PL205117B1

PL205117B1 - Prekursor hirudyny obejmujący sekwencję sygnałową, jego zastosowanie oraz sposób wytwarzania Leu-hirudyny

Info

Publication number: PL205117B1
Application number: PL354444A
Authority: PL
Inventors: Paul Habermann; Rudolf Bender
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland
Priority date: 1999-09-18
Filing date: 2000-09-01
Publication date: 2010-03-31
Also published as: HK1049172A1; CN1269838C; RU2002110278A; EE200200139A; EE05187B1; WO2001021662A1; AU775923B2; NO20021254L; TR200200667T2; DK1216259T3; JP2003510041A; DE19944870A1; CA2385287A1; IL148624A; HRP20020226A2; TR200501541T2; US7455987B1; NZ517825A; NO20021254D0; AR025660A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest prekursor hirudyny obejmujący sekwencję sygnałową, sposób wytwarzania Leu-hirudyny oraz zastosowanie prekursora hirudyny do wytwarzania Leu-hirudyny.

Pochodzący z pijawek preparat Refludan® wykazuje w klinicznych badaniach dobre właściwości terapeutyczne (The Lancet, tom 353, str. 429-438). Prowadzi to do konkluzji, że można spodziewać się dużego zapotrzebowania na ten preparat. Aktywnym biologicznie składnikiem preparatu jest opisana w patencie europejskim EP-0324712 [Leu¹, Thr²]-63-desiarczanohirudyna, dalej krótko nazywana Leu-hirudyną.

W europejskim opisie patentowym EP-0448093 opisano sposób wytwarzania hirudyny. W korzystnym wykonaniu patent dotyczy hirudyny, której N-końcowy aminokwas stanowi alanina. Po fuzji tej hirudyny z sekwencją sygnałową glikozylotransferazy α-cyklodekstryny (CGTaza) i transformacji mutanta sekrecyjnego E. coli wektorem ekspresyjnym kodującym tę białko fuzyjne jak opisano w opisie patentowym, można uzyskać nieprzetworzoną Ala-hirudynę z wydajnością rzędu 2 g na litr. Europejski opis patentowy EP-0549915 opisuje warianty Ala-hirudyny o polepszonej stabilności. Gdy warianty te są otrzymywane w układzie sekrecyjnym E. coli uzyskuje się wydajności rzędu kilku gramów na litr. Wydajności są więc wyraźnie wyższe niż opisane przez Dodt i wsp. (FEBS LETTERS tom 202, 373-377, 1986) dla wariantu hirudyny HV1. Nieznaczne w porównaniu z tym zwiększenie wydajności opisano w patencie US-5,573,929 poprzez ekspresję znanym sposobem kasety ekspresyjnej wektorem Puc zamiast wektorem pBR322w opisanym przez Dodt i wsp. Bender i wsp. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 34, str. 203-207 1990) opisują sekrecję opisanej w Europejskim opisie patentowym Thr-hirudyny przez Streptomyces lividans. Jednakże uzyskiwane wydajności są znacznie niższe w porównaniu z wydajnościami podanymi w Europejskich opisach patentowych EP-0448093 i EP-0549915. Dotyczy to także ekspresji w E. coli B, co zaobserwowali P. de Taxis du Poet i wsp. dla sekrecji wariantu hirudyny HV1 przez sekwencje sygnałową Ompa z E. coli. Autorzy opisują uzyskiwanie wydajności 300 mg/l hirudyny w peryplazmie i około 40 mg/l w supernatancie komórkowym. Opisana również w tym artykule ekspresja w systemie komórek owadzich jest niska (400 μg/l).

W przeciwieństwie do uzyskanych z S. cerevisiae wartości najbliższe wydajnościom opisanym w Europejskich opisach patentowych EP-0448093 i EP-0549915 wydajności uzyskuje się z układem ekspresyjnym drożdży Hansenula polymorpha lub Pichia pastoris.

Rosenfeld i wsp. (Protein Expression and Purification 8, 476-482, 1996) opisali ekspresję i sekrecję hirudyny przez drożdże Pichia pastoris. W tym przypadku uzyskali oni wydajności około 1,5 g/l podłoża hodowlanego. Wydajności podobnego rzędu wielkości można uzyskać w drożdżach Hansenula polymorpha (Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 377-385 1995). Jednakże istotną wadą takich układów ekspresyjnych jest to, że czasy fermentacji są znacząco dłuższe niż dla układu E. coli. Byłoby więc korzystne gdyby można było otrzymać Leu-hirudynę podobnie jak Ala-hirudynę przez sekrecję w E. coli.

Jednak nie udało się to w układzie opisanym w Europejskim opisie patentowym EP-0448093. Dlatego też w tym opisie patentowym zaproponowano przedłużenie sekwencji Leu-hirudyny o tripeptyd Ala-Thr-Arg tak, aby powstała pre-Leu-hirudyna, którą następnie po trawieniu trypsyną przekształca się do natywnej substancji czynnej Leu-hirudyny. Zgodnie z tą propozycją uzyskuje się wyraźnie niższe surowe wydajności w eksperymencie z wytrząsaniem w kolbach, niż opisane dla Ala-hirudyny. Tak więc żadna wyraźna korzyść nie jest widoczna w porównaniu z późniejszymi układami ekspresyjnymi drożdży.

Założeniem niniejszego wynalazku jest uzyskanie białka fuzyjnego, w którym kombinacja sekwencji sygnałowej i Leu-hirudyny pozwala na bezpośrednie przekształcenie w Leu-hirudynę i późniejszą sekrecję z wysoką wydajnością natywnej Leu-hirudyny przez E. coli. Jest to warunek wstępny do opracowania sposobu, który zarówno w etapie fermentacji jak i też w następującym po nim oczyszczaniu korzystnie wpływa na koszty produkcji Refludanu poprzez polepszone stężenie wyjściowe hirudyny.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że istnieją sekwencje sygnałowe, które pozwalają na bezpośrednie wydzielanie Leu-hirudyny przez E. coli i że obserwuje się wówczas sekrecję nawet wydajniejszą niż ta opisana w Europejskim opisie patentowym EP-0448093. Czyni to możliwym opracowanie sposobu, dzięki któremu z łatwością uzyska się wysokie ilości Leu-hirudyny jednocześnie unikając wysokich kosztów.

PL 205 117 B1

Aby znaleźć korzystne sekwencje sygnałowe wprowadzono sposób opartego na PCR skriningu sekwencji sygnałowych. Sposób ten jako matrycę wykorzystuje DNA kodujący białko będące przedmiotem zainteresowania oraz określony skierowany do tyłu starter dla PCR, jak i zmienne skierowane do przodu startery, które pozwalają na syntezę odcinka DNA, który koduje sekwencję sygnałową połączoną z genem będącym przedmiotem zainteresowania. Reakcja przebiega według schematu przedstawionego na figurze 1. Dla specjalisty w dziedzinie jest oczywistym, że w zależności od długości sekwencji sygnałowej, która ma być zsyntetyzowana liczba etapów reakcji może ulegać zmianie. Krótkie sekwencje sygnałowe mogą być przygotowane w jednoetapowej reakcji, dłuższe w reakcji z dwoma, trzema lub więcej etapami. Poza tym liczba etapów reakcji zależy również od urządzenia stosowanego do syntezy oligonukleotydów używanych jako startery. Tak zsyntetyzowana fuzja genowa peptydu sygnałowego może być swoiście cięta enzymami rozpoznającymi miejsca restrykcyjne 1 i 2 i wstawiona do odpowiednio przeciętego wektora ekspresyjnego. Układ ten staje się istotny wówczas, gdy gen będący przedmiotem zainteresowania stanowi hirudyna. Może wówczas być wybrany różny N-końcowy aminokwas hirudyny. Mimo, że ma to pewien wpływ na wiązanie hirudyny do trombiny (zmiana stałej wiązania), to nadal jest możliwym pomiar efektu hamującego hirudyny względem aktywności trombiny.

Opis patentowy EP-0448093B1 opisuje sekrecję hirudyny w supernatancie hodowli. Stężenie hirudyny w tym supernatancie można mierzyć bezpośrednio za pomocą znanego testu hamowania trombiny. Stężenie hirudyny stanowi bezpośrednią miarę wydajności sekrecji a tym samym odcięcia sekwencji sygnałowej. W tymże opisie patentowym jest jednak wskazane, że np. hirudyna zaczynająca się od aminokwasu leucyny nie może być efektywnie uwalniana do supernatantu z udziałem sekwencji sygnałowej CGT-azy. Za pomocą sposobu opisanego powyżej można poszukiwać sekwencji sygnałowych, które na to skutecznie pozwalają. W podobny sposób można badać sekrecję hirudyn, które zaczynają się od jednego z 19 pozostałych aminokwasów. Prowadzi to do otrzymania spektrum sekwencji sygnałowych, które pozwalają na modelowanie skutecznej obróbki C-końcowego aminokwasu peptydu sygnałowego i połączonej z tym reszty peptydu. Jest więc możliwa wstępna selekcja peptydów sygnałowych ze względu na wydajną sekrecję dowolnego białka w peryplazmie a tym samym zwiększa się szansę na opracowanie korzystnego sposobu wytwarzania białka. Opisany sposób można przyspieszyć lub też zautomatyzować poprzez wytrząsanie transformacyjnej mieszaniny liganda i kompetentnych komórek w postaci płynnej hodowli w podłożu wybiórczym przez noc, a następnego dnia zaszczepienie porcji komórek na podłożu jak opisano w przykładzie 11, które zawiera induktor do przeprowadzenia indukcji, ale większość hodowli wiruje się a następnie zamraża się osad komórek. Jeśli podczas ekspresji stwierdzi się aktywność hirudyny, odpowiadający plazmid ekspresji można ponownie izolować z komórek, linearyzować i rozdzielać elektroforetycznie od ewentualnych produktów autoligacji. Następnie liniowy plazmid DNA religuje się i ponownie transformuje się nim szczep gospodarza. Istnieje wówczas możliwość wyizolowania pojedynczych kolonii i przebadania ich pod względem wydajności ich ekspresji. Jest przy tym możliwym takie prowadzenie postępowania, aby sposób spełniał kryteria dopuszczenia do obrotu środków farmaceutycznych.

Kolejną zaletą niniejszego sposobu jest możliwość łatwego równoczesnego badania różnych wariantów peptydu sygnałowego które powstały w czasie ewolucji poprzez podstawienie aminokwasów u poszczególnych gatunków pod kątem ich zdolności do wydajnej sekrecji hirudyny.

Sposób według wynalazku jest również korzystny w porównaniu z zastosowaniem programu komputerowego takiego jak opisano w Nielsen i wsp. (Protein Engineering 10. 1-6, 1997), za pomocą którego można przewidywać miejsca cięcia pomiędzy sekwencją sygnałową i białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Okazuje się bowiem, że takie przewidywania nie w każdym przypadku są prawdziwe przez co łatwo można przeoczyć korzystne kombinacje. Ponadto pomiędzy przewidywaniem prawidłowej obróbki i faktycznie otrzymaną wydajnością często nie ma żadnego związku.

Zgodnie z jednym z aspektów wynalazek dotyczy prekursora hirudyny obejmującego sekwencję sygnałową wybraną z grupy zawierającej sekwencję sygnałową białka błony zewnętrznej Serratia marcescens, białka oprF Pseudomonas fluorescens i reduktazy fumaranowej Shewanella putrifaciens, na którego C-końcu wprowadzona jest sekwencja Leu-hirudyny. Korzystnie, sekwencja sygnałowa wybrana jest z grupy obejmującej sekwencję sygnałową białka błony zewnętrznej Serratia marcescens i reduktazy fumaranowej Shewanella putrifaciens.

Zgodnie z kolejnym aspektem wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania Leu-hirudyny, w którym jako etap pośredni występuje prekursor hirudyny według wynalazku, przy czym:

(a) przygotowuje się plazmid ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą prekursor hirudyny;

PL 205 117 B1 (b) plazmid ekspresyjny według (a) wyraża się w komórce E. coli;

(c) prekursor hirudyny z E. coli jest wydzielany i równocześnie obrabiany; i (d) Leu-hirudynę izoluje się bezpośrednio z podłoża hodowlanego.

Ponadto, zgodnie z jeszcze kolejnym z aspektów wynalazek dotyczy zastosowania prekursora hirudyny według wynalazku do wytwarzania Leu-hirudyny, korzystnie w sposobie według wynalazku.

W poniższych przykładach opisano syntezę sekwencji sygnałowych, które umożliwiają wydajną syntezę i sekrecję Leu-hirudyny. Opisano również syntezę innych sekwencji sygnałowych, które nie wpływają na lub dają gorszą wydajność. Przykłady te mają na celu przybliżyć idee wynalazku w oparciu o dobór sekwencji sygnałowych w związku z Leu-hirudyną i nie mają na celu jakiegokolwiek ograniczania wynalazku.

Opisane sposoby mogą być stosowane do oczyszczenia Refludanu, co jest przykładowo opisane w przykładzie 11.

P r z y k ł a d 1: Synteza fuzji genowej kodującej białko fuzyjne złożone z Leu-hirudyny i sekwencji sygnałowej z zewnętrznej błony Serratia marcescens.

Stosowany plazmid ekspresyjny stanowi wektor pJF118 opisany w Europejskim opisie patentowym EP-0468539 i przedstawiony na figurze 1, który odnośnie swojej podstawowej struktury jest identyczny z wektorem pCM705 popisanym w Europejskim opisie patentowym EP-0448093.

Jako matrycę stosowano plazmid pK152 wymieniony w przykładzie 1 w Europejskim opisie patentowym EP-0448093, który niesie sekwencję hirudyny przedstawioną w Europejskim opisie patentowym EP-0171024.

Białko membranowe było opisane przez Braun, G. i Cole, S.T. (Mol. Gen. Genet. 195m 321-328, 1984).

Do syntezy pożądanego odcinka DNA zastosowano trzy sekwencje oligonukleotydów: Oligonukleotyd hirrev ma sekwencję:

5' TTTTTTTAAG CTTGGGCTGC AGTTC 3' [SEK NR ID:1]

Hindlll

Starter hybrydyzuje do regionu 227-210 bp genu hirudyny przedstawionego w tabeli 1.

Starter smompaf1 ma sekwencję:

5' TGGCACTGGC AGGTTTCGCT ACCGTAGCGC AAGCCcttac gtatactgac tgca -3' [SEK NR ID:2]

Starter hybrydyzuje do nukleotydów 1-19 sekwencji genu hirudyny przedstawionej w tabeli 1. Hybrydyzująca część sekwencji startera jest przedstawiona małymi literami. Reszta sekwencji hybrydyzuje do regionu 229bp - 262 bp sekwencji opublikowanej przez Braun, G. i Cole, S.T. (Mol. Gen. Genet. 195, 321-328, 1984).

Starter smompaf2 ma sekwencję:

5' ttttttgaat tcATGAAAAA GACAGCTATC GCATTAGCAG TGGCACTGGC AGGTTTC-3' [SEK NR ID:3].

Od pozycji 13 bp sekwencja startera hybrydyzuje z opublikowaną przez Braun i Cole sekwencją od 201 bp - 245 bp i zachodzi w ten sposób częściowo na sekwencję startera smompaf2. Pozycja 1-12 startera zawiera miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny EcoRI jak i następne sześć nukleotydów T aby umożliwić rozpoznawanie przez enzym.

W standardowym PCR (jak na przykł ad 94°C: 10'', 50°C: 30, 72°: 45'', 25 cykli) z DNA plazmidu pK152 jako matrycą, która niesie sekwencję opisaną w tabeli 1 i starterami hirrev i smompaf1 sekwencja hirudyny będzie przedłużona o częściową sekwencję sygnałową bakterii. Produkt reakcji następnie stosuje się jako matrycę w drugim PCR ze starterami hirrev i smompaf2 w tych samych warunkach. Jako produkt reakcji otrzymuje się fragment DNA, który koduje białko fuzyjne, która składa się z sekwencji hirudyny przedłużonej o pożądaną sekwencję sygnałową. Na końcu 5' znajduje się miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny EcoRI i na końcu 3' miejsce rozpoznawane przez enzym Hindlll.

Produkt reakcji drugiego PCR umieszcza się w reakcji podwójnego trawienia z obydwoma enzymami restrykcyjnymi i wstawia się jako fragment EcoRI/Hindlll do otwartego tymi enzymami wektora przez reakcję ligacji z ligazą DNA T4. Kompetentne komórki szczepu E. coli Mc1061 lub mutanta sekrecyjnego WCM100 transformuje się mieszaniną ligacyjną i namnaża w warunkach presji selekcyjnej na płytkach zawierających ampicylinę. Następnego dnia zachodzi ekspresja opisana w przykładzie 6, którą porównano z ekspresją ala-hirudyny w szczepie E. coli WCM100/pCM7 053. Okazuje się, że uzyskana ekspresja jest około 1,5 razy wyższa niż w porównywalnym eksperymencie.

PL 205 117 B1

P r z y k ł a d 2: Synteza białka fuzyjnego z Leu-hirudyny i sekwencji sygnałowej produktu genu oprF z Pseudomonas fluorescens.

Konstrukcja zachodzi według schematu opisanego w przykładzie 1 z tym wyjątkiem, że zamiast startera smompaf1/f2 stosuje się dwa nowe startery, które ze względu na swoją specyficzność względem genu hirudyny i sekwencji rozpoznawanej przez enzym restrykcyjny EcoRI wykazują te same cechy jak startery smompa ale kodują pożądaną sekwencję sygnałową genu oprF (De, E. i wsp.: FEMS Microbiol. Lett. 127. 267-272, 1995).

Starter pfuf1 ma sekwencję:

5' GGTTCTCTTA TTGCCGCTAC TTCTTTCGGC GTTCTGGCAc ttacgtatac tgactgca 3' [SEK NR ID: 4]

Starter pfuf2 ma sekwencję:

5' ttttttgaat tcatgAAAAA CACCTTGGGC TTGGCCATTG GTTCTCTTAT TGCCGC 3' [SEK NR ID:5]

Starter pfu1 stosuje się jak w przykładzie 1 w PCR1 a starter pfu2 odpowiednio w PCR2. Ekspresję przeprowadza się w porównaniu z ekspresją Ala-hirudyny w szczepie E. coli WCM100/pCM7053. Okazuje się, że uzyskana ekspresja jest około 1,1 razy lepsza niż w doświadczeniu kontrolnym. Po rozdzieleniu elektroforetycznym w systemie SDS-PAGE izoluje się prążek hirudyny i okreś la sekwencję N-końca hirudyny. Okazuje się ponadto, ż e sekwencja jest w peł ni nienaruszona i zaczyna się od aminokwasu leucyny. Wynik ten jest zaskakują cy, jako ż e program identyfikacji potencjalnych rozpoznawanych przez peptydazę sygnałową sekwencji przewiduje przedłużenie hirudyny o walinę .

P r z y k ł a d 3: Synteza białka fuzyjnego z Leu-hirudyny sekwencji sygnałowej produktu genu lamB E. coli

Konstrukcję prowadzi się według schematu opisanego w przykładzie 1 z wyjątkiem tego, że zamiast startera smompaf1/f2 stosuje się dwa nowe startery, które ze względu na swoją specyficzność dla genu hirudyny i sekwencji rozpoznawanej przez enzym EcoRI mają te same cechy charakterystyczne jak startery smompa, ale kodują pożądaną sekwencję sygnałową genu lamb (Clement, J.M. i Hofnung, M. Cell 27, 507-514, 1981).

Starter lambbf1 ma sekwencję:

5' GTTGCCGTCG CAGCGGGCGT AATGTCTGCT CAGGCAATGG Ctcttacgta tactgactgc 3' [SEK NR ID:6]

Starter lambbf2 ma sekwencję:

5' ttttttgaat tcATGATGAT TACTCTGCGC AAACTTCCTC TGGCGGTTGC CGTCGCAGC 3' [SEK NR ID:7]

Starter lambff1 stosuje się jak w przykładzie 1 w PCR1 a starter lambbf2 odpowiednio w PCR2. Ekspresję przeprowadza się w porównaniu z ekspresją Ala-hirudyny w szczepie E. coli WCM100/pCM7053. Okazuje się, że uzyskana ekspresja jest równie wysoka jak w badaniu kontrolnym. Po rozdzieleniu elektroforetycznym w systemie SDS-PAGE izoluje się prążek hirudyny i określa sekwencję N-końca hirudyny. Okazuje się ponadto, że sekwencja jest w pełni nienaruszona i zaczyna się od aminokwasu leucyny. Wynik ten jest zaskakujący, jako że program identyfikacji potencjalnych rozpoznawanych przez peptydazę sygnałową sekwencji nie przewiduje prawidłowej obróbki hirudyny.

P r z y k ł a d 4: Synteza białka fuzyjnego z Leu-hirudyny i sekwencji sygnałowej prekursora podjednostki flawoproteiny reduktazy fumaranu z Shewanella putrifaciens

Konstrukcję prowadzi się według schematu opisanego w przykładzie 1 z wyjątkiem tego, że zamiast startera smompaf1/f2 stosuje się dwa nowe startery, które ze względu na swoją specyficzność dla genu hirudyny i sekwencji rozpoznawanej przez enzym EcoRI mają te same cechy charakterystyczne jak startery smompa ale kodują pożądaną sekwencję sygnałową z Shewanella putrifaciens (Pealing, S.L. i wsp., Biochemistry 31, 12132-12140, 1992). Jako że publikacja określa tylko sekwencje białka, przekłada się sekwencję aminokwasów na podstawie tabeli kodonów na sekwencję DNA, tak że uzyskuje się następującą sekwencję dla startera spfccf1:

5' CTACCCTGAT GGGTACCGCT GGTCTGATGG GTACCGCTGT TGCTcttacg tatactgact gca 3' [SEK NR ID:8]

Starter spfccf2 ma sekwencję:

5' ttttttgaat tcATGAAAAA AATGAACCTG GCTGTTTGCA TCGCTACCCT GATGGGTACC 3' [SEK NR ID:9]

Starter spccf1 stosuje się jak w przykładzie 1 w PCR1 a starter spfccf2 odpowiednio w PCR2. Ekspresję przeprowadza się w porównaniu z ekspresją Ala-hirudyny w szczepie E. coli

PL 205 117 B1 tfCM100/pCM7053. Okazuje się, że uzyskana ekspresja jest około 1,5 razy lepsza niż w badaniu kontrolnym. Po rozdzieleniu elektroforetycznym w systemie SDS-PAGE izoluje się prążek hirudyny i określa sekwencję N-końca hirudyny. Okazuje się ponadto, że sekwencja jest w pełni nienaruszona i zaczyna się od aminokwasu leucyny. Wynik ten jest zadziwiający, jako że program identyfikacji potencjalnych rozpoznawanych przez peptydazę sygnałową sekwencji przewiduje obróbkę na C-końcu cysteiny w pozycji 6 sekwencji hirudyny.

P r z y k ł a d 5: Synteza białka fuzyjnego z Leu-hirudyny i sekwencji sygnałowej prekursora β-laktamazy z pBR322.

Konstrukcję prowadzi się według schematu opisanego w przykładzie 1 z wyjątkiem tego, że zamiast startera smompaf1/f2 stosuje się dwa nowe startery, które ze względu na swoją specyficzność dla genu hirudyny i sekwencji rozpoznawanej przez enzym EcoRI mają te same cechy charakterystyczne, jak startery smompa, ale kodują pożądaną sekwencję sygnałową z prekursora β-laktamazy (Sutcliffe J.G., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43:77-90 (1978). Starter blatf1 ma następującą sekwencję:

5' CTGATCCCGT TCTTTGCAGC GTTCTGCCTG CCGGTTTTCG Cgcttacgta tactgactgc a 3' [SEK NR ID:10]

Starter blatf2 ma następującą sekwencję:

5' ttttttgaat tcATGTCCAT CCAGCACTTC CGCGTCGCCC TGATCCCGTT CTTTGC 3' [SEK NR ID:11]

Starter blaf1 stosuje się jak w przykładzie 1 w PCR1 a starter blaf2 odpowiednio w PCR2. Ekspresję przeprowadza się w porównaniu z ekspresją Ala-hirudyny w szczepie E. coli WCM100/pCM7053. Okazuje się, że uzyskana ekspresja jest na poziomie zaledwie około 50 - 90% dla uzyskanej w doświadczeniu kontrolnym. Po rozdzieleniu elektroforetycznym w systemie SDS-PAGE izoluje się prążek hirudyny i określa sekwencję N-końca hirudyny. Okazuje się ponadto, że sekwencja jest w pełni nienaruszona i zaczyna się od aminokwasu leucyny. Ten wynik został przewidziany przez program identyfikacji potencjalnych rozpoznawanych przez peptydazę sygnałową sekwencji.

P r z y k ł a d 6: Synteza fuzji genowej z Leu-hirudyny i sekwencji sygnałowej prekursora alkalicznej fosfatazy z E. coli.

Konstrukcję prowadzi się według schematu opisanego w Przykładzie 1 z wyjątkiem tego, że zamiast startera smompaf1/f2 stosuje się dwa nowe startery, które ze względu na swoją specyficzność dla genu hirudyny i sekwencji rozpoznawanej przez enzym EcoRI mają te same cechy charakterystyczne jak startery smompa, ale kodują pożądaną sekwencję sygnałową z białka fosfatazy alkalicznej z E. coli (Shuttleworth, H, Taylor, J. i Minton J. Nucleic Acids Res. 14(21) 8689 (1986).

Starter linkphoafl ma następującą sekwencję:

5' GCTGCCGCTG CTGTTCACCC CGGTTACCAA AGCGcttacg tatactgact gca 3' [SEK NR ID:12]

Starter linkphoaf2 ma następującą sekwencję:

5' ttttttgAAT TCATGAAACA GTCGACCATC GCGCTGGCGC TGCTGCCGCT GCTGTTC 3' [SEK NR ID:13]

Starter linkphoaf1 stosowany jest według przykładu 1 w PCR1 a starter linkphoaf2 odpowiednio w PCR2. Ekspresję przeprowadza się w porównaniu z ekspresją Ala-hirudyny w szczepie E. coli WCM100/pCM7 053. Okazuje się, że uzyskana ekspresja jest tylko frakcją uzyskanej w badaniu kontrolnym. Po rozdzieleniu elektroforetycznym w systemie SDS-PAGE izoluje się prążek hirudyny i określa sekwencję N-końca hirudyny. Okazuje się ponadto, że sekwencja jest w pełni nienaruszona i zaczyna się od aminokwasu leucyny. Ten wynik był przewidziany przez program identyfikacji potencjalnych rozpoznawanych przez peptydazę sygnałową sekwencji. Zadziwiająca jest jednak tak słaba wydajność.

P r z y k ł a d 7: Synteza fuzji genowej z Leu-hirudyny i sekwencji sygnałowej prekursora alkalicznej fosfatazy z E. fergusonii.

Konstrukcję prowadzi się według schematu opisanego w przykładzie 1 z wyjątkiem tego, że zamiast startera smompaf1/f2 stosuje się dwa nowe startery, które ze względu na swoją specyficzność dla genu hirudyny i sekwencji rozpoznawanej przez enzym EcoRI mają te same cechy charakterystyczne jak startery smompa, ale kodują pożądaną sekwencję sygnałową z białka fosfatazy alkalicznej z E. fergusonii (Du Bose, R.F. i Hartl, D.L. Mol. Biol. Evol. 7, 547-577 (1990).

Ta sekwencja sygnałowa różni się w pięciu pozycjach od sekwencji alkalicznej fosfatazy z E. coli.

PL 205 117 B1

Starter fergusf1 ma następującą sekwencję:

5' GCTGAGCTGC CTGATCACCC CGGTGTCCCA GGCGcttacg tatactgact gca

3' [SEK NR ID:14]

Starter fergusf2 ma sekwencję:

5' ttttttgaat tcATGAAACA GAGCGCGATC GCGCTGGCTC TGCTgAGCTG CCTGATC 3' [SEK NR ID:15]

Oba startery są optymalizowane pod względem wyboru kodonów E. coli tzn. nie w pełni odpowiadają naturalnej sekwencji wyjściowej. Starter fergusf1 stosuje się jak w przykładzie 1 w PCR1 a starter fergusf2 odpowiednio w PCR2. Ekspresję przeprowadza się w porównaniu z ekspresją dla Ala-hirudyny w szczepie E. coli WCM100/pCM7053. Okazuje się, że uzyskana ekspresja jest tylko frakcją uzyskanej w badaniu kontrolnym. Jest ona jeszcze o około połowę mniejsza niż ta uzyskana z konstruktem z peptydem sygnałowym dla fosfatazy alkalicznej E. coli i Leu-hirudyny.

P r z y k ł a d 8: Synteza fuzji genowej z Leu-hirudyny i sekwencji sygnałowej prekursora glukanotransferazy cyklodekstryny z Paenibacillus macerans

Konstrukcję prowadzi się według schematu opisanego w przykładzie 1 z wyjątkiem tego, że zamiast startera smompaf1/f2 stosuje się dwa nowe startery, które ze względu na swoją specyficzność dla genu hirudyny i sekwencji rozpoznawanej przez enzym EcoRI mają te same cechy charakterystyczne jak startery smompa, ale kodują pożądaną sekwencję sygnałową z genu glukanotransferazy cyklodekstryny z Paenibacillus macerans (Takano, T., Fukuda, M., Monma, M., Kobayashi, S., Kainuma, K. i Yamane, K. J. Bacteriol. 166, 1118-1122 (1986)).

Starter baccdgf1 ma następującą sekwencję:

5' CTTTCGCTGA GTATGGCGTT GGGGATTTCA CTGCCCGCAT GGGCActtac gtatactgac tgca 3' [SEK NR ID:16]

Starter baccdgf2 ma sekwencję:

5' ttttttgaat tcATGAAATC GCGGTACAAA CGTTTGACCT CCCTGGCGCT TTCGCTGAGT ATGGC 3' [SEK NR ID:17]

Starter baccdgf1 stosuje się jak w przykładzie 1 w PCR1, a starter baccdgf2 odpowiednio w PCR2. Ekspresję przeprowadza się w porównaniu z ekspresją Ala-hirudyny w szczepie E. coli WCM100/pCM7 053. Okazuje się, że uzyskana ekspresja wynosi około H uzyskanej w badaniu kontrolnym. Syntetyzowana hirudyna zachowuje się w teście hamowania trombiny jak Leu-hirudyna. Oznacza to, że peptyd sygnałowy był prawidłowo obrobiony. Nie odpowiada to przewidywaniom uzyskanym na podstawie analizy teoretycznej, która wskazywała na N-koniec wydłużony o 8 aminokwasów lub alternatywnie skrócony o dwa aminokwasy.

P r z y k ł a d 9: Synteza fuzji genowej z Leu-hirudyny i sekwencji sygnałowej biał ka prekursora fimbriliny (fotA) z E. coli PCF020.

Konstrukcję prowadzi się według schematu opisanego w przykładzie 1 z wyjątkiem tego, że zamiast startera smompaf1/f2 stosuje się dwa nowe startery, które ze względu na swoją specyficzność dla genu hirudyny i sekwencji rozpoznawanej przez enzym EcoRI mają te same cechy charakterystyczne jak startery smompa, ale kodują pożądaną sekwencję sygnałową z białka prekursora fimbriliny z E. coli

PCF020 (Viboud, G.I., Jonson, G., Dean-Nystrom, E. i Svennerholm, A.M. Infect. Immun. 64(4), 1233-1239 (1996)).

Starter pcf1-ala ma następującą sekwencję:

5' TGGTTTCAGC TTTAGTAAGC GGGGTTGCAT TTGCTCTTAC GTATACTGAC TGCAC 3' [SEK NR ID:18]

Starter p-pcf2 ma sekwencję:

5' TTTTGGGAAT TCATGAAAAA GACAATTATG TCTCTGGCTG TGGTTTCAGC TTTAGTAAGC 3' [SEK NR ID:19]

Starter pcf1-ala stosuje się jak w przykładzie 1 w PCR1, a starter p-pcf2 odpowiednio w PCR2. Ekspresję przeprowadza się w porównaniu z ekspresją Ala-hirudyny w szczepie E. coli WCM100/pCM7053. Okazuje się, że uzyskana wydajność ekspresji wynosi około 40% uzyskanej w badaniu kontrolnym.

P r z y k ł a d 10. Synteza fuzji genowej z Leu-hirudyny i sekwencji sygnałowej białka zewnętrznej błony S. typhimurium (fimD)

Konstrukcję prowadzi się według schematu opisanego w przykładzie 1 z wyjątkiem tego, że zamiast startera smompaf1/f2 stosuje się dwa nowe startery, które ze względu na swoją specyficzność

PL 205 117 B1 dla genu hirudyny i sekwencji rozpoznawanej przez enzym EcoRI mają te same cechy charakterystyczne jak startery smompa, ale kodują pożądaną sekwencję sygnałową z białka zewnętrznej błony

S. typhimurium (Rioux, C.R., Friedrich, M.J. i Kadner, R.J. J. bacteriol. 172 (11), 6217-6222(1990).

Starter styfimf1 ma następującą sekwencję:

5' CGGCGCTGAG TCTCGCCTTA TTTTCTCACC TATCTTTTGC Ccttacgtat actgactgca 3' [SEK NR ID:20]

Starter styfimf2 ma sekwencję:

5' ttttttgaat tcaTGTCATT TCATCACCGG GTATTTAAAC TGTCGGCGCT GAGTCTC 3' [SEK NR ID:21]

Starter styfimf1 stosuje się jak w przykładzie 1 w PCR1, a starter styfimf2 odpowiednio w PCR2. Ekspresję przeprowadza się w porównaniu z ekspresją Ala-hirudyny w szczepie E. coli WCM100/pCM7053. Okazuje się, że uzyskana wydajność ekspresji wynosi około 10% wydajności uzyskanej w badaniu kontrolnym.

P r z y k ł a d 11: Ekspresja w E. coli

Przykład opisuje ekspresję hirudyny. W tym celu 1-5 ml podłoża LB, które zawiera 25 mg/ml ampicyliny i 0,5-2 mM IPTG (izopropylo β-D-tiogalaktopiranozyd) zaszczepiono komórkami transformanta i hodowano około 20 godzin w 28°C w wytrząsarce przy 220 obr/min. Następnie po określeniu gęstości optycznej zawiesinę komórek żwirowano i oznaczono hirudynę w przezroczystym supernatancie.

Równolegle do ekspresji Refludanu przeprowadzono ekspresję opisanej w europejskim patencie 0 448 093 Ala-hirudyny na plazmidzie pCM7053 przez opisanego w patencie mutanta sekrecyjnego WCM100. W ten sposób jest możliwe bezpośrednie porównanie tempa sekrecji.

Ekspresja na większą skalę ogólnie może zachodzić według sposobów opisanych w patencie US 5,616,476. Refludan może być oczyszczony według sposobów opisanych w tym patencie w przykładach 5 i 6.

P r z y k ł a d 12: Określenie stężenia hirudyny

Określenie stężenia przeprowadzono według sposobu opisanego w Greissbach i wsp. (Thrombosis Research 37, 347 350, 1985). Włączono określone ilości standardu Refludanu w celu określenia krzywej standardowej. W ten sposób wydajność może być podana bezpośrednio w mg/l.

T a b e l a 1

Sekwencja DNA kodująca hirudynę z przetłumaczeniem na aminokwasy

CTTACGTATACTGACTGC ACTGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGATCTAAC 6 0

LTYTDCTESGQNLCLCEGSN 61 GTTTGCGGCCAGGGTAACAAATGCATCCTTGGATCCGACGGTGAAAAGAACCAGTGCGTT 120

VCGQGNKCILGSDGEKNQCV 121 ACTGGCGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTCATAACGACGGCGACTTCGAAGAGATCCCT 180

TGEGTPKPQSHNDGDFEEIP 181 GAGGAATACCTTCAGTAATAGAGCTCGTCGACCTGCAGCCCAAGCTT 227

[SEQ ID NO.i 22]

E E Y L Q * * ---------------------------- [SEQ ID NO.: 23]

PL 205 117 B1

T a b e l a 2

Przykład	Sekwencja sygnałowa	Struktura pierwszorzędowa	Względna wydajność na ml hodowli	SEQ ID NO.:
	Kontrola : cgtaza -Ala -Hirudyna	MKRNRFFNTS AAIAISIALNTFF CSMQTIA	1	24
1	białko błony zewnętrznej / Serratia marcescens	MKKTAIALAVALAGFATVAQ A	1,5	25
2	białko oprF Pseudomonas fuorescens	MKNTLGLAIGSLIAATSFGV LA	1,1	26
3	białko lambB / E. coli	MMITLRKLPL AVAVAAGVMS AQAMA	1	27
4	Reduktaza fumaranu / Shewanella putrifaciens	MKKMNLAVCI ATLMGTAGLM GTAVA	1,5	28
5	e-laktamaza/pBR322	MSIQHFRVAL IPFFAAFSLPVFA	0,5	29
8	alk. fosfataza / E. coli	MKQSTIALAL LPLLFTPVTK A	0,1	30
9	alk. fosfataza/ E.fergusonii	MKQSAIALAL LSCLITPVSQ A	0,05	31
10	glukanotransferaza cyklodekstryny/ Paenibacillus macerans	MKSRYKRLTS LALSLSMALGI SLPAWA	0,25	32
11	białko błony zewnętrznej / S. typhimurium	MSFHHRVFKL SALSLALFSH LSFA	0,11	33

PL 205 117 B1

LISTA SEKWENCJI 7 <110> A-/er.-is ?harma Deutschland GmbH <12C> .Sekwencje sygnałowe do produkcji Leu-hirudyny przez sekrecję w E. coli do •podłoża hodowlanego <130> 1999/L055 <14,0> 19944870.1 <141> 1999-09-18 <160> 33 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <21I> 31 .

<212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna .

<220 .

<223> °P^is sekwencji syntetycznej: różne cechy <400> 1 tttttttaag cttgggctgc aggtcsdnhn d 31 <210> 2 <210 54 .

<212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>

<223> opis sekwencji syntetycznej: różne cechy <40 0 2 cggcactggc agctttcgcz accgtagcgc aagcccttac gtatactgac -gca 54 <210> 3 <210 52 <212> DNA <213> sekwencja syntetyczna

Opis sekwencji syntetycznej: różne cechy

PL 205 117 B1 <400> 3 tttttcgaat tcatgaaaaa gacagccatc gcatcagcag tggcactggc aggcttc 57 <210> <1 <211> 59 <212> DNA <2i3> sekwencja syntetyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: różne cechy <400> 4 ggttctctta ttgccgctac ttctttcggc gttctggcac ctacgtacae tgactgca 59 <210> 5 <211> 56 ” <212> nwa <213> Sekwencja synte.tyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: różne cechy <400> 5 ttttctgaat tcatgaaaaa caccttgggc ttggccattg gttctcttat tgccgc 56 <210> 6 <2il> 61 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: różne cechy <40C> 6 gttgccgtcg cagcgggcgt aatgtctgct caggcaatgg ctcttacgt— tactgactgc oO a 61

- > » <211> 53 <212> DNA ^<---^> Sekwencja syntetyczna < 2 2 2 >

:..j> Opis sekwencji syntetycznej: różne cechy

PL 205 117 B1

<400	7
tttctt	:gaa c z ca ega t ca c tzact c tgege aaacctccrc zggcgazzgc	cgccgcagc	59
<210	8
<210	63
<212>	DNA
<213>	Sekwencja syntetyczna
<220>
<223>	Opis sekwencji syntetycznej: różne cechy
<400>	8 ł
ctaccctgat gggtaccgct ggtctgatgg gtaccgctgt tgctcttacg	tatactgact	60
gca			63
<210>	9
<211>	60 '
<212>	DNA ‘
<213>	Sekwencja syntetyczna
<220>
<223>	Opis sekwencji syntetycznej: różne cechy
<400	a
tttttz	:gaat tcatgaaaaa aatgaacctg gccgtttgca tcgctaccct	gatgggtacc	60
<210>	10
<210	61
<212>	DNA
<213>	Sekwencja syntetyczna
<220>
<223>	Opis sekwencji syntetycznej: różne cechy
<400>	10
częac-	:ccgt zctczgcagc gtzctgcctg ccggcttccg cgctzacg-a	tazzgaczgz	6 2
a			6 :

<2ΐο> ::

<2:0 5 6 <ς:ξ> ona <213> Sekwencja syntetyczna

PL 205 117 B1 <2 20>

<223> °Pis sekwencji syntetycznej: różne cechy <400> U

U - - L.	tgaat tcatgtccat ccagcacttc cgcgtcgccc tgatcccgtt	ctctcc	5 c
<213>	12
<211 >	53
<212>	DNA
<213>	Sekwencja syntetyczna
<220>
<223>	Opis sekwencji syntetycznej: różne cechy
<400>	12
gctgccgctg ctgttcaccc cggttaccaa agcgcttacg tatactgact	gca	53
<210>	13
<211>	57 ’
<212>	DNA
<213>	Sekwencja syntetyczna
<220>
<223>	Opis sekwencji syntetycznej: różne cechy
<400>	13
ttttttgaat tcatgaaaca gtcgaccatc gcgctggcgc cgctgccgct	gctgttc	57
<210>	14
<211>	53
<2 12>	DNA
<2I3>	Sekwencja syntetyczna
<220> <223>	Opis sekwencji syntetycznej: różne cechy
< 4 0 C >	1 4
gctgac	'C-gc c:ga:caccc zggzgzzzzz ggzzzzzizg tacaccgacc	gca	53

< 2 i 0> 15 < 2 11 > 5 <212> ZNA

Sekwencja syntetyczna

PL 205 117 B1 <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: różne cechy <400> 15 ttttttgaat tcatgaaaca gagcgcgatc gcgctggctc tgctgagctg cctgatc <210> 16 <211> 64 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>

<223> opis sekwencji syntetycznej: różne cechy <400> 16 ctttcgctga gtatggcgtt ggggatttca ctgcccgcat gggcacttac gtacactgac 60 tgca 64 <210> 17 <211> 65 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: różne cechy <400> 17 ttttttgaat tcacgaaatc gcggtacaaa cgtctgacct ccctggcgct ttcgctaagt 60 acggc <210> 13 <211> 55 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>

<223>

Opis sekwencji syntetycznej: różne cechy <400 13

Λ-,3,~ < 2 L O > 19 < 2 L L > o O <2L2> DNA.

PL 205 117 B1 <213> Sekwencja syntetyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: różne cechy <400> 19 ttctgggaat tcatgaaaaa gacaattatg tctctggctg tggttccagc tttagtaagc 60 <210> 20 <2'll> 60 * <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: różne cechy <400> 20 cggcgctgag tctcgcctta ttttctcacc catcttttgc. ccttacgtat actgactgca 60 <210> 21 <211> 57 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: różne cechy <400> 21 ttttttgaat tcatgtcatt tcatcaccgg gtatttaaac tgtcggcgct gagtctc 57 <210> 22 <211> 267 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna < 2 2 0 >

<223>Opis sekwencji syntetycznej: gen

PL 205 117 B1 <210> 23 <2Ι1> 5 <2ΐ2> PRT <2ΐ3> Sekwencja syntetyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: peptyd <400> 23

Giu ,jG1u Tyr Leu Gin .

<210> 24 <211> 30 <212> PRT <213> Sekwencja syntetyczna <220> <223> Opis sekwencji syntetycznej: sygnał <400> 24 .

Met Lys Arg Asa Arg Phe Phe Asn Thr Ser Ala Ala Ile Ala Ile Ser

10 15

Ile Ala Leu Asn Thr Phe Phe Cys Ser Met Gin Thr Ile Ala 20 25 30 <210> 25 ;

<211> 21 <212> PRT <213> Sekwencja syntetyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: sygnał <400> 25

Met Lys Lys Thr Ala He Ala Leu .Ala Vai Ala Leu .Ala Gly Phe Ala

Thr Vai Ala Gin Ala '

PL 205 117 B1 <21G> 26 <211> 22 ' <212> PRT <2I3> Sekwencja syntetyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: sygnał <400> 26 .

Met Lys Asn Thr Leu Gly Leu Ala Ile Gly Ser Leu Ile Ala Ala Thr 15 10 15

Ser Phe Gly Val Leu Ala 20 <210> 27 <211> 25 <212> PRT <213> 'Sekwencja syntetyczna <220>

<223> °^{pis sekwenc}ji syntetycznej: sygnał <400> 27

Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala 15 10 15

Giy Val Met Ser Ala Gin Ala Met Ala 20 25 <210> 28 <211> 25 .

<212> PRT <213> Sekwencja syntetyczna <220> _; .

<223> ^Opis sekwencji syntetycznej: sygnał <400> 23

Met Lys Lys Met Asn Len Ala Vai Cys Ile Ala Thr Leu Met Giy Th ^Λ 5 10 15

Ala Giy Leu Met Giy Thr Ala Val Ala

PL 205 117 B1 <210> 29 <211> 23 <212> PRT <213> Sekwencja syntetyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: sygnał .

<400> 29

Met Ser Ile Gin His Phe Arg Val Ala Leu Ile Pro Phe Phe Ala Ala 15 10 15

Phe Ser Leu Pro Val Phe Ala 20 <210> 30 <211> 21 . <212> PRT _<2^2> Sekwencja syntetyczna <220> , .....

<223> opis sekwencji syntetycznej.: , sygnał <400> 30

Met Lys Gin Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr 15 10 15

Pro Val Thr Lys Ala 20 <210> 31 <211> 21 <212> PRT <213> Sekwencja syntetyczna <220>

<223> Opis sekwencji syntetycznej: sygnał <4C0> 31

Me _ Lys Gin Ser Ał a z i. e A ~ a lsu Ar a Lec Len 3 0 */ s Leu I i^Λ h

PL 205 117 B1

Pro Vai Ser Gin Ala 20 <210> 32 <211> 27 <212> PRT <213> Sekwencja syntetyczna <220>

<223>

Opis sekwencji syntetycznej, sygnał <400> 32

Met Lys Ser Arg Tyr Lys Arg Leu Thr Ser Leu Ala Leu Ser Leu Sei ^{1 5 10} .. ¹⁵

Met Ala Leu Gly Ile Ser Leu Pro Ala Trp Ala 20 - 25 <210> 33 <211> 24 <212> PRT <213>

Sekwencja syntetyczna <220>

<223> opis sekwencji syntetycznej: sygnał <400> 33

Met Ser Phe Pis His Arg Vai Phe Lys Leu Ser .Ala Leu Ser Leu Ala 15 10 15 jeu Phe Ser His Leu Ser Phe Ala 20

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Prekursor hirudyny obejmujący sekwencję sygnałową wybraną z grupy zawierającej sekwencję sygnałową białka błony zewnętrznej Serratia marcescens, białka oprF Pseudomonas fluorescens i reduktazy fumaranowej Shewanella putrifaciens, na którego C-końcu wprowadzona jest sekwencja Leu-hirudyny.
2. Prekursor hirudyny według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja sygnałowa jest wybrana z grupy obejmującej sekwencję sygnałową białka błony zewnętrznej Serratia marcescens i reduktazy fumaranowej Shewanella putrifaciens.
3. Sposób wytwarzania Leu-hirudyny, znamienny tym, że jako etap pośredni występuje prekursor hirudyny określony w zastrz. 1 albo 2, przy czym:

(a) przygotowuje się plazmid ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą prekursor hirudyny;

(b) plazmid ekspresyjny według (a) wyraża się w komórce E. coli;

(c) prekursor hirudyny z E. coli jest wydzielany i równocześnie obrabiany; i (d) Leu-hirudynę izoluje się bezpośrednio z podłoża hodowlanego.
4. Zastosowanie prekursora hirudyny jak określony w zastrz. 1 albo 2 do wytwarzania Leu-hirudyny, zwłaszcza w sposobie określonym w zastrz. 3.