CN108359689B

CN108359689B - 利用抗病基因识别无毒效应蛋白以鉴定具有分泌功能信号肽的方法

Info

Publication number: CN108359689B
Application number: CN201810055476.3A
Authority: CN
Inventors: 阴伟晓; 罗朝喜; 谢松霖; 林杨; 田振东
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2018-01-19
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2038-01-19
Also published as: CN108359689A

Abstract

本发明提供了一种利用抗病基因识别无毒效应蛋白以鉴定具有分泌功能信号肽的方法，包括以下步骤：(1)将待鉴定信号肽连接致病疫霉无毒效应蛋白Avr3a的C端构建表达载体，所述致病疫霉无毒效应蛋白Avr3a的C端氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；(2)将步骤(1)构建的表达载体转化感受态细胞；(3)将步骤(2)的感受态细胞和含有抗病基因的感受态细胞共同注射入植物细胞中，观察注射位点坏死情况，若注射位点坏死，则待检测信号肽不具有分泌功能，若注射位点无坏死，则待检测信号肽具有分泌功能。

Description

利用抗病基因识别无毒效应蛋白以鉴定具有分泌功能信号肽的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体地说，涉及一种利用抗病基因和无毒效应蛋白在细胞内识别并引起细胞坏死的特点来鉴定具有分泌功能信号肽的方法。

背景技术

分泌蛋白指的是在细胞内合成，能够分泌到细胞外发挥作用的蛋白质。信号肽位于分泌蛋白的N端，一般由15-30个氨基酸组成。当信号肽序列合成后，被信号识别颗粒所识别，蛋白质合成暂停或减缓，信号识别颗粒将核糖体携带至内质网上，蛋白质合成重新开始。在信号肽的引导下，新合成的蛋白质进入内质网腔，最终被转移到细胞外，信号肽则被切除。

植物病原菌分泌的无毒效应蛋白进入寄主植物细胞后，能够被对应的抗病基因识别，引起植物细胞坏死。目前，植物病原细菌、真菌以及卵菌中大量的无毒效应蛋白和对应的抗病基因已经被鉴定。例如，卵菌中致病疫霉的无毒效应蛋白Avr3a和寄主中对应的马铃薯抗病基因R3a已经被鉴定，R3a在植物细胞中可以识别Avr3a，引起细胞坏死。由于R3a在植物细胞中发挥作用，对Avr3a的识别也发生在细胞内，因此Avr3a在植物细胞外时则不能被识别，从而不能引起细胞坏死。

当前，检测分泌信号肽功能的方法有酵母的pSUC2系统、分泌蛋白融合标签后在病原菌中超量表达后进行检测等。酵母系统需要进行酵母转化，并且在多种培养基上验证，操作过程繁琐，费用高。在病原菌中超量表达融合有标签蛋白的分泌蛋白，需要进行病原菌的转化，效率较低，周期长，并且费用较高。现有技术亟需一种操作简单、成本低、准确率高、效率高且耗时短的检测具有分泌功能信号肽的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种成本低、准确率高、成本低、耗时短的鉴定信号肽是否具有分泌功能的方法。本发明利用Avr3a和R3a在植物细胞内识别引起细胞死亡的特点，在本氏烟中表达R3a以及融合检测信号肽的Avr3a，观察其是否可以引起坏死，可以快速高效的检测信号肽是否具有分泌功能。

本发明提供了一种利用抗病基因识别无毒效应蛋白以鉴定具有分泌功能信号肽的方法，所述抗病基因能够在细胞内识别无毒效应蛋白，包括以下步骤：

(1)将待鉴定信号肽连接无毒效应蛋白C端构建表达载体；

(2)将步骤(1)构建的表达载体转化感受态细胞；

(3)将步骤(2)的感受态细胞和含有抗病基因的感受态细胞共同注射入植物细胞中，观察注射位点坏死情况，若注射位点坏死，则待检测信号肽不具有分泌功能，若注射位点无坏死，则待检测信号肽具有分泌功能。

所述抗病基因为R3a，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述无毒效应蛋白为致病疫霉无毒效应蛋白Avr3a，其C端核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

步骤(1)所述表达载体为植物瞬时表达载体。

步骤(2)所述感受态细胞为农杆菌感受态。

步骤(3)所述植物为烟草、马铃薯、番茄、辣椒。

本发明提供的利用抗病基因识别无毒效应蛋白以鉴定具有分泌功能信号肽的方法还包括设立阳性对照，所述阳性对照是在步骤(1)阶段，将大豆疫霉无毒效应蛋白Avr1b的信号肽连接无毒效应蛋白C端构建表达载体得到。

优选地，阳性对照为将氨基酸序列如SEQ ID NO.4所述的Avr1b的信号肽连接氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示致病疫霉无毒效应蛋白Avr3a的C端构建植物瞬时表达载体得到。

本发明提供了上述方法在筛选具有分泌功能信号肽中的应用。

进一步地，通过本发明的方法可以筛选得到具有分泌功能的信号肽，本领域技术人员可以利用这些信号肽应用于异源基因表达。

基于此，本发明提供了上述方法在制备转基因植物中的应用。

本发明的有益效果在于，本发明克服现有技术鉴定分泌蛋白信号肽工作量大、费用高、周期长等缺陷，基于抗病基因和无毒效应蛋白在细胞内识别并引起细胞坏死的特点，通过在植物细胞瞬时表达的方法，可以方便、快捷的对待鉴定信号肽功能进行鉴定，操作鉴定、耗时短、成本低、结果准确可靠，能够很好的满足信号肽功能鉴定的要求，在植物基因工程技术领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为通过R3a和Avr3a识别验证信号肽分泌功能图。Avr1b、SsSSVP1、GME5899和AvrPiz-t的信号肽融合Avr3a的C端和R3a在烟草上进行农杆菌共表达，4-6天后观察注射位点是否坏死，“+”表示Avr3a的C端和R3a共注射烟草为阳性对照，“-”表示Avr3a的C端单独注射为阴性对照。灰色表示Avr1b、SsSSVP1、GME5899或AvrPiz-t的信号肽，黑色表示为Avr3a的C端区域。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

(1)将大豆疫霉无毒效应蛋白Avr1b的信号肽序列(氨基酸序列如SEQ ID NO.4)和核盘菌的分泌蛋白SsSSVP1的信号肽序列(氨基酸序列如SEQ ID NO.5)分别连接Avr3a的C端序列(核苷酸序列SEQ ID NO.2，氨基酸序列SEQ ID NO.3)，构建植物瞬时表达载体，获得可以在植物上表达Avr1bSP-Avr3a-C和SsSSVP1SP-Avr3a-C的载体。

具体过程如下：根据片段序列设计特异性引物，SP1bF(SEQ ID NO.8)和LapSP1b-3aR(SEQ ID NO.9)扩增Avr1b的信号肽区域，获得扩增产物A，LapSP1b-3aF(SEQ ID NO.10)和Avr3aR(SEQ ID NO.11)扩增Avr3a的C端区域，获得扩增产物B；SPSsSSVP1-F(SEQ IDNO.12)和LapSP-SsSSVP1-3aR(SEQ ID NO.13)扩增Avr1b的信号肽区域,获得扩增产物C，LapSP-SsSSVP1-3aF(SEQ ID NO.14)和Avr3aR扩增Avr3a的C端区域，获得扩增产物D。按照如下反应进行PCR扩增：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。扩增完成后，在1％的琼脂糖凝胶上电泳，获得长度为目的大小的DNA扩增条带；使用凝胶回收试剂盒进行回收、纯化。由于分别要将Avr1b和SsSSVP1的信号肽区域与Avr3a的C端进行融合，因此以SP1bF和Avr3aR引物，以扩增产物A和B的片段混合物为模板，进行PCR扩增，获得Avr1b信号肽和Avr3a的C端融合片段Avr1bSP-Avr3a-C；以SsSSVP1和Avr3aR引物，以扩增产物C和D的片段混合物为模板，进行PCR扩增，获得SsSSVP信号肽和Avr3a的C端融合片段SsSSVP1SP-Avr3a-C。使用凝胶回收试剂盒进行回收、纯化。将载体通过ClaI和SmaI酶进行双酶切，酶切产物用凝胶回收试剂盒进行回收。通过一步连接试剂盒(货号：C112-01，Vazyme Biotech Co.,Ltd)将基因片段和载体连接，转化大肠杆菌JM109，挑取阳性克隆，经PCR和测序验证。

(2)通过电击转化农杆菌的方法获得含有目的载体的农杆菌。农杆菌转化在电转化仪上进行，将电击杯及杯架置于冰上。设置电转化仪参数，电容C＝25μF，电压V＝2.5kV(电击杯为0.2cm)。电转完成后，加入1mlLB培养液至电击杯中，重新悬浮细胞并转移EP管中，30℃振荡培养1-2h。离心收集细胞，弃上清，保留50-100μl液体，轻轻混匀涂布于含有卡那霉素的LB平板上，30℃培养，待长出单菌落后，挑取单菌落进行阳性菌落验证。

(3)分别将含有Avr1bSP-Avr3a-C和SsSSVP1SP-Avr3a-C表达载体的农杆菌和含有R3a的农杆菌在本氏烟草中共注射，4-6天后观察注射位点是否坏死。具体操作如下：挑取含有目的基因质粒的农杆菌于含有卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，30℃振荡培养24h，3000rpm，3min离心收集菌体，用MgCl₂(10m M)溶液重悬，重复3次后，再次悬浮。定容OD600＝0.3注射烟草。选取温室中生长4到6周的本氏烟，选择合适烟草叶片用于注射接种农杆菌。注射器针头在烟草下表皮造成微小创伤，用无针头的注射器将农杆菌悬液渗透到本氏烟叶片中。注射时分别将含有Avr1bSP-Avr3a-C和SsSSVP1SP-Avr3a-C的农杆菌和含有R3a的农杆菌混合之后，在烟草上进行注射，同时以含有Avr3a的C端农杆菌和含有R3a的农杆菌共同注射作为阳性对照，4-6天后观察注射位点是否坏死。细胞死亡说明蛋白不能分泌到细胞外，细胞没有死亡说明蛋白分泌到细胞外，信号肽具有分泌功能，见图1。

实施例2

为了验证方法的可靠性，选择稻曲病菌中预测的分泌蛋白GME5899和稻瘟病菌中的无毒效应蛋白AvrPiz-t信号肽的分泌功能进行进行检测。通过实施例1中(1)的方法将GME5899(氨基酸序列如SEQ ID NO.6)和AvrPiz-t(氨基酸序列如SEQ ID NO.7)信号肽区域和Avr3a的C端区域融合，构建植物瞬时表达载体，通过电击转化农杆菌，将目的基因表达载体的农杆菌在烟草中共注射，4-6天后观察注射位点是否坏死。发生坏死说明蛋白不能够分泌到细胞外，信号肽没有分泌功能；没有坏死则说明蛋白能够分泌到细胞外，信号肽具有分泌功能，见图1。结果表明GME5899SP-Avr3a-C和AvrPiz-tSP-Avr3a-C均不能够引起植物细胞坏死，说明GME5899和AvrPiz-t的信号肽具有分泌功能。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 利用抗病基因识别无毒效应蛋白以鉴定具有分泌功能信号肽的方法

<130> KHP171118726.4

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3849

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggagattg gcttagcagt tggtggtgca tttctctctt cagctttgaa tgttctcttt 60

gataggcttg ctcctcacgg tgatctgctc aacatgtttc agaagcataa ggatcatgtt 120

aagctcttaa agaagctgga ggacattttg ctcggtcttc agattgtgct aagtgatgca 180

gagaataaac aagcatcaaa tcgacatgtg agccagtggt tcaataagct tcagaatgct 240

gtggacggtg ctgagaactt gatagaacaa gtcaattatg aagctttgag gcttaaggtg 300

gaaggccagc atcaaaatct tgcagaaaca agcaaccagc aagtaagtga ccttaacctg 360

tgcttcagtg atgatttctt tcttaacata aaggataagt tggaagaaac cattgaaaca 420

ttggaggtgt tggaaaagca aattggtcgc cttggcttaa aggaacattt tggttcgact 480

aaacaagaaa ctagaacacc ttcaacttct ttagttgatg actctgatat ctttggaagg 540

cagaatgata tagaggattt gattgaccgt ttattatctg aagatgcaag tggaaaaaag 600

cggactgtag ttcctattgt tggaatgggt ggtctgggta agacaacact tgctaaagcg 660

gtttacaatg atgagagagt gcagatacat tttggtttga aagcttggtt ttgtgtttct 720

gaggcatttg atgctttcag aataacaaaa gggttacttc aagaaattgg ctcatttgac 780

ttgaaggctg atgacaatct taatcagcta caagtcaaat tgaaggaaag attaaaggga 840

aagaagtttc ttatagtttt ggatgatgtg tggaatgaca actacaacaa gtgggatgaa 900

ttgagaaatg tttttgtaca aggagatata ggaagtaaga tcattgtgac gacacgtaaa 960

gagagtgttg ccttgatgat gggaaatgag caaattagca tggacaattt gtctactgaa 1020

tcctcttggt ctttatttaa aacacatgca tttgaaaaca tgggtcctat gggacatccg 1080

gaacttgaag aggtcgggaa acaaattgca gctaagtgca aaggactgcc cttagctctg 1140

aagacgctcg ctggcatgtt acgctccaaa tcagaggttg aagagtggaa acgtattttg 1200

agaagtgaaa tatgggagct gccacacaat gacatattac cagcgttgat gttgagctac 1260

aatgatcttc ccgcacattt aaagcgatgt ttttcctttt gtgcaatatt tcctaaagat 1320

tatcccttta ggaaagaaca agttattcat ctgtggattg ccaatggtct cgtaccacag 1380

gaagatgtaa taattgaaga ttcaggcaac caatactttc tcgagttgag gtcaagatca 1440

ttattcgaaa gggtcccaaa tccttctcaa gggaacacag agaatttatt cttaatgcat 1500

gaccttgtca atgatttagc gcaaattgca tcttcaaaac tttgtatcag gttggaagag 1560

agccaaggat ctcatatgtt ggaacaaagt caacacttat catattcaat gggatatggt 1620

ggtgagtttg agaaattgac acccctctac aaattggagc agctgaggac attgcttccg 1680

acatgtattg atctccctga ttgttgtcac catctaagca agagggtgct acataacata 1740

ctgccaagac taacatcctt aagggcatta tcgttgtcat gctatgagat tgttgagttg 1800

ccaaatgact tgtttatcaa attaaagctc ctcagatttt tggatatttc tcggacagag 1860

attaaaaggt tgccagattc catttgtgca ttgtataact tagagacact tctcctgtca 1920

tcttgttatg atcttgagga gctaccgctg cagatggaga agctgattaa cttgcgtcat 1980

cttgacataa gcaacactcg tctcttgaag atgccgctac atctgagcaa gttgaaaagc 2040

ctccaagtgt tagtgggagc caaatttctt ataggtggtt tgagaatgga agatttgggt 2100

gaagtacata acttgtacgg atctctatca gttgtagagt tgcaaaatgt ggttgataga 2160

agggaagctg tgaaggcaaa gatgagggag aagaatcacg tcgacaggtt atatttggag 2220

tggagtggaa gtagtagtgc cgacaattca caaacagaaa gagacatact tgatgagcta 2280

cgcccccata aaaacataaa agtagtcaaa atcactggat atagagggac aaactttccc 2340

aattggctag ctgatccttt gtttcttaag ctggtaaaat tgtctcttag aaactgcaag 2400

aactgttatt cattgccagc actaggacaa ctcccttttc tgaaattcct ttcgattaga 2460

gagatgcatg gaataacaga ggtgacggaa gaattctatg gcagttggtc ctccaaaaag 2520

ccttttaact gtcttgagaa gcttgaattt aaagatatgc cggagtggaa gcaatgggac 2580

ctactaggaa gtggagagtt ccctatactt gagaagcttt tgattgaaaa ttgccctgaa 2640

ctcagtttgg agacggtacc catccaactt tcaagtttaa aaagttttga cgtaattggt 2700

tctcccttgg ttataaactt tcctttaagc atactgccca ctaccttgaa gagaataaag 2760

atatctgatt gccagaaatt gaaattggaa cagccaactg gtgagattag tatgtttctg 2820

gaggaattga cactgattaa atgtgattgt atagatgata tatcacctga gttactccca 2880

agagcacgca aattgtgggt acaggattgg cacaacctta ctaggttttt gattcctact 2940

gccactgaaa ctctcgatat ttggaattgt gagaatgttg aaatactttc ggtggcatgt 3000

ggggggaccc agatgacgtc actgactatt gcctactgta agaagctgaa gtggctgcca 3060

gaacgtatgc aggaactcct tccatctctt aaggaactgc atctgtctaa ttgtccagaa 3120

atagagtcct ttcctgaagg tggattgccc ttcaatttac aacaacttgc gatcagatat 3180

tgcaagaaac tggtgaacgg ccgaaaggag tggcatttac agagacgact ctgtctcaca 3240

gcgttaatca tctaccatga tggcagtgac gaagagattg ttggtggtga gaattgggag 3300

ttgccttcct ctattcaaag gcttaccata gtgaatctga aaacattaag cagccaacat 3360

ctcaaaaacc tcacctctct tcaatatcta tttattaggg gtaatttacc tcagattcag 3420

ccaatgctgg aacaaggcca gtgttcgcac ctcacttcgc ttcaaagtct acaaatctcc 3480

tccctccaat cacttcctga atcggcactg ccctcctccc tctctcacct ggagatctcc 3540

cattgcccta atctccaatc acttcctgaa tcggcactgc cctcctccct ctctcagctg 3600

accatcaata attgccctaa tctccaatca ctttccgaat caacactgcc ctcctccctc 3660

tctcagctgg agatctcctt ttgccctaat ctccaatatc ttccactaaa agggatgccc 3720

tcttccctct ctgaactatc tatttacaaa tgcccattgc tcaaaccaca actagaattt 3780

gacaaggggg aatactggcc aaatattgct caatttccca ccataaagat cgatagggaa 3840

tgcatgtga 3849

<210> 2

<211> 264

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccccaaatt tcaatttggc gaatctaaat gaggagatgt ttaatgtggc tgcgttgacg 60

aagagagcag atgccaaaaa gctagcgaaa cagcttatgg gtaatgataa gctggcggat 120

gctgcataca tttggtggca gcacaacagg gttacgctag accagattga cacgttcctg 180

aagcttgcaa gccgcaagac gcaaggcgca aagtacaatc agatctacaa tagccacatg 240

atgcacctgg ggctcactgg atat 264

<210> 3

<211> 88

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Pro Asn Phe Asn Leu Ala Asn Leu Asn Glu Glu Met Phe Asn Val

1 5 10 15

Ala Ala Leu Thr Lys Arg Ala Asp Ala Lys Lys Leu Ala Lys Gln Leu

20 25 30

Met Gly Asn Asp Lys Leu Ala Asp Ala Ala Tyr Ile Trp Trp Gln His

35 40 45

Asn Arg Val Thr Leu Asp Gln Ile Asp Thr Phe Leu Lys Leu Ala Ser

50 55 60

Arg Lys Thr Gln Gly Ala Lys Tyr Asn Gln Ile Tyr Asn Ser His Met

65 70 75 80

Met His Leu Gly Leu Thr Gly Tyr

85

<210> 4

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Arg Leu Ser Phe Val Leu Ser Leu Val Val Ala Ile Gly Tyr Val

1 5 10 15

Val Thr Cys Asn Ala

20

<210> 5

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Lys Val Val Leu Phe Ile Ser Ala Leu Ala Ala Thr Leu Ser Ala

1 5 10 15

Ala Ala Pro Leu Glu Pro

20

<210> 6

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Lys Thr Ser Val Val Ala Leu Ala Ala Leu Leu Gly Leu Ala Ser

1 5 10 15

Ala Gln Asn Ala Val Val Ile Asn Ser

20 25

<210> 7

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Gln Phe Ser Thr Ile Ile Thr Val Cys Leu Phe Thr Gly Leu Ala

1 5 10 15

Ser Ala Ser Phe Val Gln Cys Asn His

20 25

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagcaccagc tagcatcgat atgcgtctat cttttgtg 38

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccaaattgaa atttggggct gcgttgcagg tcacgac 37

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtcgtgacct gcaacgcagc cccaaatttc aatttgg 37

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agtccatgga tcccccggga tatccagtga gccccagg 38

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cagcaccagc tagcatcgat atgaaggtcg ttctgtttat c 41

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ccaaattgaa atttggggct ggctctagtg gggcagctgc 40

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcagctgccc cactagagcc agccccaaat ttcaatttgg 40

Claims

1.一种利用抗病基因识别无毒效应蛋白以鉴定具有分泌功能的信号肽的方法，其特征在于，所述抗病基因能够在细胞内识别无毒效应蛋白，包括以下步骤：

（1）将待鉴定信号肽连接无毒效应蛋白C端构建表达载体；

（2）将步骤（1）构建的表达载体转化感受态细胞；

（3）将步骤（2）的感受态细胞和含有抗病基因的感受态细胞共同注射入植物细胞中，观察注射位点坏死情况，若注射位点坏死，则待检测信号肽不具有分泌功能，若注射位点无坏死，则待检测信号肽具有分泌功能；

所述抗病基因为R3a，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述无毒效应蛋白为致病疫霉无毒效应蛋白Avr3a，其C端核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述表达载体为植物瞬时表达载体。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述感受态细胞为农杆菌感受态。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述植物为烟草、马铃薯、番茄或辣椒。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括设立阳性对照，所述阳性对照是在步骤（1）阶段，将大豆疫霉无毒效应蛋白Avr1b的信号肽连接无毒效应蛋白C端构建表达载体得到，所述Avr1b的信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，阳性对照为将氨基酸序列如SEQ ID NO.4所述的Avr1b的信号肽连接氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的致病疫霉无毒效应蛋白Avr3a C端构建植物瞬时表达载体得到。

7.权利要求1-6任一所述的方法在筛选具有分泌功能的信号肽中的应用。

8.权利要求1-6任一所述的方法在制备转基因植物中的应用。