JP2012105675A - 難発現性タンパク質の分泌のためのタンパク質融合因子(tfp)を明らかにする方法、タンパク質融合因子(tfp)ライブラリーを製造する方法、及び難発現性タンパク質の組み換え的生産方法 - Google Patents
難発現性タンパク質の分泌のためのタンパク質融合因子(tfp)を明らかにする方法、タンパク質融合因子(tfp)ライブラリーを製造する方法、及び難発現性タンパク質の組み換え的生産方法 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】本発明の方法は、難発現性の目的タンパク質遺伝子(X)を自動選別用レポーター遺伝子(R)に結合してX−Rの難発現性融合タンパク質を製造し、X−Rの融合物に別の遺伝子の融合によってX−R難発現性融合タンパク質の分泌を細胞外に誘導するタンパク質融合因子(translational fusion partner、TFP)を遺伝子ライブラリーから選別する方法である。
【選択図】なし
Description
(1)難発現性目的タンパク質の遺伝子(X)とフレーム単位(in−frame)で連結された自動選別用レポーター遺伝子(R)の融合遺伝子(X−R)を含む自動選別ベクターを製造する段階と、
(2)難発現性融合タンパク質(X−R)の分泌を誘導するタンパク質融合因子を含んだ遺伝子ライブラリーを自動選別ベクターと連結してタンパク質融合因子ライブラリーを製造する段階と、
(3)タンパク質融合因子ライブラリーでレポーター遺伝子の活性がない細胞を形質転換させてレポータータンパク質の活性を検出する段階と、
(4)レポータータンパク質の活性を示す形質転換細胞から遺伝子を分離してタンパク質融合因子の特性を分析する段階とを含んで、難発現性タンパク質生産用適合型タンパク質融合因子を選別する方法に関する。
(1)酵母インベルターゼを用いた自動選別システムの開発のためのレポーター遺伝子として使用するために、酵母自体が有するインベルターゼ遺伝子INV2(I)を欠失させた酵母変異株を製造する段階と、
(2)酵母GAL10プロモータによって発現が調節され、インベルターゼ(I)遺伝子と難発現性遺伝子(X)がフレーム単位で融合された遺伝子(X−I)を含有する自動選別ベクターとしての酵母HTS(high throughput selection)ベクター(pYHTS−F0、pYHTS−F1及びpYHTS−F2)を製造する段階と、
(3)インベルターゼと難発現性タンパク質の融合遺伝子(X−I)を分泌させることが可能な酵母遺伝子からのタンパク質融合因子ライブラリーをpYHTSベクターに製造する段階と、
(4)製造されたライブラリーを段階(1)で製造された酵母に形質転換し、スクロースを単一炭素源として含んでいる培地で自動選別する段階と、
(5)スクロース培地で成長した酵母を培養し、培地に分泌されたタンパク質を確認する段階と、
(6)酵母から遺伝子を分離してタンパク質融合因子特性を分析する段階とを含む、難発現性タンパク質生産用適合型TFPを超高速で選別する方法に関する。
難発現性タンパク質に対するタンパク質融合因子を超高速で選別するために、酵母インベルターゼをレポーターとして用いて、スクロース培地における細胞成長の評価を利用した自動選別システムを製造した。
インベルターゼ遺伝子が欠失された菌株でインベルターゼと融合されたタンパク質の発現によってスクロース培地における自動選別を確認するために、酵母でよく発現されるヒトタンパク質である血清アルブミン(HSA)と難発現タンパク質であるヒトインターロイキン−2(IL−2)を利用した。
インターロイキン−2とインベルターゼとが融合されたベクターpGIL2−INV2を用いて融合タンパク質の分泌を誘導することが可能な適正のタンパク質融合因子を確保するために、3つのリーディングフレームを有するライブラリー製造ベクターpYHTS−F0、F1及びF2を製造した(図6)。
タンパク質融合因子ライブラリーを製造するために、酵母サッカロマイセス・セレヴィシェY2805(SK Rhee, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)及びハンゼヌラポリモルファDL−1(ATCC26012)由来の染色体DNAを用いた。それぞれの染色体を制限酵素Sau3AIで部分切断した後、アガロースゲルから0.5〜1.0kbサイズのDNAを回収し、その後BamHIで切断し、子牛腸由来のホスファターゼで処理したpYHTS−F0、F1及びF2混合ベクターに連結した(図6)。連結されたDNAを大腸菌DH5αに形質転換し、アンピシリン含有LB培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵素抽出物、1%NaCl)に塗抹した後、37℃で一日中培養した。それぞれの染色体から製造されたライブラリーDNAを用いて約5×104細胞の形質転換体ライブラリーを確保した。全ての形質転換体を滅菌蒸留水を用いて回収し、回収された菌体からライブラリーDNAをプラスミド抽出キット(Bioneer社製、韓国)を用いて分離した。
前述した方法で製造されたライブラリーDNAを酵母サッカロマイセス・セレヴィシェY2805Δgal1Δinv2(Mat a ura3 inv2::Tc190 pep4::HIS3 gal1 can1)に酢酸リチウム方法(Hills et al., Nucleic Acids Res. 1991, 19, 5791)で形質転換した後、ウラシルが欠乏されたUD最小培地(0.67%アミノ酸が欠乏された酵母窒素基質、適正濃度の各種アミノ酸混合体、2%グルコース)、及びスクロースとアンチマイシンAを含む複合培地YPGSA(1%酵母抽出物、2%ペプトン、2%スクロース、0.3%ガラクトース、1μg/mLアンチマイシンA)にそれぞれ塗抹して30℃で5日間培養した。培養後、各培地で形成された菌体の数は、表1(タンパク質融合因子導入前後の形質転換体数の比較)に表示したとおりである。ライブラリーの製作のために使用したベクター(pYHTS−F0、F1及びF2)のみを形質転換した場合には、グルコース培地では約1×104程度の菌体が形成されたが、炭素源としてスクロースを使用した培地では予想したように全く成長しなかった。ところが、酵母遺伝体ライブラリーを挿入した場合には、約11個の形質転換体が成長して、挿入されたタンパク質融合因子の助けによりインベルターゼが分泌されたことを予想することができた。
スクロース培地で成長した各菌体をYPD(1%酵母抽出物、2%ペプトン、2%グルコース)培地で24時間培養した後、回収された細胞を破砕し、その後導入されたプラスミドを分離し、大腸菌に再形質転換した。形質転換された大腸菌からプラスミドを分離した後、制限酵素処理して挿入された遺伝子の有無を確認し、塩基配列分析によって4種の相異なる配列を有する遺伝子が挿入されてタンパク質融合因子の役割をすることが分かった(表2:スクロース培地で成長した菌体から分離されたプラスミドに挿入された新規のタンパク質融合因子)。
本発明者らは、インターロイキン−2とインベルターゼとの融合タンパク質を効率よく細胞外に分泌させることが可能なタンパク質融合因子1(TFP1)(配列番号2)を選別した。TFP1遺伝子は、酵母サッカロマイセス・セレヴィシェ遺伝子Yar066wの部分配列と同一である。Yar066w遺伝子は、α1,4−グルカングルコシダーゼ(STA1)遺伝子と類似であり、これによりコードされるタンパク質はグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)−アンカー(glycosyl−phosphatidylinositol (GPI) anchor)を含有したタンパク質である。Yar066w遺伝子は、未だ機能が知られていない遺伝子であり、酵母サッカロマイセス・セレヴィシェの機能が知られていない遺伝子であるYol155c、Yil169cとそれぞれ70.3%、72.7%の配列類似性を示す。Yar066w遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のうち、インターロイキンと融合されたアミノ酸の数は、全体203個中の105個であり、タンパク質分泌のためのシグナルとして23個のアミノ酸の分泌シグナルを含有しており、N−グルコシル化部位とセリン、アラニンリッチ(serine−rich)配列を含有している。
本発明者らは、インターロイキン−2とインベルターゼとの融合タンパク質を効率よく細胞外に分泌させることが可能なタンパク質融合因子2(TFP2)(配列番号4)を選別した。TFP2遺伝子は、酵母サッカロマイセス・セレヴィシェ遺伝子Yar026cの部分配列と同一である。Yar026c遺伝子は、未だ機能が知られていない遺伝子である。Yar026c遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のうち、インターロイキン−2と融合されたアミノ酸の数は、全体169個中の117個であり、タンパク質分泌のためシグナルとして19個のアミノ酸の分泌シグナルを含有しており、3個のN−グルコシル化部位を含有している。
本発明者らは、インターロイキン−2とインベルターゼとの融合タンパク質を効率よく細胞外に分泌させることが可能なタンパク質融合因子3(TFP3)(配列番号6)を選別した。TFP3遺伝子は、酵母サッカロマイセス・セレヴィシェ遺伝子Yjl158c(PIR4/CIS3)の部分配列と同一である。Yjl158c遺伝子によってコードされるタンパク質は、細胞壁に共有結合されたO−マンノシル化されたタンパク質である。Yjl158c遺伝子は、細胞分裂に関与するCik1欠如変異株に対するマルチコピーサプレッサ(multicopy suppressor)として知られている遺伝子である。Yjl158c遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のうち、インターロイキン−2と融合されたアミノ酸の数は、全体227個中の104個であり、タンパク質分泌のためのシグナルとして23個のアミノ酸のプレ(pre)分泌シグナルと41個のプロ(pro)分泌シグナルを含有しており、Lys−ArgからなるKex2p切断配列を含有しており、PIR繰り返し配列を持っている。
本発明者らは、インターロイキン−2とインベルターゼとの融合タンパク質を効率よく細胞外に分泌させることが可能なタンパク質融合因子4(TFP4)(配列番号8)を選別した。TFP4は、酵母ハンゼヌラポリモルファ由来の遺伝子であり、機能は知られていないが、インターロイキン−2と融合されたアミノ酸の数は50個であり、この中の18個のアミノ酸からなるタンパク質分泌シグナルを含んでいる。
スクロース培地で成長した菌体が分泌するタンパク質を分析するために、前述した4つのタンパク質融合因子を含有する菌体をYPDG培地(1%酵母抽出物、2%ペプトン、2%グルコース、0.3%ガラクトース)で40時間培養した後、細胞を除去し、残った培養上澄液に溶解されている全体タンパク質をアセトン(最終濃度40%)に沈澱させた後、SDS−PAGEを行ったが、インベルターゼが融合された状態では、インベルターゼ部分の過多なグルコシル化により単一タンパク質バンドを確認し難いという問題があったため、各ベクター(pYHTS−TFP1、2、3及び4)からインベルターゼを除去し、インターロイキン−2遺伝子に翻訳終結コドンを挿入した。このために、プライマーJH132(SacI−GAL−forward primer)(配列番号23)及びJH137(IL2−Term−reverse primer)(配列番号24)を用いてそれぞれのベクターからGALプロモータ、各TFP及び翻訳終結コドンを含有したインターロイキン−2遺伝子を含む切片を得るために、各ベクター(pYHTS−TFP1、2、3及び4)を重合酵素連鎖反応した後、回収された遺伝子切片をSacI/SalIで処理し、SacI/SalIで処理されたYEGα−HIR525ベクターに挿入してpYIL−TFP1、2、3及び4を製造した。製造された4種のIL−2発現ベクターを酵母に形質転換した後、単一コロニーを確保し、前述したような方法で培養し、培養上澄液に分泌されたタンパク質をSDS−PAGEして分析した(図7)。図7の結果から分かるように、pYIL−TFP2を除いたそれぞれのベクターを含有した菌体の培養上澄液から、タンパク質のサイズが相異なる強いバンドが観察された。これらは、IL−2抗体を用いたウェスタンブロット法(図7)でバンドと確認され、それぞれの分泌誘導融合タンパク質とIL−2とが融合された状態であることを確認することができた。ところが、SDS−PAGE上で現れた実際サイズは、それぞれのタンパク質融合因子及びIL−2遺伝子のサイズから類推されるタンパク質のサイズとは相当な差異を示した。これはグルコシル化による差異であると推定されるので、N−グルコシル化によってタンパク質に付加された糖を除去するために、各タンパク質にEndo−H酵素を処理した後、さらにSDS−PAGE分析した(図8)。タンパク質配列上、TFP1には1つのN−グルコシル化誘発配列(28〜30番目のアミノ酸)があり、TFP3はO−グルコシル化誘導配列を含有しており、TFP4にはグルコシル化誘導配列がなかった。予想したように、pYIL−TFP1の場合には、Endo−H処理の後、分子量が相当減少することが分かった。したがって、pYIL−TFP1の場合には、発現されたタンパク質がN−グルコシル化されていることを確認することができたが、pYIL−TFP3の場合にはO−グルコシル化によるグルコシル化なので、Endo−H処理を施しても分子量の変化がなく、pYIL−TFP4の場合にも、何の変化がなかった。
本発明者らは、実施例7で使用したベクターが各タンパク質融合因子とIL−2とが融合された状態で培地に分泌されるので、ヒトインターロイキン−2と同一な状態のオーセンティックなタンパク質を生産するために、細胞内でタンパク質融合因子を自動的に除去することができるよう、融合因子とIL−2との間に、酵母が自体的に生産する蛋白分解酵素Kex2pが認識し得る切断部位(Leu−Asp−Lys−Arg)をそれぞれ挿入した。pYIL−TFP1にKex2p切断配列を組み込むために、pYIL−TFP1を鋳型とし、プライマーJH132(配列番号23)及びHY22(TFP1−LDKR−reverse primer)(配列番号25)、HY23(TFP1−LDKR−forward primer)(配列番号26)及びJH137(配列番号24)を用いてそれぞれ重合酵素連鎖反応し、電気泳動の後、ゲルから回収されたGALプロモータ及びTFP1を含有する切片とインターロイキン−2遺伝子を含有する切片とを鋳型とし、JH132(配列番号23)及びJH137(配列番号24)を用いて2次重合酵素連鎖反応した。得られたGALプロモータ−TFP1−IL2切片を制限酵素SacI/SalIで処理し、SacI/SalIで処理されたYEGα−HIR525ベクターに挿入してpYIL−KRTFP1を製造した。また、pYIL−TFP2にKex2p切断配列を組み込むために、pYIL−TFP2を鋳型とし、前述の方法と同様の方法でプライマーJH132(配列番号23)及びHY20(TFP2−LDKR−reverse primer)(配列番号27)、HY21(TFP2−LDKR−forward primer)(配列番号28)及びJH137(配列番号24)を用いてそれぞれ重合酵素連鎖反応し、回収された2つの遺伝子切片を鋳型とし、JH132(配列番号23)及びJH137(配列番号24)を用いて2次重合酵素連鎖反応した後、得られた切片を制限酵素SacI/SalIで処理し、SacI/SalIで処理されたYEGα−HIR525ベクターに挿入してpYIL−KRTFP2を製造した。また、pYIL−TFP3にKex2p切断配列を組み込むために、pYIL−TFP3を鋳型とし、前述の方法と同様の方法でプライマーJH132(配列番号23)及びHY17(TFP3−LDKR−reverse primer)(配列番号38)、HY18(TFP3−LDKR−Forward primer)(配列番号39)及びJH137(配列番号24)を用いてそれぞれ重合酵素連鎖反応し、回収された2つの遺伝子切片を鋳型とし、JH132(配列番号23)及びJH137(配列番号24)を用いて2次重合酵素連鎖反応した後、得られた切片を制限酵素SacI/SalIで処理し、SacI/SalIで処理されたYEGα−HIR525ベクターに挿入してpYIL−KRTFP3を製造した。また、pYIL−TFP4にKex2p切断配列を組み込むために、pYIL−TFP4を鋳型とし、前述の方法と同様の方法でプライマーJH132(配列番号23)及びHY24(TFP4−LDKR−reverse primer)(配列番号29)、HY25(TFP4−LDKR−Forward primer)(配列番号30)及びJH137(配列番号24)を用いてそれぞれ重合酵素連鎖反応し、回収された2つの遺伝子切片を鋳型とし、JH132(配列番号23)及びJH137(配列番号24)を用いて2次重合酵素連鎖反応した後、得られた切片を制限酵素SacI/SalIで処理し、SacI/SalIで処理されたYEGα−HIR525ベクターに挿入してpYIL−KRTFP4を製造した。
IL−2を最も効率よく分泌生産するタンパク質融合因子としてTFP1を選別し、TFP1配列に存在する分泌シグナル(a)、N−グルコシル化部位(b)、及びセリン、アラニンリッチ配列(c)、追加配列(d)及び5’−UTR(5’−非翻訳配列)配列(e)の中のどの配列が、難分泌タンパク質であるインターロイキン−2の分泌に絶対的な影響を与えるかを確認するために、図10に示すように、TFP1の各特徴配列を一つずつ除去した欠如遺伝子を製造した。まず、TFP1から配列上別に特徴がない追加配列dを除去するために、pYIL−KRTFP1を鋳型とし、プライマーJH143(XbaI−TFP1−d−reverse primer)(配列番号31)及びJH132(配列番号23)を用いて重合酵素連鎖反応した。得られたDNA切片は、GALプロモータとTFP1から配列dが除去された切片TFP1−1を含んでいる。TFP1から追加配列(d)及びセリン、アラニンリッチ配列(c)を除去するために、pYIL−KRTFP1を鋳型とし、プライマーJH142(XbaI−TFP1−c−reverse primer)(配列番号32)及びJH132(配列番号23)を用いて重合酵素連鎖反応し、得られた切片はGALプロモータと配列c及びdが除去された切片TFP1−2を含んでいる。また、TFP1からd、c及びN−グルコシル化部位(b)を除去するために、pYIL−KRTFP1を鋳型とし、プライマーJH141(XbaI−TFP1−b−reverse primer)(配列番号33)及びJH132(配列番号23)を用いて重合酵素連鎖反応し、得られた切片にはGALプロモータ及び配列c、d及びbが除去された切片をTFP1−3を含んでいる。Kex2p切断部位を含むIL−2遺伝子を製造するために、pYIL−KRTFP1を鋳型とし、プライマーJH140(SpeI−XbaI−LDKR−forward primer)(配列番号34)及びJH137(配列番号24)を用いて重合酵素連鎖反応した。回収されたIL−2切片を制限酵素SpeI及びSalIで処理した切片と、以前に得られた3つの切片(TFP1−1、2及び3)をそれぞれ制限酵素SacI及びXbaIで処理し、SacI及びSalIで処理されたYEGα−HIR525にそれぞれ挿入して、図10に示すように、pYIL−KRT1−1、pYIL−KRT1−2、及びpYIL−KRT1−3を製造した。TFP1の5’−UTRを除去するために、pYIL−KRTFP1を鋳型とし、プライマーHY38(TFP1−UTR−forward primer)(配列番号35)及びJH137(配列番号24)を用いて重合酵素連鎖反応し、回収された遺伝子をBamHI/SalIで処理した後、SacI/BamHIで処理されたGAL10プロモータと共に、SacI/SacIで処理されたYEGα−HIR525に挿入してpYIL−KRT1−4を製造した(図10)。
前記ベクターpYIL−KRT1−4を形質転換した組み換え酵母菌株を5Lのジャーファーメンター(jar fermentor)で流加発酵培養によってインターロイキン−2の分泌生産性を調査した。ファーメンターに接種するためのシード培養は、フラスコでシード培地(酵母窒素ベース(アミノ酸不在)6.7%、カザミノ酸0.5%及びブドウ糖2%)を用いて培養し、初期発酵培地としては、発酵培養培地(酵母抽出物4%、ペプトン1%、ブドウ糖2%)を用いて約15OD600まで培養した後、流加培地(酵母抽出物15%、ブドウ糖30%、ガラクトース30%)を細胞の成長速度に応じて異なる供給量で供給して培養した。約64時間培養の後、細胞は約200OD600まで成長し、各時間別に培地試料5μLを取って分泌タンパク質をSDS−PAGE分析した(図12)。結果的に約500mg/Lのインターロイキン−2が培地に分泌生産されたことを標準試料の量と比較して確認した。酵母発酵によって分泌生産されたインターロイキン−2は、アミノ酸末端の分析によってAla−Pro−Thr−Ser−Ser−Serから構成されたことを確認し、ヒトから分泌されるインターロイキン−2と同一であることを確認した。
難分泌タンパク質であるヒトインターロイキン−2を用いて確保された4種のタンパク質融合因子(TFP1、2、3及び4)が別の難分泌ヒトタンパク質の分泌にも効果があるか否かを確認するために、難分泌タンパク質であるヒトコロニー刺激因子(G−CSF)を4種のTFPに融合して酵母における発現及び分泌を確認した。ヒトコロニー刺激因子遺伝子は、ヒトcDNAライブラリーからプライマーJH144(GCSF−forward primer)(配列番号36)及びJH145(GCSF−reverse primer)(配列番号37)を用いて重合酵素連鎖反応によって確保し、確保された遺伝子を制限酵素XbaI/SalIで処理し、pYIL−KRTFP1、2、3及び4のXbaI/SalI部位に挿入してpYGCSF−TFP1、2、3及び4を製造した。
実施例11で記述されたベクターpYGCSF−TFP3で形質転換された組み換え酵母菌株を5Lのジャーファーメンターで流加発酵培養によってヒトコロニー成長因子の分泌生産性を調査した。ファーメンターに接種するためのシード培養は、フラスコでシード培地(酵母窒素ベース(アミノ酸不在)6.7%、カザミノ酸0.5%、及びブドウ糖2%)を用いて培養し、初期発酵培地としては、発酵培養培地(酵母抽出物4%、ペプトン1%、ブドウ糖2%)を用いて約15OD600まで培養した後、流加培地(酵母抽出物15%、ブドウ糖30%、ガラクトース30%)を細胞の成長速度に応じて異なる供給量で供給して培養した。約64時間培養の後、細胞は約200OD600まで成長し、各時間別に培地試料5μLを取って分泌タンパク質をSDS−PAGE分析した(図14)。結果的に約300mg/Lのヒトコロニー成長因子が培地に分泌生産されたことを標準試料の量と比較して確認した。酵母発酵によって分泌生産されたヒトコロニー成長因子は、アミノ酸末端の分析によってThr−Pro−Leu−Gly−Proから構成されたことを確認して、ヒトから分泌されるコロニー成長因子と同一であることを確認した。
前記実施例11でG−CSFの最適分泌のためにTFP3が最も優れることを確認することにより、酵母サッカロマイセス・セレヴィシェ遺伝体からPCRを用いて、TFP3が由来した遺伝子Yjl158c(CIS3)全体を確保し、図15に示すように、TFP3の長さを漸次変化させたTFP3の誘導体を6種(TFP3−1、2、3、4及びTFP3−1−1(配列番号40)、TFP3−1−2(配列番号42))製造した。最初得られたTFP3は、Yjl158c(CIS3)から得られる227個のアミノ酸中の104個を含有しているが、これを漸次長く作った各TFP3−1(130個のアミノ酸を含む)、TFP3−2(157個のアミノ酸を含む)、TFP3−3(189個のアミノ酸を含む)及びTFP3−4(222個のアミノ酸を含む)を製造し、それぞれをG−CSF遺伝子に連結し、融合部位にKex2p認識部位を挿入した。図15の(A)結果から分かるように、TFP3に比べて26個のアミノ酸を追加したTFP3−1の場合、追加的なN−グルコシル化部位が含まれてG−CSF分泌率がTFP3に比べて約3倍程度増加した。ところが、TFP3の長さをさらに長くした場合には別に効果がなく、むしろTFP3−3及びTFP3−4の場合には分泌効率が低くなる結果を示した。
タンパク質分泌融合因子TFP3を含有したG−CSF発現ベクターpYGCSF−KRTFP3のXbaI−SalI部位に、pYGA−CAlB14(ES Choi, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)をXbaI−SalIで処理して得たCalB遺伝子を挿入し、pYGT3−CalB14を製造した。各発現ベクターを用いて培養温度によるCalB14の分泌率を比較した。TFP3を用いたCalB14分泌生産の場合、培養適温である30℃でも既存の発現システムに比べて2倍以上の高い分泌率を示した(表3:各発現ベクターを含有した菌株の培養温度によるCalB活性)。
本発明で開発されたTFPが異なる酵母P.パストリスでも作動するかを確認するために、P.パストリスベクターpPIC9(Invitrogen社製、米国)をBalII−EcoRIで処理してAOXプロモータを除去し、ここにP.パストリス染色体からプライマー[Bg1II−GAP−forward primer(配列番号44)及びGAP−EcoRI−reverse primer(配列番号45)]を用いて確保されたGAP(glyceraldehyde 3−phosphate dehydrogenase)由来のプロモータを挿入してpPIC9−GAPを製作した。このベクターをEcoRI−NotIで処理し、ここにEcoRI−NotIで処理されたMFalpha(mating factor alpha)−GCSF及びTFP1−GCSF遺伝子をそれぞれ挿入して、pGAP−MF−GCSF及びpGAP−TFP1−GCSFを製作した。それぞれのベクターをSalIで処理した後、P.パストリスGS115(Invitrogen社製、米国)に形質転換した。確保された形質転換体をフラスコ培養し、培地に分泌されたG−CSFをSDS−PAGE分析によって最終菌株を選別した。それぞれのベクターが導入された選別菌株をファーメンターで発酵培地(酵母抽出物4%、バクトペプトン1%、グリセロール4%)を用いて回分培養し、時間別に試料を取って、培地に分泌されたG−CSFをSDS−PAGE分析によって確認した(図17)。図17に示すように、TFP1の場合、MFalphaより高い分泌率を示して酵母S.セレヴィシェ由来のTFPがP.パストリスでも非常に効果的に利用できることを確認した。
[1]細胞から分泌されない難発現性タンパク質の分泌のためのタンパク質融合因子(TFP)を選別する方法であって、
a)レポータータンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドがインフレームで連結された上記難発現性タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドを含む自動選別ベクターを製造する段階と、
b)上記自動選別ベクターに第3のポリヌクレオチドを連結して、ライブラリーを製造する段階と、
c)上記ライブラリーで上記レポータータンパク質の活性がない上記細胞を形質転換する段階と、
d)上記細胞を培養する段階と、
e)一個以上の上記細胞から分泌されたレポータータンパク質の活性を検出することでタンパク質融合因子(TFP)を選別する段階とを含み、
上記レポータータンパク質が、インベルターゼ、スクラーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、マルターゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、及びガラクトシダーゼから成る群から選択される、方法。
[2]さらに、選別されたタンパク質融合因子(TFP)を分離する段階を含む1に記載の方法。
[3]上記難発現性タンパク質が、サイトカイン、血清タンパク質、免疫グロブリン、サイトカインレセプター、ラクトフェリン、インターフェロン、コロニー刺激因子、幹細胞刺激因子、ホスホリパーゼ活性化タンパク質、インスリン、腫瘍怪死因子、成長因子、ホルモン、酵素、抗癌ペプチド、及び抗菌ペプチドから成る群から選択される、1に記載の方法。
[4]上記難発現性タンパク質がヒトインターロイキン−2、ヒトコロニー刺激因子、又はCalB14である1に記載の方法。
[5]上記第3のポリヌクレオチドが、ゲノム性DNAに由来する1に記載の方法。
[6]上記第3のポリヌクレオチドが、cDNAに由来する1に記載の方法。
[7]上記第3のポリヌクレオチドが、動物、植物、又は微生物のDNAに由来する1に記載の方法。
[8]上記第3のポリヌクレオチドが、酵母DNAに由来する7に記載の方法。
[9]上記第3のポリヌクレオチドが、カンジダ(Candida)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クリュイベロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウィア(Yarrowia)、サッカロマイセス(Saccharomyces)、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)、クモノスカビ(Rhizopus)、又はトリコデルマ(Trichoderma)のDNAに由来する7に記載の方法。
[10]上記細胞が真核細胞、又は細菌細胞である1に記載の方法。
[11]上記細胞が、エシェリキア(Escherichia)、シュードモナス(Pseudomonas)、バシラス(Bacillus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)、CHO、COS1、COS7、BSC1、BSC40、BMT10、カンジダ(Candida)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クリュイベロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウィア(Yarrowia)、サッカロマイセス(Saccharomyces)、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)、クモノスカビ(Rhizopus)、又はトリコデルマ(Trichoderma)の細胞である10に記載の方法。
[12]上記レポータータンパク質が細胞外部に分泌されるタンパク質である1に記載の方法。
[13]上記レポータータンパク質がインベルターゼであり、上記細胞が単一炭素源としてスクロースを含む培地で培養される1に記載の方法。
[14]上記自動選別ベクターに、さらにプロモータ遺伝子が含まれる1に記載の方法。
[15]上記プロモータ遺伝子がGAPDH、PGK、ADH、PHO5、GAL1及びGAL10より成る群から選択される遺伝子に由来する14に記載の方法。
[16]上記自動選別ベクターに、さらに切断認識部位が含まれる1に記載の方法。
[17]上記切断認識部位がKex2pによって認識される16に記載の方法。
[18]上記自動選別ベクターは、プロモータ遺伝子と、翻訳開始及び終結コドンが除去された難発現性タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドと、上記難発現性タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドにインフレームで連結されたレポータータンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドとを含む1に記載の方法。
[19]酵母の細胞から分泌されない難発現性タンパク質の分泌のためのタンパク質融合因子(TFP)を選抜する方法であって、
a)インベルターゼをコードする第2のポリヌクレオチドがインフレームで連結された上記難発現性タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドを含む自動選別ベクターを製造する段階と、
b)上記自動選別ベクターに第3のポリヌクレオチドを連結して、ライブラリーを製造する段階と、
c)上記ライブラリーで内在性インベルターゼ遺伝子が欠失している酵母変異株を形質転換する段階と、
d)上記形質転換された酵母を単一炭素源としてスクロースを含む培地で培養する段階と、
e)一個以上の上記形質転換された酵母から分泌されたインベルターゼの活性を検出することで上記タンパク質融合因子(TFP)を選別する段階とを含む方法。
[20]タンパク質融合因子(TFP)ライブラリーを製造する方法であって、
a)インベルターゼをコードする第2のポリヌクレオチドがインフレームで連結されたインターロイキン−2をコードする第1のポリヌクレオチドを含む自動選別ベクターを製造する段階と、
b)上記自動選別ベクターに切断した酵母遺伝体断片を連結して、ライブラリーを製造する段階と、
c)上記ライブラリーで上記インベルターゼの活性がない細胞を形質転換する段階と、
d)上記細胞を培養する段階と、
e)インベルターゼの活性を分泌する細胞を選別する段階と、
f)インベルターゼの活性を分泌する上記細胞を回収する段階とを含み、これによって、タンパク質融合因子(TFP)ライブラリーを製造する方法。
[21]さらに回収された各細胞から上記タンパク質融合因子(TFP)をコードするポリヌクレオチドを分離する段階を含む20に記載の方法。
[22]上記切断した酵母遺伝体断片が、カンジダ(Candida)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クリュイベロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウィア(Yarrowia)、サッカロマイセス(Saccharomyces)、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)、クモノスカビ(Rhizopus)、又はトリコデルマ(Trichoderma)のDNAに由来する20に記載の方法。
[23]上記インベルターゼが細胞外部に分泌されるタンパク質である20に記載の方法。
[24]上記細胞が単一炭素源としてスクロースを含む培地で培養される20に記載の方法。
[25]上記自動選別ベクターに、さらにプロモータ遺伝子が含まれる20に記載の方法。
[26]上記プロモータ遺伝子がGAPDH、PGK、ADH、PHO5、GAL1及びGAL10より成る群から選択されるポリヌクレオチドに由来する25に記載の方法。
[27]上記自動選別ベクターに、さらに切断認識部位が含まれる20に記載の方法。
[28]上記切断認識部位がKex2pによって認識される27に記載の方法。
[29]上記自動選別ベクターは、プロモータ遺伝子と、翻訳開始及び終結コドンが除去されたインターロイキン−2をコードする第1のポリヌクレオチドと、上記第1のポリヌクレオチドにインフレームで連結されたインベルターゼをコードする第2のポリヌクレオチドとを含む20に記載の方法。
[30]難発現性タンパク質とタンパク質融合因子(TFP)タンパク質とを含む融合タンパク質であって、
該難発現性タンパク質が、細胞から分泌されないものであり、
該タンパク質融合因子(TFP)タンパク質が、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号40又は配列番号42で表されるアミノ酸配列の一つを含み、該難発現性タンパク質の該細胞からの分泌を誘導するものである、融合タンパク質。
[31]30に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
[32]上記遺伝子が配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号41、又は配列番号43で表されるヌクレオチド配列の一つを有する、タンパク質融合因子(TFP)タンパク質のためのポリヌクレオチドを含む、31に記載の遺伝子。
[33]31に記載の遺伝子を含むベクター。
[34]上記ベクターが、pYIL−KRTEP1(KCTC 10544BP)、pYIL−KRTEP2(KCTC 10545BP)、pYIL−KRTEP3(KCTC 10546BP)、pYIL−KRTEP4(KCTC 10547BP)、pYIL−KRT1−3(KCTC 10548BP)、pYIL−KRT1−4(KCTC 10549BP)、pYGT3−1−1−GCSF(KCTC 10753BP)、及びpYGT3−1−2−GCSF(KCTC 10754BP)から成る群から選択される33に記載のベクター。
[35]33に記載のベクターで形質転換された細胞。
[36]上記細胞が、エシェリキア(Escherichia)、シュードモナス(Pseudomonas)、バシラス(Bacillus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)、CHO、COS1、COS7、BSC1、BSC40、BMT10、カンジダ(Candida)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クリュイベロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウィア(Yarrowia)、サッカロマイセス(Saccharomyces)、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)、クモノスカビ(Rhizopus)、又はトリコデルマ(Trichoderma)から成る群から選択される35に記載の細胞。
[37]難発現性タンパク質の組み換え的生産方法であって、
a)1に記載の方法によって選別されたタンパク質融合因子(TFP)タンパク質をコードする第2のポリヌクレオチドと連結された、上記難発現性タンパク質をコードする第1のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを製作する段階と、
b)上記発現ベクターで細胞を形質転換する段階と、
c)上記細胞を培養する段階とを含み、上記難発現性タンパク質が生産される組み換え的生産方法。
[38]上記タンパク質融合因子(TFP)タンパク質が、
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号40又は配列番号42で表されるアミノ酸配列の一つを含み、難発現性タンパク質の分泌を誘導するタンパク質である、37に記載の組み換え的生産方法。
[39]上記タンパク質融合因子(TFP)タンパク質が、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号41、又は配列番号43で表されるヌクレオチド配列の一つを含む遺伝子によってコードされている37に記載の組み換え的生産方法。
本発明は、現在まで組み換え生産が不可能であり或いは発現率が低かった多様なタンパク質を適合型TFP超高速選別及び利用によって経済的に量産可能にするのに寄与する。
Claims (9)
- 難発現性タンパク質とタンパク質融合因子(TFP)タンパク質とを含む融合タンパク質であって、
該難発現性タンパク質が、細胞から分泌されないものであり、
該タンパク質融合因子(TFP)タンパク質が、配列番号5、配列番号40又は配列番号42で表されるアミノ酸配列の一つを含み、該難発現性タンパク質の該細胞からの分泌を誘導するものである、融合タンパク質。 - 請求項1に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
- 上記遺伝子が配列番号6、配列番号41、又は配列番号43で表されるヌクレオチド配列の一つを有する、タンパク質融合因子(TFP)タンパク質のためのポリヌクレオチドを含む、請求項2に記載の遺伝子。
- 請求項2に記載の遺伝子を含むベクター。
- 上記ベクターが、pYIL−KRTEP3(KCTC 10546BP)、pYGT3−1−1−GCSF(KCTC 10753BP)、及びpYGT3−1−2−GCSF(KCTC 10754BP)から成る群から選択される請求項4に記載のベクター。
- 請求項4に記載のベクターで形質転換された細胞。
- 上記細胞が、エシェリキア(Escherichia)、シュードモナス(Pseudomonas)、バシラス(Bacillus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)、CHO、COS1、COS7、BSC1、BSC40、BMT10、カンジダ(Candida)、デバリオミセス(Debaryomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クリュイベロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウィア(Yarrowia)、サッカロマイセス(Saccharomyces)、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium)、クモノスカビ(Rhizopus)、又はトリコデルマ(Trichoderma)から成る群から選択される請求項6に記載の細胞。
- 難発現性タンパク質の組み換え的生産方法であって、
a)(ii) 配列番号5、配列番号40又は配列番号42で表されるアミノ酸配列の一つを含むタンパク質融合因子(TFP)タンパク質をコードするポリヌクレオチドと連結された、(i) 上記難発現性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを製作する段階と、
b)上記発現ベクターで細胞を形質転換する段階と、
c)上記細胞を培養する段階とを含み、上記難発現性タンパク質が生産される組み換え的生産方法。 - 上記タンパク質融合因子(TFP)タンパク質が、配列番号6、配列番号41、又は配列番号43で表されるヌクレオチド配列の一つを含む遺伝子によってコードされている請求項8に記載の組み換え的生産方法。
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