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Abstract

本发明属于生物能源和基因工程技术领域，特别涉及到藻类油脂及其用于制备生物柴油的方法。包括藻类体内乙醇的制备和利用藻类体内油脂与乙醇发生酯交换反应制备生物柴油的方法，具体来说，本发明涉及了使用重组藻类来生产生物柴油的方法。该方法使用了一种含有能表达丙酮酸脱羧酶(PDC)活性和能表达乙醇脱氢酶(ADH)活性的藻类，通过基因工程技术将一个能表达脂肪酸乙脂合成酶(FAEES)活性的基因转入进去，在藻类体内表达的FAEES就能在一定的条件下催化藻类体内的乙醇与脂肪酸反应，得到生物柴油，副产物为甘油。该技术条件温和、成本低、易于控制，以藻类生物体内油脂为原料，具有良好的工业化应用前景。

Description

一种重组藻类体内生产生物柴油的方法
技术领域
本发明属于生物能源和基因工程技术领域，特别涉及到藻类油脂及其用于制备生物柴油的方法。具体来说，本发明涉及了使用重组藻类来生产生物柴油的方法，是一种低投入高产率的生物柴油生产方法。该方法使用了一种含有能表达丙酮酸脱羧酶(以下称之为PDC)活性和能表达乙醇脱氢酶(以下称之为ADH)活性的藻类，通过基因工程技术将一个能表达脂肪酸乙脂合成酶(以下称之为FAEES)活性的基因转入进去，在藻类没有实质性增殖的条件下，体内表达的FAEES就能在一定的条件下催化藻类体内的(内源)乙醇与脂肪酸反应，从而体内生成生物柴油。
背景技术
当前，人口的增长使得不断增加的油脂需求量与自然资源严重短缺的矛盾日益尖锐，特别是随着日趋严重的全球性能源短缺与环境恶化，使得人们不得不从环境保护与资源开发的角度出发，积极开发替代石化燃料的可再生新能源，如生物柴油就是一种具有很大发展潜力且环境友好的可再生清洁能源。生物能源具有能量密度、含硫量低、燃烧充分、润滑性能好等液体能源产品所期望的优良性能。自1988年以来，许多欧洲国家已经开始将生物柴油作为传统柴油的替代品，但由于较高的原料成本，使得生物柴油的价格高于传统柴油，这严重地制约了生物柴油的产业化进程，因此选取合适的、低成本的油脂资源是生物柴油产业发展的方向。
目前有关生物柴油制备的研究基本上集中于植物油方面，都是以植物油或餐饮废弃油脂为原料，利用植物油为原料，成本高；而以餐饮废弃油脂为原料，也存在原料难以收集和运输的困难，因此这些研究难以实现工业化应用。在利用植物油脂制备生物柴油的过程中，原料成本就占了总成本的70％-85％，这严重制约了生物柴油的工业化应用。
藻类生物体内含有大量的油脂，通过基因工程技术在藻类生物体内制备生物柴油(即脂肪酸乙脂和脂肪酸甲脂)，这可以为生物柴油的制备提供更加廉价的原料，因为藻类分布的范围极广，对环境条件要求不严，适应性较强，在只有极低的营养浓度、极微弱的光照强度和相当低的温度下也能生活。不仅能生长在江河、溪流、湖泊和海洋，在短暂积水或潮湿的地方也能生长。从热带到两极，从积雪的高山到温热的泉水，从潮湿的地面到不很深的土壤内，几乎到处都有藻类分布。而且该过程不需要大量劳动力。生产生物柴油的常用方法是酯交换法，即在油脂中加入一定量的低碳醇，如甲醇或乙醇等，在碱或酸催化剂作用下，在一定的温度和时间反应生成生物柴油，同时产生副产物甘油。本发明将基因工程技术与酯交换反应制备生物柴油的技术相结合，提出了一种用藻类体内油脂制备生物柴油的方法，目前尚未见过有相关报道。
本发明反应条件温和，成本低、产率高、原料资源丰富，同时具有不占用土地、不消耗油资源的优点，具有良好的工业化应用前景。
发明内容
本发明的目的：旨在提供一种以高生产率高效率生产生物柴油的方法，包含使用一种由含有一个PDC活性基因且含有一个ADH活性基因的藻类，通过基因工程技术将一个能表达脂肪酸FAEES活性的基因转入进去，这种藻类体内表达的FAEES就能催化藻类体内的乙醇与脂肪酸反应，从而体内生成生物柴油。
本发明将公开一种利用基因工程技术在藻类中转入FAEES基因，从而产生一种体内生产生物柴油的办法。本发明是建立在通过重组藻类生产乙醇的基础之上的。
藻类植物是植物界中没有真正根、茎、叶分化，以光能自养生活，生殖器官由单细胞构成和无胚胎发育的一大类群。以小球藻为例，小球藻是单细胞浮游种类，细胞微小，圆形或略椭圆形，细胞壁薄，细胞内有1个杯形或曲带形载色体，细胞老熟时载色体分裂成数块。无蛋白核，只有蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa Chick.)有蛋白核。无性生殖时，原生质分裂形成2、4、8、16个似亲孢子，母细胞壁破裂时，孢子放出成为新的植物体。小球藻在我国分布甚广，生活于含有机质的小河、沟渠、池塘等水中，在潮湿的土壤上也有分布。
实施方案如下：
本发明中可以使用来自各种生物的、能表达FAEES活性的基因。通过基因工程技术，在表达FAEES的基因已获得的前提下，进行基因扩增(PCR技术)、体外重组、重组体向寄主细胞导入、再经过重组体的克隆筛选与鉴定，得到能够表达外源基因FAEES的转型小球藻。
按照本发明转型的宿主微生物是藻类生物，该藻类不同于以上现有技术中作为宿主的菌类。
本发明的主要特征之一是，选择一种由含有一个PDC活性的基因且含有一个能表达ADH活性的基因的DNA的能生产(内源)乙醇的藻类作为主要转型宿主，按照本发明转型藻类的使用，藻类制备FAEES。这一发明处于国际领先水平，具有重大意义。
具体实施方式
以下实施实例详细说明本发明，但不应视为本发明范围的限制。
实施例一：藻种培养
所培养的藻种为本公司研发中心已构建好，并稳定转化ADH和PDC的转基因小球藻，该过程的详细方法见本公司另一专利：《一种通过重组藻类生产乙醇的方法》。
配制稀释的LB培养基，按藻液与培养液1∶2的比例扩种于1000mL的三角烧瓶中。将三角瓶放在光照培养箱中培养，控制其培养条件：光照强度75.3～80.1mmol/m2s，温度为26℃，pH为6～8。每天搅拌三次，每次1分钟，待藻体达到一定密度后按藻液与培养液1∶4的比例扩种于3000ml的三角烧瓶中，放在温度较低、光线较弱的地方，人工通入经过过滤的空气进行培养，每3个星期左右扩种1次。扩大培养的程序为3000mL三角烧瓶→20L细口玻璃瓶→桶中培养→生产池。
实施例二：FAEES基因克隆到穿梭载体
将目的基因FAEES与PET28载体连接，以质粒形式存在，简称PET-FAEES。以PET-FAEES作为模板，进行PCR。为了在PCR中克隆FAEES基因，合成下列引物并使用FAEES基因扩增引物：
(a-1)5’-ccgCTCGAG ATA GCC ACC ATGCCGCCCTACACC-3’
(b-1)5’-tgcTCTAGATCACTGTTTCCCGTTGCCATT-3’
PCR(Polymerase Chain Reaction)在下列条件用“DNA热循环者”和Tag DNA聚合酶(Takara公司)作为反应试剂进行的。
反应物：PCR缓冲剂、1.25mM dNTP混合物、模板、引物(上游和下游)、Tag酶、无菌水。将以上成分混合，并使该混合物进行PCR反应。
PCR循环：
变性过程：    94℃    60s
退火过程：    52℃    60s
延伸过程：    72℃    120s
由以上过程组成的一个循环重复30个循环。反应完成后，将以上反应混合物10ul进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物片段大小是否符合FAEES片段大小。
FAEES基因与穿梭质粒pKYL71连接：
用胶回收试剂盒(Invitrogen公司)回收作为PCR产物的FAEES目的片段，详细步骤参考试剂盒内的说明书。回收后的片段与pGEM-T载体连接，其连接体系为：反应缓冲剂、pGEM-T载体、PCR产物FAEES片段、T4连接酶。反应1小时后转入4℃连接反应16小时。蓝白斑筛选连接产物，酶切获得目的片段FAEES，构建穿梭载体。
将以上连接反应产物用氯化钙的方法转化入感受态状态的Escherichia coli JM109细胞，涂布到含有0.2M IPTG的固体培养基(10g蛋白胨、5g酵母粉、5gNaCl、和16g琼脂溶解于1升双蒸水)。在该培养基挑取白色阳性菌落扩增培养，16小时后收集细胞并利用碱裂解法小量制备质粒。然后酶切质粒并回收FAEES目的片段。该片段与同样经过酶切处理的基因表达载体，如pKYL71载体连接，其连接体系为：pKYL71、FAEES、T4连接酶、无菌水。连接产物为目的基因FAEES与载体连接的质粒，简称FAEES-载体。
实施例三：根癌农杆菌的培养和转化
利用冻融法把以上构建好的FAEES-载体转入根癌农杆菌感受态细胞中，涂布于固体培养基上(LB+40mg/L利福平+25mg/L链霉素+75mg/L庆大霉素)，挑取单菌落，在2mL农杆菌液体培养基中，28℃培养过夜，取1mL以上培养物，加入50mL农杆菌液体培养基中，28℃培养至OD600＝1.0，将50mL农杆菌液经3500～4000r/min离心8min收集菌体，用UM1液体培养基重悬，28℃继续培养3～4h，至OD600＝0.5。
实施例四：藻的遗传转化及转化株的筛选
将以上培养好的藻种放入上述农杆菌培养液中，在190r/min，28℃摇床上共培养10min后，用无菌滤纸吸去除多余菌液，置于铺有一层无菌滤纸的UM1培养基上，用封口膜封好培养皿，25℃，于暗处共培养约60h，之后依次用无菌水、含500mg/L氨苄青霉素的无菌水和用含500mg/L氨苄青霉素的UM1将农杆菌洗掉，放在稀释的LB培养基上，用封口膜封好培养皿，暗处培养，待藻种生长到一定密度时，转至UM3培养基中继续培养，之后转至配制稀释的LB培养基培养，得到藻种转化株，而非转化株则在含有50mg/L卡娜霉素的培养基上逐渐死亡。
利用初步热解技术筛选总脂产量高、不饱和脂肪酸含量低的藻种大量培养。
实施例五：藻转化株的生物柴油体内生产
在稀释的LB培养基中，培养藻种生长到一定密度时，收集培养混合物。以生物催化工艺生产生物柴油，工艺简述如下：生物酯反应，藻类体内的乙醇与脂肪酸，脂肪酸乙脂合成酶催化，在一定温度与常压下进行酯交换生物反应。重力沉淀、水洗、分层。甘油的分离与粗制脂肪酸乙脂的获得。催化剂的脱出与精制生物柴油的获得。所获得生物柴油以EN 14214为标准。
实施例六：藻转化株的生物柴油体外生产
将藻转化株含FAEES基因并能稳定表达的藻类破碎，在37℃反应1-24小时，进行体外生物转酯化酶反应后，经分离纯化得到脂肪酸己酯即生物柴油，副产物为甘油。所获得生物柴油以EN 14214为标准。

Claims (4)

1.一种利用藻类油脂及其用于制备生物柴油的生物技术方法。其特征在于，包括藻类体内乙醇的制备和利用藻类体内油脂与乙醇发生酯交换反应制备体内生物柴油的方法，即使用了一种含有能表达丙酮酸脱羧酶(以下称之为PDC)活性和能表达乙醇脱氢酶(以下称之为ADH)活性的藻类，通过基因工程技术将一个能表达脂肪酸乙脂合成酶(以下称之为FAEES)活性的基因转入进去，在藻类体内表达的FAEES就能在一定的条件下催化藻类体内的乙醇与脂肪酸反应，体内得到生物柴油，副产物为甘油。
2.按权利要求一所述利用藻类油脂及其用于制备生物柴油的方法。其特征在于，所述利用藻类油脂及其用于制备生物柴油的步骤如下：
①.藻类生物体内乙醇的制备
1)基因克隆：由细菌中克隆pdc基因和Adh基因。由人肝脏细胞克隆FAEES基因。
2)质粒构建：将pdc和Adh分别连接到质粒pUC19中，得到pdc+pUC19和Adh+pUC19。制备大肠杆菌感受态细胞，转化大肠杆菌。
3)质粒扩增：在大肠杆菌中扩增质粒。提取质粒。
4)构建表达载体：酶切质粒pUC19，电泳，胶回收目的基因。再用酶切载体，得粘性末端。将pdc基因和Adh基因分别连接到质粒载体，得到pdc+载体和Adh+载体，FAEES+载体。
5)转化农杆菌：制备农杆菌感受态细胞，用上一步得到两种质粒转化农杆菌。
6)转染藻类：转化后的农杆菌与藻类共培养，使pdc基因和Adh基因，FAEE基因插入藻类基因组中。
7)基因表达：洗去农杆菌后，大量培养转基因藻类。
8)乙醇的检测。检测培养基中乙醇含量的变化。如果检测到乙醇明显增加，则说明以上两种基因已经成功转入藻类。
②.藻类生物油脂酯交换制备生物柴油
由人肝脏细胞克隆FAEES基因。以农杆菌为介质，再将FAEES基因转入上述转基因藻中。检测脂肪酸的含量变化。当含量不再变化时，破碎藻细胞经分离收集培养混合物，以催化工艺生产生物柴油，副产物为甘油。藻转化株的生物柴油体内生产和藻转化株的生物柴油体外生产。
3.按权利要求二所述生产的生物柴油技术。权利要求包括脂肪酸乙脂合成酶FAEES和脂肪酸甲脂合成酶FAMES，在生物柴油(脂肪酸乙脂和脂肪酸甲脂)的体内和体外生物合成应用。
4.按权利要求所述的藻类包括小球藻，微藻，常见的藻类和其他不常见藻类，淡水和咸水藻类。
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