, 히루딘의 N-말단 서열을 결정한다. 당해 서열이 완전히 온전하고 아미노산 루신으로 부터 개시된다는 것이 밝혀졌다. 이러한 결과는, 추정상의 시그날 펩티드 인식 부위를 동정하기 위한 프로그램에 의해 예견되었다.
실시예 6
Leu-히루딘 및 대장균으로 부터의 알카린 포스파타제의 전구체의 시그날 서열의 융합 유전자의 합성
작제를 실시예 1에 기술된 방법에 따라 수행하나, 단 프라이머 smompaf1 /f2 대신에, 히루딘 유전자에 대한 특이성 및 제한효소 EcoRI에 의한 인식을 위한 서열 면에서 smompa 프라이머와 동일한 특성을 가지면서도 대장균으로부터의 알카린 포스파타제 단백질의 필수 시그날 서열을 암호화하는 두 개의 새로운 프라이머를 사용한다[참조 문헌: Shuttleworth, H., Taylor, J. and Miniton, N. Nucleic Acids Res. 14(21), 8689(1986)].
프라이머 linkphoaf1은 다음 서열을 갖는다:
프라이머 linkphoaf2는 다음 서열을 갖는다:
상기 두 개의 프라이머를 대장균에서의 코돈 선택을 고려하여 최적화한다. 즉, 이들은 개시 유전자의 천연 서열에 전적으로 상응하지는 않는다.
이 경우에, 프라이머 linkphoaf1은 PCR1에서 실시예 1에 따라 사용하고, 프라이머 linkphoaf2는 PCR2에서 상응하게 사용한다. 발현을 수행하여, 대장균 균주 WCM100/pCM7053을 사용한 Ala-히루딘 발현과 비교한다. 수득된 발현 수율이 비교 시험에서 수득된 수율의 일부 밖에 안된다는 것이 밝혀졌다. SDS-PAGE 시스템에서 겔 전기영동에 의해 분획시킨 후, 히루딘 밴드를 분리하고, 히루딘의 N-말단 서열을 결정한다. 당해 서열이 완전히 온전하고 아미노산 루신으로 부터 개시된다는 것이 밝혀졌다. 이러한 결과는, 추정상의 시그날 펩티다제 인식 부위를 동정하기 위한 프로그램에 의해 예견되었다. 그러나, 저조한 수율은 놀라운 일이다.
실시예 7
Leu-히루딘 및 이.페르구소니(
E.fergusonii
)로 부터의 알카린 포스파타제의 전구체의 시그날 서열의 융합 유전자의 합성
작제를 실시예 1에 기술된 방법에 따라 수행하나, 단 프라이머 smompaf1 /f2 대신에, 히루딘 유전자에 대한 특이성 및 제한효소 EcoRI에 의한 인식을 위한 서열 면에서 smompa 프라이머와 동일한 특성을 가지면서도 이.페르구소니로부터의 알카린 포스파타제 단백질의 필수 시그날 서열을 암호화하는 두 개의 새로운 프라이머를 사용한다[참조 문헌: Du Bose, R.F. and Hartl, D.L. Mol. Biol., Evol. 7, 547-577 (1990)].
이 시그날 서열은 대장균으로 부터의 알카린 포스파타제의 시그날 서열과 5개 위치에서 상이하다.
프라이머 fergusf1은 다음 서열을 갖는다:
프라이머 fergusf2는 다음 서열을 갖는다:
상기 두 개의 프라이머를 대장균에서의 코돈 선택을 고려하여 최적화한다. 즉, 이들은 개시 유전자의 천연 서열에 전적으로 상응하지는 않는다. 이 경우에, 프라이머 fergusf1은 PCR1에서 실시예 1에 따라 사용하고, 프라이머 fergusf2는 PCR2에서 상응하게 사용한다. 발현을 수행하여, 대장균 균주 WCM100/pCM7053을 사용한 Ala-히루딘 발현과 비교한다. 수득된 발현 수율이 비교 시험에서 수득된 수율의 일부 밖에 안된다는 것이 밝혀졌다. 이는 대장균 알카린 포스파타제와 Leu-히루딘으로 부터의 시그날 펩티드 작제물을 사용하여 관찰된 것 보다도 약 50% 낮은 수준이다.
실시예 8
Leu-히루딘 및 파에니바실루스 마세란스(
Paenibacillus macerans
)로 부터의 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라제의 전구체의 시그날 서열의 융합 유전자의 합성
작제를 실시예 1에 기술된 방법에 따라 수행하나, 단 프라이머 smompaf1 /f2 대신에, 히루딘 유전자에 대한 특이성 및 제한효소 EcoRI에 의한 인식을 위한 서열 면에서 smompa 프라이머와 동일한 특성을 가지면서도 파에니바실루스 마세란스로 부터의 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라제 유전자의 필수 시그날 서열을 암호화하는 두 개의 새로운 프라이머를 사용한다[참조 문헌: Takano, T., Fukuda, M., Monma, M., Kobayashi, S., Kainuma, K. and Yamane, K. J. Bacteriol. 166, 1118-1122 (1986)].
프라이머 baccdgf1은 다음 서열을 갖는다:
프라이머 baccdgf2는 다음 서열을 갖는다:
이 경우에, 프라이머 baccdgf1은 PCR1에서 실시예 1에 따라 사용하고, 프라이머 baccdgf2는 PCR2에서 상응하게 사용한다. 발현을 수행하여, 대장균 균주 WCM100/pCM7053을 사용한 Ala-히루딘 발현과 비교한다. 수득된 발현 수율이 비교 시험에서 수득된 수율의 약 1/4 이라는 것이 밝혀졌다. 합성된 히루딘은 트롬빈 억제 분석에서 Leu-히루딘 처럼 작용한다. 이는 당해 시그날 펩티드가 정확하게 프로세싱 되었음을 의미한다. 이는, 8개 아미노산이 연장되거나 또는 N 말단에서 2 개의 아미노산이 절단된다고 제시한 이론적 분석에 따른 기대와 일치하지 않는다.
실시예 9
Leu-히루딘 및 대장균 PCFO20 핌브릴린 전구체 단백질(fotA)의 시그날 서열의 융합 유전자의 합성
작제를 실시예 1에 기술된 방법에 따라 수행하나, 단 프라이머 smompaf1 /f2 대신에, 히루딘 유전자에 대한 특이성 및 제한효소 EcoRI에 의한 인식을 위한 서열 면에서 smompa 프라이머와 동일한 특성을 가지면서도 대장균 PCFO20 핌브릴린 전구체의 필수 시그날 서열을 암호화하는 두 개의 새로운 프라이머를 사용한다[참조 문헌: Viboud, G.I., Jonson, G., Dean-Nystrom, E. and Svennerholm, A.M. Infect. Immun. 64(4), 1233-1239 (1996)].
프라이머 pcf1-ala은 다음 서열을 갖는다:
프라이머 p-pcf2는 다음 서열을 갖는다:
이 경우에, 프라이머 pcf1-ala은 PCR1에서 실시예 1에 따라 사용하고, 프라이머 p-pcf2는 PCR2에서 상응하게 사용한다. 발현을 수행하여, 대장균 균주 WCM100/pCM7053을 사용한 Ala-히루딘 발현과 비교한다. 수득된 발현 수율이 비교 시험에서 수득된 수율의 약 40% 이라는 것이 밝혀졌다.
실시예 10
Leu-히루딘 및 에스 티피무리움(
S. typhimurium
) 외막 단백질(fimD)의 시그날 서열의 융합 유전자의 합성
작제를 실시예 1에 기술된 방법에 따라 수행하나, 단 프라이머 smompaf1 /f2 대신에, 히루딘 유전자에 대한 특이성 및 제한효소 EcoRI에 의한 인식을 위한 서열 면에서 smompa 프라이머와 동일한 특성을 가지면서도 에스. 티피무리움 외막 단백질의 필수 시그날 서열을 암호화하는 두 개의 새로운 프라이머를 사용한다[참조 문헌: Rioux, C.R., Friedrich, M.J. and Kander, R.J.; J. Bacteriol. 172 (11), 6217-6222 (1990)].
프라이머 styfimf1은 다음 서열을 갖는다:
프라이머 styfimf2는 다음 서열을 갖는다:
이 경우에, 프라이머 styfimf1은 PCR1에서 실시예 1에 따라 사용하고, 프라이머 styfimf2는 PCR2에서 상응하게 사용한다. 발현을 수행하여, 대장균 균주 WCM100/pCM7053을 사용한 Ala-히루딘 발현과 비교한다. 수득된 발현 수율이 비교 시험에서 수득된 수율의 약 10% 이라는 것이 밝혀졌다.
실시예 11
대장균에서의 발현
본 실시예는 히루딘의 발현을 기술한다. 이를 위하여, 25mg/ml 앰피실린 및 0.5 내지 2mM IPTG(이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드)을 함유하는 LB 배지의 1 내지 5ml 분량으로 형질전환체 세포를 접종하고, 항온배양 진탕기에서 28℃에서 220rpm으로 약 20 시간 동안 진탕시킨다. 이어서, 광학 밀도를 측정한 후, 세포 현탁액을 원심분리하고, 히루딘을 청명한 상청액중에서 측정한다.
유럽 특허 제0 448 093호에 기술된 분비인자 돌연변이체 WCM100 중의 플라스미드 pCM7053을 통한 동일한 특허에 기술된 Ala-히루딘의 발현을, 레플루단의 발현과 함께 수행한다. 이를 통해 발현 속도를 직접 비교할 수 있다.
대량 발현을 미국 특허 제5,616,476호에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 이어서, 레플루단을 당해 특허의 실시예 5 및 6에 기술된 방법에 의해 정제할 수 있다.
실시예 12
히루딘 농도의 측정
히루딘 농도의 측정을 문헌[Grieβbach et al., Thrombosis Research 37, 347-350, 1985)의 방법에 의해 수행한다. 이를 위하여, 규정된 양의 레플루단 표준물을 일련의 측정치에 포함시켜, 보정 플롯을 작성한다. 따라서, 수율을 직접 mg/l 단위로 기술할 수 있다.
| 실시예 | 시그날 서열 | 1차 구조 | 배양물 ml당 상대적 수율 | 서열 번호 |
| - | 대조군: cgtase-Ala-히루딘 | MKRNRFFNTS AAIAISIALNTFF CSMQTIA | 1 | 24 |
| 1 | 외막 단백질/세라티아 마르세센스 | MKKTAIALAVALAGFATVAQ A | 1.5 | 25 |
| 2 | oprF 단백질/슈도모나스 플루오레센스 | MKNTLGLAIGSLIAATSFGV LA | 1.1 | 26 |
| 3 | LambB 단백질/대장균 | MMITLRKLPL AVAVAAGVMS AQAMA | 1 | 27 |
| 4 | 푸마레이트 리덕타제/ 쉬완넬라 푸트리파시엔스 | MKKMNLAVCI ATLMGTAGLM GTAVA | 1.5 | 28 |
| 5 | β-락타마제/pBR322 | MSIQHFRVAL IPFFAAFSLPVFA | 0.5 | 29 |
| 8 | 알카린 포스파타제/대장균 | MKQSTIALAL LPLLFTPVTK A | 0.1 | 30 |
| 9 | 알카린 포스파타제/ 이.페르구소니 | MKQSAIALAL LSCLITPVSQ A | 0.05 | 31 |
| 10 | 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라제/ 파에니바실루스 마세란스 | MKSRYKRLTS LALSLSMALGI SLPAWA | 0.25 | 32 |
| 11 | 외막 단백질/에스. 티피무리움 | MSFHHRVFKL SALSLALFSH LSFA | 0.11 | 33 |
<110> Aventis Pharma Deutschland GmbH
<120> Signal sequences for the production of Leu-hirudin via secretion
by E. coli in a culture medium
<130> 1999/L055
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<151> 1999-09-18
<160> 33
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: misc feature
<400> 1
tttttttaag cttgggctgc aggtcsdnhn d 31
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: misc feature
<400> 2
tggcactggc aggtttcgct accgtagcgc aagcccttac gtatactgac tgca 54
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: misc feature
<400> 3
ttttttgaat tcatgaaaaa gacagctatc gcattagcag tggcactggc aggtttc 57
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: misc feature
<400> 4
ggttctctta ttgccgctac ttctttcggc gttctggcac ttacgtatac tgactgca 58
<210> 5
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: misc feature
<400> 5
ttttttgaat tcatgaaaaa caccttgggc ttggccattg gttctcttat tgccgc 56
<210> 6
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: misc feature
<400> 6
gttgccgtcg cagcgggcgt aatgtctgct caggcaatgg ctcttacgta tactgactgc 60
a 61
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: misc feature
<400> 7
ttttttgaat tcatgatgat tactctgcgc aaacttcctc tggcggttgc cgtcgcagc 59
<210> 8
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: misc feature
<400> 8
ctaccctgat gggtaccgct ggtctgatgg gtaccgctgt tgctcttacg tatactgact 60
gca 63
<210> 9
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: misc feature
<400> 9
ttttttgaat tcatgaaaaa aatgaacctg gctgtttgca tcgctaccct gatgggtacc 60
<210> 10
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: misc feature
<400> 10
ctgatcccgt tctttgcagc gttctgcctg ccggttttcg cgcttacgta tactgactgc 60
a 61
<210> 11
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: misc feature
<400> 11
ttttttgaat tcatgtccat ccagcacttc cgcgtcgccc tgatcccgtt ctttgc 56
<210> 12
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: misc feature
<400> 12
gctgccgctg ctgttcaccc cggttaccaa agcgcttacg tatactgact gca 53
<210> 13
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: misc feature
<400> 13
ttttttgaat tcatgaaaca gtcgaccatc gcgctggcgc tgctgccgct gctgttc 57
<210> 14
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: misc feature
<400> 14
gctgagctgc ctgatcaccc cggtgtccca ggcgcttacg tatactgact gca 53
<210> 15
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: misc feature
<400> 15
ttttttgaat tcatgaaaca gagcgcgatc gcgctggctc tgctgagctg cctgatc 57
<210> 16
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: misc feature
<400> 16
ctttcgctga gtatggcgtt ggggatttca ctgcccgcat gggcacttac gtatactgac 60
tgca 64
<210> 17
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: misc feature
<400> 17
ttttttgaat tcatgaaatc gcggtacaaa cgtttgacct ccctggcgct ttcgctgagt 60
atggc 65
<210> 18
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: misc feature
<400> 18
tggtttcagc tttagtaagc ggggttgcat ttgctcttac gtatactgac tgcac 55
<210> 19
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: misc feature
<400> 19
ttttgggaat tcatgaaaaa gacaattatg tctctggctg tggtttcagc tttagtaagc 60
<210> 20
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: misc feature
<400> 20
cggcgctgag tctcgcctta ttttctcacc tatcttttgc ccttacgtat actgactgca 60
<210> 21
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: misc feature
<400> 21
ttttttgaat tcatgtcatt tcatcaccgg gtatttaaac tgtcggcgct gagtctc 57
<210> 22
<211> 267
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: gene
<400> 22
cttacgtata ctgactgcac tgaatctggt cagaacctgt gcctgtgcga aggatctaac 60
tytdctsgnc cgsngtttgc ggccagggta acaaatgcat ccttggatcc gacggtgaaa 120
agaaccagtg cgttvcggnk cgsdgkncva ctggcgaagg taccccgaaa ccgcagtctc 180
ataacgacgg cgacttcgaa gagatccctt ggtkshndgd gaggaatacc ttcagtaata 240
gagctcgtcg acctgcagcc caagctt 267
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: peptide
<400> 23
Glu Glu Tyr Leu Gln
1 5
<210> 24
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: signal
<400> 24
Met Lys Arg Asn Arg Phe Phe Asn Thr Ser Ala Ala Ile Ala Ile Ser
1 5 10 15
Ile Ala Leu Asn Thr Phe Phe Cys Ser Met Gln Thr Ile Ala
20 25 30
<210> 25
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: signal
<400> 25
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Leu Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala
20
<210> 26
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: signal
<400> 26
Met Lys Asn Thr Leu Gly Leu Ala Ile Gly Ser Leu Ile Ala Ala Thr
1 5 10 15
Ser Phe Gly Val Leu Ala
20
<210> 27
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: signal
<400> 27
Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala
1 5 10 15
Gly Val Met Ser Ala Gln Ala Met Ala
20 25
<210> 28
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: signal
<400> 28
Met Lys Lys Met Asn Leu Ala Val Cys Ile Ala Thr Leu Met Gly Thr
1 5 10 15
Ala Gly Leu Met Gly Thr Ala Val Ala
20 25
<210> 29
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: signal
<400> 29
Met Ser Ile Gln His Phe Arg Val Ala Leu Ile Pro Phe Phe Ala Ala
1 5 10 15
Phe Ser Leu Pro Val Phe Ala
20
<210> 30
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: signal
<400> 30
Met Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr
1 5 10 15
Pro Val Thr Lys Ala
20
<210> 31
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: signal
<400> 31
Met Lys Gln Ser Ala Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Ile Thr
1 5 10 15
Pro Val Ser Gln Ala
20
<210> 32
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: signal
<400> 32
Met Lys Ser Arg Tyr Lys Arg Leu Thr Ser Leu Ala Leu Ser Leu Ser
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Met Ala Leu Gly Ile Ser Leu Pro Ala Trp Ala
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Met Ser Phe His His Arg Val Phe Lys Leu Ser Ala Leu Ser Leu Ala
1 5 10 15
Leu Phe Ser His Leu Ser Phe Ala
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- 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)의 ompA 외막 단백질, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)의 oprF 단백질 및 쉬완넬라 푸트리파시엔스(Shewanella putrifaciens)의 푸마레이트 리덕타제의 시그날 서열을 포함하는 그룹중에서 선택된 시그날 서열을 포함하고, 이들 시그날 서열의 C-말단에 Leu-히루딘 서열이 부착된 히루딘 전구체.
- 제1항에 있어서, 시그날 서열이 세라티아 마르세센스의 ompA 외막 단백질 및 쉬완넬라 푸트리파시엔스의 푸마레이트 리덕타제의 시그날 서열을 포함하는 그룹중에서 선택되는 히루딘 전구체.
- (a) 제1항 또는 제2항에 따른 히루딘 전구체를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 발현 플라스미드를 제조하고;(b) 단계(a)로 부터의 발현 플라스미드를 적합한 대장균 세포에서 발현시키고;(c) 히루딘 전구체가 대장균으로 부터 분비됨과 동시에 프로세싱된 후;(d) Leu-히루딘을 배양 배지로 부터 분리하는 단계를 포함하는, 제1항 또는 제2항에 따른 히루딘 전구체가 중간체로서 존재하는, Leu-히루딘의 제조 방법.
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