CN102206615B - 一种用酶解法制备乙醇脱氢酶的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用酶解法制备乙醇脱氢酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)混合液：将CBP液和α-淀粉酶液按体积比为5∶1-2混合均匀，得混合溶液；取啤酒酵母和上述混合液置反应罐中，搅拌均匀；2)在搅拌下调pH值至6.5-7.5，在37-42℃条件下搅拌反应23h-25h，得酶解啤酒酵母液；3)上述酶解啤酒酵母液经离心、超滤浓缩，得浓缩液；4)上述浓缩液经干燥得乙醇脱氢酶酶粉。本发明的原料获取简单，制备设备简单、过程操作简单且时间不长。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种用酶解法制备乙醇脱氢酶的工艺。
【背景技术】
乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase，EC 1.1.1.1，缩写ADH)属氧化还原酶类，是体内一种含Zn的金属酶，它在乙醇代谢途径中起着关键酶的重要作用。催化反应如下：
【发明内容】
本发明的目的是提供一种用酶解法制备乙醇脱氢酶的工艺，制备简单、快速。
上述目的通过以下技术方案实现：
一种用酶解法制备乙醇脱氢酶的工艺，其特征在于，包括以下步骤：
1)混合液：将CBP液和α-淀粉酶液按体积比为5∶1-2混合均匀，得混合溶液；取啤酒酵母和上述混合液置反应罐中，搅拌均匀；
2)在搅拌下调pH值至6.5-7.5，在37-42℃条件下搅拌反应23h-25h，得酶解啤酒酵母液；
3)上述酶解啤酒酵母液经离心、超滤浓缩，得浓缩液；
4)上述浓缩液经干燥得乙醇脱氢酶酶粉。
由上述方案可知，本发明通过CBP液和α-淀粉酶液对啤酒酵母按设置条件进行酶解以获取酶解啤酒酵母液，再经离心、超滤浓缩和干燥得乙醇脱氢酶酶粉，其中，离心、超滤浓缩和干燥这些步骤皆为常规技术手段；本发明的原料获取简单，制备设备简单、过程操作简单且时间不长。
进一步的方案是，所述步骤1)的α-淀粉酶液由以下工艺制得：混合步骤3)的残渣和步骤4)的残渣得混合物，将所述混合物加入pH6.0-pH7.0、0.01mol/L磷酸缓冲液，混合物的质量g与磷酸缓冲液的体积ml之比为1∶2，搅拌0.5h，经离心、超滤浓缩，得α-淀粉酶液。本方案使得本制备工艺可以废物利用，在刚开始制备乙醇脱氢酶时，可以先从其它地方获取α-淀粉酶液，之后就可以在生产过程中利用相应的残渣来生产α-淀粉酶液。
进一步的方案是，步骤2)中的所述啤酒酵母为废弃啤酒酵母泥，即生产啤酒后过滤出的啤酒酵母；这些废弃啤酒酵母泥可由啤酒厂提供，可以废物回收利用，低成本低耗环保。
进一步的方案是，步骤1)中，所述啤酒酵母的质量g与混合溶液的体积ml之比为1∶2。
进一步的方案是，所述步骤3)具体包括：
301)上述酶解啤酒酵母液抽入离心机，经1200-1500r/min常温离心收集上清液，残渣压滤再收集上清液，合并两次上清液，残渣保留备用；
302)上述合并上清液抽入离心机，经14000-17000r/min常温离心收集上清液，残渣保留备用；
303)将步骤302)所得的上清液经超滤浓缩，得浓缩液。
进一步的方案是，所述步骤4)具体为，上述浓缩液转入冷冻干燥机中冷冻干燥，或用-15℃以下的冷丙酮洗涤脱水干燥，得乙醇脱氢酶酶粉。
【附图说明】
图1是本发明的制备工艺流程图；
图2是本发明制备工艺中所采用的设备流程图。
【具体实施方式】
结合图1、图2和表1，本发明包括以下步骤：
1)取100kg废啤酒酵母泥(废弃啤酒酵母泥是生产啤酒后过滤出的啤酒酵母，由青岛啤酒厂(珠海)提供，当然也可以用其他公司的废弃啤酒酵母泥或其它啤酒酵母)置反应罐中，加入混合溶液，搅拌均匀，该混合溶液包括150L的酶活力为500U/ml的萝卜几丁质结合蛋白液(CBP液)和50L的酶活力为1.17U/ml的α-淀粉酶液；其中，CBP液可以按由本申请人于2011年1月30日在中国申请的专利申请号为201110033110.4、名称为《一种高分子冷凝聚法制备萝卜几丁质结合蛋白的方法》的发明专利中所记载的技术方案来制备。
2)在搅拌下调pH值至7，在搅拌速度100r/min、40℃的条件下保温反应25h，得酶解啤酒酵母液约300L，酶活力达13500U/ml，比活力5403U/mg蛋白质；
3)上述酶解啤酒酵母液抽入离心机，先用低速离心(1500r/min，常温)收集上清液，残渣再经过压滤机压滤一次再收集上清液，合并两次上清液约97L，残渣保留备用；
4)上述合并上清液再经管式离心机离心(16000r/min，常温)，收集上清液约85L，酶活力达14967U/ml，比活力770807U/g蛋白质，残渣保留备用；
5)将步骤4)所得的上清液泵入超滤机，经超滤(过滤条件：收集分子量为10000道尔顿以上的物质)得浓缩液约29L，酶活力达15600U/ml，比活力19500U/mg蛋白质；
6)将浓缩液转入冷冻干燥机中冷冻干燥或用-15℃以下的冷丙酮洗涤脱水三次，得ADH酶粉5kg，酶活力达14万U/g。
表1制备过程中的相关数据
在生产过程中，我们利用步骤3)的残渣和步骤4)的残渣来制备α-淀粉酶液：混合步骤3)的残渣和步骤4)的残渣得混合物，将该混合物加入pH6.0-pH7.0、0.01mol/L磷酸缓冲液，混合物的质量g与磷酸缓冲液的体积ml之比为1∶2，搅拌0.5h，先离心(1200-1500r/min，常温)收集上清液，残渣重复一次离心(14000-17000r/min，常温)收集上清液，合并两次上清液，经超滤(过滤条件：收集分子量为10000道尔顿以上的物质)浓缩，得α-淀粉酶液，经检测，酶活力达1.17-1.36U/ml，比活力为63.3-76.8U/mg蛋白质。
酶解啤酒酵母液、上清液、浓缩液和酶粉的活力测定工艺：于石英比色皿中加入pH8.0、0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tri-HCl缓冲液3ml、17mol/L乙醇40uL、0.05mol/LNAD+40ul(用上述缓冲液制备)，于25℃水浴恒温恒定后，迅速加入0.1ml酶液(酶解啤酒酵母液或提取液或浓缩液或酶粉的稀释液)，并以缓冲液为对照；在340nm波长下，每隔30S读一次数，共读3min，以A340对时间(s)作图，计算出每分钟的A340增加值。在上述条件下，每分钟在340nm波长下，增加0.001光吸收单位的酶量为一个酶活力单位(U)。按下式计算酶活力单位：
U/ml＝ΔA340×3.18/(3×0.001×0.1)
U/g酶＝U/mL×稀释倍数/酶质量
萝卜几丁质结合蛋白的活力测定工艺：以溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)为底物。挑取少量底物于研钵内，加入定量1/15mol/L pH6.2的磷酸盐缓冲液，研磨破壁，不断加入上述缓冲液，研磨，使悬浮液在450nm波长下，光吸收值达0.6～0.9个光吸收单位，即为底物悬浮液；酶活性测定时，在25℃下以上述磷酸盐缓冲液为对照，于测定比色皿内加入底物悬浮液2.5ml，迅速加入0.1ml酶液，搅匀，立即读取光吸收值(A)后，每隔30s读一次数，共读3min。求出平均光吸收值(ΔA)。以在上述条件下每分钟在450nm波长下光吸收值下降0.001个单位的酶量为1个酶活力单位(U)，依下式计算酶活力单位：
酶活力单位(U/ml)＝ΔA450×0.1/(3×0.001)
酶活力单位(U/g)＝U/mL×稀释倍数/酶质量
α-淀粉酶的活力测定工艺：取酶液、1％可溶性淀粉溶液(1g可溶性淀粉加入0.01mol/L pH6.9磷酸缓冲液100ml，该磷酸缓冲液内含0.05mol/L NaCl)分别在25℃水浴中保温恒定，各取0.5ml，迅速混匀，于25℃下准确反应3min，立即加入1.0ml显色剂(1g 3，5-二硝基水杨酸中加入少量蒸馏水，搅匀，加入20ml 2mol/L NaOH水溶液，使其溶解，然后加入30.0g四水酒石酸钾钠，待其溶解后以蒸馏水定容至100ml)终止反应。置沸水浴中加热5min，冷却后用4ml蒸馏水稀释。在540nm波长下测定吸光值(A)，并以1ml显色剂中加入1ml上述缓冲液同样保温冷却再用4ml蒸馏水稀释为对照。以A值于葡萄糖标准曲线上，查出还原糖含量。在上述条件下每分钟从可溶性淀粉中释放1μmol/L还原糖的酶量为1个酶活力单位。
蛋白质含量测定：蛋白质含量测定按Bradford(1976)工艺，并以牛血清白蛋白为标准蛋白质。
本发明不局限于上述实施例，基于上述实施例的、未做出创造性劳动的简单替换，应当属于本发明揭露的范围。
Claims (2)
1.一种用酶解法制备乙醇脱氢酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)混合液：将萝卜几丁质结合蛋白液和α-淀粉酶液按体积比为5∶1-2混合均匀，得混合溶液；取啤酒酵母和上述混合液置反应罐中，搅拌均匀，所述啤酒酵母的质量g与混合溶液的体积ml之比为1∶2；
2)在搅拌下调pH值至6.5-7.5，在37-42℃条件下搅拌反应23h-25h，得酶解啤酒酵母液；
3)上述酶解啤酒酵母液经离心、超滤浓缩，得浓缩液；
4)上述浓缩液转入冷冻干燥机中冷冻干燥，或用-15℃以下的冷丙酮洗涤脱水干燥，得乙醇脱氢酶酶粉；
所述步骤3)具体包括：
301)上述酶解啤酒酵母液抽入离心机，经1200-1500r/min常温离心收集上清液，残渣压滤再收集上清液，合并两次上清液，残渣保留备用；
302)上述合并上清液抽入离心机，经14000-17000r/min常温离心收集上清液，残渣保留备用；
303)将步骤302)所得的上清液经超滤浓缩，得浓缩液。
2.根据权利要求1所述的用酶解法制备乙醇脱氢酶的方法，其特征在于，步骤1)中的所述啤酒酵母为废弃啤酒酵母泥，即生产啤酒后过滤出的啤酒酵母。
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