JP2012510808A - 高分泌性蛋白質のスクリーニングおよび組換え蛋白質の生産のための融合パートナーとしてのその用途 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
(i)分泌ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種プロモーターで、第1の宿主細胞を形質転換させる工程;
(ii)前記分泌ポリペプチドの天然のプロモーターが前記分泌ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドに連結された場合に、分析された前記ポリペプチドの分泌レベルと比較して、前記第1の宿主細胞から分泌されたポリペプチドが過分泌されるかどうかを決定する工程;
(iii)目的ポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドおよび工程(ii)で過分泌されたものとして決定されたポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドを含むコンストラクトで第2の宿主細胞を形質転換させる工程であって、ここで、前記第1および第2のポリヌクレオチドは、互いに任意の順序であり、同じフレーム内にあるものであることを特徴とする、工程;
(iv)前記コンストラクトが前記目的ポリペプチドおよび前記過分泌されたポリペプチドの融合ポリペプチドを発現させる条件下で、前記第2の宿主細胞を培養する工程;そして
(v)前記融合ポリペプチドが培養培地に分泌されるかどうかを決定することによって、前記過分泌されたポリペプチドのSFPを確認する工程。
用語「1つの(a)」または「1つの(an)」独立体は、1つ以上のその独立体を表するものであって、例えば、「1つのベクター」は、1つ以上のベクターを示すものとして理解されなければならない。このように、用語「1つの」(または「1つ」)、「1つ以上の、」および「少なくとも1つの」は、本願において相互に交換可能に使用され得る。
好ましいウイルス粒子としては、アデノウイルス、バキュロウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ関連ウイルス、セムリキ森林(Semliki Forest)ウイルス、ワクシニアウイルス、およびレトロウイルスが挙げられるが、これらに制限されない。好ましい発現ベクターとしては、pcDNA3(インビトロジェン)およびpSVL(Pharmacia Biotech)が挙げられるが、これらに制限されない。他の発現ベクターとしては、pSPORTTMベクター、pGEMTMベクター(プロメガ社)、pPROEXベクターTM(LTI,Bethesda,MD)、ブルースクリプト(Bluescript)TMベクター(ストラタジーン社)、pQETMベクター(キアゲン社)、pSE420TM(インビトロジェン)、およびpYES2TM(インビトロジェン)が挙げられるが、これらに制限されない。
さらなる実施態様において、レポーター蛋白質の活性を示す細胞を確認する工程は、成長抑制剤、例えば、抗生剤に耐性を提供するレポーター蛋白質を使用することによってなされる。また他の実施態様において、レポーター蛋白質は、視覚的に検出され得る蛋白質、例えば、緑色蛍光蛋白質またはルシフェラーゼである。一実施態様において、レポーター蛋白質の活性を示す細胞を確認する工程は、2つ以上のレポーター蛋白質、例えば、リパーゼおよびインベルターゼを使用することによってなされる。
予め選択された核酸断片のライブラリは、以前に確認された核酸断片を多様化することによって、例えば、単一方向性欠失、突然変異、機能性配列(例えば、グリコシル化部位)の付加または、核酸断片の間でのプレおよびプロ−シグナル配列のスワッピングによって得ることができる。一実施態様において、核酸断片は、1000塩基対未満、例えば、700、500、または、300塩基対未満のサイズを持つ。核酸断片のライブラリは、DNAの酵素的切断、cDNA合成、または組換えDNA技術(例えば、単一方向性欠失、突然変異誘発)によって作製され得る。
細胞外分泌のためのYGR106C遺伝子の最適サイズの決定
この実施例は、細胞外分泌のために必要なYGR106の最適領域を立証する。図1Aに示されたように、YGR106C(以下、分泌融合パートナー1、SFP1)蛋白質(配列番号1)は、シグナルペプチド、3つのグリコシル化部位、1つの親水性ドメイン(HL)および1つの膜貫通ドメイン(TM)を含有する265個のアミノ酸残基からなる。
目的蛋白質の分泌のための融合パートナーとしての、SFP1遺伝子の最適サイズの決定
この実施例は、SPF1誘導体の融合パートナーとしての用途を立証する。例示的な目的蛋白質である、ヒトインターロイキン−2(hIL−2)の分泌のための融合パートナーとしてのSFP1誘導体を試験するために、YGaT92、YGaT93およびYGaT94の3つのSFP1誘導体(SFP1−92(配列番号39)、SFP1−93(配列番号40)、およびSFP1−94(配列番号41))との融合蛋白質として、それぞれhIL−2を発現させるための3つのベクターを作製した(図2A)。YGaT91とのhIL−2融合もまた生成し、SFP1−91(配列番号38)のデータは示さなかった。hIL2遺伝子をYGaT92のSFP1−92と融合させるために、部分SFP1遺伝子をYGaT92ベクターからGAL10プロモーターを認識するセンスプライマーGAL100(配列番号10)およびアンチセンスプライマーH121(配列番号11)で増幅させた。hIL2遺伝子との融合を促進し、hIL2融合蛋白質の酵母ジペプチジルプロテアーゼKex2pによるインビボ切断を誘導するために(Mizuno K et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.156:246(1988))、H121プライマー(配列番号11)をKex2p切断配列およびN−末端hIL2配列を含有するように考案した。ヒトIL−2遺伝子をH121プライマー(配列番号11)に相補的なSFP1配列の一部を含有するセンスプライマーIL2F(配列番号12)およびアンチセンスプライマーIL2R(配列番号13)で増幅させた。IL2Rプライマーは、GAL7ターミネーター配列の一部を含有する。SFP1−92およびhIL−2遺伝子を含有する増幅されたPCR断片を重複−延長(overlap−extension)PCRによってGAL100およびGT50R(配列番号14)プライマーで融合させた。GT50Rプライマーは、GAL7ターミネーターを認識するアンチセンスプライマーである。これで生成されたPCR生産物を、100bpのGAL10プロモーター配列および50bpのGAL7ターミネーター配列でフランキングさせた。発現宿主としてサッカロマイセス・セレビシエの長所のうちの1つは、効率的且つ正確な相同的組換えストラテジーを利用することが可能であるということである。断片末端の一側面上にDNA配列重複を共有する線型化されたベクターおよびDNA断片は、プラスミドの円型トポロジーを復旧する組換えを行うことができるということが当業界で公知されている(文献[Kunes et al.,Genetics.115:73(1987)])。サッカロマイセス・セレビシエのこの特性を発現宿主系の作製のために利用した。
SFP1誘導体と融合した目的蛋白質の発現
YGaT92から実施例2で作製されたSFP1−92(配列番号39)を、エキセンディン−4(EXD4)、グルカゴン−類似ペプチド−1(GLP1)の39個のアミノ酸ペプチド類似体の分泌生成のために使用した。無傷のEXD4蛋白質の単純且つ効率的な精製のために、6−ヒスチジンタグおよびエンテロキナーゼ切断部位(DDDDK(配列番号79)、D:アスパラギン酸、K:リジン)をSFP1のC−末端に付加した。従って、融合蛋白質のN−末端からC−末端では、SFP1断片、6−ヒスチジンタグ、エンテロキナーゼ切断部位およびEXD4配列を含んでいた。SFP1−92 EXD4融合蛋白質を発現するYGaT92−EXD4ベクターを作製するために、SFP1−92遺伝子をYGaT92ベクターからHL配列を認識し、6個のヒスチジンコドンを含有するアンチセンスプライマーHDK−R(配列番号17)およびGAL100プライマー(配列番号10)で増幅させた。EXD4遺伝子をDDDDKコドンおよびHDK−Rプライマーに相補的な18個のヌクレオチドを含有するセンスプライマーHDK−F(配列番号18)およびGT50R(配列番号14)プライマー配列の18個のヌクレオチドを含有するアンチセンスプライマーEXD−R(配列番号19)で増幅させた。増幅されたSFP1−92およびEXD4遺伝子を重複−延長PCRによってGAL100/GT50Rプライマーセットで融合させた。YGaT92−EXD4ベクターを保有する組換えサッカロマイセス・セレビシエ2805菌株を、実施例2に記載したように融合した断片およびBamHI/SalI消化したYGaT92ベクター断片の共形質転換を介してインビボ組換えによって直接作製した。
SFP1のHLドメインと融合した目的蛋白質の分泌
実施例2に示されたように、HLドメインは、目的蛋白質の分泌において重要な役割を果たす。目的蛋白質の分泌において、HLの機能は、HLドメイン内の酸性荷電されたアミノ酸によったことによるが、蛋白質の可溶性は蛋白質の純電荷(net charge)と密接に関連していることによる。HLドメインの融合パートナーとしての機能を調査するために、本発明者らはEXD4の分泌のためにHLドメインを使用した。
酵母セクレトームからの分泌融合パートナーの選択
この実施例は、融合パートナーとして有用な、高分泌された蛋白質を確認するための技術を立証した。
融合パートナーとしての、SCW4遺伝子の最適サイズの決定
この実施例は、目的蛋白質、例えば、エキセンディン−4の分泌用融合パートナーとしての、SCW4の最適サイズの決定を立証する。8個のSCW4欠失クローンをカイト−ドゥーリトル疏水性分析に基づいて作製した(図19A)。8個のSCW4断片を、GAL100(配列番号10)および6個のヒスチジン配列をそれぞれ含有する8個の異なるアンチセンスプライマーH453−H460(配列番号47〜54)で増幅させた。増幅された断片をYGaT92−EXD4からセンスプライマー(配列番号55)およびGT50R(配列番号14)で増幅されたEXD4遺伝子と重複延長PCRによって、プライマー、GAL100(配列番号10)およびGT50R(配列番号14)をそれぞれ使用して、融合させた。それぞれの延長されたPCR断片を、以前の実施例に記載されたように、EcoRI−SalI消化したYEGα−HIR525で形質転換させた。8個の異なる形質転換体の3つのコロニーをYPDG(1%酵母抽出物、2%ペプトン、1%グルコース、および1%ガラクトース)培地で培養した。それぞれのサンプルに対する培養ブロス10μlをSDS−PAGE(濃縮無し)で直接分析した。図19Bに示されたように、SCW4の異なるC−末端断片を含有するSCW4−1、SCW4−2、SCW4−3およびSCW4−4は、EXD4の分泌に対する融合パートナーとして強い活性を示した。EXD4に対する融合パートナーとしてSCW4の最適なサイズは、SCW4蛋白質全体(380個のアミノ酸)のうち、169個未満のアミノ酸で示された。
Claims (145)
- (i)分泌ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種プロモーターで第1の宿主細胞を形質転換させる工程;
(ii)前記分泌ポリペプチドの天然のプロモーターが前記分泌ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドに連結された場合に、分析された前記ポリペプチドの分泌レベルと比較して、前記第1の宿主細胞から分泌ポリペプチドが過分泌されるかどうかを決定する工程;
(iii)目的ポリペプチドをコードする第1のポリヌクレオチドおよび工程(ii)で過分泌されたものとして決定されたポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドを含むコンストラクトで第2の宿主細胞を形質転換させる工程であって、ここで、前記第1および第2のポリヌクレオチドは、互いに任意の順序であり、同じフレーム内にあるものであることを特徴とする、工程;
(iv)前記コンストラクトが前記目的ポリペプチドおよび前記過分泌されたポリペプチドの融合ポリペプチドを発現させる条件下で、前記第2の宿主細胞を培養する工程;および
(v)前記融合ポリペプチドが培養培地に分泌されるかどうかを決定することによって、前記過分泌されたポリペプチドがSFPであるかどうかを確認する工程を含む、分泌融合パートナー(SFP)を確認する方法。 - 前記分泌ポリペプチドがセクレトームで高発現されるものとして選択されたものである、請求項1に記載の方法。
- 前記セクレトームが酵母、バクテリア、植物または動物から単離されたものである、請求項2に記載の方法。
- 前記セクレトームが酵母から単離されたものである、請求項3に記載の方法。
- 前記融合ポリペプチドまたは第2の融合ポリペプチドの分泌に対する前記SFPの最適なサイズを決定することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記最適なサイズが前記SFPの欠失分析によって決定されるものである、請求項5に記載の方法。
- 前記異種プロモーターが原核生物、真核生物またはウイルス由来である、請求項1に記載の方法。
- 前記異種プロモーターがバクテリオファージラムダPR、バクテリオファージラムダPL、ラムダII、エシェリキア・コリtrp、エシェリキア・コリrecA、エシェリキア・コリ熱衝撃、エシェリキア・コリlacZ、SV40初期、酵母GAPDH、PGK、ADH、PHO5、TEF、GAL1、GAL10、マウス乳腺腫瘍ウイルス、ヒト免疫欠乏ウイルスの長い末端反復、マロにーウイルス、サイトメガロウイルス即時初期プロモーター、エプスタイン・バー(Epstein Barr)ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、およびヒトメタロチオネインからなる群から選択されるものである、請求項7に記載の方法。
- 前記異種プロモーターがGAL10である、請求項8に記載の方法。
- 前記分泌されたポリペプチドがグリコシル化されたものである、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の宿主細胞が植物、バクテリア、菌類、酵母、または動物細胞から選択されるものである、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の宿主細胞が酵母細胞である、請求項11に記載の方法。
- 前記第1の宿主細胞がカンジダ(Candida)、テバリオミセス(Debaryomyces)、ハンゼヌラ(Hansenula)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、ピキア(Pichia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ヤロウイア(Yarrowia)、サッカロミセス(Saccharomyces)、シュワンニオマイセス(Schwanniomyces)、およびアルクスラ(Arxula)からなる群から選択されるものである請求項12に記載の方法。
- 前記第1の宿主細胞がカンジダ・ユチリス(Candida utilis)、カンジダ・ボイジニイ(Candida boidinii)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ピキア・スチピチス(Pichia stipitis)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、シュワンニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)、およびアルクスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)からなる群から選択されるものである請求項13に記載の方法。
- 前記第2の宿主細胞が植物、バクテリア、菌類、酵母、または動物細胞から選択されるものである、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の宿主細胞が酵母細胞である、請求項15に記載の方法。
- 前記第2の宿主細胞がカンジダ、テバリオミセス、ハンゼヌラ、クルイベロミセス、ピキア、シゾサッカロミセス、ヤロウイア、サッカロミセス、シュワンニオマイセス、およびアルクスラからなる群から選択されるものである、請求項16に記載の方法。
- 前記第2の宿主細胞がカンジダ・ユチリス、カンジダ・ボイジニイ、カンジダ・アルビカンス、クルイベロミセス・ラクティス、ピキア・パストリス、ピキア・スチピチス、シゾサッカロミセス・ポンベ、サッカロマイセス・セレビシエ、ハンゼヌラ・ポリモルファ、ヤロウイア・リポリティカ、シュワンニオマイセス・オクシデンタリス、およびアルクスラ・アデニニボランスからなる群から選択されるものである、請求項17に記載の方法。
- (i)請求項1のSFPまたはその断片または誘導体;および
(ii)目的ポリペプチドを含む単離された融合ポリペプチド。 - 前記SFPが配列番号84のアミノ酸1−84またはその断片または誘導体を含むものである、請求項19に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記SFPが配列番号84のアミノ酸1−101またはその断片または誘導体を含むものである、請求項20に記載単離された融合ポリペプチド。
- 前記SFPが配列番号84のアミノ酸1−135またはその断片または誘導体を含むものである、請求項21に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記SFPが配列番号84のアミノ酸1−169またはその断片または誘導体を含むものである、請求項22に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記SFPが配列番号84のアミノ酸1−195またはその断片または誘導体を含むものである、請求項23に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記SFPが配列番号84のアミノ酸1−227またはその断片または誘導体を含むものである、請求項24に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記SFPが配列番号84のアミノ酸1−271またはその断片または誘導体を含むものである、請求項25に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記SFPが配列番号84のアミノ酸1−364またはその断片または誘導体を含むものである、請求項26に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記SFPがBGL2(配列番号80)、GAS3(配列番号81)、GAS5(配列番号82)、PST1(配列番号83)、SCW4(配列番号84)、SCW10(配列番号85)、SIM1(配列番号86)、UTH1(配列番号87)、YGP1(配列番号88)、YPS1(配列番号89)、およびZPS1(配列番号90)からなる群から選択されるものである、請求項19に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記SFPがBGL2(配列番号62)、GAS3(配列番号63)、GAS5(配列番号64)、PST1(配列番号65)、SCW4(配列番号66)、SCW10(配列番号67)、SIM1(配列番号68)、UTH1(配列番号69)、YGP1(配列番号70)、YPS1(配列番号71)、およびZPS1(配列番号72)からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされるものである、請求項19に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記目的ポリペプチドがヒトインターロイキン2(hIL−2)、エキセンディン−3、エキセンディン−4(EXD4)、グルカゴン−類似−ペプチド−1(GLP−1)、副甲状腺ホルモン(PTH)、ヒトインターロイキン−1β、ヒトインターロイキン−6、ヒトインターロイキン−32α、ヒトインターロイキン−32β、ヒトインターロイキン−32γ、因子VII、因子VIII、因子IX、ヒト血清アルブミン、ヒトインターフェロン−α、ヒトインターフェロン−β、ヒトインターフェロン−γ、ヒト顆粒球−コロニー刺激因子、ヒト顆粒球大食細胞−コロニー刺激因子、ヒト成長ホルモン(hGH)、ヒト血小板−由来成長因子、ヒト塩基性線維芽細胞成長因子、ヒト表皮成長因子(EGF)、ヒトインスリン−類似成長因子、ヒト神経成長因子、ヒト形質転換成長因子β−1、ヒト濾胞刺激ホルモン、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルクロニダーゼ、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、過酸化物ジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ウシガラクトース−1−ポスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、クラゲ緑色蛍光蛋白質、カンジダアンタクチカリパーゼB、カンジダルゴサ(Candida rugosa)リパーゼ、菌類クロロペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、レゾルバーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、トレハロースシンターゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、キシラナーゼ、フィターゼ、ヒトラクトフェリン、ヒトエリスロポエチン、ヒトパラオキソナーゼ、ヒト成長分化因子15、ヒトガレクチン−3結合蛋白質、ヒトセリンプロテアーゼ抑制剤、クニッツ類型2、ヒトヤヌスキナーゼ2、ヒトfms−類似チロシンキナーゼ3リガンド、ヒトYM1&2、ヒトCEMI、ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ヒトレプチン、ヒトmL259、ヒトプロテイナーゼ3、ヒトリゾチーム、ヒトデッドボックス蛋白質41、ヒトエトポシド誘導された蛋白質24、マウスカスパーゼ1、ウシアンギオジェニン、およびミミズルンブロキナーゼからなる群から選択されるものである、請求項19に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記目的ポリペプチドがEXD4である、請求項30に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記目的ポリペプチドがhGHである、請求項30に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記融合ポリペプチドがSCW4−3−EXD4(配列番号61)によりコードされるものである、請求項31に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記融合ポリペプチドがSCW4−4−hGH(配列番号73)によりコードされるものである、請求項32に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記SFPが目的ポリペプチドのN−末端で融合するものである、請求項19に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記SFPが目的ポリペプチドのC−末端で融合するものである、請求項19に記載の単離された融合ポリペプチド。
- (i)配列番号1のアミノ酸176−213またはその断片または誘導体を含む親水性(HL)ドメインを含み、膜貫通ドメイン(TM)が欠如したSFP;および
(ii)目的ポリペプチドを含む、単離された融合ポリペプチド。 - 前記SFPが目的ポリペプチドのN−末端で融合したものである、請求項37に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記SFPが目的ポリペプチドのC−末端で融合したものである、請求項37に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記SFPが配列番号39またはその断片もしくは誘導体を含むポリヌクレオチドによってコードされるものである、請求項37に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記SFPが配列番号42またはその断片もしくは誘導体を含むポリヌクレオチドによってコードされるものである、請求項37に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記SFPが配列番号43またはその断片もしくは誘導体を含むポリヌクレオチドによってコードされるものである、請求項37に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記SFPが配列番号44またはその断片もしくは誘導体を含むポリヌクレオチドによってコードされるものである、請求項37に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記HLドメインが配列番号45またはその断片もしくは誘導体を含むポリヌクレオチドによってコードされるものである、請求項37に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記目的ポリペプチドがヒトインターロイキン2(hIL−2)、エキセンディン−3、エキセンディン−4(EXD4)、グルカゴン−類似−ペプチド−1(GLP−1)、副甲状腺ホルモン(PTH)、ヒトインターロイキン−1β、ヒトインターロイキン−6、ヒトインターロイキン−32α、ヒトインターロイキン−32β、ヒトインターロイキン−32γ、因子VII、因子VIII、因子IX、ヒト血清アルブミン、ヒトインターフェロン−α、ヒトインターフェロン−β、ヒトインターフェロン−γ、ヒト顆粒球−コロニー刺激因子、ヒト顆粒球大食細胞−コロニー刺激因子、ヒト成長ホルモン(hGH)、ヒト血小板−由来成長因子、ヒト塩基性線維芽細胞成長因子、ヒト表皮成長因子(EGF)、ヒトインスリン−類似成長因子、ヒト神経成長因子、ヒト形質転換成長因子β−1、ヒト濾胞刺激ホルモン、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルクロニダーゼ、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、過酸化物ジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ウシガラクトース−1−ポスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、クラゲ緑色蛍光蛋白質、カンジダアンタクチカリパーゼB、カンジダルゴサ(Candida rugosa)リパーゼ、菌類クロロペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、レゾルバーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、トレハロースシンターゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、キシラナーゼ、フィターゼ、ヒトラクトフェリン、ヒトエリスロポエチン、ヒトパラオキソナーゼ、ヒト成長分化因子15、ヒトガレクチン−3結合蛋白質、ヒトセリンプロテアーゼ抑制剤、クニッツ類型2、ヒトヤヌスキナーゼ2、ヒトfms−類似チロシンキナーゼ3リガンド、ヒトYM1&2、ヒトCEMI、ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ヒトレプチン、ヒトmL259、ヒトプロテイナーゼ3、ヒトリゾチーム、ヒトデッドボックス蛋白質41、ヒトエトポシド誘導された蛋白質24、マウスカスパーゼ1、ウシアンギオジェニン、およびミミズルンブロキナーゼからなる群から選択されるものである、請求項37に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記目的ポリペプチドがIL2である、請求項45に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記目的ポリペプチドがEXD4である、請求項45に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記目的ポリペプチドがEGFである、請求項45に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記目的ポリペプチドがPTHである、請求項45に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 親和性タグを更に含む、請求項19乃至49のいずれか一項に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記親和性タグがGST、MBP、NusA、チオレドキシン、ユビキチン、FLAG、BAP、6HIS、STREP、CBP、CBD、S−タグ、およびその任意の組合せからなる群から選択されるものである、請求項50に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記親和性タグが6HISである、請求項51に記載の単離された融合ポリペプチド。
- リンカーペプチドを更に含み、ここで、前記リンカーは、前記SFPと前記目的ポリペプチドとの間に位置するものである、請求項19乃至52のいずれか一項に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記リンカーペプチドがプロテアーゼ認識配列を含むことによって、SFPと目的ポリペプチドとの間を切断するようにする、請求項53に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記プロテアーゼ認識配列が酵母kex2p−認識配列、kex2p−類似プロテアーゼ−認識配列、哺乳動物フリン−認識配列、エンテロキナーゼ認識配列、サブチリシン−認識配列、タバコエッチウイルスプロテアーゼ−認識配列、トロンビン−認識配列、ユビキチン加水分解酵素−認識配列、およびその任意の組合せからなる群から選択されるものである、請求項54に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記プロテアーゼ認識配列がエンテロキナーゼ認識配列である、請求項55に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記プロテアーゼ認識配列がアミノ酸配列Asp−Asp−Lysを含むものである、請求項56に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記プロテアーゼ認識配列がkex2p−類似プロテアーゼ−またはkex2p−認識配列である、請求項55に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記リンカーペプチドが親和性タグを含むものである、請求項53に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記親和性タグがGST、MBP、NusA、チオレドキシン、ユビキチン、FLAG、BAP、6HIS、STREP、CBP、CBD、S−タグ、およびその任意の組合せからなる群から選択されるものである、請求項59に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記親和性タグが6HISである、請求項60に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記リンカーペプチドが制限酵素認識部位を含むポリヌクレオチドによってコードされるものである、請求項53に記載の単離された融合ポリペプチド。
- (i)プロモーター;
(ii)請求項1のSFPまたはその断片もしくは誘導体をコードする第1のポリヌクレオチド;および
(iii)目的ポリペプチドをコードする第2のポリヌクレオチドを含むコンストラクト。 - (i)プロモーター;
(ii)配列番号1のアミノ酸176−213を含み、膜貫通ドメイン(TM)が欠如したSFPまたはその断片もしくは誘導体をコードする第1のポリヌクレオチド;および
(iii)目的ポリペプチドまたはその誘導体をコードする第2のポリヌクレオチドを含むコンストラクト。 - 前記第1のポリヌクレオチドがBGL2(配列番号80)、GAS3(配列番号81)、GAS5(配列番号82)、PST1(配列番号83)、SCW4(配列番号84)、SCW10(配列番号85)、SIM1(配列番号86)、UTH1(配列番号87)、YGP1(配列番号88)、YPS1(配列番号89)、およびZPS1(配列番号90)からなる群から選択されるSFPをコードするものである、請求項63に記載のコンストラクト。
- 前記第1のポリヌクレオチドがBGL2(配列番号62)、GAS3(配列番号63)、GAS5(配列番号64)、PST1(配列番号65)、SCW4(配列番号66)、SCW10(配列番号67)、SIM1(配列番号68)、UTH1(配列番号69)、YGP1(配列番号70)、YPS1(配列番号71)、およびZPS1(配列番号72)からなる群から選択されるものである、請求項63に記載のコンストラクト。
- 前記第1のポリヌクレオチドが配列番号66の核酸1−252またはその断片もしくは誘導体を含むものである、請求項63に記載のコンストラクト。
- 前記第1のポリヌクレオチドが配列番号66の核酸1−303またはその断片もしくは誘導体を含むものである、請求項67に記載のコンストラクト。
- 前記第1のポリヌクレオチドが配列番号66の核酸1−405またはその断片もしくは誘導体を含むものである、請求項68に記載のコンストラクト。
- 前記第1のポリヌクレオチドが配列番号66の核酸1−507またはその断片もしくは誘導体を含むものである、請求項69に記載のコンストラクト。
- 前記第1のポリヌクレオチドが配列番号66の核酸1−585またはその断片もしくは誘導体を含むものである、請求項70に記載のコンストラクト。
- 前記第1のポリヌクレオチドが配列番号66の核酸1−681またはその断片もしくる、請求項71に記載のコンストラクト。
- 前記第1のポリヌクレオチドが配列番号66の核酸1−813またはその断片または誘導体を含むものである、請求項72に記載のコンストラクト。
- 前記第1のポリヌクレオチドが配列番号66の核酸1−1092またはその断片または誘導体を含むものである、請求項73に記載のコンストラクト。
- 第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドが目的ポリペプチドのN−末端に融合したSFPをコードするものである、請求項63に記載のコンストラクト。
- 第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドが目的ポリペプチドのC−末端に融合したSFPをコードするものである、請求項63に記載のコンストラクト。
- 前記第1のポリヌクレオチドが配列番号39またはその断片もしくは誘導体である、請求項64に記載のコンストラクト。
- 前記第1のポリヌクレオチドが配列番号42またはその断片もしくは誘導体である、請求項64に記載のコンストラクト。
- 前記第1のポリヌクレオチドが配列番号43またはその断片もしくは誘導体である、請求項64に記載のコンストラクト。
- 前記第1のポリヌクレオチドが配列番号44またはその断片もしくは誘導体である、請求項64に記載のコンストラクト。
- 前記第1のポリヌクレオチドが配列番号45またはその断片もしくは誘導体である、請求項64に記載のコンストラクト。
- 第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドが目的ポリペプチドのN−末端に融合したSFPをコードするものである、請求項64に記載のコンストラクト。
- 第1のポリヌクレオチドおよび第2のポリヌクレオチドが目的ポリペプチドのC−末端に融合したSFPをコードするものである、請求項64に記載のコンストラクト。
- 前記コンストラクトがベクターである、請求項63乃至83のいずれか一項に記載のコンストラクト。
- 前記プロモーターが原核生物、真核生物またはウイルス由来である、請求項63乃至84のいずれか一項に記載のコンストラクト。
- 前記プロモーターがバクテリオファージラムダPR、バクテリオファージラムダPL、ラムダII、エシェリキア・コリtrp、エシェリキア・コリrecA、エシェリキア・コリ熱衝撃、エシェリキア・コリlacZ、SV40初期、GAPDH、PGK、ADH、PHO5、TEF、GAL1、GAL10、マウス乳腺腫瘍ウイルス、ヒト免疫欠乏ウイルスの長い末端反復、マロにーウイルス、サイトメガロウイルス即時初期、エプスタイン・バーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、およびヒトメタロチオネインからなる群から選択されるものである、請求項85に記載のコンストラクト。
- 前記プロモーターがGAL10である、請求項86に記載のコンストラクト。
- 前記第2のポリヌクレオチドがヒトインターロイキン2(hIL−2)、エキセンディン−3、エキセンディン−4(EXD4)、グルカゴン−類似−ペプチド−1(GLP−1)、副甲状腺ホルモン(PTH)、ヒトインターロイキン−1β、ヒトインターロイキン−6、ヒトインターロイキン−32α、ヒトインターロイキン−32β、ヒトインターロイキン−32γ、因子VII、因子VIII、因子IX、ヒト血清アルブミン、ヒトインターフェロン−α、ヒトインターフェロン−β、ヒトインターフェロン−γ、ヒト顆粒球−コロニー刺激因子、ヒト顆粒球大食細胞−コロニー刺激因子、ヒト成長ホルモン(hGH)、ヒト血小板−由来成長因子、ヒト塩基性線維芽細胞成長因子、ヒト表皮成長因子(EGF)、ヒトインスリン−類似成長因子、ヒト神経成長因子、ヒト形質転換成長因子β−1、ヒト濾胞刺激ホルモン、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルクロニダーゼ、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、過酸化物ジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ウシガラクトース−1−ポスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、クラゲ緑色蛍光蛋白質、カンジダアンタクチカリパーゼB、カンジダルゴサ(Candida rugosa)リパーゼ、菌類クロロペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、レゾルバーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、トレハロースシンターゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、キシラナーゼ、フィターゼ、ヒトラクトフェリン、ヒトエリスロポエチン、ヒトパラオキソナーゼ、ヒト成長分化因子15、ヒトガレクチン−3結合蛋白質、ヒトセリンプロテアーゼ抑制剤、クニッツ類型2、ヒトヤヌスキナーゼ2、ヒトfms−類似チロシンキナーゼ3リガンド、ヒトYM1&2、ヒトCEMI、ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ヒトレプチン、ヒトmL259、ヒトプロテイナーゼ3、ヒトリゾチーム、ヒトデッドボックス蛋白質41、ヒトエトポシド誘導された蛋白質24、マウスカスパーゼ1、ウシアンギオジェニン、およびミミズルンブロキナーゼからなる群から選択される目的ポリペプチドをコードするものである、請求項63乃至87のいずれか一項に記載のコンストラクト。
- 親和性タグを更に含む請求項63乃至88のいずれか一項に記載のコンストラクト。
- 前記親和性タグがGST、MBP、NusA、チオレドキシン、ユビキチン、FLAG、BAP、6HIS、STREP、CBP、CBD、S−タグ、およびその任意の組合せからなる群から選択されるものである、請求項89に記載のコンストラクト融合ポリペプチド。
- 前記親和性タグが6HISである、請求項90に記載のコンストラクト融合ポリペプチド。
- リンカーDNAを更に含み、ここで、前記リンカーDNAは、前記第1のポリペプチドと前記第2のポリペプチドとの間に位置するものである、請求項63乃至91のいずれか一項に記載のコンストラクト。
- 前記リンカーDNAがプロテアーゼ認識配列をコードすることによって、SFPと目的ポリペプチドとの間を切断するようにする、請求項92に記載のコンストラクト。
- 前記プロテアーゼ認識配列が酵母kex2p−認識配列、kex2p−類似プロテアーゼ−認識配列、哺乳動物フリン−認識配列、エンテロキナーゼ−認識配列、サブチリシン−認識配列、タバコエッチウイルスプロテアーゼ−認識配列、トロンビン−認識配列、ユビキチン加水分解酵素−認識配列、およびその任意の組合せからなる群から選択されるものである、請求項93に記載のコンストラクト。
- 前記プロテアーゼ認識配列がエンテロキナーゼ−認識配列である、請求項94に記載のコンストラクト。
- 前記エンテロキナーゼ−認識配列がアミノ酸Asp−Asp−Lysである、請求項95に記載のコンストラクト。
- 前記プロテアーゼ認識配列がkex2p−類似プロテアーゼ−またはkex2p−認識配列である、請求項94に記載のコンストラクト。
- 前記リンカーDNAが親和性タグをコードするものである、請求項92に記載のコンストラクト。
- 前記親和性タグがGST、MBP、NusA、チオレドキシン、ユビキチン、FLAG、BAP、6HIS、STREP、CBP、CBD、S−タグ、またはその任意の組合せからなる群から選択されるものである、請求項98に記載のコンストラクト。
- 前記親和性タグが6HISである、請求項99に記載のコンストラクト。
- 前記リンカーDNAが制限酵素認識部位を含むものである、請求項92に記載のコンストラクト。
- 請求項63乃至101のいずれか一項に記載のコンストラクトを含む宿主細胞。
- 前記宿主細胞が植物、バクテリア、菌類、酵母、または動物細胞から選択されるものである、請求項102に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項103に記載の宿主細胞。
- 前記酵母細胞がカンジダ、テバリオミセス、ハンゼヌラ、クルイベロミセス、ピキア、シゾサッカロミセス、ヤロウイア、サッカロミセス、シュワンニオマイセス、およびアルクスラからなる群から選択されるものである、請求項104に記載の宿主細胞。
- 前記酵母細胞がカンジダ−ユチリス、カンジダ・ボイジニイ、カンジダアルビカンス、クルイベロミセスラクティス、ピキアパストリス、ピキアスチピチス、シゾサッカロミセスポンベ、サッカロマイセス・セレビシエ、ハンゼヌラ・ポリモルファ、ヤロウイアリポリティカ、シュワンニオマイセス・オクシデンタリス、およびアルクスラ・アデニニボランスからなる群から選択されるものである、請求項105に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞がkex2突然変異体である、請求項102に記載の宿主細胞。
- (i)SFPをコードするポリヌクレオチドおよび目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換させる工程;
(ii)前記目的ポリペプチドに融合した前記SPFを含む融合ポリペプチドが宿主細胞から生成され、分泌される条件下で、前記宿主細胞を培養する工程;および
(iii)前記融合ポリペプチドを単離する工程を含む、目的ポリペプチドを組換え的に生成する方法。 - SFPをコードする前記ポリヌクレオチドおよび目的ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが単一コンストラクトの一部である、請求項108に記載の方法。
- SFPをコードする前記ポリヌクレオチドおよび目的ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが多数のコンストラクトの一部である、請求項108に記載の方法。
- 前記多数のコンストラクトが線型である、請求項110に記載の方法。
- 前記多数のコンストラクトが相同的組換えによって組換えされたものである、請求項111に記載の方法。
- 前記SPFおよび前記目的ポリペプチドがエンドプロテアーゼ消化によって分離されるものである請求項108に記載の方法。
- 前記融合ポリペプチドが親和性タグを更に含むものである、請求項108に記載の方法。
- 前記親和性タグがGST、MBP、NusA、チオレドキシン、ユビキチン、FLAG、BAP、6HIS、STREP、CBP、CBD、S−タグ、およびその任意の組合せからなる群から選択されるものである、請求項114に記載の方法。
- 前記親和性タグが6HISである、請求項115に記載の方法。
- 前記融合ポリペプチドがリンカーペプチドを更に含み、ここで、前記リンカーペプチドが、前記SFPと前記目的ポリペプチドとの間に位置するものである、請求項108に記載の方法。
- 前記リンカーペプチドがプロテアーゼ認識配列を含むことによって、SFPと目的ポリペプチドとの間を切断するようにするものである、請求項117に記載の方法。
- 前記プロテアーゼ認識配列が酵母kex2p−認識配列、kex2p−類似プロテアーゼ−認識配列、哺乳動物フリン−認識配列、エンテロキナーゼ−認識配列、サブチリシン−認識配列、タバコエッチウイルスプロテアーゼ−認識配列、トロンビン−認識配列、ユビキチン加水分解酵素−認識配列、およびその任意の組合せからなる群から選択されるものである、請求項118に記載の方法。
- 前記プロテアーゼ認識配列がエンテロキナーゼ−認識配列である、請求項119に記載の方法。
- 前記エンテロキナーゼ−認識配列がアミノ酸Asp−Asp−Lysである、請求項120に記載の方法。
- 前記プロテアーゼ認識配列がkex2p−類似プロテアーゼ−またはkex2p−認識配列である、請求項119に記載の方法。
- 前記リンカーペプチドが親和性タグを含むものである、請求項117に記載の方法。
- 前記親和性タグがGST、MBP、NusA、チオレドキシン、ユビキチン、FLAG、BAP、6HIS、STREP、CBP、CBD、およびS−タグからなる群から選択されるものである、請求項123に記載の方法。
- 前記親和性タグが6HISである、請求項124に記載の方法。
- 前記宿主細胞が流加発酵によって培養されるものである、請求項108に記載の方法。
- 前記SFPまたはその断片または誘導体が請求項1の方法によって確認されるものである、請求項108乃至126のいずれか一項に記載の方法。
- 前記SFPが配列番号84のアミノ酸1−84またはその断片もしくは誘導体を含むものである、請求項127に記載の方法。
- 前記SFPが配列番号84のアミノ酸1−101またはその断片もしくは誘導体を含むものである、請求項128に記載の方法。
- 前記SFPが配列番号84のアミノ酸1−135またはその断片もしくは誘導体を含むものである、請求項129に記載の方法。
- 前記SFPが配列番号84のアミノ酸1−169またはその断片もしくは誘導体を含むものである、請求項130に記載の方法。
- 前記SFPが配列番号84のアミノ酸1−195またはその断片もしくは誘導体を含むものである、請求項131に記載の方法。
- 前記SFPが配列番号84のアミノ酸1−227またはその断片もしくは誘導体を含むものである、請求項132に記載の方法。
- 前記SFPが配列番号84のアミノ酸1−271またはその断片もしくは誘導体を含むものである、請求項133に記載の方法。
- 前記SFPが配列番号84のアミノ酸1−364またはその断片もしくは誘導体を含むものである、請求項134に記載の方法。
- SFPがBGL2(配列番号80)、GAS3(配列番号81)、GAS5(配列番号82)、PST1(配列番号83)、SCW4(配列番号84)、SCW10(配列番号85)、SIM1(配列番号86)、UTH1(配列番号87)、YGP1(配列番号88)、YPS1(配列番号89)、およびZPS1(配列番号90)からなる群から選択されるものである、請求項108乃至126のいずれか一項に記載の方法。
- 前記SFPがBGL2(配列番号62)、GAS3(配列番号63)、GAS5(配列番号64)、PST1(配列番号65)、SCW4(配列番号66)、SCW10(配列番号67)、SIM1(配列番号68)、UTH1(配列番号69)、YGP1(配列番号70)、YPS1(配列番号71)、およびZPS1(配列番号72)からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされるものである、請求項108乃至126のいずれ一項に記載の方法。
- 前記SFPが配列番号1のアミノ酸176−213またはその断片または誘導体を含む親水性(HL)ドメインを含み、膜貫通ドメイン(TM)が欠如したものである、請求項108乃至126のいずれか一項に記載の方法。
- 前記SFPが配列番号39またはその断片もしくは誘導体によってコードされるものである請求項138に記載の方法。
- 前記SFPが配列番号42またはその断片もしくは誘導体によってコードされるものである請求項138に記載の方法。
- 前記SFPが配列番号43またはその断片もしくは誘導体によってコードされるものである請求項138に記載の方法。
- 前記SFPが配列番号44またはその断片もしくは誘導体によってコードされるものである請求項138に記載の方法。
- 前記SFPが配列番号45またはその断片もしくは誘導体によってコードされるものである請求項138に記載の方法。
- 前記目的ポリペプチドがヒトインターロイキン2(hIL−2)、エキセンディン−3、エキセンディン−4(EXD4)、グルカゴン−類似−ペプチド−1(GLP−1)、副甲状腺ホルモン(PTH)、ヒトインターロイキン−1β、ヒトインターロイキン−6、ヒトインターロイキン−32α、ヒトインターロイキン−32β、ヒトインターロイキン−32γ、因子VII、因子VIII、因子IX、ヒト血清アルブミン、ヒトインターフェロン−α、ヒトインターフェロン−β、ヒトインターフェロン−γ、ヒト顆粒球−コロニー刺激因子、ヒト顆粒球大食細胞−コロニー刺激因子、ヒト成長ホルモン(hGH)、ヒト血小板−由来成長因子、ヒト塩基性線維芽細胞成長因子、ヒト表皮成長因子(EGF)、ヒトインスリン−類似成長因子、ヒト神経成長因子、ヒト形質転換成長因子β−1、ヒト濾胞刺激ホルモン、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルクロニダーゼ、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、過酸化物ジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ウシガラクトース−1−ポスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、クラゲ緑色蛍光蛋白質、カンジダアンタクチカリパーゼB、カンジダルゴサ(Candida rugosa)リパーゼ、菌類クロロペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、レゾルバーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、トレハロースシンターゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、キシラナーゼ、フィターゼ、ヒトラクトフェリン、ヒトエリスロポエチン、ヒトパラオキソナーゼ、ヒト成長分化因子15、ヒトガレクチン−3結合蛋白質、ヒトセリンプロテアーゼ抑制剤、クニッツ類型2、ヒトヤヌスキナーゼ2、ヒトfms−類似チロシンキナーゼ3リガンド、ヒトYM1&2、ヒトCEMI、ヒトジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ヒトレプチン、ヒトmL259、ヒトプロテイナーゼ3、ヒトリゾチーム、ヒトデッドボックス蛋白質41、ヒトエトポシド誘導された蛋白質24、マウスカスパーゼ1、ウシアンギオジェニン、およびミミズルンブロキナーゼからなる群から選択されるものである請求項108乃至143のうち、いずれか1に記載の方法。
- 請求項108乃至144のいずれか一項に記載の方法によって組換え的に生成された、目的ポリペプチド。
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