SECUENCIAS DE SEÑALES PARA LA PRODUCCIÓN DE LEU-HIRUDIÜA A TRAVÉS DE SECRECIÓN POR E. COLI EN UN MEDIO DE CULTIVO El producto derivado ze la sanguijuela Refludan® muestra buenas propiedades terapéuticas en ensayos clínicos {The Lancet, Vol. 353, p. 425-438). Esto lleva a la conclusicn que cantidades mayores del producto se requerirán probablejierite en el futuro. El ingrediente biológico activo en el producto es [Leu1, Thr2] -63-des.:ifatohirudina que es descrito en la patente Europea 0 324 "12 y se conoce como "Leu-hirudina" a continuación. La patente Europea 0 448 093 describe un proceso para preparar la hirudina. la modalidad preferida de la pa-ente comprende una hirudina rayo aminoácido N-terminal consiste de alanina. La fusión de e;~a hirudina con la secuencia de señal de a-ciclodextringliczsiltransferasa (CGTasa) y la transformación de un vector de expresión que codifica esta proteina de fusión, de conformidad con lo descrito en la patente, en un mutante de E. coli secretor hace pcsible preparar Ala-hirudina con rendimientos crudos de más de 2 gramos por litro. La patente Europea 0 549 915 describe variantes de Ala-hirunina con estabilidad mejorada. La preparación de estas variantes que utilizan el sistema secretor de E. coli ree-lta en rendimientos de varios :ranos por litro. Los rendimientos son por consiguiente claramente más elevados que los rendimientos descritos por Dodt et al.
.<>_»._ A-,-- _¿.¿- > •.
para la variante de hirudina HV1 (FEBS LETTERS vol. 202 373-377 1936} . Un incremento insignificante del rendimiento en comparación se describe en la patente Norteamericana No. 5,573,929 mediante la expresión del cassette de expresión a través de un vector pUC de manera conocida en lugar del vector derivado de pBR322 de Dodt et al. Bender et al. (Appl . Microbol Biotechnol 34, p. 203-207 1990) describen la secreción de Thr-hirudina, que se describe en la patente Europea C 171 024, por Streptomyces lividans. Sin embargo, los rendimientos en comparación con los rendimientos mencionados en las patentes Europeas 3 443 093 y 0 549 915 otra vez son claramente inferiores. Esto se aplica también a la expresión en E. coli B según lo encontrado por P. de Taxis du Poei er al. para secreción de la variante de hirudina HV1 a través de la secuencia de señal Oinpa de E. coli. Los autores encuentran rendimientos de 30C mg/l de hirudina en el periplasma y aproximadamente 40 mg/l en el sobrenadante celular. La expresión en sistemas ce células de insecto, también descrita en el articulo, es ba;¡a (400 ag/1) . Rendimientos que pueden lograrse con los sistemas de expresión de levadura Hansenula polyrporpha o Pichia pastoris se acercan a los rendimientos descritos en las patentes Europeas 0 448 093 y 0 549 915 en contraste con los niveles logracis con S. cerevisiae. Rosenfeld et. al. (expresión y purificación de proteínas 8,
--J*," 476-482, 1996) describen la expresión y secreción de nirudina por la levadura Pichia pastcris. Rendimientos de aproximadamente 1.5 g/i de caldo de cultivo se logran en este caso. Un orden similar de magnitud, puede lograrse con la levadura Hansenula pclyinorpha (Appl. Microbiol. Bioiechnol. 44, 377-385 1995) . Sm embargo, una desventaja considerable de dichos sistemas de expresión es que los tiempos de fermentación son claramente más largos que en el caso del sistema de E. coli. For consiguiente seria provechoso si se pudiera preparar Leu-hirudina, como Ala-hirudina, por secreción por E. coli. Sin embargo, esto no es posible con el sistema describo en la patente Europea 0 448 093. Por esta razón, se propone en la patente extender la secuencia ce Leu-hirudina per el tripéptido Ala-Thr-Arg para producir una pre-Leu-hirudir.a que es finalmente convertida después de reacción con tripsina en el ingrediente activo nativo Leu-hirudina. Efectuando esto en un frasco agitado, un experimento resulta en rencmientos crudos claramente peores que los rendimientos descriios para Ala-hirudina. Por cons guiente, a primera vista, no se obtiene ninguna venta:a clara en comparación con los sistemas de expresión de levadura anteriores. El objeto en el cual se basó la presente invención fue por consiguiente preparar una proteina de fusión en la cual la combinación de secuencia de señal y Leu-hirudina permite un
ik£. ¡te t¿ J&ato 3¡k fc-i. Íá-procesamiento directo en Leu-hirudina y la secreción subsecuente de Leu-hirudina en alies rendimie uos por E. colí. Es un requisito previo para el desarrollo de un proceso que tiene un efecto provechoso sobre les costos de producción de Refludan tanto en la fermentación como en la purificación subsecuente debido a la concentración inicial nejorada de hirudina. Se ha encontrado ahora, de manera sorprendente, que las secuencias de señal que permiten una secreción directa de Leu-hirudina por E. coli existen, y que en este caso la secreción se observa de hecho cono más eficiente que lo descrito en la patente Europea 0 446 C93. Por consiguiente es posible desarrollar un proceso que hace disponible grandes camidades de Leu-hirudina sin coste i-portante, la invención se refiere a esto. Con el objeto de encontrar secuencias de señal provechosas, se introduce un método de tamizado de secuencias de señal asistido con reacción en cadena de polimerasa. Este método utiliza el ADN que codifica la prcreina de interés como templado y un cebador de reacción en cadena de polimerasa reversa definido, y cebadores delanteros variables que peralten la síntesis de una sección de ADN que codifica una secuencia de señal acoplada a un gen de interés. La reacción prosigue como se muestra en el esquena ilustrado en la figura 1. Es claro para el experto en la materia que el número de pasos de reacción puede variar según la longitud de la secuencia de señal a sintetizar . Secuencias ce señal cortas pueden ser preparaaas con un paso de reacción, y secuencias más largas con dos, tres o más reacciones . Además, el número de reacciones depende también del aparato utilizado para sintetizar los oli onucleótidos empleados cono inici adores . La fusión de gen ue péptido de señal sintetizada de esta forma puede ser disc iada después específicamente con las enzimas que reconocen los sitios de restricción 1 y 2 e insertada en un vecuor de expresión correspondientemente abierto. El sistema se vuelve de importancia general cuando se selecciona la nirudina como el gen de interés . Una selección variable __el aminoácido de N-termina de hirudina es además posible . Aun c uando esto tiene un cierro efect o sobre la unión de la hir udina con la trombina (caic io en la constante de unión , el efecto inhibidor de la hirudana con relación a la actividad de trombina sigue siendo medible . La patente EP-B1 0 448 093 describe la secreción ce hirudina en el sobrenadante de cultivo . La concentración ce hirudina ahi puede ser deteminada directamente a través del ensayo de inhibición de troncina bien conocido . La concentración de hirudina es una medición directa de la eficiencia de secreción y por consiguiente de la eliminación de la secuencia de señal . La patente describe, sin embargo, que, por ejemplo, la hirudina que empieza con el aminoácido
leucina no puede ser liberada eficientenente en el sobrenadante a través de la secuencia de señal de la CGTasa. Es ahora posible, utilizando el método descrito arriba, buscar secuencias de señal que permiten esto de manera efectiva. Es ahora posible de manera similar investigar la secreción de hirudinas empezando con uno de los otros 19 ainoácidos. Esto resulta en cada caso en un espectro de secuencias de señal que permiten el procesamiento eficiente del aminoácido de carboxi terminal del péptido de señal y el residuo de péptido unido. Por consiguiente es posible efectuar una preselección de péptidos de señal para secreción eficiente de cualquier proteína deseada en el periplasma y per consiguiente incrementar las oportunidades de desarrollar un proceso provechoso para preparar una proteína. La invención se refiere también a esto. El proceso puede ser automatizado mediante la agiración de la mezcla de transformación de mezcla de ligando y células competentes como cultivo líquido en un medio de selección durante la noche y, al día siguiente, mediante la inoculación con una alícuota de las células de conformidad con lo descrito en el medio del ejemplo 11 que contiene un inductor para efectuar la inducción, pero centrifugando la mayor parte del cultivo y congelando la pella de células. Si se encuentra actividad hirudina en la expresión, el plásmido de expresión correspondiente puede ser aislado de nuevo de las células, linearizado y separado por electroforesis en gel a partir de cualquier producto de autoligación. El ADN de plasmdo lineal es ligado de nuevo y transformado de nueve en la cepa huésped. Es después posible que colonias ind?~?duales sean aisladas y presadas para determinar la eficiencia de expresión. Es pcsir>le proseguir en este caso oe ral manera que el procese cumpla con los criterios oe aprobación farmacéutica. Una ventaja adicional del procedimiento es rué es fácil investigar variantes diferentes de un péptido ce señal, como surgen en el transcurso de la evolución por mrercambio de aminoácidos entre especies individuales, lade a lado para determinar su capacidad de secretar eficieutenente una hirudma. El proceso es también provechoso en comparación oon el uso de programas de ce to de conformidad con lo descrito per Nielsen et al. Protein Engmeering 10, 1-6, 1PP7S , con cuya ayuda es posible predecir sitios de disociación entre una secuencia de señal y una proteína de interés. Sm embargo, se encuentra que las predicciones efectuadas aquí no sen correctas en cada caso de tal manera que oembinaciones provechosas pueuen ser fácilmente no tomadas en cuenta. Además, no hay ninguna relación entre la premoción de un procesamiento correcto y el rendimiento que pueoe lograrse de hecho. Un aspecto de la invención es un precursor de hirudina
j-j-éi-rf» á4,^ ?ÉÉifti-i8Áfa--**fa& t**-*
8
que comprende una secuencia de señal seleccionada dentro del grupo que comprende las secuencias de señal de la proteína de membrana externa de Serratia arcescens, la proteína de oprF de Pseudomonas fluorescens, la proteína de lamb B de
5 Escherichia coli (codificada por el gen (la.rr.bB) de receptor lambda) , y la fumarato reductasa de Shewanella putrifaciens, que se selecciona de preferencia dentro del grupo que comprende la secuencia de señal de la proteína de membrana externa de Serratia marcescens y la fumarato reductasa de
10 Shewanella putrifaciens, en donde existe una unión de C- terminal de la secuencia de Leu-hirudina. Otro aspecto de la invención ee un proceso para preparar Leu- hirudina, en donde un precursor de hirudina de conformidad con lo descrito arriba ocurre como prouuctc intermedio, en
15 donde: (a) se prepara un plásmido de expresión q' e comprende una secuencia de ADN que codifica para el precursor de hirudina; (b) el plásmido de expresión de (a) es expresado en una 20 célula de E. coli adecuada; (c) el precursor de hirudina es secretado a partir de E. coli y procesado simultáneamente; y (d) la Leu-hirudina es aislada directamente del medio de cultivo . 25 De la misma manera, un aspecto de la invención es el uso de
i^^^d ?¡hÍ í ^.íÍ^í-htíi ?t. -.?ií?i?t?.-t.. . -A, .„ >• «. <, ,.~» , *^iv*m „**th#?^ , .. >.<»..» ¿ SÉÍA un precursor de hirudina de conformidad con lo descrito arriba para la preparación de Leu-hirudina, da preferencia en un proceso de conformidad con lo descrito arrut . Un aspecto aoicional de la invención es un proceso para encontrar un péptido de señal adecuado para la expresión secretoria de cualquier proteína deseada en E. culi, en donde (a) la hiruduna o un derivado de hirudina que tiene un efecto antitrombotico y que tiene un aminoácido aa,: definido en su N-terminal conectado K-terminalmente a un péptico de señal a probar es expresado en E. coli; (b) la taaa de expresión es determinara mediante la medici:n de la actividad de hirudina en el sobrenadante de cultivo; (c) los pasos (a) y (b) se repiten con vaoiO-? péptidos de señal; (d) un péptido de señal adecuado se selecciona mediante la comparación de las tasas e expresión representadas por las activi cades hirudina encontradas en el paso (b) . De la misma manera, un aspecto de la invención es el uso de hirudina o un derivado de hirudina que tiene un efecto antitrombótico y que tiene un aminoácido aax en su N-terminal para encontrar un péptido de señal que nace posible la secreción eficiente de una proteína de precursor que consiste del péptido de señal y de cualquier otra proreípa deseada con
el aminoácido aa N-terminal con eliminación simultánea del péptido de señal de E. coli, en particular en donde aa, es leucina. Un aspecto adicional de la invención es un proceso parí preparar cualquier proteína aeseada por expresión secretoria en E. coli, en donde (a) un péptido de señal adecuado es encontrado a través del proceso para encontrar un péptido de señal adecuado; (b) un constructo de ácico nucleico que codifica para una proteína de precursor que consiste del péptido aa señal adecuado de a) y la proteína deseada es expresado en E. coli, y (c) la proteína deseada es aislada del sobrenadante aa cultivo, en particular en donde el aminoácido N-terminal de la proteína deseada es leucina, y la expresión se efectúa a través de un constructo ue ácido nucleico en donde la secuencia que comprende el péptido de señal codifica para un péptido de señal seleccionaco dentro del grupo que comprenda la proteína de membrana externa de Serratia marcescens, la proteína de oprF de Pseudononas fluorescens, la proteína ce lab B de Escherichia ccli y la fumarato reductasa oe Shewanella putrifaciens. La síntesis de secuencias de señal que permiten una síntesis
* a??. &d?tátá;iitt í iií*. .. «Ai. .- ,-_. „ .. - - . » 8t¡« J»A. ,* j>.a?»^-. ai»Lu-» ^ »-.tt-«d«-»t ¿U-B- , Í¡É y secreción eficiente de Leu-hirudina se describe a título de ejemplo. Se describe también la síntesis de otras secuencias de señal que no llevan al objetivo o cien proporcionan resultados perores con relación al rendimiento. Los ejemplos tienen el propósito de explicar el concept: de la invención con base en la selección de secuencias de señal con base en Leu-hirudina pero no tienen el propósito de restringir dicha invención. Los procesos descritos pueden ser utilizados para la purificación e Refludan; se describe, per ejemplo, en el ejemplo 11. Ejemplo 1: Sínresis de un gen de fusión que codifica para una proteína de fusión que consiste de Leu-hirudina y la secuencia ca señal de la proteína de menorana externa de Serratia aroescens El plásmidc de expresión utilizado es el vector pJF118 descrito en la patente Europea 0 468 539, en la figura 1, puesto que es idéntico en cuanto a su estructura básica al vector pCM7153 descrito en la patente Europa 0 448 093. El templado utilizado es el plásmido pK152 que es mencionado en el ejep lc 1 en la patente Europea I 443 093 y que contiene la secuencia de hirudina que corresponde a la patente Europea 0 171 024. La proteína de membrana ha sido descrita por Braun, G. y Colé, S.T: Hol. Gen. Genet. 195, 321-328, 1984).
Para sintetizar la sección de ADN requerida, se preparan tres secuencias de oligonucleót.dc=. El oligonucleótido hirrev tiene la secuencia: 5' TTTTTTTAAG CTTGGGCTGC AGGTC 3' [SEQ ID NO: 1] Hindlll El cebador se híbrida con la región de 227-210 pb del gen de hirudina presentado en la tabla 1. El cebador smompafl tiene la secuencia: 5'-TGGCACTGGC AGGTTTCGCT ACCGTAGCGC AAGCCcttac gtatactoae tgca - 3' [SEQ ID NO:2] El cebador se híbrida oon los nucleótidos 1-19 de la secuencia de hirudina presenrada en la tabla 1. La parte de hibridación de la secuencia de cebador es simbolizada per letras minúsculas. El rest: de la secuencia se híbrida con la región de 229 bp-263 bp de la secuencia publicada por Gram, G. y Colé, S.T. (Mol. Gen. Genet. 195, 321-328, 1984) . El cebador snsompaf2 tiene la secuencia: 5' - tttttttgaat tcATGAAAAA GACAGCTATC GCATTAGCAG TGGCAC1?GC AGGTTTC -3' [SEQ ID NO: 3] La secuencia de cebador se híbrida desde la posición 13 bp en adelante con la secuencia de 201 bp-245 bp publicado per Braun y Colé y por consiguiente empalma la secuencia ce cebador smaßpaf2. La posición 1-12 del cebador contiene un
^•^^**^ sitio de reconocimiento para la enzima oe restricción EcoRI y, junte, 6 nucleótidos T para nacer posible el reconocimiento por la enzima. En una reacción en cadena de polimerasa estándar (como por ejemplo, 94° C: 10", 50° C: 30", 72° C: 45", 25 ciclos) con ADN del piásmido pK152, que contiene la secuencia descrita en la tabla 1, como templado, y los cebadores irrev y smompafl, la secuencia de hirudina es extendida por la secuencia de señal parcial bacteriana. El producro de la reacción reacciona después en una segunda reacción en cadena de polimerasa como templado con los cebadoras hirrev y smompaf2 en las msinas condiciones. El producto de la reacción es un fragmente de ADN que codifica para una proteína de fusión que consiste de la secuencia de hirudina exrendida por la secuencia, de señal deseada. En el extren; o ' se encuentra el sitio de reconocimiento para la enzima de resrricción EcoRI y en el extremo 3' se encuentra el sitio de reconocimiento para la enzima HindIII. El produotc de la reacción de la segunda reacción en cadena de poliiterasa reacciona en una mezcla de doble digestión con las dos enzimas de restricción y es insertado como fragmento EcoRI/HindIII en el ADN de vector, que ha sido abierto con las dos enzimas, en una reacción de T4 ADN ligasa. Células competentes de la cepa Mcl061 de E. ecli o bien el mutante secretor WCM100 son transformadas con la mezcla de ligación y cultivadas bajo presión de selección en placas que contienen ampicilina. La mañana siguiente, la expresión de confcrraidad con lo descrito en el ejemplo 6 es después comparada con la expresión de Ala-hirudma empleando la cepa WCM100/pCM 153 de E. coli. Se encuentra que la expresión obtenioa es aproximadamente 1.5 veces mejor que en la prueba comparativa. Ejemplo 2: Síntesis de la proteina de fusión de Leu-hirudana y la secuencia de señal del producto de gen oprF de Pseudomonas fluorescens La construcción se efectúa de conformidad con el esquema descrito en el ejemplo 1, a excepción que, en lugar oe ios cebadores smompafl/f2, se utilizan dos nuevos cebadores que, en términos de su especificidad para el gen de hirudma y la secuencia para reconocuniento por la enzima de restr.ccuón EcoRI, tienen las mispas características que los ceradcres smompa pero codifican para la secuencia de señal res.erida del gen oprF (De, E. et al.: FEMS Microbial. Lett. 12". 267-272, 1995). El cebador pfufl tiene la secuencia: 5'GGTTCTCTTA TTGCCGCTA1 TTCTTTCGGC GTTCTGGCAc ttacrtatac tgactgca 3'0 [SEQ ID NO:4: El cebador pfuf2 tiene la secuencia: 5'ttttttgaat tcatgAAAAA CACCTTGGGC TTGGCCATTG GTTC1CTTAT TGCCGC 3'
i£.¿ éhi~k * ,Mgk . .
[SEQ ID NO: 5] En este caso, el cebador pfufl es utilizado de conformidad con el ejemplo 1 en PCR1 y el cebador pfuf2 es utilizado de manera correspondiente en PCR2. La expresión es efectuada mediante la comparación con la expresión de Ala-hirudina empleanco la cepa CM100/pCM7053 de E. ooli. Se encuentra que la expresión obtenida es aproximadamente 1.1 veces mejor que en la prueba de comparación. Después del fraccionamiento por electroforesis en gel en el sistema ?DS-PAGE, la banda de hirudina es aislada y la secuencia N-terminal de la hirudina es determinada. Se encuentra que la secuencia es totalmente intacta y empieza con el aminoácido le_eina. El resultado es sorprendente puesto que el programa para identificar el sitio de reconocimiento de peptidasa de señal putativo predice una extensión de la hirudma por la valina. Ejemplo 3: Síntesis de la proteina de fusión de Leu-hirudina y la secuencia de señal del producto de gen lama de E. col La construcción se efectúa de confomidac con el esquema descrito en el ejemplo 1 a excepción que, en lugar de los cebadores s?nompafl/f2, se emplean los dos nuevos cebadores que, en términos de su especificidad para el gen de hirudina y la secuencia para reconocimiento por la enzima de restricción EcoRI tienen las mismas características que los cebadores s ompa pero codifican para la secuencia de señal requerida del gen lamb (Clement, J.M. y Hofnung, M. : Cell 27, 507-514, 1981 ) . El cebador lambbfl tiene la secuencia : 5' GTTGCCGTCG CAGCGGGCGT AATGTCTGCT CAGGCAATGG CTctr acgta tactgactgc a 3 ' [ SEQ ID NO: 5] El cebador lambbf2 tiene la secuencia : 5' ttttttgaat tcATGATGAT TACTCTGCGC AAACTTCCTC TGPCG-3TTGC CGTCGCAGC 3' [ SEQ ID NO: " ] En este caso, el cebador lambbfl l es utilizado de confomidad con el ejemplo 1 en PCR1 y el cebador lambbf2 es utilizado de manera correspondiente en PCR2 . La expresión es efect-aca por comparación con la expresión de Ala-hirudina empleando la cepa WCM100/pCM7053 de E . coli . Se encuentra que la expresión obtenida esté en el mismo nivel que en la prueba comparar iva . Después de fraccionaniento por electroforesis en gel en el sistema SDS-PAGE, la banda de hirudina es aislada, y la secuencia de N-terminal de la hirudina es determinada . Se encuentra que la secuencia es totalmente intacta y enpieza con el aminoácido leucina . Este resultado es sorprendente puesto que el programa para identificar ei sitio putativo de reconocimiento de peptidasa de señal no preeuce un procesamiento correcto de la hirudina . Ej emplo 4 : Síntesis ce la proteína de fusión de Leu-iiridma y la secuencia de señal del precursor de la subunidad de
flavcoroteína de fumarato reductasa a cartir de Shewanella putrafaciens La construcción se efectúa de confcmidad con el esquema descriro en el ej emplo 1 , a excepción que, en lugar de los cebaucres smompfal/f2 , se emplean los eos nuevos cebadores que, en términos de su especif icidao para el gen de hirudina y la secuencia para reconocimienre por la enzima de restricción EcoRI , tienen las mismaa características que los cebauores smompa pero codifican para la secuencia de señal requerida a partir de Shewanella purrefaeiens ( Pealing, S . L . et al . : Biochemistry 31 , 12132-12141 , 1592 ) . Puesto que la publicación describe solamente la secuencia de proteínas, la secuencia de aminoácidos es traduci rá de conformidad con las tablas de codones en una secuencia ue AU de tal manera que la secuencia que surge para el cebador spfccl es de confemidad con lo siguiente 5' ZTACCCTGAT GGGTACCGCT GGTCTGAT1-3 GTACCGCTGT TGCTcttacg tatactgact gca 3' [ SEQ ID NO : 8 ] El cebador de spfccf2 tiene la secuenci a : 5' ttttrtgaat tcATGAAAAA AATGAACCT:- GCTGTTTGCA TCGCTACCCT GATC-GG7ACC 3' [ SEQ ID NO : 9] En este caso, el cebador spfccl es uplizado de conformidad con el ejemplo 1 en PCRl y el cebador spfccf2 es utilizado de manera correspondiente en PCR2. La expresión ee efectuada comparando con la expresión de Ala-hirudina empleando la cepa WCM100/pCM7053 de ?. coli. Se encuentra que la expresión obtenida es aproximadamente 1.5 veces mejor que en la prueba comparativa. Después del fraccionamiento por elecrroforesis en gel en el sisrema SDS-PAGE, la banda de hirudina es aislada y la secuencia de N-terminal de la hirudina es determinada. Se encuentra que la secuencia es rotalmente intacta y empieza oon el aminoácido leucina. Este resultado es sorprendente puesto que el programa para identificar el sitio putativo de reconocimiento de peptidasa de señal predice el procesamiento en el lado carboxilo de la cisteína en la posición 6 de la secuencia de hirudina. Ejemplo 5: Síntesis de la proteína de fusión de Lea-hirudina y la secuencia de señal del precursor de ß-lactamasa a partir de pBR322 La construcción ee efectúa de conformidad con el esquema descrito en el ejemplo 1 a excepción que, en lurar de los cebadores smompaf1 'f2, se utiliza los dos nuevos cebadores que, en términos e su especificidad para el gen oe hirudina y la secuencia para reconocimiento por la enuiroa de restricción EcoRI, tienen las mismas características que los cebadores smompa pero codifican para la secuencia de señal requerida de la proteína de precursor de I-lactamasa (Sutcliffe J.G.; Ccid Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43:77- 90 ( 1978 ) ) . El cebador blatfl tiene la siguiente secuencia : 5' CTGATCCCGT TCTTTGCAGC GTTCTGC "TG CCGGTTTTCG CGcttacgta tactgactgc a 3' [ SEQ ID NO : 10 ] El cebador blatf2 tiene la secuencia : 5' ttttttgaat tcATGTCCAT CCAGCACTTC CGCGTCGCCC TGATCCCGTT CTTTGC 3' [ SEQ ID NO : 11 ] En este caso, el cebador blatf l es utilizado de conformidad ccn el ej emplo 1 en PCRl y el cebador blatf2 es utilizado de manera correspondiente en PCR2 . La expresión se efectúa por comparación con la expresión de Ala-hirudina empleando la cepa WCM-100/pCM7053 de E . coli . Se encuentra que el rendimiento de expresión que se obtiene es solamente 50%-90% del rendimiento obtenido en la prueba conparativa . Después de fraccionamiento por electroforesis en gel en el sistema SDS- PAGE, la banda de hirudina es aislada y la secuencia N- terminal de la hirudina es determinada . Se encuentra que la secuencia es totalmente intacta y empieza con el aminoácido leucina. Este resultado fue predicho por el programa para identificar el sitio de reconocimiento de péptido de señal putativo . Ejemplo 6 : Síntesis del gen de fus ión de Leu-hirudina y la secuencia de señal del precursor de fosfatasa alcalina a
partir de E. coll La construcción se efectúa de conformidad con el esquema descrito en el ejemplo 1 a excepción que, en lugar de los cebadores smompafl/ 2, se utilizan dos nuevos ceoaccres que, en términos de su especificidad para el gen de Lir dina y su secuencia para reconocimiento por la enzima de restricción EcoRI, tienen las mismas características que los cebadores smompa pero codifican para la secuencia de señal requerida de la proteína de fosfatasa alcalina a partir de E. coli (Shuttleworth, H., Taylor, J. y Minton, N. Nuciere cids Res. 14(21), 8689 (1986) . El cebador linkphoafl tiene la siguiente secuencia: 5' GCTGCCGCTG CTGTTCACCC CGGTTACCAA AGCGcttacg tetacrgact gca 3' [SEQ ID NJ:12]
El cebador linkphoaí2 tiene la secuencia: 5' ttttttgAAT TCAGGAAACA GTCGACCATC GCGCTGGCG: TGCTGCCGCT
GCTGTTC 3' [SEQ ID NO: 13] Los dos cebadores son optimizados en términos de la elección de codones para E. coli, es decir, no corresponden Totalmente a la secuencia natural del gen inicial. En este caso, el cebador linkphoafl es urilizado de conformidad con el ejemplo 1 en PCRl y el cebader lmkphoaf2 es utilizado de manera correspondiente en PCR2. La expresión
j4-JH &«& es efectuada mediante la comparaci ón con la expresión de Ala-hirudina utilizando la cepa ZM1 00/pCM7053 de E . coli . Se encuentra que el rendimiento ce expresión obtenido es solamente una fracción del rencunuento obtenido en la prueba comparativa . Después de fraccionar: lento por electroforesis en gel en el sistema SDS-PAGE, la randa de hirudína es aislada y la secuencia N-terminal de la hurudina es determinada . Se encuentra que la secuencia es re raímente intacta y empieza con el aminoácido leucina . Este resultado fue predicho por el programa para identificar el sutio de reconocimiento de peptidasa de señal putativa . 3m embargo, el rendimiento limitado es sorprendente . Ej emplo 7 : Síntesis del gen de fusión de Leu-hirudina y la secuencia de señal del precurs ir de la fosfatasa alcalina a partir de E. fergusonii La construcción se efectúa de conformidad con el esquema descrito en el ej emplo 1 a excepción que, en lugar de los cebadores smompafl/f2, se utilizan dos nuevos cebadores que, en términos de su especificidac para el gen de hirudina y su secuencia para reconocimiento per la enzima de restricción ?coRI, tienen las mismas caracrerísticas que los cebadores smompa pero codifican para la secuencia de señal requerida de la proteína ée fosfatasa alcalina de E . fergusonni (Du Bose, R . F. , y Hartl, D . L . Mol . Biol . Evo 1 . 7, 547-577 ( 1990) ) . Esta secuencia difiere en cincc posiciones de la fosfatasa alcalina de E. coii . El cebador ferrus fl tiene la siguiente secuencia : 5' GCTGAGCTGC "TGATCACCC CGGTGTCCCA GGCGcttacc taractgact gca
3 ' [SE; ID NO : 14 ]
El cebador ferras f2 tiene la secuencia : 5' ttttttgaat tcATGAAACA GAGCGCGATC GCGCTGGCTC TGCTgAGCTG CCTGATC 3' [ SEI ID NO : 15 ] Los dos cebadores son optimizados en términos de la elección de codones para E. coli, es decir, no corresponden totalmente a la secuencia natural del gen inicial. En este caso, el cebador ferguecl es utilizado de conformidad con el ejemplo 1 en PCRl y el cebador fergusf2 es utilicadc de manera correspondiente en PCR2. La expresión es efectuada por comparación c:n la expresión de Ala-hirudina empleando la cepa WCM100/pCM7053 de E. coli. Se encuenrra que el rendimiento de expresión obtenida es solamer.re una fracción del rendimiento obtenido en la prueba comparativa. Es aproximadamente 50% menor que lo que se ibserva con el constructo de péptido de señal de fosfatasa alcalina de E. coli y Leu-hirudina . Ejemplo 8: Síntesis del gen de fusión de Ler-hirudina y la secuencia de señal del precursor de ciclodextrina glucanotransferasa de Paenibacillus macerans
Í» -« »»'.t . i- . :At ft .& l La construcción se efectúa de conformidad con el esquema descrito en el ej emplo 1 a excepción que, en lugar de los cebadores smompafl/f2 , se utilizan dos nuevos cebadores que, en términos de su especificidad para el gen de hirudina y su secuencia para reconocimiento por la enzima de restricción EcoRI , tienen las mismas caracrerísticas que los cebadores s ompa pero codifican para la secuencia de señal requerida del gen de ciclodextrina glucanotransferasa de Paenibacillus macerans (Tacaño, T . , Fukuda, M. , Monma, M. , Kobayashi, S . , Kainuma, K. , y Yamane, K.J. Bacteriol . 166, 1118-1122 1986) ) . El cebador baccdgfl tiene la siguiente secuencia : = , CTTTCGCTGA GTATGGCGTT GGGGATTTCA CTGCCCGCAT GGGCActtac gtatactgac tgca 3 ' [ SEQ ID NO : 16 ]
?l cebador baccdgf2 tiene la secuencia : 5' ttttttgaat tcATGAAATC GCGGTACAAA CGTTTGACCT
CCCTGGCGCT TTCGCTGAGT ATGGC 3' [SEQ ID NO : 17 ] En este caso, el cebador baccdgfl se utiliza de conformidad con el ejemplo 1 en PCRl y el cebador baccdgf2 se utiliza de manera correspondiente en PR2. La expresión se efectúa mediante la comparación con la expresión de Ala-hirudina empleando la cepa WCM100/pCM~:?3 de E. coli. Se encuentra que el rendimiento de expresión obtenido es aproximadamente una
-.»_Jh- ^^ cuarta parte del rendimiento obtenido en la prueba comparativa. La hirudina sintetizada se comporta cono Leu-hirudina en el ensayo de inhibición de trombina. Esto significa que el péptido de señal ha sido procesado correctamente. Esto no corresponde a las expectativas a partir del análisis teórico que indicó una extensión de 8 aminoácidos o bien, alternativamente, un truncado por dos aminoácidos en la terminal N. Ejemplo 9: Síntesis del gen de fusión de Leu-hirudina y la secuencia de señal de la proteína de precursor de fimbrilina de la cepa PCFO20 de E. coli (fotA) La construcción se efectúa de conformidad con el esquema descrito en el ejemplo 1 a excepción que, en lugar de los cebadores smompafl/f2, ee utilizan dos nuevos cebadores que, en términos de su especificidad para el gen de hirudma y su secuencia para reconocimiento por la enzima de restricción EcoRI, tienen las mismas características que los cebadores smompa pero codifican para la secuencia de señal requerida de la proteína de precursor de fimbrilina de E. coli PCFO20 (Viboud, G.I., Jonson, G., Dean-Nystrom, E. y Svenuerholm, A.M. Infect. Immun. 64(4 , 1233-1239 (1996)). El cebador pcfl-ala tiene la siguiente secuencia: 5' TGGTTTCAGC TTTAGTAAG GGGGTTGCAT TTGCTCTTAC GTATACTGAC TGCAC 3' [SEQ ID N0:18] El cebador p-pcf2 tiene la secuencia: 5' ITTTGGGAAT TCATGAAAAA GACAATTAIG TCTCTGGCTG TGGTTTCAGC
TTTAGTAAGC 3' [SEQ ID NO: 19] En este caso, el cebador pcfl-ala ee utiliza de conformidad con el ejemplo 1 en PCRl y el cebador p-pcf2 se utiliza de manera correspondiente en PCR2. la expresión se efectúa mediante la comparación con la expresión de Ala-hirudina empleando la cepa WCM100/pCM7053 de I. coli. Se encuentra que el rendimiento de expresión es aproximadamente 40% del rencumiento obtenido en la prueba ccnparativa. Ejemplo 10: Síntesis del gen de fusión de Leu-hirudina y la secuencia de señal de la proteina oe membrana externa de S. typhimurium (fi D) La construcción se efectúa de conformidad con el esquema descrito en el ejemplo 1 a excepción que, en lugar de los cebadores smompafl/f2, se utilizan des primeros cebadores que, en términos de su especificidad para el gen de hirudina y su secuencia para reconocimientc por la enzima de restricción EcoRI, tienen las mismas características que los cebadores smompa pero codifican para la secuencia de señal requerida de la proteína de nembrana externa de S. typhi urium (Rioux, C.R., Friedrich, M..J. y Kadner, R.J.; J. Bacteriol. 172 (11), 6217-6222 (199: ). El cebador styfimfl tiene la siguiente secuencia: 5' CGGCGCTGAG TCTCGCCTTA TTTTCTCACC TATCTTTTGC Icrracgtat actgactgca 3' [SEQ ID 50:20] El cebador styfimf2 riene la secuencia: 5' ttttttgaat tcaTGTCATT TCATCACCGG GTATTTAAAC 1GTCGGCGCT GAGTCTC 3' [SEQ ID 50:21] En este caso, el cebador styfimfl se utiliza de conformidad con el ejemplo 1 en PCRl y el cebador styfimf2 se utiliza de manera correspondiente en PCR2. La expresión se efecrúa por comparación con la expresión de Ala-hirudina empleando la cepa CM100/pCM7055 de E. coli. Se encuentra que el rendimiento de expresión obtenido es de aproximadamente 10% del rendimiento obtenido en la prueba comparativa. Ejemplo 11: Expresión en E. coli El ejemplo describe la expresión de hirudina. Para este propósito, porciones de 1-5 mi de medio LB que ccntnene 25 mg/ml de ampicilina y 0.5-2 mM IPTG (ß-D-tiogalactcpiranosido de isopropilo) se inoculan con células de un transformante y se agitan a 220 revoluciones por minuto en un agitador de incubación a una temperatura de 28° C durante aproximadamente 20 horas. Subsecuentemente, después de la determinación de la densidad óptica, la suspensión de células es centrifugada y la hirudina es determinada en el sobrenadante clare. La expresión de la Ala - hirudina descrita en la Dátente
afeij.
Europea 0 448 093 a través del plásnido pCM7053 en el secretor mutante WCM100 descrito en la patente se efectúa en paralelo con la expresión de Refludan. Esto hace posible una comparación directa de las tasas de expresión. 5 La expresión en una mayor escala puede efectuarse de conformidad con lo descrito en la patente Norteamericana 5,616,476. El Refludan puede ser purificado por los métodos descritos en los ejemplos 5 y 6 en esta patente. E:emplo 12: Determinación de la concentración de hirudina 10 La determinación de la concentración de hirudina se efectúa per el método de Grießach et al. (Trombosis Research 37, 347- 3?D, 1985) . Para este propósito, cantidades definidas de un estándar de Refludan están incluidas en las series de mediciones para construir una gráfica de calibración. Por
15 censiguiente es posible establecer directamente el rendimiento en mg/l. Ta la 1: Secuencia de ADN que codifica hirudina con traducción en aminoácidos 1 CTTACGtArACrGACtGCACTsAArCTGOTCAGAACCT^TGCCTGtorO.^&O-ATCTAAC 60 T Y T D C T S S G Q N O O C S G S N 20 ~1 G".T".GCGGCCAGCGTAACAAATGCATCCTTGGATCCGACGC 3AAA- :. AACCAGTGCG7T 120 V C G Q G N K C I G S D G E C/ O
121 ACT&GCGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTCATAACGACGGCGACTTCGAAGAGATCCC? 180 T G E G 7 P K P Q S H N D G D F E E . P
131 GAGGAATACCTTCAGTAATAGAGC CGTCGACCTGCAGCCCA GC i 227 25 "se? ID NO. -22J E E Y L ? * * .3E? ID NO. : 23] S».ü-t¿fiS$_ Tabla 2: Ejemplo Secuencia Estructura rendimiento SEQ ID NO : de señal primaria relativo por mi de cultivo Control: MKRNRFFFNTS 1 24 cgtasa-Ala- AAIAISIALNTFF hirudina CSMQTIA 1 Proteína de MKKTAIALAVALA 1.5 25 membrana GFATVAQ A externa/ Serratia marcescens Proteína MKNTLGLAIGSLI 1 . 1 26 oprF/ AATSFGV LA Pseudomcna: fluorescen; Proteína MMITLRKLPL 27 La bB/ AVAVAAGVMS E. coli AQAMA Fumato reMKKMNLAVCI 1 . 5 28 ductasa/ ATLMGTAGLM Shewanella GTAVA putrifaeie: -S ß-Lactaras; / MSIQHFRVAL 0. 5 29 pBR322 IPFFAAFSLPVFA
8 Fosfatasa MKQSTIALAL 0.1 30 alcalina/ LPLLFTPVTK E. coli 9 Fosfatasa MKQSAIALAL 0.05 31 alcalina/ LSCLITPVSQ A E. fergusonii 10 Ciclodextri- MKSRYKRLT? 0.25 32 na glucano- LALSLSMALGI transferasa/ SLPAA Paenibacillus macerans 11 Proteína de MSFHHRVFKL 0.11 33 membrana SALSLALFSH LSFA externa/S. typhimurium LISTA DE SECUENCIAS <110> Aventis Pharma Deutschlanc GmbK <120> Secuencias de señales para la producción de Leu- hirudina a través de secreción per E. coli en un medio de cultivo <130> 1999/L055 <140> 19944870.1 <141> 1999-09-18 <160> 33 <170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: característica mise <400> 1 tttttttaag cttgg ctgc aggtcsdnhn d 31 <210> 2 <211> 54 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: característica mise <400> 2 tggcactggc aggttrcg t accgtagcgc aagcccttac gtatactrac tgca 54
<210> 3 <211> 57 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: característica mise
.S. ^Í.Í?Í <400> 3 ttttttgaat tcatgaaaaa gacagctatc gcattagcag tggcactggc aggtttc 57 <210> 4 <211> 58 <212> ADN <213> Secuencia arti ficial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial : característica mise <400> 4 ggttctctta ttgccgctac ttctttcggc gttctggcac ttacgtatac tgactgca 5E <210> 5 <211> 56 <212> ADN <213> Secuencia arti ficial <220> <223> Descripción de la secuencia arti ficial : característica mise <400> 5 ttttttgaat tcatgaaaaa caccttgggc ttggccattg gttetettat tgccgc 5f
<210> 6 <211> 61 <212> ACN <213> Secuencia arti ficial <220>
t«- É6faJÍ ?J ?&&»1*~ «J-JJll5«. f? l-jakÁ <223> Descripción de la secuencia artificial : característica mise <400> 6 gttgccgtcg cagcgggcgt aatgtctgct caggcaatgg ctctt=cgta tactgactgc 60 a 61
<210> 7 <211> 59 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial : característica mise <400> 7 ttttttgaat tcatgatgat tactctgcgc aaacttcctc tggcr?ttgc cgtcgcagc 59 <210> 8 <211> 63 <212> ADN <213> Secuencia arti ficial <220> <223> Descripción de la secuencia arti ficial : característica mise <400> 8 ctaccctgat gggta cgct ggtctgatgg gtaccgctgt tgctr tacg tatactgact 60 gca 63 <210> 9
Isá taá >Í ,. ? .*.£ i.í * í .:*..
<211> 60 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: característica mise <400> 9 ttttttgaat tcatgaaaaa aatgaacctg gctgtttgca tcgctaccct gatgggtacc 60
<210> 10 <211> 61 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial : característica mise <400> 10 ctgatcccgt tctttgcagc gttctgccrg cggttttcg cgc tacgta tactgactgc 60 a 61
<210> 11 <211> 56 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: característica mise
..-?.¿..fcA»¿.>¿J> ¡t-fc.-fe. - . ..;**,.
<400> 11 ttttttgaat tca gtccat ccagcacttc cgcgtcgccc tg= ccrgtt ctttgc 56
<210> 12 <211> 53 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial : característica mise <400> 12 gctgccgctg ntgttcaccc cggttaccaa agcgcttacg t¿.zac~ gact gca 53
<210> 13 <211> 57 <212> ADN <213> Seciencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artifi cial : característica mise <400> 13 ttttttgaat -catgaaaca gtcgaccatc gcgctggcgc trrrtgrrgct gctgttc 57
<210> 14 <211> 53 <212> ADN <213> Se iencia artificial <220>
ÍÁ? JháJUttí?i??é <223> Descripción de la secuencia artificial: característica mise <400> 14 gctgagctgc ctgatcaccc cggtgtccca ggcgcttacg tatactgact gca 53 <210> 15 <211> 57 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: característica mise <400> 15 ttttttgaat tcatgaaaca gagcgigatc gcgctggctc tgctgagctg cctgatc £ 7
<210> 16 <211> 64 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial : característica mise <400> 16 ctttcgctga gtatggcgtt ggggaittca ctgcccgcat gggcacttac gtatacttac 60 tgca 64
<210> 17 <211> 65
tAAíá H A*A *-?.t& Í- *MÁÁ i- J <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: característica mise <400> 17 ttttttgaat tcatgaaatc gcggtacaaa cgtttgacct ccctggcgct ttcgctgagt 60 atggc 65
<210> 18 <211> 55 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: característica mise <400> 18 tggtttcagc tttagtaagc ggggttgcat ttgetettac gtatactgac tgcac 55
<210> 19 <211> 60 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: característica mise <400> 19
... . •» * .J& fej>.<.<-A.i ttttgggaat tcatgaaaaa gacaattatg tctctggctg tggtttcagc tttagtaagc 60
<210> 20 <211> 60 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: característica mise <400> 20 cggcgct.gag - -c cc--. nz-.zzzt : -a.c.-:c<jc ¿s-.-.ac?'.*: -Ctcíc-.qca 60
<210> 21 <211> 57 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: característica mise <400> 21 -ct tt?aac CCÍ'.;::¿P. i A^ &zz^q -uAC?taaac t ? -"3* jc 5^-?- <210> 22 <211> 267 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: gen
I?? tt a.- AÉai-.Áfa .fc-i-i-ml í.
<400> 22 cct c?tic ". actgcac ?jaacít q. c ^aac — ^c í ; ;:;cca ?^ at--.ü 60 eytílc.sy: ?s í? t c j?;caq q-.i acaaa-.^?a: :: .j? ; :c p-^y^ tia '.23 jqadccßc.q ;; :vc?<jni< si-jt.icvj ¿zi cqu?q -.i cc^aai "j:*— :" 130 acaa gai?? raacc-.-gaa ;j? _ c; ^tks?rKSgd ja ?fa.-cc -,-.r:-.r:a ? C -aq r.3— :g a-cc^a c- rja? ": ^
<21C 23 <211> 5 <212> FRT <213> Secuencia artificial <220> <223^ Descripción de la secuencia arpfucial: péptido <40C> 23 Glu 2-lu Tyr Leu Gln 1 5 <21C> 24 <211> 30 <212> PRT <21?> Secuencia artificial <22C> <22?> Descripción de la secuencia art; .ricial: señal <40C> 24
«et '.¡a Ar? Asn Arq ?..e Pí-.ß Ase. Thr Ser Ala -.la :,e i. a .-e ser 13 lie ?-a •_.«,. Asn 7i.r ?Me ?".« Cys 3*r -e: Gl 20 25
taAá* -t sj-ij -&áaí_-<,i .,,. t, j-... __ - jM-Afa_at J -^.OJ H??Á&i;
<210> 25 <211> 21 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial : seña." <400> 25
Mee Lys Lys Thr l li* Aia li. =-ia -ai A_a '_.*_ Ala c.y ? t Aia Va] «lia Zlr Ala :c
<210> 26 <211> 22 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: seña. <400> 26
Met lys Asr 7nr Le- Gl y Le , Ai. '.... Se: ie- I-e A-a A¿a Thr
Ser Phe Giy '/ai Le Aia 20
<210> 27 <211> 25 <212> PRT
kAltJ it*. *&&**»*&.»***.. ,.«. -^á-l-lfe-... *»-. « < -«*(-» «fc-fctt-t-ji.
<213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: señal <4 I 0> 27
Met Me lie Tí-.r le- Ar? iys Le'.. ?ro Le. '- i i Vai A„ _ va . Ai = i 10 a i Mee Ser A.a G--. A_a Met Aia 2C 25
<210> 28 <211> 25 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: señal <4:0> 28
«*j L..s -ys <-!e: í_- Le. A.a v4; : 3 ;_e _,., Th. Lí. „e . ._ ... 5 i; .. A -- 3-. Le. Me; G.y 7*r iia Va. A.a
<210> 29 <211> 23 <212> PRT <213> Secuencia artificial <210> <223> Descripción de la secuencia artificial : señal
jBaw i-->f -ttái. - . ,..a - tt-a-a»»- '. . .«ai-ti.t ;¿..i <400> 29 .et Ser tía Gln "la ? e -r .ai Ala iáv. i.ß Pro ¿>-e ?-e Aia < l 5 10 i5 ? e Ser Leu Pro l P^e A_.a 20
<210> 30 <211> 21 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: señal <400> 30 Me. Lys Sin Ser Thc :iß =_a _«u Ala e L^u ?: -e. .-rt Tn- 1 5 10 15 Pro Vai t ? L s Ala 20
<210> 31 <211> 21 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: señal <400> 31 Me: Lys Ci.n Ser Ala e Ala _e<_ Ai -e?_ _.e'j se i. :ie 7tr
Pro i«- ~.?
<210> 32 <211> 27 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuenciaa artificial: señal
<400> 32
z Lys Ser Arg Tyr Lys Ar? Leu Tr.r Ser Leu Ala -e_ Ser Le1- Ser i 5 1C 15 e_ Gly lie Ser Ala Tr.
<210> 33 <211> 24 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencla artificial: señal <400> 33 Met Ser ?f.e riis H..s Arg Va i Pr.e Lys Le. ; r A- a -ß - se: Leu Ai a : s :: 15 Leu ft-.e Ser his Le- Ser ?n<» Ala 7C íík * ,J¡ ? i i «j ;i .t ,-.it¿. : »á-- «•i-aMgÍT»,^-