JP2003530106A - シグナル配列のトラッピング - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、分泌、部分分泌又は例えば酵素、レセプター、サイトカイン、ペプチドホルモンのような汎用のスクリーニングアッセイを用いては単離され無かったであろう産業上注目のある細胞表層-表示ポリペプチドをコードする遺伝子の、予め確立した遺伝子バンク又はライブラリーからのスクリーニングを可能にする。分泌、部分分泌又は細胞表層-表示ポリペプチドをコードする遺伝子を既存の遺伝子ライブラリーから単離する為の方法を記載する。この方法において、invitroポリヌクレオチド挿入反応を用いて内因性シグナル配列を検出し、挿入したポリヌクレオチドがプロモーターを有しない及び分泌シグナルを有しない分泌レポーターを含んで成る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 既存のDNAライブラリーから分泌ポリペプチドをコードする遺伝子を単離する
為の方法を記載する。この方法において、in vitroトランスポジション反応を用
いて内因性分泌シグナル配列を検出し、ここでトランスポゾンは分泌レポーター
を含む。

【０００２】 本発明の背景 新規な産業上の酵素及び更に特異的な分泌酵素の探索は、現在、簡易な原始的
な機能的アッセイの有効性に依存している。一般的に基質は、微生物のスクリー
ニングの為の培地中で使用し、当該基質の分解は当該基質における物理的変化(
変色、コロニー周辺の輪の形成、蛍光など)により認識しうる。簡易な機能的ア
ッセイが無い多くのタンパク質が存在し、これらは産業的な酵素としての潜在的
な用途を持ちうる。

【０００３】 分泌される酵素は、産業上の用途における使用の為により高い注目が在る。分
泌した酵素をコードするクローンのみを選択するポジティブ選択スクリーニング
系は従って、とても所望される。シグナルのトラッピングは、自身のシグナルを
欠く細胞外レポーター遺伝子に対する翻訳的融合を使用して、シグナルペプチド
を含む遺伝子を同定する為の方法である。これは、新規のシグナル配列同定 (Ma
noil&Beckwith 1985,TnphoA:A transposon for protein export signals.Proc.N
atl.Acad.Sci USA 82:8129-8133;Smith,H.et al.,1987,Construction and use o
f signal sequence selection vectors in Escherichia coli and Bacillus sub
tillis.J.Bact. 169:3321-3328)、又最適な機能の為に要求されるシグナルペプ
チドの中の特異的な成分を明確に決定する為のような使用(Smith, H. et al, 19
98. Characterisation of signal-sequence-coding regions selected from the
Bacillus subtillis chromosome. Gene. 70:351-361)の目的で刊行物において
報じられている。

【０００４】 シグナルを有しないレポーター(シグナルレポーター)遺伝子を含有するスクリ
ーニングベクター中でゲノム又はcDNAライブラリーが構築された、数多くの刊行
物に記載のクローニングベクターレポーター系が有る。翻訳停止部位を欠くcDNA
又はゲノム断片を、翻訳的融合においてレポーター遺伝子の上流にクローン化し
た時、結果としてタンパク質レポーター遺伝子融合産物が形成する。もしクロー
ニングされた当該cDNA又はゲノム断片がシグナルペプチドを含めば、当該翻訳的
融合は細胞の外側に分泌される。分泌は、サッカロミセス・セレビジアエ(Sacch
aromyces cerevisiae)中のインベルターゼの使用、又は例えば、大腸菌(Escheri
chia coli)中のβ-ラクタマーゼを使用し、選択培地上の増殖により検出できう
る。これらの刊行物は予め確立された遺伝子ライブラリーをスクリーニングする
為の方法に関連しない。

【０００５】 ライブラリー中で探索される多くのクローンは、シグナルペプチドを含むそれ
らに対するスクリーニングにより劇的に減少するが、得られるクローンは、通常
単離した分泌シグナル配列に本来一本化した、酵素活性をコードするのに必要で
あった最小限の遺伝子情報を含みうるもしくは含まない、不完全な遺伝子のみを
含みうる。

【０００６】 本発明の概要 本発明により解決する問題は、既存の遺伝子ライブラリーにおいて有効に分泌
又は表層-表示ポリペプチドをコードするクローンを同定することである。それ
においては、たとえポリペプチドが未知の活性であっても、スクリーニングベク
ターにおいてライブラリーを再クローニングする必要なく、既知の活性のみを検
出するであろう典型的な骨の折れ時間を消費する活性アッセイにおいてライブラ
リーをスクリーニングする必要ない。この問題を解決することで、遺伝子ライブ
ラリーが、以前に確立していることのある新規な生物から対応の分泌又は表層-
表示ポリペプチドの迅速且つ有効な産業上の活用が可能になる。

【０００７】 例えばシグナルを有しないβ-ラクタマーゼ遺伝子がMuAトランスポゾンのよう
なトランスポゾンに含まれている予め確立されたゲノムもしくはcDNAライブラリ
ーから、分泌、部分分泌、又は細胞表層-表示ポリペプチドをコードする遺伝子
を同定する為のシグナルレスポーター遺伝子と、in vitroポリヌクレオチド反応
との組み合わせを我々は記述する。本発明は、汎用のスクリーニングアッセイを
用いては単離されていないであろう分泌、部分分泌、又は細胞表層-表示ポリペ
プチド例えば、酵素、レセプター、サイトカイン、ペプチドホルモン等をコード
する遺伝子についての予め確立した遺伝子バンクもしくはライブラリーのスクリ
ーニングを可能にする。

【０００８】 それ故第１局面において本発明は、分泌又は部分分泌の為のシグナル配列を担
持するポリペプチドをコードする注目の遺伝子を、遺伝子ライブラリーから同定
及び単離する為の方法、即ち、 a）ゲノムDNAライブラリー又はcDNAライブラリーを用意し; b）前記ライブラリーへ、分泌レポーターをコードするプロモーターを有しない
及び分泌シグナルを有しないポリヌクレオチドを含んで成るDNA断片を挿入し; c）ホスト細胞に当該挿入したDNA断片を含んで成る当該ライブラリーを導入し; d）活性分泌レポーターを分泌又は部分的に分泌するホスト細胞をスクリーニン
グ及び選択し; e）当該挿入したDNA断片に隣接するDNAのシーケンシングにより、選択ホスト細
胞中の当該分泌レポーターの挿入された注目の遺伝子を同定し;そして f）段階e)において同定した注目の完全な遺伝子を単離する 段階を含んで成る当該方法に関連する。

【０００９】 第2局面において本発明は、遺伝子がコードする分泌シグナル配列を担持する
ポリペプチドをコードする注目の遺伝子を遺伝子ライブラリーから同定及び単離
する為の方法、即ち a）ゲノムDNAライブラリー又はcDNAライブラリーを用意し; b）前記ライブラリーへ、分泌レポーターをコードするプロモーターを有しない
及び分泌シグナルを有しない遺伝子を含んで成るDNA断片を挿入し; c）ホスト細胞の集団に前記DNA断片のランダムな挿入体を担持する当該ライブラ
リーを導入し; d）分泌レポーターを発現及び分泌するホスト細胞をスクリーニングし; e）段階bのDNA断片に隣接するDNAのシーケンシングにより、当該分泌レポーター
の挿入された注目の遺伝子を同定し;そして f）段階a)の前記ライブラリーから注目の完全な遺伝子を単離する 段階を含んで成る当該方法に関連する。

【００１０】 用語、「ポリペプチド」、「分泌した」又は「部分分泌」及び「部分的に分泌
した」は同義語として本明細書にて使用し、真核、原核又は古細菌細胞のような
細胞の膜を介する、ポリペプチドの一部のもしくはポリペプチド全体の移動を意
味する。非限定的なポリペプチド分泌の例において、レセプターのような膜境界
又は膜貫通タンパク質は、本発明の方法において、本発明の「分泌レポーター」
と融合された融合ポリペプチドとしてホスト細胞中で発現されるであろう。従っ
て、本文において「分泌」は、少なくとも当該融合ポリペプチドの分泌レポータ
ー部分が膜の細胞外部分に表示されており、分泌レポーターアッセイにおいて機
能的に活性となるような範囲にホスト細胞の膜を介する融合ポリペプチドの移動
の意味する。他の例において、分泌細胞に対する任意の残留性の結合がなく当該
融合ポリペプチドは完全に培養培地に分泌されるであろう。

【００１１】 本明細書に記載の非限定の例において、既存のcDNA又はゲノムDNAライブラリ
ーはレポーター遺伝子を含むトランスポゾンで標識する。全てのトランスポゾン
レポーター遺伝子とシグナル配列を含むライブラリー中の遺伝子のインフレーム
における融合は、活性レポーターの発現をアッセイすることにより検出した。次
いで、トランスポゾン挿入体の、上流及び下流の隣接するDNA配列をシーケンシ
ングし、トランスポゾンを挿入した当該遺伝子はシーケンシング解析によって同
定する。多くの場合において、標識した遺伝子の全長配列を得ることは、異なる
ヌクレオチド位置又は部位において標識された同様の遺伝子の多数のクローンの
回収により助長されるであろう。ポジティブクローンは、同様の遺伝子であるが
異なるトランスポゾン挿入部位を持つクローンを同定する為にシーケンシングす
る。このようにして、オープンリーディングフレーム (ORF) の全て又は大部分
はコンティグアセンブリー(contig assembly) によって得ることができうる。
おそらくは、当該遺伝子においてトランスポゾン挿入体の不十分な数又は不均一
な分配が原因に、もしこの方法で完全なORFが得られないなら、その時は、全長
遺伝子は古典的なプライマーウォーキング(primer walking)DNAシーケンシング
によって得られうる。

【００１２】 次いで、このようにして得た配列情報は、分泌シグナル配列をコードする配列
を含む注目の完全な遺伝子を単離する為及び、更に、当業者周知の、当該分泌タ
ンパク質の産業上の生産の為の最適な発現の構築体を作成する為に使用すること
ができ、その後の酵素を発現及び回収する産業上の生産工程は、本明細書におい
て他の何処かに示したような当業界においてよく記載してある事項である。

【００１３】 従って第3番目の局面において本発明は、本発明の方法により単離した注目の
遺伝子、好適には遺伝子ライブラリーから単離された注目の遺伝子に関連する。
本発明の他の局面では、遺伝子ライブラリーから単離された注目の遺伝子に関係
し、ここにおいて前記遺伝子は第１又は第２局面の方法により単離される。

【００１４】 本発明のある局面は、先の局面にて定義した注目の遺伝子によりコードされる
酵素に関連する。

【００１５】 更に、他の局面において、本発明は先の局面において定義した注目の遺伝子を
含んで成る発現系に関連する。

【００１６】 本発明の更に他の局面は、先の局面において定義した発現系を含んで成るホス
ト細胞に、又は先の局面において定義した注目の遺伝子の2以上の染色体的に組
込まれたコピーを含んで成るホスト細胞に関連する。

【００１７】 最終的な局面において本発明は、酵素を生産する為の方法であって、先に定義
したホスト細胞を先に定義した注目の遺伝子が発現されるのに適当な条件下で増
殖することを含んで成り、ここでこのホスト細胞は増殖培地中にこの遺伝子によ
りコードされるタンパク質を分泌するものである方法に関連する。

【００１８】 寄託微生物 2001年2月8日にDSMZにおいてDSM14046としてパエニバチルス(Paenibacillus)N
N018026株を寄託した。

【００１９】 定義 本発明に関連して、ここで当業者にしって汎用の分子生物学的、微生物学的及
び組換えDNA技術を使って良い。このような技術は刊行物にて十分に説明されて
いる。Sambrook, Fritsch＆Maniatis, Molecular Cloning:A Laboratory Manual
,Second Edition(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Ha
rbor, New York(ここでは“Sambrook et al.,1989”) DNA Cloning:A Practical
Approach,VolumesＩandII/D.N. Glover ed.1985);Oligonucleotide Synthesis(
M.J.Gait ed.1984);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds
(1985));Transcription And Translation (B.D.Hames & S.J.Higgins,eds.(1984
));Animal Cell Culture(R.I.Freshney, ed. (1986));Immobilized Cells And E
nzymes (IRL Press, (1986));B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloni
ng (1984)等を参照のこと。

【００２０】 タンパク質に適用する時、用語「単離した」とは、タンパク質がその生来の環
境の中以外の状態、例えば血液及び動物組織から隔離した状態、において見い出
されることを示す。好適な形態において、当該単離されたタンパク質は他のタン
パク質から、特に動物起源の他のタンパク質を実質的に含まない。高純度形態、
すなわち純度95%超、更に好適には純度99%超であるタンパク質を提供することが
好適である。ポリヌクレオチド分子に適用する時、用語「単離した」は、当該分
子がその生来の遺伝的環境から取り除かれ、かように他の外因性の又は不要なコ
ーディング配列を含まず、遺伝子操作されたタンパク質生産系の為の使用に適し
た形態にあることを示す。そのような単離した分子は、それらの生来の環境から
分離したものであり、cDNA及びゲノムクローン等である。本発明の単離したDNA
分子は、それらが通常結合している他の遺伝子を含まず、そしてプロモーターや
ターミネーターのような天然の5´及び3´非翻訳領域を含みうる。結合した領域
の同定は、当業者により明らかになるであろう（例えばDynan and Tijan,Nature
316:774-78, 1985を参照のこと）。

【００２１】 「ポリヌクレオチド」は5´から3´末端へ読むデオキシリボヌクレオチド又は
リボヌクレオチド塩基の1本又は2本鎖の重合体である。ポリヌクレオチドはRNA
及びDNA等であり、天然資源から単離されたもの、in vitroで合成されたもの、
又は天然及び合成の分子の組み合わせから調製したものであって良い。「核酸分
子」は1本鎖形態又は2重鎖らせんにおけるリボヌクレオシド(アデノシン、グア
ノシン、ウリジン又はシチジン;「RNA分子」)又は デオキシリボヌクレオシド(
デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン又はデオキシチジ
ン;「DNA分子」)のリン酸エステルポリマー形態に言及する。2重鎖DNA-DNA,DNA-
RNA及びRNA-RNAらせんはありえる。用語核酸分子及び、特にDNA又はRNA分子は、
分子の１次又は2次構築体にのみに言及し、任意の特別な3次又は4次形態に対し
てそれを限定しない。従ってこの用語は、とりわけて、DNA直線又は環状DNA分子
(例えば制限断片)、プラスミド、及び染色体に見出される2重鎖を含む。特定の2
重鎖DNA分子の構築体を論ずる上で、本明細書記載の配列はDNAの非転写鎖(すな
わちmRNAと相同性のある配列を持つ鎖)に沿った5´から3´方向における配列の
みを示す通常の汎用の方法に従って良い。「組換えDNA分子」は分子生物学的な
操作を受けたDNA分子である。

【００２２】核酸の構築体 コントロール配列と適合する条件の下で、適切なホスト細胞中でコーディング
配列の発現を誘導する１又は複数のコントロール配列に作用可能式に結合した本
発明の核酸配列を含んで成る核酸の構築体にも又本発明は関連する。発現はポリ
ペプチドの生産等に伴う任意の段階を含むが、転写、転写後修飾、翻訳、後翻訳
修飾及び分泌に限定しないが、発現は理解されるだろう。

【００２３】 本明細書中で「発現構築体」は、1本又は2本鎖の核酸分子として定義されてい
る。それは天然遺伝子から単離される、又は他方自然において存在しないであろ
う方法において結合し並置した核酸分子のセグメントを含む為に修飾されている
。核酸構築体が本発明のコーディング配列の発現の為の必要な全てのコントロー
ル配列を含む時、当該用語核酸構築体は用語発現カセットと同じ意味である。用
語「コーディング配列」は本明細書において、そのタンパク質産物のアミノ酸配
列を特異的に明記する核酸配列として定義する。コーディング配列の境界は一般
的に、リボソーム結合部位(原核生物)により又はmRNAの5´末端でオープンリー
ディングフレームの丁度上流に位置するATG開始コドン(真核生物)及びmRNAの3´
にて末端オープンリーディングフレームの丁度下流に位置する転写終結配列によ
り決定される。コーディング配列は、限定されないが、DNA、cDNA及び組換え核
酸配列を含むことができる。

【００２４】 本発明のポリペプチドをコードする単離した核酸配列は、当該ポリペプチドの
発現を供給する為の様々な方法において操作されてよい。ベクターへの挿入に先
立つ核酸配列の操作は、発現ベクターに依存することが望ましく又は必要であろ
う。組換えDNA法を利用して核酸配列を修飾する為の技術は当業者に良く知られ
ている。

【００２５】 用語「コントロール配列」は本明細書において、本発明のポリペプチドの発現
に対して必須又は有益な全ての成分を含む為であると定義する。各々のコントロ
ール配列は、当該ポリペプチドをコードする核酸配列に対し天然又は外来であっ
てよい。そのようなコントロール配列は例えば、限定はしないが、リーダー、ポ
リアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、
及び転写ターミネーターである。最小限、当該コントロール配列は、プロモータ
ー並びに転写及び翻訳停止配列を含む。当該コントロール配列は、ポリペプチド
をコードする核酸配列のコーディング領域とコントロール配列のライゲーション
を促進する特異的制限部位を導入する目的でリンカーが施されていて良い。用語
「作用可能式に結合した」は本明細書中で次のような形態として定義する。即ち
コントロール配列は、ポリペプチドの発現を誘導するようにDNA配列のコーディ
ング配列に関連する位置に適切に位置された形態である。

【００２６】 コントロール配列は適切なプロモーター配列であってよく、核酸配列は核酸配
列の発現の為のホスト細胞により認識される。当該プロモーター配列は、ポリペ
プチドの発現を仲介する転写制コントロール列を含む。当該プロモーターは、突
然変異、端を切り取った、及びハイブリッドのプロモーター等、選択ホスト細胞
中で転写活性を示す任意の核酸配列であってよく、当該ホスト細胞に対する同種
もしくは異種の細胞外もしくは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ら
れうる。

【００２７】 本発明の核酸構築体の転写を指示する為の適切なプロモーター、特に細菌ホス
ト細胞における例は、大腸菌(E.coli) lacオペロンから得たプロモーター、スト
レプトミセス・コエリカラー(Streptomyces coelicolor)・アガラーゼ遺伝子(da
gA)、枯草菌 (Bacillus subtilis)・レバンスクラーゼ(levansucrase)遺伝子(sa
cB)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)・α-アミラーゼ遺
伝子(amyL)、バチルス・ステアロサーモフィルス (Bacillus stearothermophilu
s) ・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子(amyM)、バチルス・アミロリケファ
シエンス(Bacillus amyloliquefaciens)・α-アミラーゼ遺伝子(amyQ)、バチル
ス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)・ペニシリナーゼ遺伝子(penP)
、枯草菌(Bacillus subtilis)xylA及びxylB遺伝子及び真核生物β-ラクタマーゼ
遺伝子(Villa-Kamaroff et al.,1978,Proceedings of the National Academy o
f Science USA 75:3727-3731)、並びにtacプロモーター(DeBoer et al.,1983,Pr
oceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25)である。更な
るプロモーターは“Useful proteins from recombinant bacteria” in Scienti
fic American,1980,242:74-94;及びSambrook,J.et al.,1989,Molecular Cloning
, A Laboratory Manual,2d edition,Cold Spring Harbor,New Yorkに記載がある
。

【００２８】 糸状菌ホスト細胞において本発明の核酸構築体の転写を指示する為の適切なプ
ロモーターの例は、アスペルジルス・オリザエ(Aspergillus oryzae) ・TAKAア
ミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)・アスパルティック (spa
rtic) プロテナーゼ、アスペルジルス・ニガー(Aspergillus niger)中性(neutra
l)・α-アミラーゼ、アスペルジルス・ニガー(Aspergillus niger)・酸安定(aci
d stable)α-アミラーゼ、アスペルジルス・ニガー(Aspergillus niger)又はア
スペルジルス・アワモリ(Aspergillus awamori)・グルコアミラーゼ(glaA)、リ
ゾムコル・ミエヘイリパーゼ、アスペルジルス・オリザエ・アルカリ性プロテア
ーゼ、アスペルジルス・オリザエ・三炭糖リン酸イソメラーゼ、アスペルジルス
・ニジュランス(Aspergillus nidulans)・アセタミダーゼ(acetamidase)及びフ
ザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)・トリプシン様プロテアーゼ(W
O96/00787)、並びにNA2-tpiプロモーター(アスペルジルスニガー中性α-アミラ
ーゼ及びアスペルジル・スオリザエ・三炭糖リン酸イソメラーゼに対する遺伝子
由来のプロモーターのハイブリッド型)及びアスペルジルス・オリザエ酸炭糖リ
ン酸イソメラーゼこれらの突然変異、端を切り取った及びこれらのハイブリッド
プロモーターに対する遺伝子から得られたものである。

【００２９】 酵母菌のホストにおける有用なプロモーターはサッカロミセス・セレビジアエ
・エノラーゼ(Saccharomyces cerevisiae)(ENO-１)、サッカロミセス・セレビジ
アエ・ガラクトキナーゼ(GAL1)、サッカロミセス・セレビシアエ・アルコールデ
ヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-リン酸・デヒドロゲナーゼ(ADH2/GAP)及
びサッカロミセス・セレビジアエ・3-フォスフォグリセレートキナーゼに対する
遺伝子から得られた。酵母菌ホスト細胞の為の有用な他のプロモーターはRomano
s et al., 1992, Yeast8; 423-488に記載がある。

【００３０】 コントロール配列は又適切な転写ターミネーター配列でありうり、配列はホス
ト細胞によって転写を終結させる為に認識される。当該ターミネーター配列は、
ポリペプチドをコードする核酸配列の3´末端に作用可能式に結合している。選
択ホスト細胞中で機能的な任意のターミネーターを本発明において使用して良い
。

【００３１】 糸状菌ホスト細胞の為の好適なターミネーターは、アスペルジルス・オリザエ
・TAKAアミラーゼ、アスペルジルス・ニガー・グルコアミラーゼ、アスペルジル
ス・ニジュランス・アントラニル酸シンターゼ、アスペルジルス・ニガー・α-
グルコシダーゼ、フザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)・トリプシ
ン様プロテアーゼに対する遺伝子から得られる。

【００３２】 酵母菌ホスト細胞の為の好適なターミネーターはサッカロミセス・セレビジア
エ・エノラーゼ、サッカロミセス・セレビジアエシトクロームC(CYC1)、及びサ
ッカロミセス・セレビジアエ・グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ
に対する遺伝子から得た。酵母菌ホスト細胞に対して有用な他のターミネーター
Romanos et al, 1992, supra.による記載がある。

【００３３】 コントロール配列は、又適切なリーダー配列であって良く、mRNAの非翻訳領域
はホスト細胞による翻訳の為に重要である。リーダー配列はポリペプチドをコー
ドする核酸配列の5´末端に作用可能式に結合される。選択ホスト細胞において
機能的な任意のリーダー配列を本発明において使用して良い。

【００３４】 糸状菌ホスト細胞の為の好適なリーダーは、アスペルジルス・オリザエ・TAKA
アミラーゼ及びアスペルジルス・オリザエ・三炭糖リン酸イソメラーゼに対する
遺伝子から得られる。

【００３５】 酵母菌ホスト細胞の為の好適なリーダーは、サッカロミセス・セレビジアエ・
エノラーゼ (ENO-１)、サッカロミセス・セレビジアエ3-フォスフォグリセレー
トキナーゼ、サッカロミセス・セレビジアエα-因子、及びサッカロミセス・セ
レビジアエアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロ
ゲナーゼ(ADH2/GAP)に対する遺伝子から得られる。

【００３６】 コントロール配列は又ポリアデニル化配列でありうり、核酸配列の3´末端に
作用可能式に結合し、転写した時、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加
する為のシグナルとしてホスト細胞により認識される配列である。選択ホスト細
胞中で機能的な任意のポリアデニル化配列を本発明において使用して良い。

【００３７】 糸状菌ホスト細胞の為の好適なポリアデニル化配列は、アスペルジルス・オリ
ザエTAKAアミラーゼ、アスペルジルス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルジル
ス・ニジュランアントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシスポルム・トリ
プシン様プロテアーゼ及びアスペルジルス・ニガーαグルコシダーゼに対する遺
伝子から得られる。

【００３８】 酵母菌ホスト細胞の為の有用なポリアデニル化配列はGuo and Sherman, 1995,
Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990による記載がある。

【００３９】 ホスト細胞の増殖に関連のあるポリペプチド発現の制御を可能にする調節配列
を付加することが又望ましいであろう。調節系の例は、調節化合物の存在等、化
学的又は物理的刺激に応答してオン又はオフになる遺伝子の発現を引き起こすそ
れらである。原核生物系における調節系は、lac,tac及びtrpオペレーター系であ
る。酵母菌において、ADH2系又はGAL1系が使われうる。糸状菌においては、前記
TAKAα-アミラーゼプロモーター、アスペルジルスニガー・グルコアミラーゼプ
ロモーター、及びアスペルジルスオリザエ・グルコアミラーゼプロモーターを調
節配列として使用しうる。調節系の他の例は、遺伝子増幅を可能にするそれらで
ある。真核生物の系において、これらはメトトレキサート(methotrexate)の存在
において増幅されるジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及び重金属によって増幅される
メタロチオネイン遺伝子等である。これらの場合では、ポリペプチドをコードし
ている当該核酸配列は作用可能式に調節配列と結合されたであろう。

【００４０】 本発明は又、本発明のポリペプチドをコードする内因性の遺伝子の発現を改変
する為の核酸の構築に関連する。構築体は、当該内因性の遺伝子の発現を改変す
る為に必要な最小限の数の成分を含みうる。ある実施態様において、核酸構築体
は好適には、(a)ターゲッティング配列(b)調節配列(c)エキソン、及び(d)スプラ
イスドナー部位を含む。当該核酸構築体の細胞への導入により、当該構築体は、
内因性遺伝子部位において細胞ゲノムに相同的組換えを介して挿入をする。 タ
ーゲッティング配列は成分(b)-(d)が作用可能式に内因性の遺伝子に結合される
ように成分(a)-(d)が内因性の遺伝子に組込まれることを指示する。他の実施態
様において、当該核酸構築体は、 (a)ターゲッティング配列 (b)調節配列 (c)エ
キソン (d)スプライスドナー部位 (e)イントロン、及び(f)スプライスアクセプ
ター部位を含み、ここで、ターゲッティング配列は成分(b)-(f)が作用可能式に
内因性の遺伝子に結合されるように成分(a)-(f)が組込まれることを指示する。
しかしながら、当該構築体は選択マーカーのような更なる成分も含みうる。

【００４１】 これらの成分の導入は、内因性の遺伝子の発現が改変された新たな転写ユニッ
トの生産をもたらす。核心において、当該新規転写ユニットはターゲッティング
構築体び当該内因性の遺伝子により導入された配列の融合産物である。当該内因
性の遺伝子が改変された実施態様において、当該遺伝子は活性化された。本実施
態様において、対応の親細胞中で、明らかにより高いレベルで当該遺伝子の発現
を引き起こす調節配列の挿入を通じて、通常親細胞の内因性の遺伝子と結合した
調節領域を置換、分裂または無能にする為に、相同的組換えを使用する。

【００４２】 構築体は更に内因性の遺伝子の１又は複数のエキソンを含む。エキソンはRNA
へコピーされるDNA配列として定義し、エキソン配列が内因性の遺伝子のコーデ
ィング領域とインフレームであるような成熟mRNAに存在する。当該エキソンは、
随意に、１又は複数のアミノ酸をコードする及び/又はアミノ酸を、部分的にコ
ードするDNAを含む。代わりに、当該エキソンは5´非コーディング領域に対応す
るDNAを含む。当該外因性のエキソンもしくはエキソンがコードする1又は複数の
アミノ酸及び/もしくはアミノ酸の部分をコードする時、当該核酸構築体は、転
写及びスプライシングにより、第2エキソン由来のmRNAの部分の適切な読み枠が
変えられないように、当該リーディングフレームは内因性の遺伝子のコーディン
グ領域とインフレームに設計してある。

【００４３】 構築体のスプライスドナー部位はあるエキソンから他のエキソンのスプライシ
ングを指示する。一般的に、第2エキソンの5´に第1エキソンがあり、その3´側
に上に重複し隣接している当該スプライスドナー部位が、第2エキソンの5´側上
に隣接するスプライスドナー部位を認識する。スプライスドナー部位と同様、ス
プライスアクセプター部位はあるエキソンから他のエキソンのスプライシングを
指示する配列である。スプライスドナー部位との一緒の作用で、スプライシング
機構はスプライスアクセプター部位をイントロン除去を行う為に使用する。

【００４４】発現ベクター 本発明は又、本発明の核酸配列、プロモーター及び転写及び翻訳停止シグナル
を含んで成る組換え発現ベクターに関連する。上記に記述した様々な核酸及びコ
ントロール配列は、このような部位で、ポリペプチドをコードする核酸配列の挿
入又は置換を可能にするに至る１又は複数の慣用の制限部位を含みうる組換え発
現ベクターを生産する為に、一緒につながれうる。代わりに、本発明の核酸配列
は、発現の為の適切なベクター中に当該核酸配列又は当該配列を含んで成る核酸
構築体を挿入することより発現しうる。発現ベクターを生み出すことにおいて、
コーディング領域が発現の為に適切なコントロール配列と作用可能式に結合する
ように、当該コーディング領域が当該ベクター中に存在する。

【００４５】 組換え発現ベクターは、簡単に組換えDNAの手法に従い、核酸配列の発現をも
たらす任意のベクター(例えば、プラスミド又はウィルス)であって良い。ベクタ
ーの選択は一般的にベクターと当該ベクターが導入されるホスト細胞の適合性に
依存するであろう。

【００４６】 ベクターは自己複製するベクターであり、即ち、染色体外質として存在するベ
クターで、この複製は染色体の複製と独立のもの、例えば、プラスミド、細胞外
染色体成分、ミニ染色体又は人工染色体であって良い。当該ベクターは自己の複
製を確かにする為の任意の手段を含みうる。代わって、ホスト細胞に導入した時
、当該ベクターはゲノムに組込まれ、それが組込まれている染色体と一緒に複製
されうる一つである。更に、ホスト細胞のゲノムに導入される全DNAを一緒に含
む単一のベクターもしくはプラスミド又は2以上のベクター又はプラスミド、又
はトランスポゾンが使用されうる。

【００４７】 本発明のベクターは好適に、形質転換細胞の容易な選択を可能にする１又は複
数の選択マーカーを含む。選択可能なマーカーは、殺生物剤又はウィルス耐性、
重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性等を供する産物の遺伝子であ
る。細菌の選択マーカーの例は枯草菌もしくはバチルス・リケニフォルミス由来
のdal遺伝子、又はアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしく
はテトラサイクリン耐性のような抗生物質耐性を付与するマーカーである。酵母
菌ホスト細胞に対して最適なマーカーはADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1及
びURA3である。糸状菌ホスト細胞等において使用するの為の選択マーカーは、am
dS(アセタミダーゼ)、argB(オルニチンカーバモイルトランスフェラーゼ)、bar(
フォスフィノチリシンアセチルトランスフェラーゼ)(phosphinothricin acetylt
ransferase)、hygB(ヒグロマイシンリン酸トランスフェラーゼ)(hygromycin pho
sphotransferase)、niaD(硝酸還元酵素)、pyrG(オルニチン-5´-リン酸デカルボ
キシラーゼ)、sC(硫酸アデニルトランスフェラーゼ)、trpC(アントラニルサンシ
ンターゼ)、並びにこれらと同等物である。アスペルジルス細胞における使用に
対して好まれるのは、アスペルジルス・ニヂュランス又はアスペルジルスオリザ
エのamdS及びpyrG遺伝子並びにストレプトミセス・ハイグロスコピカスの当該ba
r遺伝子である。

【００４８】 本発明のベクターは、好適にホスト細胞ゲノムへのベクターの安定な組込み、
又は当該ゲノムとは独立に当該細胞中でベクターの自己複製を可能にする成分を
含む。

【００４９】 ホスト細胞のゲノムへの組込みについて、ベクターは、ポリペプチドをコード
する核酸配列又は相同的もしくは非相同的組換えによるゲノムへの安定な組込み
の為のベクターの他の任意の成分に依存して良い。代わって、当該ベクターは、
ホスト細胞のゲノムへの相同的組換えにより組換えを指示する為の更なる核酸配
列を含みうる。当該更なる核酸配列は、染色体中の正確な位置で、当該ベクター
をホスト細胞のゲノムに導入することを可能にする。正確な位置での導入の可能
性を増す為に、当該導入成分は好適に、相同的組換えの可能性を増強するため、
対応の標的の配列とより高い相同性がある、例えば、100から1,500塩基対、好適
には400から1,500塩基対、最も好適で800から1,500塩基対の十分な数の核酸を含
まなくてはならない。当該導入成分はホスト細胞のゲノム中の標的配列と相同的
である任意の配列であって良い。更に、当該導入成分は非コード又はコード核酸
配列であっても良い。一方で、当該ベクターは非相同性組換えによりホスト細胞
のゲノムに組込まれる。

【００５０】 自己複製について、更にベクターは課題のホスト細胞中で当該ベクターが複製
を自立的にすることを可能にする複製開始点を含んで成りうる。細菌の複製開始
点の例は、大腸菌(E.Coli)中で複製を可能にするプラスミドpBR322、pUC19、pAC
YC177、及びpACYC184並びにバチルス中で複製を可能にするpUB110、pE194、pTA1
060及びpAMβ1の複製開始点である。酵母菌ホスト細胞中で使用する為の複製開
始点の例は、2ミクロンの複製開始点、ARS1、ARS4、ARS1とCEN3との組み合わせ
、並びにARS4とCEN6との組み合わせである。当該複製開始点は、ホスト細胞中で
機能的な温度感受性を為す突然変異を持ちうる。(例えばEhrlich, 1978, Procee
dings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433を参照のこと)

【００５１】 本発明の核酸配列の1以上のコピーは、遺伝子産物の生産を増加させる為にホ
スト細胞に挿入して良い。当該核酸配列のコピー数の増加は、当該配列の１以上
の更なるコピーをホスト細胞のゲノムへ組込むことにより、又は選択的マーカー
遺伝子の増幅したコピーを含む細胞の当該核酸配列を伴う選択的マーカー遺伝子
を導入することにより得ることができうる。その結果、当該核酸配列の更なるコ
ピーは、適切な選択試薬の存在において細胞を培養することにより選択すること
ができる。

【００５２】 本発明の組換え発現ベクター成分を構築する為、上記した成分をライゲーショ
ンする為に使用した当該方法は、当業者に周知である(例えば、Sambrookら、198
9,supraを見よ)。

【００５３】ホスト細胞 本発明は又、組換えホスト細胞に関連しており、それらは本発明の第１局面の
方法並びに本発明の方法において同定した注目の遺伝子によりコードされるポリ
ペプチドの組換え生産において使用される。核酸配列又は本発明の注目の遺伝子
を含んで成るベクターは、先に記述したような染色体成分としてもしくは自己複
製染色体外ベクターとして当該ベクターが保持されるように、ホスト細胞に導入
される。用語「ホスト細胞」は、複製の間に起こる突然変異により親細胞と同一
はではない親細胞の任意の子孫を含む。これらの目的の為のホスト細胞の選択は
、広範囲に至りポリペプチドをコードする遺伝子及びその源に依存するであろう
。

【００５４】 ホスト細胞は、単細胞微生物、例えば原核生物、又は、非単細胞微生物、例え
ば真核生物であってよい。

【００５５】 有用な単細胞生物は、例えばグラム陽性細菌等の細菌細胞であり、限定はしな
いが、バチルス細胞、例えば、バチルス・アルカロフィルス(Bacillus alkaloph
ilus)、バチルス・アミノリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バ
チルス・ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス・サーキュランス(Bacillus cir
culans)、バチルス・クラウシ(Bacillus clausii)、バチルス・コアグランス(Ba
cillus coagulans)、バチルス・ロータス(Bacillus lautus)、バチルス・レンタ
ス(Bacillus lentus)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)
、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・ステアロサーモ
フィルス(Bacillus stearothermophilus)、枯草菌(Bacillus subtilis)及びバチ
ルス・スリンジエンシス(Bacillus thuringiensis);もしくはストレプトミセス(
Streptomyces)細胞、例えば、ストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces liv
idans)もしくはストレプトミセス・ムリヌス(Streptomyces murinus)又は、グラ
ム陰性細菌、例えば大腸菌及びスードモナスsp(Pseudomonas sp)である。好適な
実施態様において、当該細菌ホスト細胞はバチルス・レンタス、バチルス・リケ
ニフォルミス、バチルス・ステアロサーモフィルス又は枯草菌細胞である。他の
好適な実施態様において、バチルス細胞は、好アルカリ性バチルス(alkalophili
c Bacillus)である。

【００５６】 細菌ホスト細胞へのベクターの導入は、例えば、コンピテント細胞(例えば、Y
oung and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81:823-829,又はDubnau a
nd Davidofoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Bioloy 56: 209-221を参
照のこと)、エレクトロポレーション(例えば、Shigekawa and Dower, 1988, Bio
techniques 6: 742-751を参照のこと)又は接合(例えば、Koehler and Thorne, 1
987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278を参照のこと)を用いたプロトプ
ラスト形質転換(例えば、Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics
168: 111-115を参照のこと)により影響を受ける。

【００５７】 ホスト細胞は哺乳類、昆虫、植物又は真菌細胞のような真核生物性であって良
い。

【００５８】 好適な実施態様において、当該ホスト細胞は真菌細胞である。本明細書中で「
真菌」として使用するのは例えば、子嚢菌門、担子菌門、ツボカビ門及び接合菌
門(CAB International,University Press, Cambridge, UK, Anisworth and Bisb
y’s Dictionary of the fungi, 1995年 第8版においてHawksworthらにより定義
された)並びに卵菌門及び全ての栄養胞子真菌(mitosporic fungi)(以前Hawkswor
thら1995年 )の門である。

【００５９】 更に好適な実施態様において、真菌ホスト細胞は酵母菌細胞である。本明細書
中で用いる「酵母菌」は、例えばアスコスポロゲノウス(ascosporogeneous)・酵
母菌 (エンドミセタレス)(Endomycetales)、バシディオスポロゲノウス(basidio
sporogeneous)・酵母菌及び不完全真菌(Fungi Imperfecti)に所属する酵母菌(ブ
ラストミセテス)(Blastomycetes)である。将来において酵母菌の分類が変わりう
るので、この発明の目的の為に、酵母菌はBiology and Activities of Yeast (S
kinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacter
iol. Symposium Series No.9, 1980)における記述のように定義すべきであろう
。

【００６０】 かなり更に好適な実施態様において、酵母菌ホスト細胞はカンジダ(Candida)
、ハンセニュラ(Hansenula)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、ピチア(Pichi
a)、サッカロミセス(Saccharomyces)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyce
s)又はヤロウィア(Yarrowia)細胞である。

【００６１】 最も好適な実施態様においてさえ、酵母菌ホスト細胞は、サッカロミセス・カ
ールスベルゲンシス(Saccharomyces carlsbergensis)、サッカロミセス・セレビ
ジアエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・ディアスタティクス(Sac
charomyces diastaticus)サッカロミセス・ドウグラシ(Saccharomyces douglasi
i)、サッカロミセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)、サッカロミセス・
ノルベンシス(Saccharomyces norbensis)又はサッカロミセス・オビフォルミス(
Saccharomyces oviformis)細胞である。他の最好適な実施態様において当該酵母
菌細胞はヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)細胞である。

【００６２】 他の更に好適な実施態様において、真菌細胞は糸状菌細胞である。「糸状菌」
は真菌及び卵菌(以前1995年Hawksworthらによって定義された)門亜門の全ての糸
状形態等である。当該糸状菌はキチン、セルロース、グルカン、キトサン、マン
ナン、及び他の複合多糖類を含む菌糸体の壁(mycelial wall)により特徴をなす
。栄養増殖は菌糸伸長により、炭素の異化は絶対的に好気性である。対照的に、
サッカロミセス・セレビジアエのような酵母菌による菌糸成長は単細胞の葉状体
の出芽を経、炭素の異化は発酵性であって良い。

【００６３】 かなり更に好適な実施態様において、発酵性糸状菌ホスト細胞は、限定はしな
いが、アクレモニウム(Acremonium)、アスペルジルス、フザリウム、ヒューミコ
ーラ(Humicora)、ムコール(Mucor)、ミセリオピトラ(Myceliophthora)、ニュー
ロスポーラ(Neurospora)、ペニシリウム(Penicillium)、チエラビア(Thielavia)
、トリポクラジウム(Tolypocladium)、又はトリコデルマ(Trichoderma) の種の
細胞である。

【００６４】 最も好適な実施態様において発酵性真菌ホスト細胞はアスペルジルス・アワモ
リ、アスペルジルス・フォエチダス(Aspergillus foetidus)、アスペルジルス・
ジャポニカス(Aspergillus japonicus)、アスペルジルス・ニジュランス、アス
ペルジルス・ニガー又はアスペルジルス・オリザエ細胞である。他の最も好適な
実施態様において、当該発酵性真菌ホスト細胞はフザリウム・バクトリディオイ
デス(Fusarium bactridioides)、フザリウム・セレアリス(Fusarium cerealis)
、フザリウム・クルックウェレンセ(Fusarium crookwellense)、フザリウム・カ
ルモラム(Fusarium culmorum)、フザリウム・バクトリディオイデス(Fusarium b
actridioides)、フザリウム・グラミニアラム(Fusarium graminearum)、フザリ
ウム・グラミヌム(Fusarium graminum)、フザリウム・ヘテロスポラム(Fusarium
heterosporum)、フザリウム・ネグンジ(Fusarium negundi)、フザリウム・オキ
シスポルム(Fusarium oxysporum)、フザリウム・レチクラタム(Fusarium reticu
latum)、フザリウム・ロゼウム (Fusarium roseum)、フザリウム・サンブシナム
(Fusarium sumbucinum)、フザリウム・サルコクロウム(Fusarium sarcochroum)
、フザリウム・スポロトリチオイデス(Fusarium sporotrichioides)、フザリウ
ム・サルフレウム(Fusarium sulphureum)、フザリウム・トルロサム(Fusarium t
orulosum)、フザリウム・トリコテシオイデス(Fusarium trichothecioides)又は
フザリウム・ベネナタム(Fusarium venenatum)細胞である。かなり最も好適な実
施態様において、当該発酵性真菌親細胞はフザリウム・ベネナタム(ニーレンバ
ーグ(Nirenberg)sp.nov)細胞である。他の最も好適な実施態様において、当該発
酵性真菌親細胞は、ヒューミコーラ・インソレンス(Humicola insolens) 、ヒュ
ーミコーラ・ラヌギノーサ(Humicola lanuginosa)、ムコール・ミエヘイ(Mucor
miehei)、ミセリオピトラ・サーモフィラ(Myceliophtora thermophila)、ニュー
ロスポーラ・クラッサ(Neurospora crassa)、ペニシリウム・パープロゲヌム(Pe
nicillium purpurogenum)、チエラビア・テレストリス(Thielavia terrestris)
、トリコデルマ・ハルジアナム(Trichoderma harzianum)、トリコデルマ・コニ
ンジ(Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンジブラチアタム(Trichoderma
longibrachiatum)、トリコデルマ・ロンジブラキアタム(Trichoderma longibr
achiatum)、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)、又はトリコデルマ
・ビリデ(Trichoderma viride)細胞である。

【００６５】 真菌の細胞は、それ自体既知の方法においてプロトプラスト形成、当該プロト
プラストの形質転換及び及び細胞壁の再生を伴う方法によって形質転換しうる。
アスペルジルスホスト細胞の形質転換の為の適切な手法は、EP 238 023及びYelt
onら1984年、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470
-1474.に記述されている。フザリウム種の形質転換の為の適切な方法はMalardie
rら1989年、Gene 78: 147-156及びWO 96/00787に記述されている。著者Becker
と Guarente, In Abelson, J.N.及びSimon, M.I.のGuide to Yeast Genetics an
d Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Acad
emic Press, Inc., New York; Ito ら1983年, Journal of Bacteriolgy 153: 16
3; 及びHinnenら1978年, Proceedings of the National Academy of Science US
A 75: 1920により記述された手法を用いて酵母菌は形質転換されうる。

【００６６】生産の方法 本発明は又、(a)ポリペプチドを含んで成る上清を生産する為に、その野生型
形態が当該ポリペプチドの生産が可能にある株の培養;及び(b)当該ポリペプチド
の回収、を含んで成る本発明のポリペプチドを生産する為の方法に関連している
。

【００６７】 本発明は更に、（a）ポリペプチドの生産を誘導する条件の下で、当該ポリペ
プチドをコードする内因性核酸配列の第2エキソンに作用可能式に結合した調節
配列、エキソン、及び/又は、スプライスドナー部位を含んで成る新たな転写ユ
ニットを、中に組込んだ相同的な組換え細胞の培養;及び(b)当該ポリペプチドの
回収、を含んで成る本発明のポリペプチドを生産する為の方法に関連している。
当該方法は、例えば、米国特許第5,641,670号において記述があるような、遺伝
子の活性化技術の使用を基礎とする。

【００６８】 本発明の生産方法において、当業者に既知の技術を用いて細胞は、ポリペプチ
ドの生産に適する栄養培地中で培養される。例えば当該細胞は、適切な培地及び
当該ポリペプチドの発現及び/又は同定を可能にする条件下において行う、研究
もしくは産業上の発酵槽における小規模又は大規模な(連続、バッチ、フェドバ
ッチ、又は固体培養等)発酵、振とうフラスコ培養により培養して良い。当該培
養は、当業者が周知の手法を用いて炭素及び窒素源及び無機塩類を含んで成る適
切な栄養培地中で行われる。適切な培地は商業的供給者から入手又は公表された
(例えば、Catalogues of the American Type Cultureにある)組成に従って調製
していい。もし、当該ポリペプチドが栄養培地に分泌されなければ、細胞の溶解
によって回収できうる。

【００６９】 ポリペプチドは、当該ポリペプチドに対して特異的な当業者に周知である方法
を用いて検出して良い。これらの検出方法は特異的な抗体の使用、酵素産物の形
成、又は酵素基質の喪失等であろう。例えば、酵素アッセイは、本明細書中で記
述したポリペプチドの活性を決定する為に使用されうる。

【００７０】 得られるポリペプチドは、当業者が周知の様々な手法により回収されうる。例
えば、当該ポリペプチドは、限定はしないが、汎用の手法である、例えば、遠心
、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発又は沈殿により栄養培地から回収されうる。

【００７１】 本発明のポリペプチドは、当業者が周知の様々な手法である、限定をしないが
、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性
、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除)、電気泳動法(例えば、予備等電点
電気泳動)、分画溶解(例えば、硫化アンモニア沈殿)、SDS-PAGE、又は抽出(例え
ばProtein Purification, J.C. Jacson and Lars Ryden, editors, VCH Publish
ers, New York 1989を参照のこと)により精製される。

【００７２】 本発明の詳細な説明 本発明は、既知のスクリーニングアッセイを伴わなず分泌ポリペプチド又は未
知の活性の酵素さえもコードする遺伝子の為の、予め確立した遺伝子バンク又は
ライブラリーのスクリーニングを可能にする。本発明の方法は、汎用のスクリー
ニングアッセイを用いては単離されていないだろう潜在的に産業が注目するポリ
ペプチドのスクリーニングを可能にする。

【００７３】 分泌又は部分分泌の為のシグナル配列を担持するポリペプチドをコードする注
目の遺伝子を、遺伝子ライブラリーから同定及び単離をする為の方法であって: a）ゲノムDNAライブラリー又はcDNAライブラリーを用意し; b）前記ライブラリーへ、分泌レポーターをコードするプロモーターを有しない
及び分泌シグナルを有しないポリヌクレオチドを含んで成るDNA断片を挿入し; c）ホスト細胞に当該挿入したDNA断片を含んで成る当該ライブラリーを導入し; d）活性分泌レポーターを分泌又は部分的に分泌するホスト細胞をスクリーニン
グ及び選択し; e）当該挿入したDNA断片に隣接するDNAのシーケンシングにより、選択ホスト細
胞中の当該分泌レポーターの挿入された注目の遺伝子を同定し、;そして f）段階e)において同定した注目の完全な遺伝子を単離する 段階を含んで成る当該方法。

【００７４】 本発明は、当業者に既知の任意の遺伝子ライブラリーを使用することにより実
行できうり、とりわけて又、一般的に環境試料中に見られるような、生存可能だ
が培養できない生物の遺伝子ライブラリーにも使用する。培養できない生物を含
む環境試料から代表的又は標準化された遺伝子ライブラリーを生産する方法は技
術(アメリカ 第5,763,239号)に記述がある。

【００７５】 従って本発明の好適な実施態様は、段階(f)における注目の完全な遺伝子が段
階(a)のライブラリーから単離された第１局面の方法に関係する。

【００７６】 当業界において、DNA断片をゲノムに挿入する様々な方法が周知であり、ある
例はトランスポジションによる挿入であり、しかしながら、これは通常実行され
る為には時間と労を消費する交配実験を要求する。本発明は、本明細書中で実証
したような商業的に入手可能なin vivoプロトコールを用いて容易に実行できう
る。

【００７７】 本発明のある好適な実施態様は段階b) がin vitroで行われる第1局面に関連す
る。

【００７８】 代表的な様々なDNAが標準化されたライブラリーにより仕事をするに至り本発
明の方法において利点があろうし、DNAライブラリーを標準化するための方法は
当業界に記載が有り、例えばアメリカ特許第5,763,239号を参照のこと。

【００７９】 本発明の好適な実施態様は第1局面の方法に関連している。ここにおいてcDNA
又はcDNAライブラリーが標準化されている。

【００８０】 本発明の他の好適な実施態様は、ゲノムcDNAライブラリー又はcDNAライブラリ
ーが微生物由来である第１局面の方法に関連している。好適な実施態様において
当該微生物は真菌、糸状菌又は酵母菌である。他の好適な実施態様において、当
該微生物は細菌であり、なおも他の好適な実施態様において当該微生物は古細菌
である。多細胞生物からDNA又はcDNAライブラリーを確立する為の方法は、例え
ば商業的に入手可能な哺乳類細胞株から、ショウジョウバエのような昆虫由来、
又は植物もしくは家畜から、及びヒト由来でさえも、同様に当業者に周知である
。特に、糖尿病患者のすい臓の腺又はガン腫瘍由来の細胞のような組織又は器官
由来のライブラリーを使うことに殊のほか注目であろう。

【００８１】 好適な実施態様において本発明は第１局面のいずれかの方法に関連する。ここ
において、ゲノムDNAライブラリー又はcDNAライブラリーは多細胞生物由来、好
適には哺乳類細胞、更に好適にはヒト細胞由来である。

【００８２】 本明細書中の何処かに記述したように、より大きいDNA配列へのDNA断片のラン
ダム組込みの為の技術において複数の方法が当業界において存在する。本発明の
ある好適な実施態様は、第１局面の当該DNA断片がトランスポゾン、好適にはMuA
トランスポゾン含んで成るこ第１局面の方法に関連する。

【００８３】 本明細書中の実施例において記述したように、本発明の方法のホスト細胞中で
機能的である複製開始点を含んで成る本発明のDNA断片を使うことは有益だろう
。

【００８４】 従って、本発明の好適な実施態様は、DNA断片がホスト細胞中で機能的である
複製開始点を含んで成り、好適には当該複製開始点は大腸菌(Escherichia coli)
中で、更に好適には当該複製開始点はcolE1、oriV、P15A又はcolDF13の誘導体で
あり、並びに最好適には当該複製開始点がcolE1である第１局面の方法に関連す
る。

【００８５】 本発明の好適な実施態様は、第１局面の方法に関連する。ここにおいて、分泌
レポーターはタンパク質であり、ホスト細胞から分泌された時、本来当該細胞の
増殖を阻害する物質の存在下で当該細胞の増殖を可能にするタンパク質であり、
好適には当該分泌レポーターはβ-ラクタマーゼ又はインベルターゼである。

【００８６】 本明細書中で何処かに説明したように、方法中の段階(b)のDNA断片のポリヌク
レオチドが、タンパク分解解裂の為の特異的標的部位を含んで成るＮ末端ペプチ
ドリンカーを担持する分泌レポーターをコードするなら、本発明の当該方法は有
益であろう。従って、当該DNA断片をインフレームで分泌又は部分分泌ポリペプ
チドをコードする注目の遺伝子に挿入した時、結果として融合ポリペプチドは、
次の成分を含んで成るであろう: 分泌ポリペプチド- ペプチドリンカー - 分泌
レポーター。従って、特に興味を引く注目の遺伝子が同定された時、当該融合ポ
リペプチドの解裂及び分泌レポーターを伴わないコードされたポリペプチドの単
離が明白であり、同様の融合ポリペプチドの方法は当業界に十分記述がある(例
えば: WO00/75344を参照のこと)。本文中、シングルオープンリーディングフレ
ームを形成する為に、少なくとも2つの遺伝子及び多分他のDNA成分が一緒に結合
され、これらの成分は、それらが列挙されたように同じオーダーにおいて一つの
ポリペプチドで発現し、当該エレメントは「シーケンシャリーフューズド(seque
ntially fused)」又は「フューズドシーケンシャリー(fused sequentially)」と
よばれ、当該ポリペプチドは「融合ポリペプチド」又は「翻訳的融合」に言及す
る。

【００８７】 用語「リンカー(linker)」又は「スペーサー(spacer)」とは、マルチドメイン
タンパク質(multidomeinprotein)のドメイン間に存在するだろうアミノ酸を含ん
で成るポリペプチドを意味し、例えば、コア酵素及びセルロース結合領域(CBD)
のような結合領域もしくは任意の他の酵素ハイブリッド、又は2つのタンパク質
のもしくはポリペプチドの間で融合ポリペプチドとして発現されたポリペプチド
を含んで成る酵素、例えば、2つのコア酵素もしくは本発明の細胞中で1が存在す
るような融合タンパク質を含んで成る融合タンパク質である。例えば、2つのコ
ア酵素の当該融合タンパク質は、1次コア酵素をコードするDNA配列、リンカーを
コードしているDNA配列及び2次コア酵素をコードするDNA配列を連続的にあるオ
ープンリーディングフレームに融合すること及びこの構築体を発現させることに
より用意される。リンカーは又タンパク質分解分割の為の標的部位を含みうる。

【００８８】 本発明の好適な実施態様において、タンパク分解解裂の標的部位は、プロテア
ーゼにより認識され解裂されるアミノ酸配列である。戦略的配置が融合産物の効
率的な解裂を助長するであろういくつかのアミノ酸配列が刊行物に記載されてい
る。これら戦略の大部分には、マザー酵素と必要なペプチドの間のリンカー領域
(linker-region)において部位特異的なタンパク分解解裂を伴う(Polyak et al.
(1997) Protein Engineering, Vol. 10 (6) pp. 615-619; Kjeldsen et al. (19
96) Gene, Vol. 170 (1) pp.107-112; Sun et al. (1995) Protein Engineering
and Purification, Vol.6 (5) pp. 685-692; Martinez et al. (1995) Biochem
ical Journal,Vol. 306 (Pt2) pp. 589-597)。

【００８９】 効率的な解裂を確証する為に、部位特異的プロテアーゼに対する認識部位をコ
ードするアミノ酸配列をマザー酵素と外因性ポリペプチド(この場合当該分泌レ
ポーターは本発明の方法のDNA断片によりコードされる)の間で挿入できた。認識
部位とプロテアーゼの複数の組み合わせが刊行物に記載がある。Kex2プロテアー
ゼは、ペプチド及びそれらのペプチド結合のC末端で解裂される塩基性アミノ酸
対を伴うタンパク質を加水分解する (Bessmertnaya et al. (1997) Biochemisty, vol. 62 (8) pp. 850-857. The Ke
x2 cleavage site used in one preffered embodiment according to the first
and second aspects is the Lys-Arg (KI-R) sequence, but other combinatio
ns of basic amino acids could be inserted to optimize the cleaveage by K
ex2 (Ledgerwood. Et al (1995) J.Biochem., Vol.308 (1) pp. 321-325; or G
hosh, S et al (1996) Gene (Amsterdam), Vol. 176(1-2) pp. 249-255)。

【００９０】 他の有用なプロテアーゼと解裂部位との組み合わせは:エンテロキナーゼ(La V
allie et al. (1993) J.Biol.Chem.,Vol 268 pp.2311-2317)と好適にアミノ酸配
列X-D-D-D-K-/-X解裂、トリプシン(Jonasson et al. (1996) Eur.J.Biochem.,Vo
l 236 (2) pp.656-661)と好適にアミノ酸配列X-K-R-/-Xの解裂、ファクターXa (
Nagai et al.(1985) PNAS,Vol 82 pp.7252-7255) と好適にアミノ酸配列X-I-E-G
-R-/-Xの解裂、コラゲナーゼ(Collagenase)(Chinery et al. (1993) Eur.J.Bioc
hem.,Vol 212 (2) pp. 557-553)と好適にアミノ酸配列P-X-/-G-P-X-Xの解裂、ト
ロンビン(Thrombin)(Rahman et al.(1992) Cell.Mol.Biol.,Vol 38 (5) pp.529-
542) と好適にアミノ酸配列X-G-V-R-G-P-R-/-Xの解裂、ALP(アクロモバクターリ
チカス(Achromobacter lyticus)リジン特異的プロテアーゼ)(Kjeldsen et al.(1
996)Gene,Vol 70(1) pp. 107-112) と好適にリジンでの解裂及び、グルタミン酸
で解裂するバチルス・リケニフォルミス由来C-成分(C-component)プロテアーゼ
(Kakudo et al. (1992) J.Biol.Chem.,Vol 267 (33) pp. 23782-23788)。

【００９１】 特異的標的部位でペプチドを解裂する他の好適な方法は、X-M-/-Xを解裂する
臭化シアン、又はS-N-/-G-Xを解裂するヒドロキシルアミン(Current protocols
in Molecular Biology. Jhon Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R., and Cutt
ing, S.M.(eds.))のような化学的化合物を使用することによる。

【００９２】 本発明の好適な実施態様は第１局面の方法に関連する。ここにおいて段階(b)
のDNA-断片のポリヌクレオチドがコードする分泌レポーターはタンパク質分解解
裂の為の特異的標的部位を含んで成るＮ末端ペプチドリンカーを担持する。

【００９３】 本発明について、良く働く為にいくつかのホスト細胞が想像できうり、当該ホ
スト細胞が認識する注目の遺伝子の分泌シグナル配列及び、当該ホスト細胞が機
能的な分泌レポーターを合成をできることが唯一の基準である。

【００９４】 本発明の好適な実施態様は、第１局面の方法に関連する。ここにおいて、ホス
ト細胞が細菌であり、好適には当該細菌細胞はエスケリキア(Escherichia)、ラ
クトコッカス(Lactococcus)、ストレプトミセス(Streptomyces)、エンテロコッ
カス(Enterococcus)又はバチルス(Batillus)細胞であり、種として大腸菌(Esche
richia coli)、ラクトコッカスラチス(Lactococcus latis)、ストレプトミセス
・グリセウス(Streptomyces griseus)、ストレプトミセス・コエリカー(Strepto
myces coelicor)、エンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis)、
バチルス・アルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)、バチルス・アミロリケ
ファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・ブレビス(Bacillus br
evis) バチルス・サークランス(Bacillus circulance)、バチルス・クラウシ(Ba
cillus clausii)、バチルス・コーグランス(Bacillus coagulance)、バチルス・
ロータス(Bacillus lautus)、バチルス・レンタス(Bacillus lentus)、バチルス
・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)バチルス・メガテリウム(Bacillu
s megaterium)、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophi
lus)枯草菌(Bacillus subtilis)又はバチルス・スリンジエンシス(Bacillus thu
ringiensis)である。

【００９５】 本発明の好適な実施態様は第１局面の方法に関連する。ここにおいてホスト細
胞が真菌であり、好適な当該真菌細胞はカンジダ(Candida)、クルイベロミセス(
Kluyveromyces)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス(Saccharomyces)、シゾサッ
カロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウィア(Yarrowia)、アクレモニウム(Ac
remonium)、アスペルジルス(Aspergillus)、アウレオバシジウム(Aureobasidium
)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、フィリバシジウム(Filibasidium)、フザ
リウム(Fusarium)、ヒューミコーラ(Humicola)、マグナポーゼ(Magnaporthe)、
ムコール(Mucor)、ミセリオピゾーラ(Myceliophthora)、ネオカリマスチクス(Ne
ocallimastix)、ニューロスポーラ(Neurospora)、パエシロミセス(Paecilomyses
)、ペニシリウム(Penicillium)、ピロミセス(Piromyses)、シゾフィリウム(Schi
zophyllum)、タラロミセス(Talaromyses)、サーモアスカス(Thermoascus)、チエ
ラビア(Thielavia)、トリポクラジウム(Tolypocladium)又はトリコデルマ(Trich
oderma)属であり、更に好適な当該糸状菌ホスト細胞はサッカロミセス・セレビ
ジアエ(Saccharomyces cerevisiae)、アスペルジルス・アクレアタス(Aspergill
us aculeatus)、アスペルジルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルジ
ルス・ニジュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルジルス・ニガー (Asperg
illus niger)、又はアスペルジルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)が好ましい
。

【００９６】 本発明の当該真菌ホスト細胞は、サッカロミセス・カースバージェニシス(Sac
charomyces carlsbergenisis)、サッカロミセス・セレビジアエ(Saccharomyces
cerevisiae)、サッカロミセス・ディアスタチカス(Saccharomyces diastaticus
)、 サッカロミセス・ドーグラシ(Saccharomyces douglasii)、サッカロミセス
・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)、サッカロミセス・ノルベンシス(Sacc
haromyces norbensis) サッカロミセス・オビフォルミス(Saccharomyces ovifor
mis) 、アスペルジルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)、アスペルジ
ルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルジルス・フォエチダス(Asperg
illus foetidus)、アスペルジルス・ジャポニカス(Aspergillus japonicus)、
アスペルジルス・ニジュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルジルス・ニガ
ー(Aspergillus niger)、アスペルジルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、フ
ザリウム・バクトリヂオデス(Fusarium bactridiodes)、フザリウム・セレアリ
ス(Fusarium cerealis)、フザリウム・クルックウェレンセ(Fusarium crookwell
ense)、フザリウム・カルモラム(Fusarium culmorum)、フザリウム・グラミニー
ラム (Fusarium graminearum)、フザリウム・グラミナム (Fusarium graminum)
、フザリウム・ヘテロスポラム(Fusarium heterosporum)、フザリウム・ネグン
ジ(Fusarium negundi)、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)、フ
ザリウム・レチクラタム(Fusarium reticulatum)、フザリウム・ロゼウム(Fusar
ium roseum)、フザリウム・サブシナム(Fusarium sambucinum)、フザリウム・サ
ルコクロラム (Fusarium sarcochroum)、フザリウム・スポロトリチオデス(Fusa
rium sporotrichiodes)、フザリウム・サルフリウム(Fusarium sulphureum)、
フザリウム・トルロサム(Fusarium torulosum)、フザリウム・トリコテシオイデ
ス(Fusarium trichothecioides)、フザリウム・ベナタム(Fusarium venenatum)
、ヒューミコーラ・インソレンス(Humicola insolens)、ヒューミコーラ・ラヌ
ギノーサ(Humicola lanuginosa) 、ムコール・ミエヘイ(Mucor miehei)、ミセリ
オピトラ・サーモフィラ(Myceliophthora thermophila)、ニューロスポーラ・ク
ラッサ(Neurospora crassa)、ペニシリウム・パープロゲナム(Penicillium purp
urogenum)、トリコデルマ・ハルジナム(Trichoderma harzianum)、トリコデルマ
・コニンジ(Tricoderma koningii)、トリコデルマ・ロンジブラキアタム(Tricho
derma longibrachiatum)、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)、又は
トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)であって良い。

【００９７】 一層、他の好適な実施態様において、ホスト細胞は哺乳類の、好適にはヒトの
、更に好適にはHeLa細胞である。非限定の周知である哺乳類の細胞の例は、CHO(
チャイニーズハムスターオバリー)、NIH3T3、WRL-68、CoLo587、PANC-1、HeLa S
3、K562、Raji、SW480、Soares B 細胞(ヒト)、Sp2/O-AG14(ネズミの骨髄腫)、B
HK-21細胞(胎児ハムスター腎臓)、Sf9スポドプテラ・フルジペルダ(Spodoptera
frugiperda)(昆虫)、D-MEL-2ヂュロソフィア・メラノガスター(ショウジョウバ
エ、昆虫);等、全てはATCCから商業的に入手可能である。

【００９８】 本発明の好適な実施態様は、本明細書中の何処かで例証したように注目の遺伝
子を単離する為のDNA配列情報に関連する。

【００９９】 従って、本発明の好適な実施態様は第１局面の方法に関連し、ここにおいて第
１局面のDNA断片に特異的な1以上のプライマーを用いること、又は第１局面のDN
AライブラリーもしくはcDNAライブラリーがクローン化されるベクターに特異的
な１以上のプライマーを用いることでシーケンシング段階が行われる。

【０１００】 更に本発明の好適な実施態様は第１局面の方法に関連し、ここにおいて注目の
完全な遺伝子の単離は、第１局面のシーケンシング段階において得られたDNA配
列情報を用いて行われる。

【０１０１】 本発明の方法により単離される注目の遺伝子は、抗体もしくは抗体断片、レセ
プター、もしくは酵素ような医薬的特性を持つぺプチドのような任意のペプチド
をコードしうる。

【０１０２】 従って、当該発明の好適な実施態様は第1局面に関連する。ここにおいて注目
の完全な遺伝子はホスト細胞から分泌される酵素をコードする。

【０１０３】 サイトカインは、標的細胞上の特異的な細胞表層レセプターに結合することに
より幅広い生物学的活性を伝達する分泌調節ペプチドである。サイトカイン作用
は、細胞の増殖と分化のコントロール、恒常性及び免疫性と炎症性応答の調節等
である。サイトカインは又ホスト防衛方法の主要なオーケストレーターであり、
外因性並びに内因性傷害に対する応答及び組織の統合の再建又は修復に含まれる
(Shi et al.,2000.J.Biol.Chem.275:19167-19176)。

【０１０４】 サイトカインファミリーの新規なメンバー及びそれらのレセプターの同定は、
それらが広範囲な生物学的応答を調節することにおいてキーとなる役割をするか
ら非常に重要である。サイトカインは高次に保存された4-ヘリックス結合3次元
構築体を持つが、一次アミノ酸配列においては低いホモロジーを持つ。従って、
ホモロジーに基づいたクローニングを使用して新規のサイトカインの同定はむし
ろ困難である。新規のサイトカインレセプターの分子クローニングは複数の疾患
の病因を理解し、しかるべき治療を仕立てる助けとなるであろう。

【０１０５】 1型サイトカインレセプターファミリーの多くのメンバーは、アッセイとして
リガンドバインディングを用いることでクローン化されてきた。それ故、WSXWS
モチーフに対するオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションプローブとして
使用され、1型のサイトカインレセプターの高次に保存された領域に対するプラ
イマーによる変性ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)も又用いた。今日、既知のサイト
カインレセプターとのホモロジーの結果(Sprecher CA, et al., Cloning and Ch
aracterization of a novel class I cytokine receptor. Biochem Biophys Res
Commun.1998; 246:82)、(ElsonGC,et al., Cytokine-like factor-1,a novel s
oluble protein, shares homology with members of the cytokine type 1 rece
ptor family. J. Immunol. 1998; 161:1371)又はcDNA発現化配列標識(ESTs)の
シグナル配列予測を用いること(Shi, Y et al., 2000, A novel cytokine recep
tor ligand pair, J. Biol. Chem. 275: 19167-19176) で発現化配列標識(EST)
データベースの検索において同定できうるサイトカインレセプターがある。

【０１０６】 cDNAライブラリーがレトロウィルスベクター中で構築され、ホスト細胞中でト
ランスフェクションされ、細胞表層に至るサイトカインレセプターの構成性の活
性突然変異を転送するそれらの能力に対するスクリーニングをして、本来IL-3依
存性であるBa/F3細胞のインターロイキン-3(IL-3)-独立増殖を可能にすることに
より、シグナルのトラッピングを用いるSST-REX(レトロウィルス介在発現スクリ
ーニングによるシグナル配列トラップ)と称される方法を記述した。本発明は、
サイトカインをコードする全長遺伝子の発見の機会を増し、当該遺伝子のシーケ
ンシングが容易に促進される。従って、新規サイトカインの更に迅速な発見が可
能になる。

【０１０７】 他の本発明の好適な実施態様は第１局面の方法に関連し、ここにおいて注目の
完全な膜境結合レセプター、好適には2成分シグナル(TCS)伝達レセプター、及び
更に好適にはサイトカインレセプターをコードする。

【０１０８】 なお、本発明の他の好適な実施態様は第１局面の方法に関連し、ここにおいて
注目の完全な遺伝子は分泌ポリペプチドサイトカインをコードする。

【０１０９】 病原体由来の表層構築体及び分泌因子はワクチンとして潜在的な価値を持つ。
それらタンパク質である表層構築体及び分泌因子は病原体細胞の内部で合成され
、当該細胞の表層又は細胞外部の空間へ分泌される。本発明はそのようなタンパ
ク質の同定に使用して良く、それは後に抗原性に対する試験に使われうる。ワク
チンを作成する為に使ってよい病原体細胞由来の分泌タンパク質の非限定の例は
:リポタンパク質、ペリプラズマチックタンパク質、内膜タンパク質及び外膜タ
ンパク質である。

【０１１０】 ネイッセリア・ゴノロホエアエ(Neisseria gonorrhoeae)由来の複数のそのよ
うなタンパク質は潜在的なワクチン標的として選択され、ワクチンの作成におい
てそれらの適合性の為に試験された(Pizza et al.(2000) Nature 287: 1816-182
0)。病原性のネイッセリア種は子供及び成人において世界的に広くかなりの罹患
率及び死亡率を引き起こす。ネイッセリア・メニンジチディス(Neisseria menin
gitidis)はアメリカにおける子供と若年において細菌性の髄膜炎を導くようにな
る。ヨーロッパ及び北アメリカにおいて、同定される髄膜炎疾患の1/4から2/3の
間がセログループBである。ポリサッカライドワクチンが容易に入手可能な為に
セログループA及びCとは異なり当該セログループBのポリサッカライドは全ての
年代において貧免疫原性である(Bash MC, et al.,2000,Genetic and immunologi
c characterization of a novel serotype 4, 15 strain of Neisseria, FEMS I
mmunol Med Microbiol, 29(3): 169-176)。

【０１１１】 外膜タンパク質(OMP)ワクチンはグループBの髄膜炎疾患に対する防御の為の必
要性を位置付ける為に探索されている(Zollinger, W.D., 1997, New and improv
ed vaccines against meningococcal disease. In: New Generation Vaccines (
Levine, M.M. et al., Eds.),2nd ed.,pp. 469-488. Marcel Dekker, New York)
。

【０１１２】 ワクチンを作成させる為に使用してよい好ましいタンパク質の非限定の例は:
ネイッセリア・ゴノロホエアエの外膜タンパク質MtrE(複合薬剤耐性);BCG(バチ
リ・カルメテ・ジュウリン(bacilli Calmette Guerin))において同定された分泌
抗原であるミコバクテリウム・チューバクロシス(Mycobacterium tuberculosis)
由来の分泌タンパク質Ag85(Tyagi AK (2000) FEMS Microbiol Lett. 190: 30
9-316);スードモナス・アルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)由来の外膜タン
パク質OprM(複合薬剤耐性);及び以下の分泌タンパク質(Molekulare Infektionsb
iologie ed.:Hacker, J. Heesamann, J, Heidelberg; Berlin; Spektru
m, Akad.Verlag 2000): ・ ヤーシニア(Yersinia spp):YopE、H、M、Oのような外部タンパク質(YOPs)
3型 ・ スードモナス・シリンガエ(Pseudomonas syringae): ArvBタンパク質 ・ スードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa) ExoS シトト
ジン(cytotoxin) ・ ネイッセイリア(Neisseria ssp) lgAプロテアーゼ、Typ IVフィムブリア
エ(fimbriae) ・ 大腸菌(Escherichia coli) a-ハエモリシン(a-Haemolysin) HylA、EPECイ
ンチミン(Intimin)(EaeA)インバシン(invasin)、P-フィンブリエン(P-fimbrien)
(Pap)、S-フィンブリン(S-Fimbrin) ・ エントバクテリア(Entobacteria) Typ I フィンブリエ(Fimbriae)

【０１１３】 病原体の表層構築造及び分泌因子は診断の為に使用できうる。病原体の構造体
又は分泌因子に対して特異的な抗体を得る為にそれらは使用できうる。これらタ
ンパク質である表層構造体及び分泌因子は病原体細胞の内部で合成され、当該細
胞の表層又は細胞外部の空間へ分泌された。本発明は、そのようなタンパク質の
同定に使用されて良い。ワクチンの作成の為に適切なタンパク質は診断のアッセ
イにおいて等しく適切であるので、診断用の抗体を作成する為に使用されて良い
分泌タンパク質の例は上記に列挙した物に限定はしない。

【０１１４】 本発明の用途は免疫療法の為の分泌アレルゲンのクローニングであろう。概し
てヒトのアレルゲンはタンパク質を含んで成る。単離した時、そのようなタンパ
ク質は、例えばアレルゲンの皮下投与を介したアレルゲンの寛容の誘導(WO 93/1
9178;WO 99/34826;US 6,048,962;US 5,558,869;WO 98/04274;US 6,147,201;US 5
,693,495;又はUS5,958,891を見よ)の為に使用しされうる。

【０１１５】 以下に列挙したのは、細胞から分泌される主要なヒトタンパク質様アレルゲン
の非限定の例である:ヒトT細胞反応性ネコタンパク質;ダー(Der)fII主要ハウス
ダストノミアレルゲン;AMBTvラグウィード花粉主用アレルゲン(Ragweed pollen
major allergen);5Cロリウムペレンネ(Lolium perenne)花粉アレルゲン;cry J2
ジャパーニーズ杉アレルゲン;Alt a オルタナリア(Altanaria) オルタネータ(al
ternata)主用アレルゲン;及びAra h1 ピーナッツアレルゲンである。

【０１１６】 本発明のトランスポゾン援助シグナル配列をトラップする方法を介して、我々
は膜結合タンパク質をコードする遺伝子を同定することができ、先述したように
、膜結合タンパク質はワクチンの開発において莫大な可能性を持ちうる。膜結合
タンパク質には、例えばリポタンパク質、溶質摂取の為のレセプター、コーラム
センシングレセプター及び感染の方法において主軸たる役割を果たす細菌の2成
分調節系(TCS)の部分が挙げられる。TCSのようなシグナル伝達系は、細菌病原体
が適合性応答の増加及び、栄養の剥奪、抗生物質の猛襲及び食菌作用等の多様な
環境ストレスとうまくやることを可能にする。

【０１１７】 新規な細菌の標的としてのTCSにおける注目は、重要なグラム陽性及びグラム
陰性病原における複数の不可欠なシステムの最近の発見により再燃した(Inhibit
ors of bacterial two-component signalling systems, Macielaq MJ; Goldschm idt R Expert Opinion on Investigational Drugs,Vol.9 (10) pp. 2351-2369(2
000))。

【０１１８】 本発明は、莫大な商業的注目がある細胞壁接着タンパク質のクローニングを可
能にした。独特の化学性及び増殖の為の古い耐性壁(old stress-bearing wall)
の選択的な解裂の必要性の為、当該細菌細胞の壁は細菌疾患の化学療法の為のキ
ーターゲットである(Koch AL Critical Reviews in Microbiology,Vol.26 (1) p
p. 1-35 (2000))。現在、多くの感染性微生物は過剰に使用した抗生物質に対し
て耐性を持ちつつある。尚、当該壁は良い標的であり、壁の同化物の他のパーツ
及び機能に対して、いくつかのまったく新しい抗生物質の標的の分類がありうる
。不可欠な自己溶解素は特に対応の標的であってよい。

【０１１９】 アドハエジンス(adhaesins)等の本発明を用いて同定し発見できうる他のタン
パク質は以下のようなものである:尿路大腸菌(uropathogenic E.coli)のP-フィ
ンブリアエ(P-fimbriae)(Pap)、S-フィンブリアエ(S-Fimbriae) 、ネイッセイリ
ア(Neisseria)の4型フィンブリアエ及びエンド細菌(entobacteria)の1型フィン
ブリアエ並びにインバシン(Invasins)例えばEPEC :インチミン(Intimin)(EaeA)
インバシン(Molekulare Infektionsbiologoe ed.: Hacker, J. Heesemann, J,
Heidelberg; Berlin; Spektrum,Akad. Verlag 2000)。

【０１２０】 従って、本発明の他の好適な実施態様は第１局面の方法に関連し、ここにおい
て注目の完全な遺伝子はヒトにおける免疫性応答を誘発するポリペプチドをコー
ドする。

【０１２１】 バクテリオシン(Bacteriocins)は異なる細菌に対する抗生物質活性を持つ小さ
なペプチドである。それらはある細菌及び真核生物種によって合成される。例は
:ルーコシンA(Leucosin A)、ペジオシンPA-1(Pediocin PA-1)、エンテロシンA及
びP(Enterocin A and P)、サッカシンA及びP(Sakacin A and P)並びにニシン(Ni
sin)である。バクテリオシンは食品を細菌汚染に対して防衛する為に用いられ、
食品産業において潜在的な商業的価値がある。バクテリオシンは大抵分細胞外空
間へと輸送される分泌タンパク質であるので、コード遺伝子は適切なホスト微生
物及び適切な分泌レポーター遺伝子を用いることにより本発明のシグナルのトラ
ッピング法を介して単離されうる。sec依存方式(sec-dependent manner)におい
て分泌されるバクテリオシンを単離する為に、sec依存レポーターはβ-ラクタマ
ーゼ等が使用されうる。

【０１２２】 最近数多くのバクテリオシンが特徴付けられてきて、新規のバクテリオシンの
大部分は、小さな(30-100アミノ酸)熱安定性タンパク質であり通常後翻訳修飾を
受けないクラスIIのバクテリオシンに属する。共通の特徴に基づき、当該クラス
IIのバクテリオシンはペディオシン(pediocin)様及び強い抗リステリアバクテリ
オシン、2-ペプチドバクテリオシン、及びsec依存シグナル配列を有するバクテ
リオシンのようなグループに細別できるもののある。sec依存シグナル配列を含
むとても稀なバクテリオシンを除き、クラスIIバクテリオシンＮ末端2重-グリシ
ンリーダー配列を含む前形体において合成される。バクテリオシンを含む当該Ｎ
末端2重-グリシンリーダーは、Ｎ末端タンパク質分解ドメイン所有を示す専用の
ABC-担持系よる細胞外在化に付随してプロセッシングされる(Nes, I.F., et al.
, 1996, Int J Gen Mol Microbiol 710:113-128)。

【０１２３】 本発明の好適な実施態様は第１局面の方法に関連する。ここにおいて注目の完
全な遺伝子がバクテリオシンをコードする。

【０１２４】 植物の病原性細菌、真菌及び他の微生物の多くの病原性因子は分泌タンパク質
である。例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tu
mefaciens）のvir遺伝子は細菌から植物細胞へのtDNA移送を仲介する分泌タンパ
ク質をコードする。この移送は、A.チュメファシエンスの病原性の為には欠かせ
ない。又例えば、ウスチラゴ・マイディス(Ustilago maydis)のような真菌種、
黒穂病の原因は真菌の病原性をはらむタンパク質を分泌する。他の細菌の植物の
病原体はスードモナス属、ザンソモナス属(Xanthomonas ssp)及びステノトロフ
ォモナス属(Stenotrophomonas spp)である。本発明の方法は、植物の病原体が有
する分泌タンパク質をコードする遺伝子を単離する為に使用されて良く、これら
のタンパク質は代わって、当該分泌タンパク質の阻害剤を設計する為に使用され
る。

【０１２５】 従って、本発明の好適な実施態様は第１局面の方法に関連し、ここにおいて注
目の完全な遺伝子は植物の病原性ポリペプチドをコードする。

【０１２６】 先に述べたように本発明の方法は、後に産業規模において発現する注目の遺伝
子の単離の為に用いることができうる。しかしながら、これは当業界で記述があ
り、本明細書中で何処かに記載したような発現系の構築を要求する。

【０１２７】 本発明の好適な実施態様は第１局面の方法に関連する。ここにおいて、発現系
構築の更なる段階が行われ、前記発現系は第１局面において単離した注目の完全
な遺伝子を含んで成る。

【０１２８】 遺伝子が本発明の方法により単離され、好適には当該遺伝子は遺伝子ライブラ
リーから単離された注目の遺伝子。

【０１２９】 先の局面において定義した注目の遺伝子によりコードされた酵素。

【０１３０】 先の局面において定義した注目の遺伝子を含んで成る発現系。

【０１３１】 先の局面において定義した発現系を含んで成るホスト細胞。

【０１３２】 先の局面において定義した注目の遺伝子の2以上の染色体的に組み込まれたコ
ピーを含んで成るホスト細胞。

【０１３３】 上に定義した注目の遺伝子の発現に適した条件の下で、先の局面において定義
したホスト細胞の培養を含んで成るポリペプチドを生産する為の方法であって、
ここにおいて前記ホスト細胞は増殖培地中の前記遺伝子によりコードされたポリ
ペプチドを分泌する。

【０１３４】 本発明の好適な実施態様は、ポリペプチドが酵素である最終局面に関連する。

【０１３５】 最終的に、本発明の好適な実施態様は当該ポリペプチドを精製する更なる段階
が実行される最終局面の方法に関連する。

【０１３６】 実施例実施例１ β-ラクタマーゼレポーター遺伝子を含有するSigAトランスポゾンの構築。本
実施例は分泌シグナルを取り除いたβ-ラクタマーゼを利用する。当該β-ラクタ
マーゼは、タンパク質が周縁質に分泌された時のみ大腸菌上でアンピシリン耐性
を担持し、β-ラクタマーゼの細胞質発現はアンピシリン耐性を付与しない。シ
グナル配列を欠くことで、当該β-ラクタマーゼ酵素は周縁質に輸送されず、従
って、そのクローンはアンピシリンを含む培地上で増殖しないであろう。下記の
トランスポゾンのin vitroトランスポジションを使用することでβ-ラクタマー
ゼ遺伝子は当該標的クローンに輸送される。

【０１３７】 シグナルを有しないβ-ラクタマーゼ遺伝子を含有するトランスポゾンの構築
は、標準的な分子生物学的技術を用いて実行した。当該シグナルを有しないβ-
ラクタマーゼ遺伝子は最初、プルーフリーリディングポリメラーゼ(例えばPfu T
urbo)を使用して(ベクターpUC19からのような)商業的に入手可能な源からPCRで
増幅した。結果的に、PCR断片は、クローニングの助けと成る為に制限部位NotＩ
及びEcoRIを含んだ。

【０１３８】 クロラムフェニコール耐性をコードするミニ-トランスポゾンMuAを、商業的に
入手可能なキット(Finnzymes)からプルーフリーディングポリメラーゼ(Pfu Turb
o)及びプライマーMuA-F (SEQ ID No.1):5´-GAAGATCTGAAGCGGCGCACGAを用いてPC
R増幅した。結果として、当該PCR断片を含有するトランスポゾンを精製しカナマ
イシン耐性遺伝子を含有するpK184ベクターに連結した。

【０１３９】 ライゲーション混合物を大腸菌DH10B中にエレクトロポレーションし、トラン
スポゾン断片の挿入されたpK184を含有するクローンを、クロラムフェニコール
及びカナマイシンを含む培地上で選択した。多くのコロニーを回収し、プラスミ
ドDNAはそれら10個から単離した。シーケンシングで、シグナルを有しないβ-ラ
クタマーゼ遺伝子のプラスミドpK184上に含んだトランスポゾンMuA中への正確な
挿入を示した(Jobling M.G., Holmes R.K. 1990. Construction of vectors wit
h the p15a replicon, kanamycin resistance, inducible lacZalpha and pUC18
or pUC19 multiple cloning site. Nucleic Acids Res.18:5315-5316)。

【０１４０】 シグナルを有しないβ-ラクタマーゼ遺伝子を、トランスポゾン境界領域(MuA
の場合およそ50bp)とβ-ラクタマーゼコーディング領域との間に連続したオープ
ンリーディングフレームがくるような方法においてトランスポゾン内に含有させ
る。このように、当該修飾化トランスポゾンは、分泌されたタンパク質をコード
する遺伝子中にそのトランスポーズした時、標的遺伝子とのインフレームでの融
合を引き起こすことができる。これは、大腸菌の周縁質に分泌され、アンピシリ
ンに対する耐性を担持する融合遺伝子産物をもたらす。全ての分泌遺伝子中のト
ランスポジション事象が首尾良いインフレーム融合をもたらすわけではないが、
ポジティブ選択を使用した時、我らは多数をスクリーニングでき、従って、とて
もまれな事象でさえ選択する。

【０１４１】 実施例2 β-ラクタマーゼレポーター遺伝子を含有するSig2Aトランスポゾンの構築。シ
グナルを有しないβ-ラクタマーゼレポーター遺伝子を含有するトランスポゾン
の構築を、標準的な分子生物学的技術を用いて実行した。当該シグナルを有しな
いβ-ラクタマーゼ遺伝子は、プルーフリーリディングポリメラーゼ(Pfu Turbo
、Stratagene,USA)を使用してベクターpUC19から最初、PCRで増幅した。結果と
してPCR断片は、クローニングの助の為に制限部位NotＩ及びEcoRIを含んだ。エ
ントランスポゾン(Entranceposon)及び抗生物質耐性マーカーCAT(トランスポゾ
ンにおいてクロラムフェニコール耐性をコードする)を含有するプラスミドpEntr
anceposon(Cam’)をFinnzymes,OY(Espoo Finland)から得た。当該プラスミドを
制限酵素Not I及びEcoRIにより消化させ、ゲル精製し及び断片を含む当該シグナ
ルを有しないβ-ラクタマーゼとライゲーションさせる。当該ライゲーションを
電気反応性DH10B細胞中で形質転換させ、シグナルを有しないβ-ラクタマーゼを
伴う組換えプラスミドを含有する大腸菌クローンを制限解析により単離し、E.Co
li SigA2と命名した。E.coli SigA2 由来のプラスミドDNAはQiaSpinプロトコー
ルにより単離し、BgIII で消化した。トランスポゾンを含むDNA断片はGFXプロト
コールを用いてゲル精製した。当該DNA断片はシグナルを有しないβ-ラクタマー
ゼを含有するトランスポゾンでありSigA2と呼ぶ。

【０１４２】実施例3 細胞外キシログルカナーゼXYG1006のシグナルのトラッピングにおいてレポー
ター遺伝子としてシグナルを有しないβ-ラクタマーゼを含有するSigAトランス
ポゾンの使用。

【０１４３】 第一に、当該SigAミニトランスポゾンは、アッセイ可能な分泌遺伝子産物をコ
ードする既知の遺伝子を含むクローン化サブゲノム断片中にトランスポジション
した。この実施例において、パエニバチルス・ポリミザ(Paenibacillus polymyx
a)由来のキシログルカナーゼを使用した。当該キシログルカナーゼは、エスケリ
キア・コリ(Escherichia Coli)DSM13321中のプラスミドから得られる4.6kbのサ
ブゲノムクローン断片上の巨大なオープンリーディングフレーム(3036bp)である
。

【０１４４】 段階１:リニアーなミニトランスポゾンを、ミニトランスポゾン全体を増幅する
プライマーmuA-f(SEQ ID 1)を用いて、Pfu turboポリメラーゼ(Stratagene Inc.
,USA)によるpsigA のPCRにより調製した。当該ミニトランスポゾンをGFXカラム(
Pharmacia)を使用して精製し、23ng/ulに希釈し、標準FinnzymeGPSトランスポジ
ションプロトコール中で使用した。

【０１４５】 段階2:シグナルのトラッピングミニトランスポゾンsigA、プラスミドpXYG1006、
5Xバッファー及びトランスポゾームをEppendorf(商標登録)チューブ中で適切な
濃度において混合し、in vitroトランスポジション反応はオリジナルFinnzymes
プロトコールに従い実行した。オリジナルCAMミニトランスポゾンと同じプラス
ミドを用いたコントロール実験を並行して行った。当該トランスポジション反応
体は、Biorad Gene Pulse装置(50uF, 25mAmp, 1.8 kV)におけるエレクトロポレ
ーションにより大腸菌XL1-ブルー電気反応性細胞(Stratagene,USA)に形質転換し
た。当該細胞を1mlSOC培地中で希釈し、シェーカーで37℃において1時間に渡り
前培養した。適切な希釈液を、形質転換を確かめる為に下記のLB固体培地上に塗
布した。シグナルのトラッピングの効率は表1のように示す。

【０１４６】固体LB培地 : LB-kan(50mg/mlカナマイシン) LB-CAM(10mg/mlクロラムフェニコール) LB-CAM-AMP(10mg/mlクロラムフェニコール、100mg/mlアンピシリン) LB-CAM、amp、AZCL-キシログルカン(10mg/mlクロラムフェニコール、50mg/mlア
ンピシリン、0.07% w/v AZCL-キシログルカン)

【表１】

【０１４７】 LB-CAM-AMP上で増殖するコロニーを、ORFの最初の900bp中にあるキシログルカ
ナーゼドメインの頻繁な分裂を得る為にLB-CAM-AMP AZCL-キシログルカン上で繰
り返し培養した。

【０１４８】 アンピシリン及びクロラムフェニコール上で選択した大腸菌クローンは、XYG1
006シグナルペプチドが大腸菌の周縁質へβ-ラクタマーゼの担持を引き起こした
ように、β-ラクタマーゼレポーター遺伝子がXYG1006キシログルカナーゼ遺伝子
と翻訳融合を為したそれらである。全てのポジティブクローンがシグナル配列の
トランスポゾン下流を含むことをシーケンシングで確かめた。10のランダムなア
ンピシリン耐性コロニー由来のプラスミドDNAをQiaspin手法(Qiagen)を用いて調
製し、DNA配列はトランスポゾンに特異的な2のプライマーを用いてプラスミドか
ら決定した。 SigA-r (SEQ ID 2):GCACCCAACTGATCTTCAGCA,及び SiqB (SEQ ID 3):TTATTCGGTCGAAAAGGATCC; 又は SigA2up (SEQ ID 4):AGCGTTTGCGGCCGCGATCC,及び SiqB (SEQ ID 3)。

【０１４９】 解析がXYG1006コーディング領域にあるSigAトランスポゾンは、キシログルカ
ナーゼオープンリーディングフレームとインフレームであるということを示す。
β-ラクタマーゼ遺伝子とXYG1006のネイティブシグナルペプチドとのインフレー
ムの融合の典型的な例は以下のように:

【０１５０】 クローンpSigA2-11を2重選択(LB-CAM-AMP)の下プレート上で増殖することが出
来るシグナルコロニーとして単離した。プラスミドDNAはQiaspin^TMプラスミド調
製キット(Qiagen GMBH)を用いてこの単離から調製した。当該プラスミドDNAを、
反応を実行するABIシーケンシングキットを使用してABI Prizm 377シーケンサー
中でプライマーSeqA及びSeqB(Finnzym Inc.)を用いてシーケンシングした。遺伝
子と分泌レポーターβ-ラクタマーゼ遺伝子の間でインフレームでの融合を為す
に至るような方法において、pSigA2-11のDNA配列解析が示したのは、当該SigA2
トランスポゾンが、キシログルカナーゼをコードする遺伝子、XYG1006のATG開始
コドンから挿入された58bpであると示す。これは、19のアミノ酸分泌シグナルペ
プチドは大腸菌の周縁質に対して有効に標的した当該β-ラクタマーゼ酵素であ
る、β-ラクタマーゼペプチドに融合していることをもたらした。

【０１５１】実施例4 細胞外プルラナーゼPULL1012のシグナルのトラッピングにおいてシグナルを有
しないβ-ラクタマーゼをレポーター遺伝子として含有するSig2Aトランスポゾン
の使用。

【０１５２】 第一に、SigA2ミニトランスポゾンを、アッセイ可能な分泌遺伝子産物をコー
ドする既知の遺伝子を含むクローン化したサブゲノム断片中にトランスポジショ
ンした。この実施例において、アナエロブランカ・ホリコシ(Anaerobranca hori
koshii)DSM9786由来のPULL1012プルラナーゼを使用した。当該プルラナーゼを、
3054bpのサブゲノムクローン断片上の巨大なオープンリーディングフレーム(259
7bp)によってコードさせる。当該SigA2ミニトランスポゾンはGFXカラム(Pharmac
ia)を使用して精製し、純粋なDNAを20ng/ulに希釈し、標準Finnzyme GPSトラン
スポジションプロトコール中で使用した。

【０１５３】 シグナルトラッピングするミニトランスポジションSigA2、プラスミドpPULL10
12、5Xバッファー及びMuAトランスポサーゼ(Transposase)をEppendorf(商標登録
)チューブ中で適切な濃度にて混合し、in vitroトランスポジション反応をオリ
ジナルFinnzymeプロトコールに従い実行した。当該トランスポジション反応体は
、Biorad Gene Pulse装置(セッティング: 50uF, 25mAmp, 1.8 kV)におけるエレ
クトロポレーションにより大腸菌DH10B電気反応性細胞(Stratagene,USA)に形質
転換した。引き続きエレクトロポレーションで、当該細胞は1mlSOC培地中で希釈
し、シェーカーで37℃において1時間に渡る前培養をしカナマイシン、アンピシ
リン及びクロラムフェニコールを含有するLBアガー培地上に塗布した。

【０１５４】 カナマイシン、アンピシリン及びクロラムフェニコール上で選択した大腸菌ク
ローンは、PULL1012シグナルペプチドが大腸菌の周縁質へのβ-ラクタマーゼの
輸送を引き起こしたようにβ-ラクタマーゼレポーター遺伝子がPULL1012プルラ
ナーゼ遺伝子と翻訳融合を為したそれらである。全てのポジティブクローンをPU
LL12シグナル配列のトランスポゾン下流を含むことをDNAシーケンシングで確か
めた。15のランダムなアンピシリン耐性コロニー由来のプラスミドDNAはQiaspin^TM 手法(Qiagen)を用いて調製し、DNA配列をトランスポゾンに特異的な2のプライ
マーSigA2up(SEQ ID 4)及びSeqB(SEQ ID 3)を用いて決定した。これらの結果は
図１に記載がある。

【０１５５】 ある場合において分泌シグナルレポーターを、結果的に、融合ポリペプチドが
分泌されたポリペプチドの活性を保持するような方法において、分泌ポリペプチ
ドをコードする遺伝子内のホストゲノム中に挿入するであろう。例えば当該分泌
シグナルレポーターが遺伝子の最3´末端に存在しうり、本実験において単離し
た2つのクローンのケースが事実そうであった:Tn4-12-ab 1(14>777)及びTn4-4-.
ab(17>719)。切断したプルラナーゼ及び分泌レポーターβ-ラクタマーゼの融合
ポリペプチドは、これら2つのクローンにおいて実体的なプルラナーゼ活性を保
持しており、図1のボックスに示してある。

【０１５６】 本発明のスクリーニングの段階は、分泌レポーター及び、プルラナーゼのよう
な注目の酵素活性の両方に対してスクリーニングをする為に形作られて良く、こ
れはそのような分泌タンパク質に対してだけではなく特異的な分泌タンパク質に
対してとても迅速且つ有効なスクリーニングを可能にするであろう。ハイスルー
プットスクリーニングアッセイと共同して本発明は、特に注目のスクリーニング
可能な活性を有する分泌ポリペプチドをコードする遺伝子を単離する為の力強い
スクリーニングツールとして使用されうる。

【０１５７】 更に、本発明の方法のDNA断片において含まれる分泌レポーターをコードする
遺伝子は、特異的なタンパク質分解酵素に対する標的配列をコードするDNA配列
と上流で、インフレームで結合してよく、かくして ｉ）本発明の挿入されたDNA断片の上流に有るDNA配列によりコードされる当該分
泌シグナル及びポリペプチド; ii)タンパク質分解標的部位を含んで成るリンカー;及び iii )分泌レポーター から成る融合ポリペプチドを供する為に、分泌シグナルの後方へその挿入後その
ような方法において、インフレームに結合うる。

【０１５８】 このような形態は、上記2つのプルラナーゼ融合体のような、注目の活性有す
る分泌融合ポリペプチドに対するスクリーニングの時、又は抗体及び他の生物学
的に活性な分子に対するスクリーニングする時に特に有益である。注目の融合ポ
リペプチドの単離後、単離した一次クローン単離体を培養することにより急速に
実体的な量で生産できたであろう。得た当該融合ポリペプチドは、活性ポリペプ
チド及び活性レポーターに結合している標的部位を分裂させる為、特異的なタン
パク質分解酵素により処理でき、実体的に純粋な活性ポリペプチドはほぼ即座に
アッセイできたであろう。分泌レポーターに対して特異的な抗体を一次精製もし
くは単離段階において使用でき、又本発明のDNA断片はHis/NiTa-コーラム精製を
可能にするポリヒスチジン-リンカーを含んで成ることができる。概略化した手
法は、ゲノムクローン発現及びクローニングの、数多くの通常困難且つ時間を消
費する段階を回避するであろう。融合リンカーの例はPCT DK00/00296に示し、上
記に言及した。

【０１５９】実施例5 トランスポゾンSigAの使用で、ゲノムライブラリーにおいてシグナル配列を含
むタンパク質をコードする遺伝子の同定。サブゲノムプラスミドDNAライブラリ
ーを、実施例2に記述した方法に従いシグナルトラッピングミニトランスポゾンS
igAにより標識する。本実施例において、標準的な方法により調製したパエニバ
チルス・パブリゲノムライブラリーを使用した。形質転換を培地1、2及び3(表2)
上でプレートアウトするべきである。

【表２】

【０１６０】 プラスミドDNAをクロラムフェニコール及びアンピシリン(選択培地3)により増
殖するポジティブクローンから単離し、トランスポゾン中に位置する配列を標的
とするプライマーからシーケンシングできうる。このようにして、シグナルトラ
ッピングした遺伝子のDNA配列を得た。多くの場合において、2つのトランスポゾ
ンプライマーによる単独の解読(single reads)はコーディング領域の遺伝子配列
の殆どを生むであろうし、それ故汎用のプライマーは、当該遺伝子配列を完全に
する為に最初のラン中で得た配列から合成できうる。他の方法はライブラリーの
全体をカバーする為に要求される量に比べて3-100倍以上の形質転換体を作成さ
せる事である。これは、いくつかの独立したトランスポジション作成において、
同じ遺伝子中だけでなく各クローン内の遺伝子の異なった位置においてトランス
ポゾンが位置することを可能にする。コンピューターコンティグ収集プログラム
(computer contig assembly program)を同じ遺伝子のオーバーラッピング領域に
現れるトランスポゾンを集める為に適用できる。この方法において、多くの分泌
遺伝子の完全又はほぼ完全な範囲が得られる。

【０１６１】実施例6 ゲノムライブラリーにおいて、新規トランスポゾンSigA2を用いてシグナル配
列を持つタンパク質をコードする遺伝子の同定。

【０１６２】 本実施例において、標準的な方法により調製したパエニバチルスNN018026(200
1年2月8日にDSMZでDSM14046として寄託した)ゲノムライブラリーを使用した。サ
ブゲノムプラスミドDNAライブラリーを実施例2に記述した方法に従い、シグナル
のトラッピングミニトランスポゾンSigA2により標識した。特に、プラスミドDNA
ライブラリーの1ul(1.85ug)、4ulの5X反応バッファー、1ul(200ug)のSigA断片及
び13ulの水を標準Finnzymesトランスポジションプロトコール中で使用した。形
質転換混合物は培地1、2及び3（表3）上でプレートアウトし、結果は表3に示す
。

【表３】

【０１６３】 Oia-spin^TM又はQiaprep turbo^TMミニプレップ(Qiagen Inc)により、選択培地3
上のクロラムフェニコール(CAM)、カナマイシン(kan)及びアンピシリン(amp)を
伴って増殖したポジティブクローンからプラスミドDNAを単離した。シグナルト
ラッピングした遺伝子の上流を読むSigA2upプライマー(SEQ ID 4)、又はトラッ
ピングした遺伝子の下流を読むSeqBプライマー(SEQ ID 3)により当該プラスミド
DNAをシーケンシングした。このようにして、シグナルトラップした遺伝子のDNA
配列を得た。多くの場合、たった2つのトランスポゾンプライマーによる単独の
解読はコーディング領域の大抵の配列を生産するだろうし、他に「プライマーウ
ォーキング」によるシーケンシングにより当該配列を完全にする為の最初のラン
で得た配列からカスタムプライマーを合成できうる。

【０１６４】 完全な配列を得る為の他の方法は、ライブラリーの全範囲をカバーする要求に
比べて3-100倍以上の形質転換体を作成する事である。それぞれ独立したトラン
スポジション事象を示す複数のクローンが作成と単離出来うるように、これは同
じ遺伝子中だけでなく遺伝子の異なった位置においてトランスポゾンが位置する
ことを可能にする。コンピューターコンティグ収集プログラム(computer contig
assembly program)を同じ遺伝子のオーバーラッピング領域を占めるトランスポ
ザントを集成する為に適用できる。このように、多くの分泌遺伝子の完全又はほ
ぼ完全な範囲が得られ、例えば、実施例４のPULL1012プルラナーゼコード遺伝子
の全体の配列は図１に示した数多くのオーバーラッピング配列のコンティングア
ッセンブリ(conting assembly)により推定することが出来うる。

【０１６５】 本実施例において、推定上のタンパク質をコードする複数の異なったオープン
リーディングフレームコーディング由来のシグナル配列を同定した。例えば、分
泌酵素: -１つのプルラナーゼ -3つのセルラーゼ -3つのキチナーゼ(chitinases) -1つのセルビオハイドラーゼ -１つのイソマルトデキストラナーゼ -2つのペクテートリアーゼ -１つのラモガラクチュロナーゼ(Rhamogalacturonase) -１つのアルギネートリアーゼ -1つのレバナーゼ と配列の相同性を示す複数の遺伝子である。

【０１６６】 記載の推定上の分泌タンパク質に対してかなりの配列の相同性を示し、又はタ
ンパク質分泌の為のシグナル配列であると予想される配列を含む全12の遺伝子を
同定した。推定上の分泌ペニシリン-結合タンパク質をコードする2つの遺伝子を
同定した。推定上の分泌溶質結合タンパク質をコードするような7つの遺伝子を
同定した。2つの遺伝子は推定上の膜貫通タンパク質をコードした。推定上の統
合膜タンパク質、LPLB PROTEIN(aa同一性40%)に類似のクロストリジウム・ステ
ィクランジ(aa同一性50%)推定膜タンパク質のbmpAに類似のabcトランスポーター
の基質結合リポタンパク質前駆体をコードする遺伝子;並びに細胞質膜の外側に
位置するが、アグロバクテリウム・チュメファシエンスの推定上の多重糖結合性
周縁質レセプターchve前駆体(aa同一性68%)又は大腸菌のd-キシロース-結合性周
縁質タンパク質(aa同一性43%)のようなアンカーペプチドタンパク質、により膜
に結合されたタンパク質をコードする遺伝子。

【０１６７】実施例7 シグナルのトラッピング計画由来の情報の使用。遺伝子ライブラリー由来の分
泌タンパク質をコードする、全又は大部分の遺伝子についての配列情報の獲得が
第一歩である。トラップした多くの遺伝子は既知又は未知の機能の分泌タンパク
質である。従って、当該遺伝子は２種類に分けてしかるべく扱った。ORFのある
種類は既知の酵素に対してアミノ酸レベルでかなりの類似性を持つ。これらORF
は最適な発現ベクター中でサブクローニングでき、構築体は当該酵素のかなりの
レベルの発現に使用でき、それは様々な用途において試験できうる。

【０１６８】 ORFの他の種類は任意の既知の酵素に対してかなりのホモロジーを持たないが
同等に注目される。発現ベクター中でサブクローニングでき、既知のORFの同じ
様に発現した。しかしながら、これらORFの(もしあれば)酵素活性は未知である
ので、それらの活性を観測する為の特異的なアッセイが存在せず、ランダムな用
途試験をすることが適切である。

【０１６９】実施例8 トランスポゾンによる真核生物シグナルのトラッピング。多くの真核生物は又
酵素を分泌し、例えば真菌は、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ等多くのク
ラスの酵素を分泌する。真核生物ゲノムの相対的なサイズ及び複雑性の為、一般
的に酵素をコードする遺伝子はcDNAライブラリーから発現クローン化されるか又
はEST（発現化 配列 標識）シーケンシングプログラムにおいて同定する。cDNA
ライブラリーは、当該真核生物由来の誘導バイオマスから単離したmRNAから作成
した。当該cDNAライブラリーにおいての広範囲の多様な分泌酵素を提供する為の
、方法が当業者に既知であり、これらの方法は例えば:別々の及び異なった誘導
条件からのバイオマス物質を貯蔵し、しかる後に、クローニング前後のmRNAもし
くはcDNAの標準化である。

【０１７０】 原核生物及び真核生物におけるシグナルトラッピングの背景にある基礎的な理
論は本質的に同様である。主なる違いは以下のようであり:cDNAライブラリーは
それをクローン化したベクターにより供給されるプロモーターに依存する。当該
cDNAライブラリーは発現するゲノムのサブセットであり、このことはコーディン
グ領域中へのトランスポゾンのヒット率が原核生物ゲノムライブラリーからのシ
グナルのトラッピングより高いということを意味する。

【０１７１】 シグナルのトラッピングマーカーはスクリーニングする生物にとって特異的で
なければならない。例えば、真菌遺伝子の為の一般的なスクリーニング生物は:
サッカロマイセス・セレビジアエ、アスペルジルス・ニガー又はシゾサッカロマ
イセス・ポンベである。本実施例において我々は、Jacobs, K.A., 1997, Gene 1
98:289-296に記載のあるインベルターゼシグナルのトラッピング系を使用した。

【０１７２】 修飾インベルターゼ遺伝子は、pSigAミニトランスポゾンへインフレームでの
クローニンングの為にNotＩ及びEcoRI部位を含ませる為にPCRによりクローン化
する。当該βラクタマーゼは制限消化及びゲル精製により取り除く。pSigAの原
核生物版にまさに記載したように当該インベルターゼが左側のトランスポゾン境
界のリーディングフレームとインフレームで融合するようにpSigAミニトランス
ポゾンへのインベルターゼ遺伝子のクローニングをライゲーション反応は可能に
する。当該完全クローン:pSigBは酵母菌における試験の準備が整っている。

【０１７３】 最初の試験は、発現クローン化した分泌酵素をコードするcDNAを含有するプラ
スミドに対してなされる。当該cDNAはアスペルジルス・アクレアタスのラムノガ
ラタノアーゼ(Rhamnogalaturnoase)をコードする rhgA遺伝子である(Kofod et a
l; 1994. J Biol C hem 46:29182-29819)。In vitroトランスポジション反応は
、上記の細菌の方法にまさに記載した様に、23ngのSigBミニトランスポゾンによ
り実行する。次いで、処理したrhgAプラスミドは、天然インベルターゼ遺伝子を
取り除いた酵母菌細胞W3124へと形質転換した。コロニーは高密度(プレートあた
り1000コロニー)でプレート培養し、シュークロース又はラフィノースのあるSC
培地(Sherman, F. 1991. Methods Enzymol., 194:3-21)上でレプリカプレート培
養した;一般的な結果は表4に示す。

【表４】

【０１７４】 シュークロース上で増殖可能な酵母菌コロニー由来のDNAは、Strathern及びHi
ggensの方法(1991, Method Enzymol. 194:319-329)により大腸菌へレスキューし
た。プラスミドDNAをQiaspinプロトコール(Qiagen)により単離し、プラスミドは
挿入体の配列を決定する為にYES2.0ベクタープライマー及びトランスポゾンプラ
イマーによりシーケンシングした。多くの場合、プライマーによる配列決定は、
このように全長遺伝子の解析及び活性発現クローンの構築を可能にするcDNAの完
全な配列カバーするのに十分である。

【０１７５】実施例9 ホスト細胞のゲノムにおいて、分泌タンパク質をコードする遺伝子を同定する
為に複製開始点を担持するトランスポゾンの使用。本方法の有益性は、トランス
ポゾン標識化ゲノムホスト細胞DNAから直接トランスポゾン-プラスミドの形成を
可能にするトランスポゾン中の複製開始点の存在である。本実施例において、co
lE1複製開始点を担持するプラスミドpBR322の塩基対1763から3147由来の領域を
、オリゴヌクレオチドプライマーori-1及びori-2によりPCR増幅する: ori-1: 5´-CGCGGATCCTACATCTGTATTAACGAAGCGC (SEQ ID 5) ori-2: 5´-CGCGGATCCCGTAGAAAAGATCAAAGGAT (SEQ ID 6)。

【０１７６】 結果的に、PCRアンプリコンは、制限エンドヌクレアーゼBamHIにより製造者の
仕様に推薦された条件の下で分裂する。2つのBamHI部位を有するpSigA2プラスミ
ドを含むSigA2トランスポゾンはBamHIにより部分的に消化し、約1.4kbの当該PCR
アンプリコンの断片を、位置が2149であるシングルBamHI分裂部位にライゲーシ
ョンさせる。次いで当該ライゲーション化構築体を、プラスミド骨格からの所望
のトランスポゾン-レプリコン断片を放つ為に酵素BgllＩにより制限処理する。
その後、DNAを更なるライゲーション段階にかけ、大腸菌DH5αに形質転換させる
。当該形質転換体はLBクロラムフェニコール選択上で培養する。次いで、結果的
に、選択の下で増殖するコロニーはLBアンピシリン及びLBクロラムフェニコール
上でレプリカプレート培養した。LBクロラムフェニコール上でのみ増殖する複数
のコロニーを、プラスミドの単離及び配列解析の為に選択した。BamHI位におけ
るColEI oriの妥当な配置を持つと確認されたプラスミドを選び、このプラスミ
ドをpMuoriと命名した。

【０１７７】 pMuoriのトランスポゾン断片を、先の実施例に示すような同じ方法においてゲ
ル精製により調製できうる。精製後、単離したトランスポゾン2つの方針で使用
できうる:1)当該トランスポゾンは、注目の生物から単離した部分的消化した及
びサイズ分画したゲノムDNAを処理する為in vitroで使用できうる。当該サイズ
分画したDNAは、その後の選択において全長遺伝子回収の見込みを高める為に100
0塩基対以上サイズの幅であるべきだ。そのような処理の為のプロトコールは実
施例4(例パエニバチルス)におけるのと同様であるが、トランスポジションの後
、結果的に混合物は、直線状DNA断片を環状化する為にDNAリガーゼによりライゲ
ーションさせる。次いで、結果的に、環状化DNAは大腸菌スクリーニングホスト
を形質転換する為に使用した。選択の形態はまさに実施例4と同様である。

【０１７８】 Muoriトランスポゾンを使用する為の第2の方法は、最初にトランスポゾンとト
ランスポサーゼによるトランスポソーム複合体を生み出すことである。商業的に
入手できるそのような系の例はEpicentre technologies (USA) 「EZ::Tn」系で
ある。本質的に、マグネシウム不在においては、マグネシウムが存在する迄外来
DNAに挿入できない安定なトランスポゾーム複合体が形成できうる。標的ホスト
への形質転換により、当該細胞中に存在する生理学的なマグネシウムが活性化す
るトランスポゾーム複合体はこのように、in vivoで染色体DNA中のトランスポジ
ションを可能にする。我々の目的の為に、シグナルトラッピングトランスポゾン
は標的生物中のin vivoトランスポジションの為に使用する。次いで染色体DNAは
、処理した生物から単離し、当該DNAを、不規則なせん断又は制限酵素部分消化
により断片に縮小させ、その後、DNAリガーゼによりライゲーションさせる。結
果的に、次いでDNAは適切なスクリーニングホストを形質転換する為に使用でき
、本実施例においては大腸菌DH5αである。確かに、実施例4におけるような選択
は又、選択マーカー;この場合アンピシリンに対する耐性を調達するような方法
においてゲノムDNA断片に挿入した複製開始点を有するトランスポゾンを含むコ
ロニーの回収をもたらす。結果的に、プラスミドを単離し精製し、プライマーSi
gA2up(SEQ ID 4)およびSeqB(SEQ ID 3)の助けによりシーケンシングした。

【化１】

【図面の簡単な説明】

【図１】 数多くのトランスポゾンを、プルラナーゼPULL1012をコードする遺伝子中組み
込んだ位置の模式的なアライメントである。既知のプルラナーゼコーディング配
列を転写の方向を示す為に右側を指す矢印により「Pllulanasetrimmed。SEQ(1>2
598)」のように示す。各々の単離したクローンにつき、トランスポゾンの位置は
矢印で示してあり、クローンの名称は左に列挙した。β-ラクタマーゼ分泌レポ
ーターを分泌したクローンは名称において「-」で印し、右向きの指示矢印は、P
ULL1012遺伝子によるレポーター遺伝子の共-方向性(co-directional)転写を示す
。当該β-ラクタマーゼレポーターを分泌しなかった更なるクローンは通常の選
択で単離し;これらは「+」又は「p」左向きの指示矢印が印てあり、インフレー
ム融合、即ち分泌ポリペプチドは達成できなかったことを示している。2つのク
ローン「Tn4-12-.ab1」及び「Tn4-4-.ab1」は図において囲われており、文書は
、PULL1012遺伝子によりコードされるプルラナーゼ活性を保持する分泌融合ポリ
ペプチドを示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 ＰＡ ２００１ ００２１０ (32)優先日 平成13年２月９日(2001．2．9) (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シュノール，キルク デンマーク国，デーコー−2840 ホルテ， ソーレロートガースバイ 38 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA07 CA03 CA04 CA20 DA02 DA05 DA11 FA18 4B050 CC01 CC03 CC10 LL03 4B063 QQ06 QQ07 QQ08 QQ13 QQ21 QQ43 QR32 QR62 QR75 QR76 QR77 QR80 4B065 AA01X AA01Y AA15X AA18X AA19X AA26X AA50X AA57Y AA58Y AA62X AA65X AA66X AA67X AA70X AA72Y AA73X AA77X AA80X AA90X AB01 AC14 BA02 CA31 CA46

Claims (37)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 分泌又は部分分泌の為のシグナル配列を担持するポリペプチ
   ドをコードする注目の遺伝子を、遺伝子ライブラリーから同定及び単離をする為
   の方法であって: a）ゲノムDNAライブラリー又はcDNAライブラリーを用意し; b）前記ライブラリーへ、分泌レポーターをコードするプロモーターを有しない
   及び分泌シグナルを有しないポリヌクレオチドを含んで成るDNA断片を挿入し; c）ホスト細胞に当該挿入した当該DNA断片を含んで成る当該ライブラリーを導入
   し; d）活性分泌レポーターを分泌又は部分的に分泌するホスト細胞をスクリーニン
   グ及び選択し; e）当該挿入したDNA断片に隣接するDNAのシーケンシングにより、選択ホスト細
   胞中の当該分泌レポーターの挿入された注目の遺伝子を同定し、;そして f）段階e)において同定された注目の完全な遺伝子を単離する、 段階を含んで成る当該方法。
2. 【請求項２】 段階(f)における注目の完全な遺伝子を段階(a)の当該ライブ
   ラリーから単離する、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 段階(b)をin vitroで実行する請求項１又は２記載の方法。
4. 【請求項４】 前記cDNA又は前記cDNAライブラリーを標準化する請求項１−
   ３記載のいずれか1項記載の方法。
5. 【請求項５】 前記ゲノムDNAライブラリー又はcDNAライブラリーは微生物
   由来である請求項１−４記載のいずれか1項記載の方法。
6. 【請求項６】 前記微生物が真菌、糸状菌又は酵母菌である請求項５記載の
   方法。
7. 【請求項７】 前記微生物が細菌である請求項５記載の方法。
8. 【請求項８】 前記微生物が古細菌である請求項５記載の方法。
9. 【請求項９】 前記ゲノムDNAライブラリー又はcDNAライブラリーが多細胞
   生物由来、好適には哺乳類細胞由来、最も好ましくはヒトの細胞由来である請求
   項１−４記載のいずれか1項記載方法。
10. 【請求項１０】 請求項１記載のDNA断片がトランスポゾン、好適にはMuAト
    ランスポゾンを含んで成る請求項１−９記載のいずれか1項記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記DNA断片がホスト細胞中で機能的な複製開始点を含ん
    で成り、好適には複製開始点が大腸菌(Escherichia coli)中で機能的であり、更
    に好適には当該複製開始点がcolE1、oriV、P15A又はcolDF13の誘導体であり、最
    も好ましくは複製開始点がcolE1である請求項１−１０記載のいずれか1項記載の
    方法。
12. 【請求項１２】 分泌レポーターがタンパク質であり、それはホスト細胞か
    ら分泌した時、本来前記細胞の増殖を妨害する物質の存在の下で前記細胞を増殖
    に至らせる請求項１−１１記載のいずれか1項記載の方法。
13. 【請求項１３】 分泌レポーターがβ-ラクタマーゼ又はインベルターゼで
    ある請求項１２記載の方法。
14. 【請求項１４】 段階(b)の前記DNA断片のポリヌクレオチドが、タンパク質
    分解解裂の為の特異的標的部位を含んで成るＮ末端ペプチドリンカーを担持する
    分泌レポーターをコードする請求項１−１３記載のいずれか1項記載の方法。
15. 【請求項１５】 ホスト細胞が細菌である請求項１−１４記載のいずれか1
    項記載方法。
16. 【請求項１６】 細菌ホスト細胞がエスケリキア(Escherichia)、ラクトコ
    ッカス(Lactococcus)、ストレプトミセス(Streptomyces)、エンテロコッカス(En
    terococcus)又はバチルス(Bacillus)細胞であり、好ましくは、エスケリキア・
    コリ(Escherchia coli)、ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)、ス
    トレプトミセス・グリセウス(Streptomyces griseus)、ストレプトミセス・コエ
    リコール(Streptomyces coelicor)、エンテロコッカス・ファエカリス(Enteroco
    ccus faecalis)、バチルス・アルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)、バチ
    ルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・ブレ
    ビス(Bacillus brevis)、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バ
    チルス・クラウシ(Bacillus clausii)、バチルス・コアグランス(Bacillus coag
    ulans)、バチルス・ロータス(Bacillus lautus)、バチルス・レンタス(Bacillus
    lentus)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・
    メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・ステアロサーモフィルス(Baci
    llus stearothermophilus)、枯草菌(Bacillus subtilis)又はバチルス・スリン
    ジエンシス(Bacillus thuringiensis)の種である請求項１５記載の方法。
17. 【請求項１７】 ホスト細胞が真菌である請求項１−１４記載のいずれか1
    項記載の方法。
18. 【請求項１８】 真菌ホスト細胞が、カンジダ(Candida)、クルイベロミセ
    ス(Kluyveromyces)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス(Saccharomyces)、シゾサ
    ッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウィア(Yarrowia)、アクレモニウム(
    Acremonium)、アスペルジルス(Aspergillus)、アウレオバシジウム(Aureobasidi
    um)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、フィリバシヂウム(Filibasidium) 、フ
    ザリウム(Fusarium)、ヒューミコーラ(Humicola)、マグナポーゼ(Magnaporthe)
    、ムコール(Mucor)、ミセリオピゾーラ(Myceliophthora)、ネオカリマスティク
    ス(Neocallimastix)、ニューロスポーラ(Neurospora)、パエシロミセス(Paecilo
    myces)、ペニシリウム(Penicillium)、ピロミセス(Piromyces)、シゾフィリウム
    (Schizophyllum)、タラロミセス(Talaromyces)、サーモアスカス(Thermoascus)
    、チエラビア(Thielavia)、トリポクラヂウム(Tolypocladium)又はトリコデルマ
    (Trichoderma)の属の細胞である請求項１７記載の方法。
19. 【請求項１９】 サッカロミセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisia
    e)、アスペルジルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)、アスペルジルス
    ・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルジルス・ニジュランス(Aspergillu
    s nidulans)、アスペルジルス・ニガー(Aspergillus niger)又はアスペルジルス
    ・オリザエ(Aspergillus oryzae)の種の真菌ホスト細胞である請求項１８記載の
    方法。
20. 【請求項２０】 前記ホスト細胞が哺乳類である請求項１−１４記載のいず
    れか1項記載の方法。
21. 【請求項２１】 請求項１におけるシーケンシング段階を、請求項１のDNA
    断片に対して特異的な1以上のプライマーを用いて行う、又は請求項１のDNAライ
    ブラリーもしくはcDNAライブラリーをクローニングしたベクターに特異的な1以
    上のプライマーを使用して行う請求項1−２０記載のいずれか1項記載の方法。
22. 【請求項２２】 注目の完全な遺伝子の単離が、請求項１記載のシーケンシ
    ング段階において得たDNA配列情報を利用して行う請求項1−２１記載のいずれか
    1項記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記注目の完全な遺伝子が、当該ホスト細胞から分泌され
    る酵素をコードする請求項1−２２記載のいずれか1項記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記注目の完全な遺伝子が、膜-結合レセプター、好適に
    は２成分シグナル(TCS)伝達レセプター、更に好適にはサイトカインレセプター
    をコードする請求項1−２２記載のいずれか1項記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記注目の完全な遺伝子が、分泌ポリペプチドサイトカイ
    ンをコードする請求項1−２２いずれか1項記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記注目の完全な遺伝子が、ヒトにおける免疫応答を誘導
    するポリペプチドをコードする請求項１−２２記載のいずれか1項記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記注目の完全な遺伝子が、バクテリオシンをコードする
    請求項1−２２記載のいずれか1項記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記注目の完全な遺伝子が、植物病原性ポリペプチドをコ
    ードする請求項１−２２記載のいずれか1項記載の方法。
29. 【請求項２９】 請求項１において単離した注目の完全な遺伝子を含んで成
    る発現系の構築の更なる段階を行う請求項1−２８記載のいずれか1項記載の方法
    。
30. 【請求項３０】 本発明の方法により単離した、好適には当該遺伝子を遺伝
    子ライブラリーから単離した注目の遺伝子。
31. 【請求項３１】 請求項３０において定義した注目の遺伝子によりコードさ
    せた酵素。
32. 【請求項３２】 請求項３０において定義した注目の遺伝子を含んで成る発
    現系。
33. 【請求項３３】 請求項３２において定義した発現系を含んで成るホスト細
    胞。
34. 【請求項３４】 請求項３０において定義した注目の遺伝子の２以上の染色
    体的に組込まれたコピーを含んで成るホスト細胞。
35. 【請求項３５】 ポリペプチドを生産する為の方法であって、請求項３３又
    は３４に定義したホスト細胞を請求項３０に定義した注目の遺伝子が発現される
    のに適当な条件下で増殖することを含んで成り、ここで当該ホスト細胞は増殖培
    地中に当該遺伝子によりコードされるポリペプチドを分泌する、方法。
36. 【請求項３６】 ポリペプチドが酵素である請求項３５記載の方法。
37. 【請求項３７】 当該ポリペプチドの精製の更なる段階を行う請求項３５又
    は３６記載の方法。