NO329723B1

NO329723B1 - Signalsekvenser for fremstilling av LEU-hirudin via sekresjon og anvendelsen av denne

Info

Publication number: NO329723B1
Application number: NO20021254A
Authority: NO
Inventors: Paul Habermann; Rudolf Bender
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland
Priority date: 1999-09-18
Filing date: 2002-03-13
Publication date: 2010-12-06
Also published as: EP1216259B1; RU2261867C2; SK287865B6; EP1216259A1; ATE357458T1; KR100737189B1; CA2385287A1; CZ2002899A3; RS50435B; MEP27908A; AR025660A1; MXPA02002469A; NZ517825A; HRP20020226A2; NO20021254L; HUP0202596A3; JP2003510041A; PL354444A1; DE50014189D1; HK1068352A1

Description

Det blodigle-avledede preparat "Refludan" viser gode terapeutiske egenskaper ved klinisk utprøving (The Lancet, bind 353, s. 429 - 438). Dette tillater den slutning at det i fremtiden vil være behov for større mengder av dette preparat. Den biologisk aktive bestanddel i preparatet er [Leu<1>, Thr^-63-Desulfato-hirudin, som beskrives i europeisk patentskrift 0 324 712 og i det påfølgende for korthets skyld betegnes "Leu-Hirudin".

I europeisk patentskrift 0 448 093 beskrives en fremgangsmåte for fremstilling av hirudin. Den foretrukne utførelse av patentet omfatter et hirudin hvis N-terminale aminosyre er alanin. Dersom dette hirudin fusjoneres med signalsekvensen fra cc-cyklohekstringlykosyltransferase (CGTase) og en ekspresjonsvektor som koder for dette fusjonsprotein, som beskrevet i patentet, transformeres inn i en E. coli-sekresjonsmutant, kan Ala-hirudin med et råutbytte på mer enn 3 gram pr. liter fremstilles. Europeisk patentskrift 0 549 915 beskriver varianter av Ala-hirudin med forbedret stabilitet. Dersom disse variantene fremstilles med E. coli-sekresjonsmutantsystemet, oppnås utbytter på flere gram pr. liter. Utbyttet er således betydelig høyere enn utbyttet beskrevet av Dodt et al. for hirudinvarianten HVI (FEBS LETTERS bind 202 373 - 377,1986). En i sammenligning med dette uvesentlig økning av utbyttet beskrives i U.S. patentskrift 5.573.929, hvori man i stedet for den pBR322-avledede vektor til Dodt et al. uttrykker ekspresjonskassetten på kjent måte ved hjelp av en pUC-vektor. Bender et al. (Appl. Microbiol Biotechnol 34, s. 203 - 207 1990) beskriver sekresjon av det i europeisk patentskrift 0 171 024 beskrevne Thr-hirudin fra Streptomyces lividans. Også her er imidlertid utbyttet sammenlignet med utbyttene som oppgis i de europeiske patentskrifter 0 448 093 og 0 549 915 betydelig lavere. Dette gjelder også for ekspresjon i E. coli B, som observert av P. de Taxis du Poet et al. for sekresjon av hirudinvarianten HVI via signalsekvensen Ompa fra E. coli. Forfatterne finner utbytter på 300 mg/l hirudin i periplasma og tilnærmet 40 mg/l i dyrkningsmediet. Den ekspresjon som samtidig beskrives i artikkelen i innsektcellesystemer, er lav (400 ug/l).

Med utbyttene som kan oppnås i gjærekspresjonssystemene Hansenula polymorpha eller Pichia pastoris kommer utbyttet beskrevet i europeiske patentskrifter 0 448 093 og 0 549 915 i motsetning til verdiene oppnådd med S. cerevisiae nærmest.

Rosenfeld et al. (Protein Expression and Purification 8, 476 - 482,1996) beskriver

ekspresjon og sekresjon av hirudin fra gjærsoppen Pichia pastoris. Her oppnås utbytter på tilnærmet 1,5 g/l dyrkningsmedium. En tilsvarende størrelsesorden kan oppnås med gjærsoppen Hansenula polymorpha (Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 377 - 385 1995).

En vesentlig ulempe med slike ekspresjonssystemer har imidlertid den vesentlig lengre permenteirngsstid sammenlignet med E. coli-systemet. Det ville også være fordelaktig om Leu-hirudin på samme måte som Ala-hirudin kunne fremstilles ved sekresjon fra E. coli.

Dette lykkes imidlertid ikke med systemet beskrevet i europeisk patentskrift 0 448 093. Av den grunn foreslås det i patentet å forlenge Leu-hirudinsekvensen med tripepetidet Ala-Thr-Arg slik at det dannes et pre-Leu-hirudin som til slutt kan omsettes med trypsin til den native aktive forbindelse Leu-hirudin. Dersom man følger dette forslag, fører det til betydelig dårligere råutbytte i rystekolbe-eksperimenter enn hva som ble beskrevet for Ala-hirudin. Følgelig er dette systemet ikke entydig fordelaktig sammenlignet med senere gjærekspresjonssystemer.

Oppgaven som lå til grunn for foreliggende oppfinnelse, var følgelig å fremstille et fusjonsprotein som ved kombinasjon av en signalsekvens og Leu-hirudin, direkte prosessering til Leu-hirudin og påfølgende sekresjon av nativt Leu-hirudin tillater høyt utbytte fra E. coli. Dette er forutsetningen for utvikling av en fremgangsmåte som både i fermenteringen og i den påfølgende rensing har gunstig virkning på fremstillingskostnadene for "Refludan" grunnet den forbedrete utgangskonsentrasjonen av hirudin.

Det ble nå overraskende funnet at det finnes signalsekvenser som tillater direkte sekresjon av Leu-hirudin fra E. coli og med hvilke det faktisk observeres en mer effektiv sekresjon enn hva som beskrives i europeisk patentskrift 0 448 093. Derved kan det utvikles en fremgangsmåte som uten store kostnader gjør store mengder av Leu-hirudin tilgjengelig. Dette er gjenstand for oppfinnelsen.

For å finne fordelaktige signalsekvenser innføres en PCR-basert fremgangsmåte for analyse av signalsekvenser. Denne fremgangsmåten benytter DNA som koder for proteinet av interesse som templat og en definert "revers" PCR-primer samt variable foroverrettede primere som tillater syntese av et DNA-fragment hvor en signalsekvens er koblet til et gen av interesse. Reaksjonen forløper ifølge reaksjonsskjemaet vist i figur 1. Det vil være åpenbart for fagmannen at avhengig av lengden på signalsekvensen som skal syntetiseres, kan antall reaksjonstrinn variere. Korte signalsekvenser kan fremstilles med et reaksjonstrinn, lengre sekvenser med to, tre eller flere reaksjoner. I tillegg er antall reaksjoner også avhengig av innretningen som anvendes for syntese av oligonukleotidet som benyttes som primer. Den således syntetiserte signalpeptid-genfusjon kan så kuttes direkte med enzymer som gjenkjenner restriksjonssetene 1 og 2 og innsettes i en ekspresjonsvektor som har åpnet på tilsvarende måte. Systemet blir av generell betydning dersom man velger hirudin som genet av interesse. Den N-terminale aminosyre i hirudin kan derved varieres. Dette fører riktignok til en viss påvirkning på bindingen av hirudin til trombin (forandret bindingskonstant), like fullt forblir imidlertid den inhibitoriske virkning av hirudin på trombinaktiviteten holdbar.

Patentskrift EP-Bl 0 448 093 beskriver sekresjon av hirudin til dyrkningsvæsken. Der kan hirudinkonsentrasjonen bestemmes direkte ved hjelp av den kjente trombininhiberingsanalyse. Hirudinkonsentrasjonen er et direkte mål effektiviteten av sekresjonen og derved avspaltingen av signalsekvensen. Patentet beskriver imidlertid at for eksempel hirudin som begynner med aminosyren Leucin, ikke tilføres effektivt til dyrkningsvæsken ved hjelp av signalsekvensen fra CGT-ase. Med hjelp av fremgangsmåten beskrevet ovenfor, kan man nå lete etter signalsekvenser som tillater effektiv sekresjon. På tilsvarende måte kan man nå undersøke sekresjonen av hirudiner som begynner med en av de øvrige 19 aminosyrer. Man erholder således et spektrum av signalsekvenser som tillater effektiv prosessering av den karboksyterminale aminosyren i signalpeptidet og peptidrester koblet til denne. Derved kan man forhåndsutvelge signalpeptider for effektiv sekresjon av et ønsket protein i periplasma og således forhøye muligheten for utvikling av en fordelaktig fremstillingsprosess for et protein. Dette er også gjenstand for oppfinnelsen. Man kan påskynde henholdsvis automatisere fremgangsmåten ved at man ryster transformasjonsblandingen som består av ligeringsblanding og kompetente celler som en flytende kultur i seleksjonsmedium over natten og neste dag utsår et uttak av prøvene i mediet beskrevet i eksempel 11, som inneholder inducer, for gjennomføring av induksjonen, mens mesteparten av cellekulturen sentrifugeres og de nedsentrifugerte cellene nedfryses. Dersom man finner hirudinaktivitet ved ekspresjonen, kan det tilsvarende ekspresjonsplasmid isoleres fra cellene, lineariseres og separeres ved gelelektroforese fra eventuelle autoligeringsprodukter. Det lineære plasmid-DNA kan så religeres og på ny transformeres inn i vertsstammen. Nå kan man isolere enkeltkolonier og analysere deres ekspresjonsende. Derved kan man gå til verks slik at fremgangsmåten oppfyller kriteriene for godkjenning av legemidler.

Ytterligere en fordel med fremgangsmåten består i at man lett kan sammenligne forskjellige varianter av et signalpeptid som har oppstått i løpet av evolusjonen ved utbytting av aminosyrer når det gjelder evne til å gi effektiv sekresjon av et hirudin. Fremgangsmåten er også fordelaktig sammenlignet med bruk av datamaskinprogrammer som beskrevet av Nielsen et al. (Protein Engineering 10,1 - 6, 1997), med hvis hjelp kutteseter mellom signalsekvens og et protein av interesse kan forutsis. Det viser seg imidlertid at de forutsigelser som oppnås herved, ikke stemmer i alle tilfeller, slik at man lett kan overse fordelaktige kombinasjoner. Videre er det ingen sammenheng mellom forutsigelse av korrekt prosessering og det faktisk oppnåelige utbyttet.

Foreliggende oppfinnelse omfatter er en hirudinforløper som er kjennetegnet ved at den omfatter en signalsekvens utvalgt fra gruppen som består av signalsekvenser fra det ytre membranprotein fra Serratia marcescens, oprF-proteinet fra Pseudomonas lfuorescens, og fumarat reduktase fra Shewanella putrifaciens, fortrinnsvis utvalgt fra gruppen som består av signalsekvensen fra det ytre membranprotein fra Serratia marcescens og Fumarat reduktase fra Shwanella putrifaciens, til hvilke Leu-hirudinsekvensen er tilkoblet i C terminal ende.

Videre omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av Leu-hirudin hvori en hirudinforløper ifølge krav 1 eller 2, forekommer som et mellomstadium, kjennetegnet ved at den omfatter: (a) fremstilling av et ekspresjonsplasmid som omfatter en DNA-sekvens som

koder for hirudinforløperen,

(b) ekspresjon av ekspresjonsplasmidet ifølge (a) i en egnet E.coli-celle,

(c) samtidig sekresjon og prosessering av hirudinforløperen fra E.coh, og (d) isolering av Leu-hirudin fra dyrkningsmediet.

Omfattet av oppfinnelsen er også anvendelse av en hirudinforløper ifølge krav 1 eller 2 for fremstilling av Leu-hirudin.

Som et eksempel skal syntesen av signalsekvenser som tillater effektiv syntese og sekresjon av Leu-hirudin beskrives. Likeledes skal syntesen av andre signalsekvenser som ikke førte til målet eller som, når det gjaldt utbyttet, ga dårligere resultater beskrives. Eksemplene skal således belyse oppfinnelsen ved hjelp av utvelgelse av signalsekvenser og ved hjelp av Leu-hirudin.

De beskrevne fremgangsmåter kan anvendes for opprensing av "Refludan", dette beskrives for eksempel i Eksempel 11.

Eksempel 1: Syntese av et fusjonsgen som koder for et fusjonsprotein som består av Leu-hirudin og signalsekvensen fra det ytre membranprotein fra Serratia macescens

Som ekspresjonsplasmid anvendes vektoren pJFl 18, som beskrives i europeisk patentskrift 0 468 539 i Figur 1, da denne er identisk med vektoren pCM7053, beskrevet i europeisk patentskrift 0 448 093, når det gjelder grunntrekkene.

Som templat anvendes plasmid pK152, som nevnes i europeisk patentskrift 0 448 093 i eksempel 1 og som omfatter hirudinsekvensen som tilsvarer europeisk patentskrift 0 171 024.

Membranproteinet er beskrevet av Braun G. og Cole, S. T.: (Mol.Gen.Genet. 195, 321-328,1984).

For syntese av det ønskede DNA-fragmentet fremstilles tre oligonukleotidsekvenser.

Oligonukleotid hirrev har sekvensen:

Primeren hybridiserer med området mellom nukleotid 227 - 210 bp i hirudingenet vist I Tabell 1.

Primeren smompafl har sekvensen:

Primeren hybridiserer mot sekvensen mellom nukleotid 1 - 19 i hirudinsekvensen vist i Tabell 1. Den hybridiserende del av primersekvensen er vist med små bokstaver. Resten av sekvensen hybridiserer mot området mellom nukleotid 229 bp - 263 bp i sekvensen publisert av Braun, G. og Cole, S.T. (Mol. Gen. Genet. 195, 321-328,1984).

Primeren smompaf2 har sekvensen:

Fra nukleotid 13 hybridiserer primersekvensen med sekvensen publisert av Braun og Cole mellom nukleotid 201 og nukleotid 245, og overlapper således med primersekvensen smompaf2. Posisjon 1 - 12 i primeren inneholder et gjenkjenningssete for restriksjonsenzymet EcoRI, så vel som seks tilgrensende T-nukleotider, for å muliggjøre gjenkjenning via enzymet.

I en standard - PCR (for eksempel 94°C i 10 sekunder, 50°C i 30 sekunder, 72°C i 45 sekunder, 25 sykluser) med plasmid pK152-DNA, som omfatter sekvensen beskrevet i Tabell 1, som templat og primerene hirrev og smompafl forlenges hirudinsekvensen med den bakterielle signalsekvensdel. Reaksjonsproduktet benyttes så som templat i en andre PCR med primerene hirrev og smompaf2 under de samme betingelser. Som reaksjonsprodukt dannes et DNA-fragment som koder for et fusjonsprotein som består av hirrudinsekvensen forlenget med den ønskede signalsekvens. I 5' ende foreligger gjenkjenningssetet for restriksjonsenzymet EcoRI og i 3' ende gjenkjenningssetet for enzymet HindRl.

Reaksjonsproduktet fra den andre PCR omsettes ved dobbeltkutting med de to restriksjonsenzymene og innsettes som et EcoRUHindUl-fragment i vektor-DNA åpnet med de to enzymene i en T4-DNA-ligasereaksjon. Kompetente celler fra E.coli stamme Mcl061 eller sekresjonsmutanten WCM100 transformeres med ligeringsblandingen og omformeres under seleksjonstrykk på ampicillinholdige skåler. Neste morgen følger ekspresjonen ifølge Eksempel 6 og sammenlignes med Ala-hirudinekspresjon med E.coli stamme WCM100/pCM7053. Det viser seg at den oppnådde ekspresjon er tilnærmet 1,5 ganger bedre enn i sammenligningsforsøket.

Eksempel 2: Syntese av et fusjonsprotein mellom Leu-hirudin og signalsekvensen fra oprF-genproduktet fra Pseudomonas lfuorescens

Konstruksjonen skjer ifølge skjemaet beskrevet i Eksempel 1, bortsett fra at det i stedet for primerne smompafl / f2 benyttes to nye primere som når det gjelder spesifisitet for hirudingenet og gjenkjenningssekvensen for restriksjonsenzymet EcoRI, har de samme egenskaper som smompa-primeren, men som koder for den ønskede signalsekvens fra oprF-genet (De, E. et al.,: FEMS Microbial. Lett. 127, 267 - 272, 1995).

Primeren pfufl har sekvensen:

Primeren pfuf2 har sekvensen:

Her anvendes primeren pfufl i samsvar med Eksempel 1 i PCR1 og primeren pfufi i PCR2. Ekspresjonen gjennomføres ved sammenligning med E. coli stamme

WCM100/pCM7053. Det viser seg at den oppnådde ekspresjon er tilnærmet 1,1 ganger bedre enn i sammenligningsforsøket. Etter gelelektroforetisk separasjon i SDS-PAGE-systemet isoleres hirudinbåndet og den N-terminale sekvens av hirudin bestemmes. Det viser seg at sekvensen er fullstendig intakt og begynner med aminosyren Leucin. Dette resultatet er overraskende, siden programmet for påvisning av mulige signalpeptidasegjenkjenningsseter forutsier en forlengelse av hirudin med valin.

Eksempel 3: Syntese av fusjonsproteinet mellom Leu-hirudin og signalsekvensen fra

lamB-genproduktet fra E.coli

Konstruksjonen skjer ifølge skjemaet beskrevet i Eksempel 1, bortsett fra at det i stedet for primerne smompafl /f2 benyttes to nye primere som når det gjelder spesifisitet for hirudingenet og gjenkjenningssekvensen for restriksjonsenzymet EcoRI, har de samme egenskaper som smompa-primeren, men som koder for den ønskede signalsekvens fra lamb-genet (Clement, J.M. og Hofhung, M: Cell 27, 507 - 514, 1981).

Primeren lambbfl har sekvensen:

Primeren lambbf2 har sekvensen:

Her anvendes primeren lambbfl 1 ifølge eksempel 1 i PCR1 og primeren lambbf2 i PCR2. Ekspresjonen gjennomføres ved sammenligning med Ala-hirudinekspresjon med E. coli WCM100/ pCM7053. Det viser seg at den oppnådde ekspresjon er like høy som i sammenligningsforsøket. Etter gelelektroforetisk separasjon i SDS-PAGE-systemet isoleres hirudinbåndet, og den N-terminale sekvens av hirudin bestemmes. Det viser seg at sekvensen er fullstendig intakt og begynner med aminosyren Leucin. Dette resultat er overraskende, siden programmet for påvisning av mulige signalpeptidasegjenkjenningsseter ikke forutsier korrekt prosessering til hirudin.

Eksempel 4: Syntese av fusjonsproteinet mellom Leu-hirudin og signalsekvensen fra forløperen til flavoprotein-subenheten fra fumaratreduktase fra Shewanella putrefaciens

Konstruksjonen skjer ifølge skjemaet beskrevet i Eksempel 1, bortsett fra at det i stedet for primerne smompafl / £2 benyttes to nye primere som når det gjelder spesifisitet for hirudingenet og gjenkjenningssekvensen for restriksjonsenzymet EcoRI, har de samme egenskaper som smompa-primeren, men som koder for den ønskede signalsekvens fra Shewanella putrefaciens (Pealing S.L. et al.: Biochemistry 31,12132 - 12140,1992). Siden publikasjonen kun beskriver proteinsekvensen, oversettes aminosyresekvensen ved hjelp av den genetiske kode til en DNA-sekvens, slik at resultatet for Primeren spfccfl er følgende sekvens:

Primeren spfccf2 har sekvensen:

Her anvendes primeren spfccfl ifølge Eksempel 1 i PCR1 og primeren spfccf2 i PCR2. Ekspresjonen gjennomføres ved sammenligning med Ala-hirudinekspresjon med E.coli stamme WCM100/pCM7053. Det viser seg at den oppnådde ekspresjon er tilnærmet 1,5 ganger bedre enn i sammenligningsforsøket. Etter gelelektroforetisk separasjon i SDS PAGE-systemet, isoleres hirudinbåndet, og den N-terminale sekvens til hirudin bestemmes. Det viser seg at sekvensen er fullstendig intakt og begynner med aminosyren Leucin. Dette resultat er overraskende da programmet for påvisning av mulige signalpeptidasegjenkjenningsseter forutsier en prosessering mot karboksyenden til cystein i posisjon 6 i hirudinsekvensen.

Eksempel 5: Syntese av fusjonsproteinet mellom Leu-hirudin og signalsekvensen fra forløperen til pMaktamase fra pBR322.

Konstruksjonen skjer ifølge skjemaet beskrevet i Eksempel 1, bortsett fra at det i stedet for primerne smompafl / £2 benyttes to nye primere som når det gjelder spesifisitet for hirudingenet og gjenkjenningssekvensen for restriksjonsenzymet EcoRI, har de samme egenskaper som smompa-primeren, men som koder for den ønskede signalsekvens fra (3-laktamaseforløperproteinet (Sutcliffe J.G.; Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43: 77-90(1978)).

Primeren blat£2 har følgende sekvens:

Primeren blat£2 har sekvensen:

Her anvendes primeren blatfl ifølge Eksempel i PCR1 og primeren blatf2 i PCR2. Ekspresjonen gjennomføres ved sammenligning med Ala-hirudinekspresjon fra E. coli stamme WCM100/pCM7053. Det viser seg at det erholdte ekspresjonsutbytte kun er 50 - 90% av utbyttet oppnådd i sammenligningsforsøket. Etter gelelektroforetisk separasjon i SDS-P AGE-systemet isoleres hirudinbåndet, og den N-terminale sekvens av hirudin bestemmes. Det viser seg at sekvensen er fullstendig intakt og begynner med aminosyren Leucin. Dette resultat ble forutsagt av programmet for påvisning av mulige signalpeptidasegj enkj enningsseter.

Eksempel 6: Syntese av fusjonsgenet mellom Leu-hirudin og signalsekvensen fra forløperen til alkalisk fosfatase fra E. coli.

Konstruksjonen skjer ifølge skjemaet beskrevet i Eksempel 1, bortsett fra at det i stedet for primerne smompafl / fl benyttes to nye primere som når det gjelder spesifisitet for hirudingenet og gjenkjenningssekvensen for restriksjonsenzymet EcoRI har de samme egenskaper som smompa-primeren, men som koder for den ønskede signalsekvens fra alkalisk fosfataseprotein fra E. coli (Shuttleworth, H., Taylor, J. og Minton, N. Nucleic Acids Res. 14 (21), 8689 (1986).

Primeren linkphoafl har følgende sekvens:

Primeren linkphoaf2 har sekvensen:

De to primere er optimalisert for kodonbruken i E. coli, dvs. at de ikke fullt ut tilsvarer den naturlige sekvens av utgangsgenet.

Her anvendes primeren linkphoafl ifølge Eksempel 1 i PCR1 og primeren linkphof2 i PCR2. Ekspresjonen gjennomføres ved sammenligning med Ala-hirudinekspresjon fra E.coli stamme WCM100 / pCM7053. Det viser seg at det oppnådde ekspresjonsutbytte kun er en brøkdel av utbyttet oppnådd i sammenligningsforsøket. Ved gelelektroforetisk separasjon i SDS-PAGE-systemet isoleres hirudinbåndet, og den N-terminale sekvens til hirudin bestemmes. Det viser seg at sekvensen er fullstendig intakt og begynner med aminosyren Leucin. Dette resultat ble forutsagt av programmet for påvisning av mulige signalpeptidasegjenkjenningsseter. Imidlertid det er dårlige utbyttet overraskende.

Eksempel 7: Syntese av fusjonsgenet mellom Leu-hirudin og signalsekvensen til

forløperen for alkalisk fosfatase fra E. fergusonii

Konstruksjonen skjer ifølge skjemaet beskrevet i Eksempel 1, bortsett fra at det i stedet for primerne smompafl / fi benyttes to nye primere som når det gjelder spesifisitet for hirudingenet og gjenkjenningssekvensen for restriksjonsenzymet EcoRI, har de samme egenskaper som smompa-primeren, men som koder for den ønskede signalsekvens fra alkalisk fosfatase fra E. fergusonii (Du Bose, R.F. og Hartl, D.L. Mol. Biol. Evol. 7, 547-577 (1990)).

Denne signalsekvensen avviker i fem posisjoner fra signalsekvensen fra alkalisk fosfatase fra E.coli.

Primeren fergusfl har følgende sekvens:

Primeren fergusf2 har sekvensen:

De to primerne er optimalisert for kodonbruken i E.coli, dvs. at de ikke fullt ut tilsvarer den naturlige sekvens av utgangsgenet. Her anvendes primeren fergusfl ifølge Eksempel 1 i PCR1 og primeren fergusG i PCR2. Ekspresjonen gjennomføres ved sammenligning med Ala-hirudinekspresjon fra E.coli stamme WCM100 / pCM7053. Det viser seg at det oppnådde ekspresjonsutbyttet kun er en brøkdel av utbyttet oppnådd i sammenligningsforsøket. Det er ytterligere 50% lavere enn utbyttet observert med konstruksjonen med signalpeptid fra alkalisk fosfatase fra E.coli og Leu-hirudin.

Eksempel 8: Syntese av fusjonsgenet mellom Leu-hirudin og signalsekvensen fra forløperen til cyklodekstrin glukanotransferase fra Paenibaallus macerans

Konstruksjonen skjer ifølge skjemaet beskrevet i Eksempel 1, bortsett fra at det i stedet for primerne smompafl /£2 benyttes to nye primere som når det gjelder spesifisitet for hirudingenet og gjenkjenningssekvensen for restriksjonsenzymet EcoRI har de samme egenskaper som smompa-primeren, men som koder for den ønskede signalsekvens fra cyklodekstrin glukanotransferasegenet fra Paenibaallus macerans (Takano, T., Fukuda, M., Monma, M., Kobayashi, S., Kainuma, K. og Yamane, KJ. Bacteriol. 166,1118-1122 (1986)).

Primeren baccdgfl har følgende sekvens:

Primeren baccdgfi har sekvensen:

Her anvendes primeren baccdgfl ifølge Eksempel 1 i PCR1 og primeren baccdgfi i PCR2. Ekspresjonen gjennomføres ved sammenligning med Ala-hirudinekspresjon fra E.coli stamme WCM100 / p CM7053. Det viser seg at det oppnådde ekspresjonsutbyttet er tilnærmet Va av utbyttet oppnådd i sammenligningsforsøket. Det syntetiserte hirudin oppfører seg som Leu-hirudin i trombininhibeirngsanalysen. Dette betyr at signalpeptidet ble korrekt prosessert. Dette tilsvarer ikke evalueringen av den teoretiske analyse, som tydet på en N-ende forlenget med 8 aminosyrer eller alternativt avkortet med to aminosyrer.

Eksempel 9: Syntese av fusjonsgenet mellom Leu-hirudin og signalsekvensen fra

fimbrillinforløperproteinet (fotA) fra E.coli PCFO20

Konstruksjonen skjer ifølge skjemaet beskrevet i Eksempel 1, bortsett fra at det i stedet for primerne smompafl /£2 benyttes to nye primere som når det gjelder spesifisitet for hirudingenet og gjenkjenningssekvensen for restriksjonsenzymet EcoRI har de samme egenskaper som smompa-primeren, men som koder for den ønskede signalsekvens fra fimbrillinforløperproteinet fra E.coli PCFO20 (Viboud, G.I., Jonson, G. Dean-Nystrom, E. og Svennerholm, A.M. Mect. Immun. 64(4), 1233-1239 (1996)).

Primeren pcfl-alahar følgende sekvens:

Primeren p-pcf2 har sekvensen:

Her anvendes primeren pcfl-ala ifølge Eksempel i PCR1 og primeren p-pcf2 i PCR2. Ekspresjonen gjennomføres ved sammenligning med Ala-hirudinekspresjon fra E.coli WCM100 / pCM7053. Det viser seg at det oppnådde ekspresjonsutbyttet er ca. 40% av utbyttet oppnådd i sammenligningsforsøket.

Eksempel 10: Syntese av fusjonsgenet mellom Leu-hirudin og signalsekvensen fra det

ytre membranprotein (fimD) fra S. typhimurium

Konstruksjonen skjer ifølge skjemaet beskrevet i Eksempel 1, bortsett fra at det i stedet for primerne smompafl / £2 benyttes to nye primere som når det gjelder spesifisitet for hirudingenet og gjenkjenningssekvensen for restriksjonsenzymet EcoRI har de samme egenskaper som smompa-primeren, men som koder for den ønskede signalsekvensen fra det ytre membranprotein fra S. typhimurium (Rioux, C.R., Friedrich, M.J. og Kadner, R.J.; J. Bacteriol. 172 (11), 6217 - 6222 (1990)).

Primeren styfimfl har følgende sekvens:

Primeren styfimfi har sekvensen:

Her anvendes primeren styfimfl ifølge Eksempel 1 i PCR1 og primeren styfimfi i PCR2. Ekspresjonen gjennomføres ved sammenligning med Ala-hirudinekspresjon fra E.coli stamme WCM100/ pCM7053. Det viser seg at det oppnådde ekspresjonsutbytte utgjør tilnærmet 10% av utbyttet i sammenligningsforsøket.

Eksempel 11: Ekspresjon i E. coli

Eksemplet beskriver ekspresjon av hirudin. For dette utsås transformerte celler i 1 - 5 ml LB-medium inneholdende 25 mg/l ampicillin og 0,5 - 2 med mer IPTG (isopropyl P-D-tiogalaktopyranosid) og omrystes i tilnærmet 20 timer ved 28°C i en rysteinkubator ved 220 rpm. Etter bestemmelse av den optiske tetthet, sentrifugeres cellesuspensjonen, og hirudin bestemmes i den klare supernatant.

Parallelt med ekspresjonen av "Refludan" gjennomføres ekspresjon av det i europeisk patentskrift 0 448 093 beskrevne Ala-hirudin via plasmid pCM7053 i sekresjonsmutanten WCM100, som beskrives i patentet. Dette muliggjør en direkte sammenligning av ekspresjonsgraden.

Ekspresjon i større målestokk kan utføres ifølge U.S. patentskrift nr. 5,616,476. Rfludan kan så renses ifølge fremgangsmåten som beskrives i Eksempel 5 og 6 i dette patent.

Eksempel 12: Bestemmelse av hirudinkonsentrasjonen

Bestemmelsen av hirudinkonsentrasjonen utføres ifølge fremgangsmåten til Griessbach et al. (Thrombosis Research 37, 347 - 350, 1985). I tillegg inngår definerte mengder av en refludanstandard for fremstilling av en standardkurve i måleserien. Derved kan utbyttet angis direkte i mg/l.

Claims

1. Hirudinforløper, karakterisert ved at den omfatter en signalsekvens utvalgt fra gruppen som består av signalsekvensen fra det ytre membranprotein fra Serratia marcescens, oprF-proteinet fra Pseudomonas fluorescens, og fumarat-reduktase fra Shewanella putrifaciens, til hvilke leu-hirudinsekvensen er tilkoblet i C terminal ende.

2. Hirudinforløper ifølge krav 1, karakterisert ved at signalsekvensen er utvalgt fra gruppen som består av signalsekvensene fra det ytre membranprotein fra Serratia marcescens og fumaratreduktase fra Shewanella putrifaciens.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av Leu-hirudin hvori en hirudinforløper ifølge krav 1 eller 2, forekommer som et mellomstadium, karakterisert ved at den omfatter: (e) fremstilling av et ekspresjonsplasmid som omfatter en DNA-sekvens som koder for hirudinforløperen, (f) ekspresjon av ekspresjonsplasmidet ifølge (a) i en egnet E.coli-celle, (g) samtidig sekresjon og prosessering av hirudinforløperen fra E.coli, og (h) isolering av Leu-hirudin fra dyrkningsmediet.

4. Anvendelse av en hirudinforløper ifølge krav 1 eller 2 for fremstilling av Leu-hirudin.