CN101970665A

CN101970665A - 分离的醇脱氢酶酶类及其用途

Info

Publication number: CN101970665A
Application number: CN2009801082701A
Authority: CN
Inventors: 樫山雄树
Original assignee: Bio Architecture Lab Inc
Current assignee: Bio Architecture Lab Inc
Priority date: 2008-01-28
Filing date: 2009-01-28
Publication date: 2011-02-09
Also published as: EP2245162A2; KR20100119877A; WO2009097346A2; JP2011510634A; CL2009000182A1; BRPI0906682A2; EP2463374A2; AU2009209184A1; EP2463374A3; MX2010008023A; ZA201005292B; US20090203089A1; CA2712722A1; WO2009097346A3

Abstract

提供细菌的多核苷酸和多肽，其中所述多肽具有脱氢酶活性，例如醇脱氢酶(ADH)活性、糖醛酸，4-脱氧-L-赤-5-己酮糖糖醛酸(DEHU)((4S，5S)-4，5-二羟基-2，6-二氧代己酸)氢化酶活性、2-酮基-3-脱氧-D-葡萄糖酸脱氢酶活性、D-甘露糖醛酸氢化酶活性和/或D-甘露糖酸脱氢酶活性。还提供方法、酶类、重组微生物和微生物系统，用于将例如来自生物质的多糖转化为适合的单糖或寡糖，还用于将适合的单糖或寡糖转化为大量生产型化学品，例如生物燃料。还提供按本文所述方法生产的大量生产型化学品。

Description

分离的醇脱氢酶酶类及其用途

优先权

本申请根据35U.S.C.§119(e)，要求2008年1月28日提交的美国临时专利申请第61/024,160号的权益，该申请通过引用的方式整体并入本文。

关于序列表的声明

以文本形式代替纸件提供了本申请相关的序列表，并且该序列表在此通过引用并入本说明书。含有序列表的文本文件的名称是150097_402PC_SEQUENCE_LISTING.txt。该文本文件为92KB，于2009年1月28日生成，并且通过EFS-Web电子提交。

技术领域

本发明的实施方案一般地涉及分离的多肽以及编码该多肽的多核苷酸，所述多肽具有脱氢酶活性，例如醇脱氢酶(ADH)活性、糖醛酸，4-脱氧-L-赤-5-己酮糖糖醛酸(DEHU)((4S，5S)-4，5-二羟基-2，6-二氧代己酸)氢化酶活性、2-酮基-3-脱氧-D-葡萄糖酸脱氢酶活性、D-甘露糖醛酸氢化酶活性和/或D-甘露糖酸脱氢酶活性，还涉及使用包含这些多核苷酸和多肽的重组微生物、微生物系统和化学系统，将生物质转化为大量生产型化学品，例如生物燃料。

相关技术

用于将生物质转化为生物燃料的现有方法集中在木质纤维素生物质的使用，并且存在很多与使用本工艺相关的问题。木质纤维素生物质的大规模培育需要大量的耕地，这只有通过用能源作物生产替代粮食作物生产、采伐森林和再耕种目前未经耕作的土地来实现。其他的问题包括水的可利用性和质量的降低以及杀虫剂和化肥的使用的增加。

由于木质纤维素生物质坚实的机械强度和复杂的化学组分，使用生物系统对其进行降解是非常困难的挑战。将木质纤维素完全转化为单糖需要约三十种不同的酶。该复杂的方式的仅有的可用的替代方式需要大量的热、压力和强酸。因此，本领域需要用于将生物质转化为作为生物燃料或生物汽油使用的碳氢化合物的经济的和技术上简单的工艺。

作为该工艺中的一个步骤，具有醇脱氢酶活性的酶类在将来自生物质的多糖转化为寡糖或单糖中是有用的，然后所述寡糖或单糖可以转化为各种生物燃料。具有诸如糖醛酸、4-脱氧-L-赤-5-己酮糖糖醛酸(DEHU)和/或D-甘露糖醛酸氢化酶活性的醇脱氢酶活性的酶类先前已经从藻酸盐代谢细菌中纯化，但是编码DEHU或D-甘露糖醛酸氢化酶的基因尚未被克隆和表征。本申请提供了编码具有DEHU和/或D-甘露糖醛酸氢化酶活性的醇脱氢酶的基因，并且也提供了在生产例如生物燃料的大量生产型化学品中与它们的使用相关的方法。

概述

本发明的实施方案包括选自以下的分离的多核苷酸，及其片段或变体：

(a)分离的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少80％同一的核苷酸序列；

(b)分离的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少90％同一的核苷酸序列；

(c)分离的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列；

(d)分离的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少97％同一的核苷酸序列；

(e)分离的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列至少99％同一的核苷酸序列；和

(f)分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列，

其中所述分离的核苷酸编码具有脱氢酶活性的多肽。在其他实施方案中，所述多肽具有醇脱氢酶活性。在某些实施方案中，所述多肽具有DEHU氢化酶活性和/或D-甘露糖醛酸氢化酶活性。

另外的实施方案包括用于将多糖转化为适合的单糖或寡糖的方法，所述方法包含使多糖与微生物系统接触，其中所述微生物系统包含重组微生物，并且其中所述重组微生物包含本公开内容的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有氢化酶活性的多肽，所述氢化酶活性例如醇脱氢酶活性、DEHU氢化酶活性和/或D-甘露糖醛酸氢化酶活性。

另外的实施方案包括用于催化D-甘露糖醛酸还原(氢化)的方法，所述方法包含使D-甘露糖醛酸与微生物系统接触，其中所述微生物系统包含微生物，并且其中所述微生物包含本公开内容的多核苷酸。

另外的实施方案包括用于催化DEHU还原(氢化)的方法，所述方法包含使DEHU与微生物系统接触，其中所述微生物系统包含微生物，并且其中所述微生物包含本公开内容的多核苷酸。

另外的实施方案包括包含本公开内容的分离的多核苷酸的载体，并且还可以包括下述载体，其中所述分离的多核苷酸可操作地连接在表达调控区，并且其中所述多核苷酸编码具有氢化酶活性的多肽，所述氢化酶活性例如醇脱氢酶活性、DEHU氢化酶活性和/或D-甘露糖醛酸氢化酶活性。

另外的实施方案包括重组微生物或包含重组微生物的微生物系统，其中所述重组微生物包含如本文所述的多核苷酸或多肽。在某些实施方案中，所述重组微生物选自：醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)、无色杆菌(Achromobacter)、嗜酸菌(Acidiphilium)、不动杆菌(Acinetobacter)、马杜拉放线菌(Actinomadura)、游动放线菌(Actinoplanes)、嗜热古生菌(Aeropyrum pernix)、土壤杆菌(Agrobacterium)、产碱杆菌(Alcaligenes)、菠萝(Ananas comosus)(M)、节细菌(Arthrobacter)、黑曲霉(Aspargillusniger)、米曲霉(Aspargillus oryze)、蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)、粉状曲霉(Aspergllus pulverulentus)、佐氏曲霉(Aspergillus saitoi)、酱油曲霉(Aspergillus sojea)、宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、缓慢芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽胞杆菌活菌(Bacillus lichiformis)、浸麻芽孢杆菌(Bacillus macerans)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)、洋葱布克氏菌(Burkholderia cepacia)、柱状假丝酵母(Candida cylindracea)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、番木瓜(Carica papaya)(L)、纤维菌(Cellulosimicrobium)、头孢霉(Cephalosporium)、毛壳菌(Chaetomiumerraticum)、细丽毛壳菌(Chaetomium gracile)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、酪酸梭菌(Clostridium butyricum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)、(谷氨酸)棒状杆菌(Corynebacterium(glutamicum))、efficiens棒状杆菌(Corynebacteriumefficiens)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠球菌(Enterococcus)、菊欧文氏菌(Erwina chrysanthemi)、葡糖杆菌(Gliconobacter)、葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter)、嗜盐古菌(Haloarcula)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、Humicola nsolens、西唐北里孢菌(Kitasatospora setae)、克雷柏氏杆菌(Klebsiella)、产酸克雷柏氏杆菌(Klebsiella oxytoca)、克鲁维斯酵母属(Kluyveromyces)、脆壁克鲁维斯酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)、考克氏菌(Kocuria)、乳酸乳杆菌(Lactlactis)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、发酵乳酸杆菌(Lactobacillusfermentum)、清酒乳酸杆菌(Lactobacillus sake)、乳球菌属(Lactococcus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、明串珠菌属(Leuconostoc)、甲基孢囊菌属(methylocysis)、西西里甲烷叶菌(methanolobus siciliae)、嗜器官产甲烷菌(Methanogenium organophilum)、布氏甲烷杆菌(Methanobacteriumbryantii)、蛾微杆菌(Microbacterium imperiale)、溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)、小月菌(Microlunatus)、爪哇毛霉(Mucor javanicus)、分支杆菌属(Mycobacterium)、漆斑菌(Myrothecium)、硝化杆菌(Nitrobacter)、亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)、诺卡氏菌(Nocardia)、番木瓜(Papayacarica)、小球菌(Pediococcus)、嗜盐片球菌(Pediococcus halophilus)、青霉(Penicillium)、沙门柏干酪青霉(Penicillium camemberti)、桔青霉(Penicillium citrinum)、埃默森青霉(Penicillium emersonii)、娄地青霉(Penicillium roqueforti)、薄青霉(Penicillium lilactinum)、多色青霉(Penicillium multicolor)、异养硝化-好氧反硝化菌(Paracoccuspantotrophus)、丙酸杆菌(Propionibacterium)、假单胞菌(Pseudomonas)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、脱氮假单胞菌(Pseudomonasdenitrificans)、热球菌(Pyrococcus)、激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)、极端嗜热球菌(Pyrococcus horikoshii)、根瘤菌(Rhizobium)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus Lindt)、根霉(Rhizopus)、戴尔根霉(Rhizopus delemar)、日本根霉(Rhizopus japonicus)、雪白根霉(Rhizopus niveus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、少孢根霉(Rhizopusoligosporus)、红球菌(Rhodococcus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、核盘菌(Sclerotina libertina)、多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriummultivorum)、鞘氨醇杆菌(Sphingobium)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、链球菌(Streptococcus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus Y-1)、链霉菌(Streptomyces)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、鼠链霉菌(Streptomyces murinus)、锈赤链霉菌(Streptomyces rubiginosus)、紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)、轮枝链霉菌(Streptoverticillium mobaraense)、四联球菌(Tetragenococcus)、嗜热菌(Thermus)、泛养硫球菌(Thiosphaera pantotropha)、栓菌(Trametes)、木霉(Trichoderma)、长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、绿色木霉(Trichoderma viride)、青霉毛孢子菌(Trichosporon penicillatum)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、黄杆菌(Xanthomonas)、酵母(yeast)、鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、酵单胞菌(Zymomonas)和运动发酵单胞菌(Zymomonus mobilis)。

另外的实施方案包括选自以下的分离的多肽，及其变体或片段：

(a)分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少80％同一的氨基酸序列；

(b)分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或78所示氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列；

(c)分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列；

(d)分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少97％同一的氨基酸序列；

(e)分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少99％同一的氨基酸序列；和

(f)分离的多肽，其包含SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列，

其中所述分离的多肽具有氢化酶活性，例如醇脱氢酶活性、DEHU氢化酶活性和/或D-甘露糖醛酸氢化酶活性。

另外的实施方案包括用于将多糖转化为适合的单糖或寡糖的方法，所述方法包含使多糖与重组微生物接触，其中所述重组微生物包含按照本公开内容的ADH多核苷酸或多肽。

另外的实施方案包括用于催化D-甘露糖醛酸还原(氢化)的方法，所述方法包含使D-甘露糖醛酸与重组微生物接触，其中所述重组微生物包含按照本公开内容的ADH多核苷酸或多肽。

另外的实施方案包括用于催化糖醛酸，4-脱氧-L-赤-5-己酮糖糖醛酸(DEHU)还原(氢化)的方法，所述方法包含使DEHU与重组微生物接触，其中所述重组微生物包含按照本公开内容的ADH多核苷酸或多肽。

另外的实施方案包括用于将多糖转化为适合的单糖或寡糖的微生物系统，其中所述微生物系统包含重组微生物，并且其中所述重组微生物包含选自以下的分离的多核苷酸：

(f)分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35或37所示的核苷酸序列。

另外的实施方案包括用于将多糖转化为适合的单糖或寡糖的微生物系统，其中所述微生物系统包含重组微生物，并且其中所述重组微生物包含选自以下的分离的多肽：

(b)分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列；

(f)分离的多肽，其包含SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或78所示的氨基酸序列。

在另外的实施方案中，如本文公开的分离的多核苷酸可以编码多肽，所述多肽包含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、NADH、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)或NADPH的结合基序中的至少一个。其他实施方案可以包括分离的ADH多肽或者其片段、变体或衍生物，其中所述多肽包含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、NADH、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)或NADPH结合基序中的至少一个。在某些实施方案中，NAD+、NADH、NADP+或NADPH结合基序选自Y-X-G-G-X-Y(SEQ IDNO：67)、Y-X-X-G-G-X-Y(SEQ ID NO：68)、Y-X-X-X-G-G-X-Y(SEQ IDNO：69)、Y-X-G-X-X-Y(SEQ ID NO：70)、Y-X-X-G-G-X-X-Y(SEQ IDNO：71)、Y-X-X-X-G-X-X-Y(SEQ ID NO：72)、Y-X-G-X-Y(SEQ IDNO：73)、Y-X-X-G-X-Y(SEQ ID NO：74)、Y-X-X-X-G-X-Y(SEQ ID NO：75)和Y-X-X-X-X-G-X-Y(SEQ ID NO：76)；其中Y独立地选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸，其中G是甘氨酸，并且其中X独立地选自基因编码的氨基酸。

某些实施方案涉及将多糖转化为乙醇的方法，所述方法包含将多糖与重组微生物接触，其中所述重组微生物能够在作为唯一碳源的多糖上生长。在某些实施方案中，所述重组微生物包含至少一种编码至少一种丙酮酸脱羧酶的多核苷酸和至少一种编码醇脱氢酶的多核苷酸。在某些实施方案中，所述多糖是藻酸盐。在某些实施方案中，所述重组微生物包含一个或多个含有灿烂弧菌(Vibro splendidus)Vl2B01_24189和Vl2B01_24249之间的基因组区的多核苷酸。在某些实施方案中，至少一种丙酮酸脱羧酶来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。在某些实施方案中，至少一种醇脱氢酶来自运动发酵单胞菌。在某些实施方案中，重组微生物是大肠杆菌。

附图简要描述

图1显示按照实施例2实施的分离的醇脱氢酶(ADH)酶利用DEHU作为底物的NADPH消耗。

图2显示按照实施例2实施的分离的ADH酶利用D-甘露糖醛酸作为底物的NADPH消耗。

图3显示ADH1的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和氨基酸序列(SEQ IDNO：2)

图4显示ADH2的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)和氨基酸序列(SEQ IDNO：4)

图5显示ADH3的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)和氨基酸序列(SEQ IDNO：6)

图6显示ADH4的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)和氨基酸序列(SEQ IDNO：8)

图7显示ADH5的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)和氨基酸序列(SEQ IDNO：10)

图8显示ADH6的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)和氨基酸序列(SEQ IDNO：12)

图9显示ADH7的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)和氨基酸序列(SEQ IDNO：14)

图10显示ADH8的核苷酸序列(SEQ ID NO：15)和氨基酸序列(SEQID NO：16)

图11显示ADH9的核苷酸序列(SEQ ID NO：17)和氨基酸序列(SEQID NO：18)

图12显示ADH10的核苷酸序列(SEQ ID NO：19)和氨基酸序列(SEQID NO：20)

图13显示ADH11的核苷酸序列(SEQ ID NO：21)和氨基酸序列(SEQID NO：22)

图14显示ADH12的核苷酸序列(SEQ ID NO：23)和氨基酸序列(SEQID NO：24)。

图15显示ADH13的核苷酸序列(SEQ ID NO：25)和氨基酸序列(SEQID NO：26)

图16显示ADH14的核苷酸序列(SEQ ID NO：27)和氨基酸序列(SEQID NO：28)

图17显示ADH15的核苷酸序列(SEQ ID NO：29)和氨基酸序列(SEQID NO：30)

图18显示ADH16的核苷酸序列(SEQ ID NO：31)和氨基酸序列(SEQID NO：32)

图19显示ADH17的核苷酸序列(SEQ ID NO：33)和氨基酸序列(SEQID NO：34)

图20显示ADH18的核苷酸序列(SEQ ID NO：35)和氨基酸序列(SEQID NO：36)

图21显示ADH19的核苷酸序列(SEQ ID NO：37)和氨基酸序列(SEQID NO：38)

图22显示如实施例3所描述的改造的或重组的大肠杆菌在作为唯一碳源的藻酸盐上生长的结果(见实线圆圈)，。根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)细胞提供阳性对照(见阴影线圆圈)。紧靠根瘤土壤杆菌阳性对照左边的孔含有DH10B大肠杆菌细胞，DH10B大肠杆菌细胞提供阴性对照。

图23显示如实施例4所描述的由在作为唯一碳源的藻酸盐上生长的大肠杆菌产生的乙醇。大肠杆菌用pBBRPdc-AdhA/B或pBBRPdc-AdhA/B+1.5FOS转化，并且允许在含有藻酸盐的m9培养基中生长。

图24显示ADH11和ADH20的DEHU氢化酶活性。ADH20是从灿烂弧菌12B01中分离的推定的羟基丙二酸半醛还原酶(TSAR)基因(参见SEQ ID NO：78氨基酸序列)，并且ADH20展示出显著的DEHU氢化作用活性，特别是与NADH。

详细描述

定义

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与在本发明所属领域具有普通技术的人员所通常理解的具有相同意义。尽管任何与本文所述相近或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但是描述的是优选的方法和材料。为了本发明的目的，以下术语定义如下。

本文使用的冠词“一个(a)”和“一个(an)”是指一个或多于一个(即至少一个)该冠词的语法对象。例如，“一个元件(an element)”表示一个元件或多于一个元件。

“约(about)”表示与参照数量(quantity)、水平、值、数目(number)、频率、百分比、尺度、尺寸、量(amount)、重量或长度相比改变了30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺度、尺寸、量、重量或长度。

“生物质(biomass)”的实例包括水生或海生的生物质、基于水果的生物质如水果废料和基于蔬菜的生物质如蔬菜废料等。水生或海生的生物质的实例包括但不限于海藻、巨藻、淡水海草、水藻和海生的显微植物群、微藻、海草等。在某些方面，生物质不包括碳的化石化来源，例如通常发现于地壳顶层内的碳氢化合物(例如天然气、几乎纯碳组成的非挥发性材料、如无烟煤等)。

“水生生物质(aquatic biomass)”或“海生生物质(marine biomass)”的实例包括但不限于海藻、巨藻、马尾藻类海草、淡水海草、水藻、海生显微植物群、微藻和海草等。

水果和/或蔬菜生物质的实例包括但不限于任何果胶来源，例如植物外皮和渣，包括柑橘、橙、葡萄柚、西红柿、马铃薯、葡萄、芒果、醋栗、胡萝卜、糖用甜菜和苹果以及其他。

生物质的多糖、寡糖、单糖或其他糖类成分的实例包括但不限于藻酸盐、琼脂、角叉胶、岩藻依聚糖、果胶、葡萄糖酸、甘露糖醛酸、甘露醇、来苏糖、纤维素、半纤维素、甘油、木糖醇、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、木聚糖、甘露聚糖、阿拉伯胶素、阿拉伯糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸(包括二半乳糖醛酸和三半乳糖醛酸)、鼠李糖等。

藻酸盐衍生的多糖的一些实例包括饱和多糖，例如β-D-甘露糖醛酸、α-L-葡萄糖醛酸、二藻酸盐(dialginate)、三藻酸盐(trialginate)、五藻酸盐(pentalginate)、六藻酸盐(hexalginate)、七藻酸盐(heptalginate)、八藻酸盐(octalginate)、九藻酸盐(nonalginate)、十藻酸盐(decalginate)、十一藻酸盐(undecalginate)、十二藻酸盐(dodecalginate)和多聚藻酸盐，以及不饱和多糖例如4-脱氧-L-赤-5-己酮糖糖醛酸、4-(4-脱氧-β-D-mann-4-enuronosyl)-D-甘露糖醛酸或L-古罗糖醛酸、4-(4-脱氧-β-D-mann-4-enuronosyl)-二藻酸盐、4-(4-脱氧-β-D-mann-4-enuronosyl)-三藻酸盐、4-(4-脱氧-β-D-mann-4-enuronosyl)-四藻酸盐、4-(4-脱氧-β-D-mann-4-enuronosyl)-五藻酸盐、4-(4-脱氧-β-D-mann-4-enuronosyl)-六藻酸盐、4-(4-脱氧-β-D-mann-4-enuronosyl)-七藻酸盐、4-(4-脱氧-β-D-mann-4-enuronosyl)-八藻酸盐、4-(4-脱氧-β-D-mann-4-enuronosyl)-九藻酸盐、4-(4-脱氧-β-D-mann-4-enuronosyl)-十一藻酸盐和4-(4-脱氧-β-D-mann-4-enuronosyl)-十二藻酸盐。

果胶衍生的多糖的一些实例包括饱和多糖，例如半乳糖醛酸、二半乳糖醛酸、三半乳糖醛酸、四半乳糖醛酸、五半乳糖醛酸、六半乳糖醛酸、七半乳糖醛酸、八半乳糖醛酸、九半乳糖醛酸、十半乳糖醛酸、十二半乳糖醛酸、多聚半乳糖醛酸和鼠李半乳糖醛酸，以及饱和多糖，例如4-脱氧-L-苏式-5-己酮糖糖醛酸、4-(4-脱氧-α-D-gluc-4-enuronosyl)-D-半乳糖醛酸、4-(4-脱氧-α-D-gluc-4-enuronosyl)-D-二半乳糖醛酸、4-(4-脱氧-α-D-gluc-4-enuronosyl)-D-三半乳糖醛酸、4-(4-脱氧-α-D-gluc-4-enuronosyl)-D-四半乳糖醛酸、4-(4-脱氧-α-D-gluc-4-enuronosyl)-D-五半乳糖醛酸、4-(4-脱氧-α-D-gluc-4-enuronosyl)-D-六半乳糖醛酸、4-(4-脱氧-α-D-gluc-4-enuronosyl)-D-七半乳糖醛酸、4-(4-脱氧-α-D-gluc-4-enuronosyl)-D-八半乳糖醛酸、4-(4-脱氧-α-D-gluc-4-enuronosyl)-D-九半乳糖醛酸、4-(4-脱氧-α-D-gluc-4-enuronosyl)-D-十半乳糖醛酸和4-(4-脱氧-α-D-gluc-4-enuronosyl)-D-十二半乳糖醛酸。

这些多糖或寡糖成分可以通过本文所述的微生物转化为“适合的单糖”或其他“适合的糖类”，例如“适合的寡糖”，所述微生物能够在作为碳源(例如唯一的碳源)的这些多糖或其他糖类组分上生长。

“单糖”、“适合的单糖”或“适合的糖类”通常指由在作为碳源或唯一碳源的果胶、藻酸盐或其他糖类(例如半乳糖醛酸、纤维素、半纤维素等)上生长的重组微生物产生的任何糖类，还通常指可以用来在本发明的生物燃料生物合成途径中产生碳氢化合物的任何糖类，所述碳氢化合物例如生物燃料或生物汽油。适合的单糖或寡糖的实例包括但不限于2-酮基-3-脱氧D-葡萄糖酸(KDG)、D-甘露醇、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、甘露醇、来苏糖、甘油、木糖醇、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸和鼠李糖等。如本文所提示，本文使用的“适合的单糖”或“适合的糖类”可以由本发明的改造的或重组的微生物产生，或者从商业上可利用的来源中获得。

本文使用的叙述“大量生产型化学品(commodity chemical)”包括可以直接产生或作为本文提供的方法的副产品产生的任何可供出售的或可销售的化学品，包括生物燃料和/或生物汽油。“大量生产型化学品”的一般实例包括但不限于，生物燃料、矿产品、聚合物前体、脂肪醇、表面活性剂、增塑剂和溶剂。本文使用的叙述“生物燃料(biofuels)”包括至少部分来自例如重组微生物的生物来源的固体、液体或气体燃料。

大量生产型化学品的实例包括但不限于甲烷、甲醇、乙烷、乙烯、乙醇、正丙烷、1-丙烯、1-丙醇、丙醛、丙酮、丙酸酯、正丁烷、1-丁烯、1-丁醇、正丁醛、丁酸乙酯、异丁醛、异丁醇、2-甲基正丁醛、2-甲基丁醇、3-甲基正丁醛、3-甲基丁醇、2-丁烯、2-丁醇、2-丁酮、2，3-丁二醇、3-羟基-2-丁酮、2，3-丁二酮、乙苯、乙烯苯、2-苯基乙醇、苯基乙醛、1-苯基丁烷、4-苯基-1-丁烯、4-苯基-2-丁烯、1-苯基-2-丁烯、1-苯基-2-丁醇、4-苯基-2-丁醇、1-苯基-2-丁酮、4-苯基-2-丁酮、1-苯基-2，3-丁二醇、1-苯基-3-羟基-2-丁酮、4-苯基-3-羟基-2-丁酮、1-苯基-2，3-丁二酮、正戊烷、乙基苯酚、乙烯基苯酚、2-(4-羟苯基)乙醇、4-羟苯基乙醛、1-(4-羟苯基)丁烷、4-(4-羟苯基)-1-丁烯、4-(4-羟苯基)-2-丁烯、1-(4-羟苯基)-1-丁烯、1-(4-羟苯基)-2-丁醇、4-(4-羟苯基)-2-丁醇、1-(4-羟苯基)-2-丁酮、4-(4-羟苯基)-2-丁酮、1-(4-羟苯基)-2，3-丁二醇、1-(4-羟苯基)-3-羟基-2-丁酮、4-(4-羟苯基)-3-羟基-2-丁酮、1-(4-羟苯基)-2，3-丁酮二酮、吲哚基乙烷、吲哚基乙烯、2-(吲哚-3-)乙醇、n-戊烷，1-戊烯、1-戊醇、戊醛、戊酸、2-戊烯、2-戊醇、3-戊醇、2-戊酮、3-戊酮、4-甲基戊醛、4-甲基戊醇、2，3-戊二醇、2-羟基-3-戊酮、3-羟基-2-戊酮、2，3-戊二酮、2-甲基戊烷、4-甲基-1-戊烯、4-甲基-2-戊烯、4-甲基-3-戊烯、4-甲基-2-戊醇、2-甲基-3-戊醇、4-甲基-2-戊酮、2-甲基-3-戊酮、4-甲基-2，3-戊二醇、4-甲基-2-羟基-3-戊酮、4-甲基-3-羟基-2-戊酮、4-甲基-2，3-戊二酮、1-苯基戊烷、1-苯基-1-戊烯、1-苯基-2-戊烯、1-苯基-3-戊烯、1-苯基-2-戊醇、1-苯基-3-戊醇、1-苯基-2-戊酮、1-苯基-3-戊酮、1-苯基-2，3-戊二醇、1-苯基-2-羟基-3-戊酮、1-苯基-3-羟基-2-戊酮、1-苯基-2，3-戊二酮、4-甲基-1-苯基戊烷、4-甲基-1-苯基-1-戊烯、4-甲基-1-苯基-2-戊烯、4-甲基-1-苯基-3-戊烯、4-甲基-1-苯基-3-戊醇、4-甲基-1-苯基-2-戊醇、4-甲基-1-苯基-3-戊酮、4-甲基-1-苯基-2-戊酮、4-甲基-1-苯基-2，3-戊二醇、4-甲基-1-苯基-2，3-戊二酮、4-甲基-1-苯基-3-羟基-2-戊酮、4-甲基-1-苯基-2-羟基-3-戊酮、1-(4-羟苯基)戊烷、1-(4-羟苯基)-1-戊烯、1-(4-羟苯基)-2-戊烯、1-(4-羟苯基)-3-戊烯、1-(4-羟苯基)-2-戊醇、1-(4-羟苯基)-3-戊醇、1-(4-羟苯基)-2-戊酮、1-(4-羟苯基)-3-戊酮、1-(4-羟苯基)-2，3-戊二醇、1-(4-羟苯基)-2-羟基-3-戊酮、1-(4-羟苯基)-3-羟基-2-戊酮、1-(4-羟苯基)-2，3-戊二酮、4-甲基-1-(4-羟苯基)戊烷、4-甲基-1-(4-羟苯基)-2-戊烯、4-甲基-1-(4-羟苯基)-3-戊烯、4-甲基-1-(4-羟苯基)-1-戊烯、4-甲基-1-(4-羟苯基)-3-戊醇、4-甲基-1-(4-羟苯基)-2-戊醇、4-甲基-1-(4-羟苯基)-3-戊酮、4-甲基-1-(4-羟苯基)-2-戊酮、4-甲基-1-(4-羟苯基)-2，3-戊二醇、4-甲基-1-(4-羟苯基)-2，3-戊二酮、4-甲基-1-(4-羟苯基)-3-羟基-2-戊酮、4-甲基-1-(4-羟苯基)-2-羟基-3-戊酮、1-吲哚-3-戊烷、1-(吲哚-3)-1-戊烯、1-(吲哚-3)-2-戊烯、1-(吲哚-3)-3-戊烯、1-(吲哚-3)-2-戊醇、1-(吲哚-3)-3-戊醇、1-(吲哚-3)-2-戊酮、1-(吲哚-3)-3-戊酮、1-(吲哚-3)-2，3-戊二醇、1-(吲哚-3)-2-羟基-3-戊酮、1-(吲哚-3)-3-羟基-2-戊酮、1-(吲哚-3)-2，3-戊二酮、4-甲基-1-(吲哚-3-)戊烷、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-戊烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-戊烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-1-戊烯、4-甲基-2-(吲哚-3)-3-戊醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-戊醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-戊酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-戊酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2，3-戊二醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-2，3-戊二酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-羟基-2-戊酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-羟基-3-戊酮、正己烷、1-己烯、1-己醇、己醛、己酸、2-己烯、3-己烯、2-己醇、3-己醇、2-己酮、3-己酮、2，3-己二醇、2，3-己二酮、3，4-己二醇、3，4-己二酮、2-羟基-3-己酮、3-羟基-2-己酮、3-羟基-4-己酮、4-羟基-3-己酮、2-甲基己烷、3-甲基己烷、2-甲基-2-己烯、2-甲基-3-己烯、5-甲基-1-己烯、5-甲基-2-己烯、4-甲基-1-己烯、4-甲基-2-己烯、3-甲基-3-己烯、3-甲基-2-己烯、3-甲基-1-己烯、2-甲基-3-己醇、5-甲基-2-己醇、5-甲基-3-己醇、2-甲基-3-己酮、5-甲基-2-己酮、5-甲基-3-己酮、2-甲基-3，4-己二醇、2-甲基-3，4-己二酮、5-甲基-2，3-己二醇、5-甲基-2，3-己二酮、4-甲基-2，3-己二醇、4-甲基-2，3-己二酮、2-甲基-3-羟基-4-己酮、2-甲基-4-羟基-3-己酮、5-甲基-2-羟基-3-己酮、5-甲基-3-羟基-2-己酮、4-甲基-2-羟基-3-己酮、4-甲基-3-羟基-2-己酮、2，5-二甲基己烷、2，5-二甲基-2-己烯、2，5-二甲基-3-己烯、2，5-二甲基-3-己醇、2，5-二甲基-3-己酮、2，5-二甲基-3，4-己二醇、2，5-二甲基-3，4-己二酮、2，5-二甲基-3-羟基-4-己酮、5-甲基-1-苯基己烷、4-甲基-1-苯基己烷、5-甲基-1-苯基-1-己烯、5-甲基-1-苯基-2-己烯、5-甲基-1-苯基-3-己烯、4-甲基-1-苯基-1-己烯、4-甲基-1-苯基-2-己烯、4-甲基-1-苯基-3-己烯、5-甲基-1-苯基-2-己醇、5-甲基-1-苯基-3-己醇、4-甲基-1-苯基-2-己醇、4-甲基-1-苯基-3-己醇、5-甲基-1-苯基-2-己酮、5-甲基-1-苯基-3-己酮、4-甲基-1-苯基-2-己酮、4-甲基-1-苯基-3-己酮、5-甲基-1-苯基-2，3-己二醇、4-甲基-1-苯基-2，3-己二醇、5-甲基-1-苯基-3-羟基-2-己酮、5-甲基-1-苯基-2-羟基-3-己酮、4-甲基-1-苯基-3-羟基-2-己酮、4-甲基-1-苯基-2-羟基-3-己酮、5-甲基-1-苯基-2，3-己二酮、4-甲基-1-苯基-2，3-己二酮、4-甲基-1-(4-羟苯基)己烷、5-甲基-1-(4-羟苯基)-1-己烯、5-甲基-1-(4-羟苯基)-2-己烯、5-甲基-1-(4-羟苯基)-3-己烯、4-甲基-1-(4-羟苯基)-1-己烯、4-甲基-1-(4-羟苯基)-2-己烯、4-甲基-1-(4-羟苯基)-3-己烯、5-甲基-1-(4-羟苯基)-2-己醇、5-甲基-1-(4-羟苯基)-3-己醇、4-甲基-1-(4-羟苯基)-2-己醇、4-甲基-1-(4-羟苯基)-3-己醇、5-甲基-1-(4-羟苯基)-2-己酮、5-甲基-1-(4-羟苯基)-3-己酮、4-甲基-1-(4-羟苯基)-2-己酮、4-甲基-1-(4-羟苯基)-3-己酮、5-甲基-1-(4-羟苯基)-2，3-己二醇、4-甲基-1-(4-羟苯基)-2，3-己二醇、5-甲基-1-(4-羟苯基)-3-羟基-2-己酮、5-甲基-1-(4-羟苯基)-2-羟基-3-己酮、4-甲基-1-(4-羟苯基)-3-羟基-2-己酮、4-甲基-1-(4-羟苯基)-2-羟基-3-己酮、5-甲基-1-(4-羟苯基)-2，3-己二酮、4-甲基-1-(4-羟苯基)-2，3-己二酮、4-甲基-1-(吲哚-3-)己烷、5-甲基-1-(吲哚-3)-1-己烯、5-甲基-1-(吲哚-3)-2-己烯、5-甲基-1-(吲哚-3)-3-己烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-1-己烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-己烯、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-己烯、5-甲基-1-(吲哚-3)-2-己醇、5-甲基-1-(吲哚-3)-3-己醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-己醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-己醇、5-甲基-1-(吲哚-3)-2-己酮、5-甲基-1-(吲哚-3)-3-己酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-己酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-己酮、5-甲基-1-(吲哚-3)-2，3-己二醇、4-甲基-1-(吲哚-3)-2，3-己二醇、5-甲基-1-(吲哚-3)-3-羟基-2-己酮、5-甲基-1-(吲哚-3)-2-羟基-3-己酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-3-羟基-2-己酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2-羟基-3-己酮、5-甲基-1-(吲哚-3)-2，3-己二酮、4-甲基-1-(吲哚-3)-2，3-己二酮、正庚烷、1-庚烯、1-庚醇、庚醛、庚酸、2-庚烯、3-庚烯、2-庚醇、3-庚醇、4-庚醇、2-庚酮、3-庚酮、4-庚酮、2，3-庚二醇、2，3-庚二酮、3，4-庚二醇、3，4-庚二酮、2-羟基-3-庚酮、3-羟基-2-庚酮、3-羟基-4-庚酮、4-羟基-3-庚酮、2-甲基庚烷、3-甲基庚烷、6-甲基-2-庚烯、6-甲基-3-庚烯、2-甲基-3-庚烯、2-甲基-2-庚烯、5-甲基-2-庚烯、5-甲基-3-庚烯、3-甲基-3-庚烯、2-甲基-3-庚醇、2-甲基-4-庚醇、6-甲基-3-庚醇、5-甲基-3-庚醇、3-甲基-4-庚醇、2-甲基-3-庚酮、2-甲基-4-庚酮、6-甲基-3-庚酮、5-甲基-3-庚酮、3-甲基-4-庚酮、2-甲基-3，4-庚二醇、2-甲基-3，4-庚二酮、6-甲基-3，4-庚二醇、6-甲基-3，4-庚二酮、5-甲基-3，4-庚二醇、5-甲基-3，4-庚二酮、2-甲基-3-羟基-4-庚酮、2-甲基-4-羟基-3-庚酮、6-甲基-3-羟基-4-庚酮、6-甲基-4-羟基-3-庚酮、5-甲基-3-羟基-4-庚酮、5-甲基-4-羟基-3-庚酮、2，6-二甲基庚烷、2，5-二甲基庚烷、2，6-二甲基-2-庚烯、2，6-二甲基-3-庚烯、2，5-二甲基-2-庚烯、2，5-二甲基-3-庚烯、3，6-二甲基-3-庚烯、2，6-二甲基-3-庚醇、2，6-二甲基-4-庚醇、2，5-二甲基-3-庚醇、2，5-二甲基-4-庚醇、2，6-二甲基-3，4-庚二醇、2，6-二甲基-3，4-庚二酮、2，5-二甲基-3，4-庚二醇、2，5-二甲基-3，4-庚二酮、2，6-二甲基-3-羟基-4-庚酮、2，6-二甲基-4-羟基-3-庚酮、2，5-二甲基-3-羟基-4-庚酮、2，5-二甲基-4-羟基-3-庚酮、正辛烷、1-辛烯、2-辛烯、1-辛醇、辛醛、辛酸、3-辛烯、4-辛烯、4-辛醇、4-辛酮、4，5-辛二醇、4，5-辛二酮、4-羟基-5-辛酮、2-甲基辛烷、2-甲基-3-辛烯、2-甲基-4-辛烯、7-甲基-3-辛烯、3-甲基-3-辛烯、3-甲基-4-辛烯、6-甲基-3-辛烯、2-甲基-4-辛醇、7-甲基-4-辛醇、3-甲基-4-辛醇、6-甲基-4-辛醇、2-甲基-4-辛酮、7-甲基-4-辛酮、3-甲基-4-辛酮、6-甲基-4-辛酮、2-甲基-4，5-辛二醇、2-甲基-4，5-辛二酮、3-甲基-4，5-辛二醇、3-甲基-4，5-辛二酮、2-甲基-4-羟基-5-辛酮、2-甲基-5-羟基-4-辛酮、3-甲基-4-羟基-5-辛酮、3-甲基-5-羟基-4-辛酮、2，7-二甲基辛烷、2，7-二甲基-3-辛烯、2，7-二甲基-4-辛烯、2，7-二甲基-4-辛醇、2，7-二甲基-4-辛酮、2，7-二甲基-4，5-辛二醇、2、7-二甲基-4，5-辛二酮、2，7-二甲基-4-羟基-5-辛酮、2，6-二甲基辛烷、2，6-二甲基-3-辛烯、2，6-二甲基-4-辛烯、3，7-二甲基-3-辛烯、2，6-二甲基-4-辛醇、3，7-二甲基-4-辛醇、2，6-二甲基-4-辛酮、3，7-二甲基-4-辛酮、2，6-二甲基-4，5-辛二醇、2，6-二甲基-4，5-辛二酮、2，6-二甲基-4-羟基-5-辛酮、2，6-二甲基-5-羟基-4-辛酮、3，6-二甲基辛烷、3，6-二甲基-3-辛烯、3，6-二甲基-4-辛烯、3，6-二甲基-4-辛醇、3，6-二甲基-4-辛酮、3，6-二甲基-4，5-辛二醇、3，6-二甲基-4，5-辛二酮、3，6-二甲基-4-羟基-5-辛酮、正壬烷、1-壬烯、1-壬醇、壬醛、壬酸、2-甲基壬烷、2-甲基-4-壬烯、2-甲基-5-壬烯、8-甲基-4-壬烯、2-甲基-5-壬醇、8-甲基-4-壬醇、2-甲基-5-壬酮、8-甲基-4-壬酮、8-甲基-4，5-壬二醇、8-甲基-4，5-壬二酮、8-甲基-4-羟基-5-壬酮、8-甲基-5-羟基-4-壬酮、2，8-二甲基壬烷、2，8-二甲基-3-壬烯、2，8-二甲基-4-壬烯、2，8-二甲基-5-壬烯、2，8-二甲基-4-壬醇、2，8-二甲基-5-壬醇、2，8-二甲基-4-壬酮、2，8-二甲基-5-壬酮、2，8-二甲基-4，5-壬二醇、2，8-二甲基-4，5-壬二酮、2，8-二甲基-4-羟基-5-壬酮、2，8-二甲基-5-羟基-4-壬酮、2，7-二甲基壬烷、3，8-二甲基-3-壬烯、3，8-二甲基-4-壬烯、3，8-二甲基-5-壬烯、3，8-二甲基-4-壬醇、3，8-二甲基-5-壬醇、3，8-二甲基-4-壬酮、3，8-二甲基-5-壬酮、3，8-二甲基-4，5-壬二醇、3，8-二甲基-4，5-壬二酮、3，8-二甲基-4-羟基-5-壬酮、3，8-二甲基-5-羟基-4-壬酮、n-癸烷、1-癸烯、1-癸醇、癸酸、2，9-二甲基癸烷、2，9-二甲基-3-癸烯、2，9-二甲基-4-癸烯、2，9-二甲基-5-癸醇、2，9-二甲基-5-癸酮、2，9-二甲基-5，6-癸二醇、2，9-二甲基-6-羟基-5-癸酮、2，9-二甲基-5，6-癸二酮-十一烷、1-十一烯、1-十一醇、十一醛，十一酸、正十二烷、1-十二烯、1-十二醇、十二醛、十二酸、正十二烷、1-十癸烯(decadecene)、1-十二醇、十二醛、十二酸、正十三烷、1-十三烯、1-十三醇、十三醛、十三酸、正十四烷、1-十四烯、1-十四醇、十四醛、十四酸、正十五烷、1-十五烯、1-十五醇、十五醛、十五酸、正十六烷、1-十六烯、1-十六醇、十六醛、十六酸、正十七烷、1-十七烯、1-十七醇、十七醛、十七酸、正十八烷、1-十八烯、1-十八醇、十八醛、十八酸、正十九烷、1-十九烯、1-十九醇、十九醛、十九酸、二十烷、1-二十烯、1-二十醇、二十醛、二十酸、3-羟基丙醛、1、3-丙二醇、4-羟基正丁醛、1、4-丁二醇、3-羟基-2-丁酮、2、3-丁二醇、1，5-戊二醇、高柠檬酸、高异柠檬酸、b-羟基己二酸、戊二酸、戊二半醛，戊二醛、2-羟基-1-环戊酮、1，2-环戊二醇、环戊酮、环戊醇、(S)-2-乙酰乳酸、(R)-2，3-二羟基-异戊酸、2-氧代异戊酸、异丁酰-Co4、异丁酸酯、异丁醛、5-氨基戊醛、1，10-二氨基癸烷、1，10-二氨基-5-癸烯、1，10-二氨基-5-羟基癸烷、1，10-二氨基-5-癸酮、1，10-二氨基-5，6-癸二醇、1，10-二氨基-6-羟基-5-癸酮、苯乙醛、1，4-二苯基丁烷、1，4-二苯基-1-丁烯、1，4-二苯基-2-丁烯、1，4-二苯基-2-丁醇、1，4-二苯基-2-丁酮、1，4-二苯基-2，3-丁二醇、1，4-二苯基-3-羟基-2-丁酮、1-(4-羟苯基)-4-苯基丁烷、1-(4-羟苯基)-4-苯基-1-丁烯、1-(4-羟苯基)-4-苯基-2-丁烯、1-(4-羟苯基)-4-苯基-2-丁醇、1-(4-羟苯基)-4-苯基-2-丁酮、1-(4-羟苯基)-4-苯基-2，3-丁二醇、1-(4-羟苯基)-4-苯基-3-羟基-2-丁酮、1-(吲哚-3)-4-苯基丁烷、1-(吲哚-3)-4-苯基-1-丁烯、1-(吲哚-3)-4-苯基-2-丁烯、1-(吲哚-3)-4-苯基-2-丁醇、1-(吲哚-3)-4-苯基-2-丁酮、1-(吲哚-3)-4-苯基-2，3-丁二醇、1-(吲哚-3)-4-苯基-3-羟基-2-丁酮、4-羟基苯乙醛、1，4-二(4-羟苯基)丁烷、1，4-二(4-羟苯基)-1-丁烯、1，4-二(4-羟苯基)-2-丁烯、1，4-二(4-羟苯基)-2-丁醇、1，4-二(4-羟苯基)-2-丁酮、1，4-二(4-羟苯基)-2，3-丁二醇、1，4-二(4-羟苯基)-3-羟基-2-丁酮、1-(4-羟苯基)-4-(吲哚-3-)丁烷、1-(4-羟苯基)-4-(吲哚-3)-1-丁烯、1-二(4-羟苯基)-4-(吲哚-3)-2-丁烯、1-(4-羟苯基)-4-(吲哚-3)-2-丁醇、1-(4-羟苯基)-4-(吲哚-3)-2-丁酮、1-(4-羟苯基)-4-(吲哚-3)-2，3-丁二醇、1-(4-羟苯基-4-(吲哚-3)-3-羟基-2-丁酮、吲哚-3-乙醛、1，4-二(吲哚-3-)丁烷、1，4-二(吲哚-3)-1-丁烯、1，4-二(吲哚-3)-2-丁烯、1，4-二(吲哚-3)-2-丁醇、1，4-二(吲哚-3)-2-丁酮、1，4-二(吲哚-3)-2，3-丁二醇、1，4-二(吲哚-3)-3-羟基-2-丁酮、琥珀酸半醛、己烷-1，8-二羧基酸、3-己烯-1，8-二羧基酸、3-羟基-己烷-1，8-二羧基酸、3-己酮-1，8-二羧基酸、3，4-己二醇-1，8-二羧基酸、4-羟基-3-己酮-1，8-二羧基酸、岩藻依聚糖、碘、叶绿素、类胡萝卜素、钙、镁、铁、钠、钾、磷酸盐等。

术语“生物活性片段(biologically active fragment)”，适用于参照或全长多核苷酸或多肽序列的片段，是指具有参照序列活性的至少约0.1、0.5、1、2、5、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99％的片段。本发明范围内包括长度至少约18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200或更多核苷酸或残基的生物活性片段，其包含或编码参照多核苷酸或多肽的活性。示例性的生物活性片段通常参与相互作用，例如分子内或分子间相互作用。分子间相互作用可以是特异结合相互作用或酶促相互作用。分子间相互作用可以是在ADH多肽和辅因子分子之间，所述辅因子分子例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、NADH、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)或NADPH分子。ADH多肽的生物活性部分包括包含与任何以下氨基酸序列具有足够相似性或同一性或者衍生自任何以下氨基酸序列的的氨基酸序列的肽：SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或78。

“编码序列(coding sequence)”是指对基因的多肽产物编码的起作用的任何核酸序列。相反地，术语“非编码序列(non-coding sequence)”是指对基因的多肽产物编码不起作用的任何核酸序列。

在本说明书始终，除非上下文另有规定，词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应理解为意指包括所述的步骤或要素或者步骤或要素组，而不排除任何其他的步骤或要素或者步骤或要素组。“由…组成(consisting of)”是指包括且限于跟在该短语“由…组成”之后的内容。因此，短语“由…组成”表明所列出的要素是必需的的或强制性，并且不存在其他要素。“基本上由…组成(consisting essentially of)”指包括该短语后面列出的任何要素，并且限于不干扰或促进所列出的要素在本公开内容中给定的活性或作用的其他要素。因此，该短语“基本上由…组成”表明所列出的要素是必需的或强制性的，但其他要素不是任选的，其是否可以存在取决于它们是否影响所列出的要素的活性或作用。

术语“互补的(complementary)”和“互补性(complementarity)”是指与碱基配对原则相关的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”是互补的。互补性可以是“部分的(partial)”，其中只有一些核酸碱基按照碱基配对原则被匹配。或者，可以有核酸之间“完全的”或“全部的”互补性。核酸链之间互补性的程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。

“对应于(corresponds to)”或“对应于(corresponding to)”是指(a)多核苷酸具有与参照多核苷酸序列的全部或部分基本上同一的或互补的核苷酸序列，或者编码与肽或蛋白质中的氨基酸序列同一的氨基酸序列；或者(b)肽或多肽具有与参照肽或蛋白质中的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列。

“衍生物”是指通过修饰从基础序列衍生而来的多肽，所述修饰例如通过与其他化学部分共轭或配位或者通过翻译后修饰，这些在本领域是可以理解的。术语“衍生物”在其范围内还包括对母序列(parentsequence)进行的改动，其包括用于提供功能等同分子的添加或缺失。

如本文所用的，术语“功能”和“功能的”等是指生物的、酶的或治疗的功能。

术语“外源的”通常指不是天然存在于野生型细胞或生物体中，而是通常通过分子生物学技术即工程改造技术导入到细胞中来产生重组微生物的多核苷酸序列或多肽。“外源”多核苷酸的实例包括编码期望的蛋白或酶的载体、质粒和/或人造核酸构建体。术语“内源的”通常指可以见于给定的野生型细胞或生物体内的天然存在的多核苷酸序列或多肽。例如某些天然存在的细菌或酵母种类通常不含有苯甲醛裂解酶基因，因此，不包含编码苯甲醛裂解酶的“内源的”多核苷酸序列。关于这点，还应该注意到尽管生物体包含给定的多核苷酸序列或基因的内源的拷贝，但是导入编码所述序列的质粒或载体，例如用于过表达所述编码蛋白或者调节所述编码蛋白的表达，表示所述基因或多核苷酸序列的“外源”拷贝。任何本文所述的途径、基因或酶可以利用或依赖于“内源”序列，或者可以作为一个或多个“外源”多核苷酸序列提供，和/或按照已经包含在给定的微生物中的内源的序列来使用。

“重组”微生物包含一个或多个外源的核苷酸序列，例如在质粒或载体中的外源核苷酸序列。

“微生物系统”通常指重组微生物的群体，例如包含在培养箱或其他类型的微生物培养瓶/装置/孔中的群体，或者例如发现在皿或板上生长的(例如含有琼脂糖的培养皿)群体。

“基因”是指在染色体占据特定基因座的遗传单位，其由转录和/或翻译调节序列和/或编码区和/或非翻译序列(即内含子、5’和3’非翻译序列)组成。

“同源性(Homology)”是指同一的或组成型保守取代的核苷酸或氨基酸的百分数。同源性可以使用序列比较程序来确定，例如GAP(Deverauxet al.，1984，Nucleic Acids Research 12，387-395)，在此通过引用将其并入。以此方式，与本文引用的序列长度相似或基本上不同的序列可以通过在比对中插入空位来进行比较，所述空位的确定例如通过GAP所用的比较算法。

术语“宿主细胞”包括可以是或已经是本发明的任何重组载体或分离的多核苷酸的接受体的个体细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然的、偶然的或蓄意的突变和/或变化，所述后代并不一定与最初的母体细胞完全相同(在形态上或在总DNA互补物方面)。宿主细胞包括用本发明的重组载体或多核苷酸体内或体外转染或感染的细胞。包含本发明重组载体的宿主细胞是重组宿主细胞。

“分离的”是指基本上或实质上没有通常在其天然状态中与之伴随的组分的物质。例如，本文使用的“分离的多核苷酸”是指从在天然存在状态时位于其侧翼的序列中纯化的多核苷酸，例如从通常与其相邻的序列中移开的DNA片段。可选地，本文使用的“分离的肽”或“分离的多肽”等是指肽或多肽分子从其天然细胞环境中和从与该细胞其他组分的结合中进行体外分离和/或纯化，即它不与体内物质结合。

如本文所用叙述，“多糖”、“适合的单糖”或“适合的寡糖”可以作为微生物中能量和碳的来源使用，并且适合用于产生例如生物燃料和生物汽油的碳氢化合物的生物燃料的生物合成途径。多糖、适合的单糖和适合的寡糖的实例包括但不限于藻酸盐、琼脂糖、岩藻依聚糖、果胶、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、甘露醇、来苏糖、甘油、木糖醇、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、鼠李糖和2-酮基-3-脱氧D-葡萄糖酸-6-磷酸(KDG)等。

“获自”是指样品，例如诸如多核苷酸提取物或多肽提取物分离自或衍生自特定来源的个体。例如，所述提取物可以获自直接从所述个体分离的的组织或生物流体。

本文使用的术语“寡核苷酸”是指多个核苷酸残基(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其相关的结构变体或合成类似物)通过磷酸二酯键(或其相关的结构变体或合成类似物)连接组成的聚合物。因此，虽然术语“寡核苷酸”通常指核苷酸聚合物，其中核苷酸残基和它们之间的连接是天然存在的，但也应该理解到，该术语在其范围内还包括各种类似物，包括但不限于肽核酸(PNAs)、氨基磷酸酯、硫代磷酸、甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核酸等。分子精确的大小根据具体应用而有所不同。寡核苷酸通常在长度上较短，通常从10到30个核苷酸残基，但是该术语可以指任何长度的分子，尽管术语“多核苷酸”或“核酸”通常用于指代大的寡核苷酸。

本文使用的术语“可操作地连接(operably linked)”表示将结构基因置于启动子的调节控制下，然后该启动子控制基因的转录和任选的翻译。在异源启动子/结构基因组合的构建中，通常优选地将基因序列或启动子放置在与基因转录起始位点有一定距离的位置，这段距离与该基因序列或启动子和其在天然环境中控制的基因之间的距离大约相同；即所述基因序列或启动子衍生自的基因。在本领域中众所周知，可以对所述这段距离进行一些变化，而不会损失功能。相似地，调节序列元件相对于将置于其控制下的异源基因的优选的放置是由该元件在其天然环境中的放置所限定；即该元件衍生自的基因。

本文使用的叙述“优化的”是指途径、基因、多肽、酶或其他分子具有改变的生物活性，例如通过多肽的氨基酸序列的遗传改变或通过所述多肽周围细胞环境的改变/修饰，以相对于最初的分子或最初的细胞环境(例如给定多肽的野生型序列或野生型微生物)改善其功能特性。本文所述的任何多肽或酶类可以任选地“优化”，并且本文所述的任何基因或核苷酸序列可以任选地编码优化的多肽或酶。本文所述的任何途径可以任选地含有一个或多个“优化的”酶或一个或多个用于编码优化的酶或多肽的核苷酸序列。

通常，多肽、酶或其他分子的改善的功能特性与所述多肽或其他分子用于在生物途径(例如生物合成途径、C-C连接途径)将单糖或寡糖转化为生物燃料的适合性有关。因此某些实施方案考虑使用“优化的”生物途径。示例性的“优化的”多肽可以在其氨基酸编码序列含有一个或多个改变或突变(例如点突变、缺失、异源序列的添加)，这促进在给定的微生物系统或微生物中的表达和/或稳定性的改善，允许相对于所需底物调节多肽活性(例如诱导型或阻遏活性)，调整多肽在细胞中的定位(例如细胞内定位、细胞外分泌)，和/或相对于所需底物影响多肽整体活性水平(例如降低或增加酶促活性)。也可以“优化”多肽或其他分子用于通过改变给定的微生物系统或微生物内的一条或多条途径来与该系统或生物体一起使用，例如通过改变调节“优化的”多肽或其他分子的表达(例如上调)、定位和/或活性的途径，或者通过改变将不需要的副产品产量降到最低的途径，以及其他改变。这样，多肽或其他分子可以改变或不改变其野生型氨基酸序列或最初的化学结构而被“优化”。按照本领域已知的技术，优化的多肽或生物途径可以通过例如针对所需要的表型进行直接诱变或自然选择来获得。

在某些方面，“优化的”基因或多肽可以包含与本文所述的参照(例如野生型)基因或多肽的核苷酸或氨基酸序列50％至99％同一的(包括中间的所有整数)核苷酸编码序列或氨基酸序列。在某些方面，“优化的”多肽或酶可以具有参照多肽的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100(包括中间的所有整数和小数点，例如1.2、1.3、1.4、1.5、5.5、5.6、5.7、60、70等)或更多倍的生物活性。

如本文使用的叙述“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。该术语通常指在长度上至少10个碱基的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核苷酸或两种类型核苷酸之一的修饰形式。该术语包括单链或双链形式的DNA。

术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指展示出与参照多核苷酸序列基本的序列同一性的多核苷酸或与参照序列在下文定义的严格条件下杂交的多核苷酸。这些术语还包括与参照多核苷酸的区别在于至少一个核苷酸的添加、缺失或取代的多核苷酸。因此，该术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或多个核苷酸被添加或缺失或用不同核苷酸取代的多核苷酸。关于这点，在本领域应很好地理解到，包括突变、添加、缺失和取代的的某些改变可以用于参照序列，由此改变的多核苷酸保留该参照序列的生物功能或活性。多核苷酸变体包括与SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35或37中任一个所示的序列具有至少50％(和至少51％至至少99％，以及中间的所有整数百分比)序列同一性的多核苷酸。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然存在的等位基因变体。

“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文可交替使用，指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，例如相应天然存在氨基酸的化学类似物，还适用于天然存在的氨基酸聚合物。

如本文使用的表述“ADH多肽”或“及其变体”包括但不限于，具有与SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或78中任一个所示的序列共享至少50％(和至少51％至99％，以及中间的所有整数百分比)序列同一性的氨基酸序列的多肽。这些表述还包括可以在细菌种类彼此之间存在或发生的ADH多肽的天然等位变体。

包括其变体在内的ADH多肽，，包括展示出至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％和130％野生型ADH多肽特异性活性的多肽(即例如具有醇脱氢酶活性，包括DEHU氢化酶活性和/或D-甘露糖醛酸氢化酶活性)。具有与野生型ADH多肽相比基本上相同或提高的生物活性的ADH多肽包括变体包括展示出至少约25％、50％、75％、100％、110％、120％或130％的野生型多肽的特异生物活性的多肽。为了本申请的目的，ADH相关生物活性可以通过例如测量ADH多肽或其变体以DEHU或D-甘露糖醛酸为底物(参见例如实施例2)消耗NADPH的能力来定量。具有与野生型ADH相比降低的生物活性的ADH多肽包括变体展示出少于约25％、10％、5％或1％的野生型ADH的特异活性。

表述多肽“变体”是指通过至少一个氨基酸残基的添加、缺失或取代与参照多肽相区别的多肽。在某些实施方案中，多肽变体是通过一个或多个保守性或非保守性取代与参照多肽相区别。在某些实施方案中，所述多肽变体包含保守性取代，并且关于这点，在本领域中应该很好地理解到，一些氨基酸可以转变为具有广泛相似性质的其他氨基酸而不改变该多肽的活性的本质。多肽变体还包括一个或多个氨基酸被添加或缺失或用不同氨基酸残基所取代的多肽。

本发明考虑全长ADH序列以及其生物活性片段在本申请的方法和微生物系统中的用途。通常，全长ADH多肽的生物活性片段可以参与相互作用，例如分子内或分子间相互作用。分子间相互作用可以是特异结合相互作用或酶促相互作用(例如所述相互作用可以是瞬时的和共价键的形成或打开)。全长ADH多肽的生物活性片段包括包含与(推定的)全长ADH氨基酸序列足够相似或衍生自(推定的)全长ADH氨基酸序列的氨基酸序列的肽。通常，生物活性片段包含具有全长ADH多肽的至少一种活性的结构域或基序，并且可以包括多种活性结构域的一个或多个(以及某些情况下所有的)，以及包括含有具有氢化酶活性片段的片段，例如醇脱氢酶活性、DEHU氢化酶活性和/或D-甘露糖醛酸氢化酶活性。全长ADH多肽的生物活性片段可以是，例如，SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或78中任一个所示的氨基酸序列的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150或更多个连续氨基酸的多肽。在某些实施方案中，生物活性片段包含如本文所述的NAD+、NADH、NADP+或NADPH结合基序。适宜地，所述生物活性片段具有不少于约1％、10％、25％和50％的其来自的全长多肽的活性。

如本文使用的表述“序列同一性”或例如包含“与…50％同一的序列”是指基于整个比较窗内的核苷酸与核苷酸或者氨基酸与氨基酸的序列的同一程度。因此，“序列同一性百分比”的计算通过如下进行：将两个最优比对的序列在整个比较窗内进行比较，确定在两个序列中出现一致的核酸碱基(例如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷)或同一的氨基酸残基(例如丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和蛋氨酸)的位置的数目，以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗中位置总数(即窗大小)，并且将结果乘以100以得到序列同一性百分比。

用来描述两个或多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参照序列(reference sequence)”、“比较窗(comparison window)”“序列同一性(sequence identity)”“序列同一性百分比(percentage of sequenceidentity)”和“基本同一性(substantial identity)”。“参照序列”在长度上为至少12个，但经常15至18个，且通常至少25个单体单位，包括核苷酸和氨基酸残基。因为两个多核苷酸可以每个包含(1)在所述两个核苷酸之间相似的序列(即只有完整多核苷酸序列的一部分)和(2)在所述两个核苷酸之间不同的序列，所以两个(或多个)多核苷酸之间的序列比较通常通过比较整个“比较窗”内的两个多核苷酸的序列来进行，从而鉴定和比较序列相似性的局部区域。“比较窗”是指至少6个连续位置，常见地约50个到约100个连续位置，更常见地约100至约150个连续位置的概念节段，其中序列与参照序列最佳比对后，所述序列与相同数目连续位置的所述参照序列比较。用于两个序列的最佳比对时，比较窗与对照序列相比(不包含添加或缺失)可以包含约20％或更少的添加或缺失(即空位)。用于比对比较窗的序列的最佳比对可以通过计算机化执行运算法则(威斯康星遗传学软件包7.0版(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0)的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机组(GeneticsComputer Group)，575 Science Drive Madison，WI，USA)或者通过目测来实施，由此通过选定的不同方法的任一种得到最优的比对(即得到整个比较内最高百分比同源性)。还可以参照例如Altschul et al.，1997，Nucl.AcidsRes.25：3389所公开的BLAST家族程序，。序列分析的详细讨论可以见Ausubel et al，″Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学指南)″，John Wiley & Sons Inc，1994-1998，第15章的19.3单元。

“载体(vector)”指多核苷酸可以插入或克隆入其中的来自于例如质粒、噬菌体、酵母或病毒的多核苷酸分子，优选地DNA分子。载体优选地含有一个或多个独特的限制位点，并且能在规定的宿主细胞中自主复制，所述宿主细胞包括靶细胞或组织或者其前体细胞或组织，或者能与规定的宿主的基因组整合，这样克隆的序列就是可复制的。因此，所述载体可以是自主复制载体，即作为染色体外独立体存在的实体的载体，其复制独立于染色体复制，例如线形或闭合环状质粒、染色体外元件、微型染色体(mini-chromosome)或人工染色体。所述载体可以含有任何用于确保自我复制的元件。可选地，当所述载体被导入宿主细胞中时，其可以整合到基因组中并且与其整合的染色体一起复制。载体系统可以包含单个载体或质粒，两个或多个载体或质粒，其共同含有待被导入宿主细胞基因组的全部DNA，或者转座子。载体的选择通常取决于载体与该载体被导入的宿主细胞的相容性。在本文情况下，载体优选是在细菌细胞中可操作地起作用的载体。所述载体还可以包括选择标记，例如用于选择适合转化子的抗生素抗性基因。

术语“野生型”和“天然存在的”可交替使用，指具有基因或基因产物从天然存在的来源中分离出来时的特征的基因或基因产物。野生型基因或基因产物(例如多肽)是群体中最常见的并因此任意设计为基因的“正常”或“野生型”形式。

本发明的实施方案部分地与细菌脱氢酶基因和这些基因编码的多肽的分离和表征有关。一些实施方案可以包括具有醇脱氢酶活性的分离的脱氢酶多肽，所述多肽称作醇脱氢酶(ADH)多肽。按照本申请，ADH多肽可以具有DEHU氢化酶活性、D-甘露糖醛酸活性或DEHU和D-甘露糖醛酸氢化酶活性两者。其他的实施方案可以包括编码这些多肽的多核苷酸。例如本申请的分子可以包括选自以下的分离的多核苷酸，及其片段或变体：

其中所述分离的核苷酸编码具有脱氢酶活性的多肽。在某些实施方案中，所述多肽具有醇脱氢酶活性，例如DEHU氢化酶活性和/或D-甘露糖醛酸氢化酶活性。

本发明的分子还可以包括分离的ADH多肽或其变体、片段或衍生物，其具体可以选自：

其中所述分离的多肽具有脱氢酶活性。在某些实施方案中，所述多肽具有醇脱氢酶活性，例如DEHU氢化酶活性和/或D-甘露糖醛酸氢化酶活性。

在另外的实施方案中，如本文公开分离的多核苷酸编码多肽，所述多肽包含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、NADH、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)或NADPH结合基序中的至少一个。其他实施方案包括如本文公开的ADH多肽、其变体、片段或衍生物，其中所述多肽包含NAD+、NADH、NADP+或NADPH结合基序中的至少一个。在某些实施方案中，所述结合基序选自以下：Y-X-G-G-X-Y(SEQ ID NO：67)、Y-X-X-G-G-X-Y(SEQ ID NO：68)、Y-X-X-X-G-G-X-Y(SEQ ID NO：69)、Y-X-G-X-X-Y(SEQ ID NO：70)、Y-X-X-G-G-X-X-Y(SEQ ID NO：71)、Y-X-X-X-G-X-X-Y(SEQ ID NO：72)、Y-X-G-X-Y(SEQ ID NO：73)、Y-X-X-G-X-Y(SEQ ID NO：74)、Y-X-X-X-G-X-Y(SEQ ID NO：75)和Y-X-X-X-X-G-X-Y(SEQ ID NO：76)；其中Y独立地选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸，其中G是甘氨酸，并且其中X独立地选自基因编码的氨基酸。不希望被任何理论所约束，NAD+和相关分子在脱氢酶反应中作为辅因子，这些结合基序通常在醇脱氢酶中是保守的，并且在NAD+、NADH、NADP+或NADPH结合中起到重要作用。

本申请所包括的变体蛋白是有生物活性的，即它们保留所需要的天然蛋白的生物活性。此类变体可以来自，例如，基因多态性或人为操纵。如通过本文其他地方所述的序列比对程序、使用默认参数所测定的，天然或野生型ADH多肽的生物活性变体具有与天然蛋白的氨基酸序列的至少40％、50％、60％、70％，一般至少75％、80％、85％，经常约90％至95％或更高，典型性地约98％或更高的序列相似性或一致性。野生型ADH多肽的生物活性变体与该蛋白的差别通常是200、100、50或20个氨基酸残基，或者适宜地少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个，例如6-10，少至5个，少至4、3、2或甚至1个氨基酸残基。在一些实施方案中，ADH多肽与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或78中的相应序列的差异在于至少一个但少于15、10或5个氨基酸残基。在其他实施方案中，它与SEQ IDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或78中的相应序列的差异在于至少一个残基但少于20％、15％、10％或5％的残基。

ADH多肽可以用各种方法改变，包括氨基酸取代、缺失、截断和插入。此类操纵的方法是本领域内所熟知的。例如，ADH多肽的氨基酸序列变体可以通过DNA中的突变制备。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域内所熟知的。参见，例如Kunkel(1985，Proc.Natl.Acad.Sci USA.82：488-492)，Kunkel et al，(1987，Methods in Enzymol，154：367-382)，美国专利第4,873,192号，Watson，J.D.et al，(“Molecular Biology of the Gene(基因分子生物学)”，第四版，Benjamin/Cummings，Menlo Park，Calif，1987)和其中引用的文献。不影响目的蛋白的生物活性的合适的氨基酸取代的指导可以见于Dayhoff et al.，(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure(蛋白质序列与结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C)中的模型。筛选由点突变和截断生成的组合文库的基因产物的方法和用于筛选具有所选特性的基因产物的cDNA文库的方法是本领域已知的。这些方法适于ADH多肽的组合诱变所生成的基因文库的快速筛选。递归整体诱变(recursive ensemble mutagenesis(REM))是提高文库中功能性突变体的频数的技术，可以与筛选检测联合使用来鉴定ADH多肽变体(Arkinand Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7811-7815；Delgrave etal.，(1993)Protein Engineering，6：327-331)。如下文更详细讨论的，保守性取代，例如将一个氨基酸交换成具有相似性质的另一个氨基酸，可能是理想的。

变体ADH多肽当与亲本ADH氨基酸序列比较时，可以在沿着其序列的不同位点含有保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是氨基端残基被具有相似侧链的氨基端残基所替代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已有界定，通常可以按照以下进行亚分类：

酸性：残基在生理pH值由于失去氢离子而带有负电荷，并且残基被水溶液吸引，以至于当含有该残基的肽在生理pH值的水性介质中时，该残基在肽的构象中寻找表面位置。具有酸性侧链的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。

碱性：残基在生理pH值或其一或两个pH单位内(例如组氨酸)由于与氢离子结合而带有正电荷，并且残基被水溶液吸引，以至于当含有该碱基的肽在生理pH值的水性介质中时，该残基在的肽的构象中寻找表面位置。具有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。

带电荷的：该类残基在生理pH值下带有电荷，因此包括具有酸性和碱性侧链的氨基酸(即谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸)。

疏水的：该类残基在生理pH值下不带电荷，并且该残基被水溶液排斥，以至于当含有该残基的肽在水性介质中时，该残基在肽的构象中寻找内部位置。具有疏水侧链的氨基酸包括酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。

中性的/极性的：该类残基在生理pH值下不带电荷，但是该残基不被水溶液充分排斥，这样当含有该残基的肽在水性介质中时，该残基可能会在肽的构象中寻找内部位置。具有中性的/极性的侧链的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。

本说明书还将某些氨基酸表征为“小的”，因为即使缺乏极性基团，其侧链也不足够大到赋予其疏水性。除了脯氨酸，“小的”氨基酸是那种当至少一个极性基团在侧链时为4个碳或更少的氨基酸，以及当没有极性基团在侧链时为3个碳或更少的氨基酸。具有小侧链的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。由于脯氨酸已知的对肽链二级构象的影响，所以基因编码的二级氨基酸(secondary amino acid)脯氨酸是特例。脯氨酸的结构与所有其他天然存在氨基酸的区别在于其侧链与α-氨基基团的氮以及α-碳结合。但是，一些氨基酸相似性矩阵(例如，PAM120矩阵和PAM250矩阵，例如由Dayhoff et al.，(1978)，A model of evolutionarychange in proteins.Matrices for determining distance relationships In M.O.Dayhoff，(ed.)，Atlas of protein sequence and structure，Vol.5，pp.345-358，National Biomedical Research Foundation，Washington DC以及由Gonnet etal.，(1992，Science，256(5062)：14430-1445)所公开的)将脯氨酸包括在与甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸相同的组内。因此，为了本发明的目的，脯氨酸分类为“小”氨基酸。

极性或非极性分类所需的吸引或排斥的程度是任意的，因此本发明所特别考虑的氨基酸被分类为两者中的一种。没有特别命名的大部分氨基酸可以基于已知的行为进行分类。

氨基酸残基可以进一步亚分类为环状或非环状，芳香族或非芳香族，根据残基侧链取代基团的显而易见的分类，以及亚分类为大或小。如果残基在存在额外的极性取代基时，包括羧基碳在内总共含有4个或更少的碳原子，或不存在额外的极性取代基时含有总共3个或更少的碳原子，该残基被认为是小的。当然小的残基总是非芳香族的。氨基酸残基根据其结构特性可能落入两个或更多的分类中。对于天然存在的蛋白质氨基酸，按照本方案的亚分类显示于表A中。

表A

氨基酸亚分类

保守性氨基酸取代还包括基于侧链的分组。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含有氨基的侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。例如，预期以下取代不会对得到的变体多肽的性质产生重要影响是合理的：用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸，用谷氨酰胺取代天冬酰胺，用丝氨酸取代苏氨酸，或者用结构相关氨基酸取代氨基酸的相似取代。如本文所述(参见，例如实施例2)，氨基酸的改变能否得到有功能的ADH多肽可以容易地通过检测其活性来决定。保守性取代显示在标题为示例性取代的表B中。落入本发明范围的氨基酸取代通常是通过选择取代来实现，所述取代不会在其维持以下作用中有显著差异：(a)取代区域的肽骨架结构，(b)分子在靶位点的带电性或疏水性，或(c)侧链的体积。引入取代后，基于生物学活性对变体进行筛选。

表B

示例性氨基酸取代

可选地，用于进行保守性取代的相似氨基酸可以根据侧链的同一性分为3类。如Zubay，G.，Biochemistry(生物化学)，第三版，Wm.C.BrownPublishers(1993)中所述，第一组包括谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸，其都具有带电荷的侧链；第二组包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺；第三组包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸。

因此，ADH多肽中可预测的非必需氨基酸通常用来自相同侧链家族的另一氨基酸残基替代。可选地，沿着ADH编码序列的全部或部分可以随机引入突变，例如通过饱和诱变，并且可以基于母体多肽的活性对得到的突变体进行筛选以鉴定保留该活性的突变体。编码序列诱变后，所编码的肽可以重组表达，并且可以确定该肽的活性。“非必需”氨基酸残基是可以在具体化多肽的野生型序列中被改变而不会消除或明显改变该多肽的一种或多种活性的残基。适宜地，所述改变不会明显改变这些活性的一种，例如所述活性至少是野生型的20％、40％、60％、70％或80％。作为例证的非必需氨基酸包括图2-21中所示的野生型ADH多肽之间在相同位置不同的氨基酸残基的任一个或多个。“必需(essential)”氨基酸残基是当在参照ADH多肽的野生型序列中改动后，导致母体分子的活性削弱以使存在的活性不到野生型20％的残基。例如，这种必需氨基酸残基包括不同种类之间的ADH多肽中保守的那些，例如，G-X-G-G-X-G(SEQID NO：77)，其在来自不同细菌来源的ADH多肽的NADH结合位点中是保守的。

因此，本发明的实施方案还考虑天然存在的ADH多肽序列的变体或其生物活性片段作为ADH多肽，其中所述变体与天然存在序列的区别是通过一个或多个氨基酸残基的添加、缺失或取代。一般情况下，变体会展示出与例如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或78所示的母体ADH多肽序列的至少约30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的相似性。某些变体会与例如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或78所示的母体ADH多肽序列具有至少30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的序列同一性。此外，还考虑与天然或母体序列的区别在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60，70、80、90、100或更多个氨基酸的添加、缺失或取代，而仍保留母体ADH多肽特性的序列。

在某些实施方案中，变体多肽与参照ADH序列的差异为至少一个但少于50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3或2个氨基酸残基。在其它实施方案中，变体多肽与SEQ ID NO：2、4、6、8、10和12中相应序列的差异为至少1％但少于20％、15％、10％或5％的残基。(如果该比较需要比对，所述序列应进行最大相似性比对，从缺失或插入或错配中“环(looped)”出的序列认为是有差异的)。适宜地，所述差异是非必需残基的差别或改变或者保守性取代。

在某些实施方案中，变体多肽包括与例如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或78所示的ADH多肽的相应序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％或更高相似性的氨基酸序列，并且该变体多肽具有ADH多肽的活性。

序列之间的序列相似性或序列同一性(这些术语在本文中克交替使用)的计算如下执行。

为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，将所述序列进行比对以达到最佳比较目的(例如将空位引入第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两者用于最佳比对，并且非同源序列不用考虑用于比较目的)。在某些实施方案中，用于比较目的进行比对的参照序列的长度为所述参照序列的至少30％，优选地至少40％，较优选地至少50％、60％，更加优选地至少70％、80％、90％、100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，所述分子在该位置是同一的。

两序列之间的同一性百分比是所述序列共享的同一位置的数目的函数，应考虑为两序列最佳比对需要引入的空位的数目和每个空位的长度。

序列的比较和两序列之间的同一性百分比确定可以通过使用数学算法实现。在优选的实施方案中，两个氨基酸序列之间的同一性百分比使用已经并入GCG软件包中的GAP程序(http://www.gcg.com上可找到)的Needleman和Wunsch算法(1970，J.MoI.Biol.48：444-453)，利用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，以及空位权重为16、14、12、10、8、6或4，且长度权重为1、2、3、4、5或6来确定。在另一个优选的实施方案中，两个核苷酸序列之间的同一性百分比是使用GCG软件包中的GAP程序(http://www.gcg.com上可找到)，利用NWSgapdna.CMP矩阵，以及空位权重为40、50、60、70或80，且长度权重为1、2、3、4、5或6来确定。特别优选的一套参数(应当使用的，除非另有说明)是Blossum 62得分矩阵，其空位罚分为12，空位延长罚分为4，移码空位罚分为5。

可以使用已经并入ALIGN程序(2.0版本)的E.Meyers和W.Miller的算法(1989，Cabios，4：11-17)，利用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4来确定两个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比。

本文所述的核酸和蛋白序列可以作为“查询序列(query sequence)”用于针对公开数据库进行检索以，例如鉴定其他家族成员或相关序列。此类检索可以使用Altschul，et al.，(1990，J.Mol.Biol，215：403-10)的NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)来执行。可以用NBLAST程序、得分＝100、字符长度＝12来进行BLAST核苷酸检索以获得与本发明的53010核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序、得分＝50、字符长度＝3进行BLAST蛋白检索以获得与本发明的53010蛋白分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的有空位的比对，可以利用如Altschul etal.，(1997，Nucleic Acids Res，25：3389-3402)中所述的有空位的BLAST(Gapped BLAST)。当利用BLAST和有空位的BLAST程序时，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。

ADH多肽的变体可以通过筛选例如截断突变体的ADH多肽的突变体组合文库来鉴定。ADH蛋白编码序列的文库或例如N末端、C末端或内部片段的片段可以用于生成片段的混杂群体用于筛选和随后选择ADH多肽的变体。

用于筛选由点突变或截断形成的组合文库的基因产物的方法，以及用于筛选具有所选特性的基因产物的cDNA文库的方法在本领域是已知的。这些方法适用于ADH多肽的组合诱变所生成的基因文库的快速筛选。

本申请的ADH多肽可以通过本领域技术人员已知的任何适合的如重组技术的方法来制备。例如，ADH多肽可以通过包括以下步骤的方法来制备：(a)制备包含多核苷酸序列的构建体，所述多核苷酸序列编码ADH多肽并且可操作地与调节元件连接；(b)将所述构建体导入宿主细胞；(c)培养宿主细胞以表达所述ADH多肽；(d)从宿主细胞中分离所述ADH多肽。在作为例证的实例中，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或78所示序列至少的生物活性部分或者其变体。使用例如Sambrook，etal，(1989，见上文)，具体在第16和17部分；Ausubel et al.，(1994，supra)，具体在第10和16章；以及Coligan et al，Current Protocols in Protein Science(John Wiley & Sons，Inc.1995-1997)，具体在第1、5和6章中所述的标准操作方案可以方便地制备重组ADH多肽。

编码本申请的ADH多肽的示例性核苷酸序列包括全长ADH基因以及ADH基因的全长或基本上全长的核苷酸序列的部分或者它们的转录本或者这些转录本的DNA拷贝。ADH核苷酸序列的部分可以编码保留天然多肽生物活性的多肽部分或片段。编码ADH多肽的生物活性片段的ADH核苷酸序列的部分可以编码全长ADH多肽中至少约20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、300或400个连续氨基酸残基，或几乎高达全部数目的氨基酸。

本发明还考虑ADH核苷酸序列的变体。核酸变体可以是天然存在的，例如等位基因变体(相同基因座)、同源体(不同基因座)、直向同源体(不同生物体)或可以是非天然存在的。例如这些天然存在的变体可以通过使用熟知的分子生物学技术来鉴定，例如在本领域已知的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术。非天然存在变体可以通过包括应用于多核苷酸、细胞或生物体的诱变技术来制备。所述变体可以包含核苷酸取代、缺失、倒位和插入。变异可以发生在编码和非编码区域之一或在两者都发生。所述变异可以产生保守性和非保守性氨基酸取代(当在编码产物中比较时)。对于核苷酸序列，保守型变体包括由于遗传密码的简并性而编码参照ADH多肽的氨基酸序列的那些序列。变体核苷酸序列还包括合成的衍生核苷酸序列，诸如通过使用定点诱变生成但仍然编码ADH多肽的那些序列。如通过使用默认参数的本文其他地方所述的序列比对程序确定的，特定ADH核苷酸序列的变体通常具有与该特定核苷酸序列至少约30％、40％50％、55％、60％、65％、70％，通常至少约75％、80％、85％、理想地约90％至95％或更高，以及更适宜地约98％或更高的序列同一性。

ADH核苷酸序列可以用于分离其他生物体，特别是其他微生物的相应序列和等位基因。在本领域用于核酸序列杂交的方法很容易找到。可以按照公知的技术、基于它们与本文所示的编码序列的序列同一性分离来自其他生物体的编码序列。在这些技术中，已知编码序列的全部或部分作为探针使用，所述探针与来自选定生物体(例如蛇)的克隆的基因组DNA片段或cDNA片段(即基因组或cDNA文库)的群体中的其他ADH编码序列选择性杂交。因此，本发明还考虑与参照ADH核苷酸序列或其互补物在下文所述的严格条件下杂交的多核苷酸。如本文所用的术语“在低严格、中等严格、高严格或极高严格条件下杂交”描述用于杂交和洗涤的条件。实施杂交反应的指导可以在Ausubel et al，(1998，同上)，第6.3.1-6.3.6部分中找到。该参考书中描述了水性和非水性方法，每种都可以使用。本文参考的低严格条件包括且含有用于42℃杂交的从至少约1％v/v到至少约15％v/v的甲酰胺和从至少约1M到至少约2M的盐，以及用于42℃洗涤的至少约1M到至少约2M的盐。低严格条件还可以包括用于65℃杂交的1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO₄(pH 7.2)、7％SDS，以及用于室温洗涤的(i)2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO₄(pH 7.2)、5％SDS。低严格条件的一个实施方案包括在约45℃的6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在至少50℃的0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤两次(低严格条件的洗涤温度可以升到55℃)。中等严格条件包括且含有用于42℃杂交的从至少约16％v/v到至少约30％v/v的甲酰胺和从至少约0.5M到至少约0.9M的盐，以及用于55℃洗涤的至少约0.1M到至少约0.2M的盐。中等严格条件还可以包括用于65℃杂交的1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5MNaHPO₄(pH 7.2)、7％SDS，以及用于60-65℃洗涤的(i)2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO₄(pH 7.2)、5％SDS。中等严格条件的一个实施方案包括在45℃的6×SSC中杂交，然后在60℃的0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一或多次。高严格条件包括且含有用于42℃杂交的从至少约31％v/v到至少约50％v/v的甲酰胺和从至少约0.01M到至少约0.15M的盐，以及用于55℃洗涤的至少约0.01M到至少约0.02M的盐。高严格条件还可以包括用于65℃杂交的1％BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO₄(pH 7.2)、7％SDS，以及用于高于65℃洗涤的(i)2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO₄(pH 7.2)、1％SDS。高严格条件的一个实施方案包括在45℃的6×SSC中杂交，然后在65℃的0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一或多次。

在某些实施方案中，ADH多肽由在极高严格条件下与公开的核苷酸序列杂交的多核苷酸编码。极高严格条件的一个实施方案包括在65℃的0.5M磷酸钠、7％SDS中杂交，然后在65℃的0.2×SSC、1％SDS中洗涤一或多次。

其他的严格条件为本领域所熟知并且技术人员会认识到可以操控多种因素来优化杂交的特异性。最后洗涤的严格性的优化可以用以确保高度杂交。至于详细的实例，参见Ausubel et al，同上第2.10.1页至2.10.16页和Sambrook et al.(1989，同上)第1.101至1.104部分。

尽管严格的洗涤通常在约42℃至68℃的温度下实施，但是本领域技术人员会认识到，其他的温度也可以适用于严格条件。最大杂交率通常出现在约低于用于形成DNA-DNA杂交的熔解温度(T_m)20℃至25℃时。本领域熟知的是，T_m是熔解温度，或两个互补多核苷酸序列解离的温度。估算T_m的方法在本领域是熟知的(参见Ausubel et al.，同上第2.10.8页)。通常，完全匹配的DNA双链体的T_m可以通过下面的公式预测出一个近似值：

T_m＝81.5+16.6(log₁₀M)+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-(600/长度)

其中：M是Na⁺的浓度，优选地在0.01M到0.4M的范围；％G+C是鸟嘌呤和胞嘧啶碱基总数占全部碱基总数的百分比，范围在30％和75％G+C之间；％甲酰胺是甲酰胺体积百分比浓度；长度是DNA双链体中碱基对的数目。DNA双链体的T_m每下降约1℃，随机错配的碱基对的数目升高1％。通常对于高严格性在T_m-15℃实施洗涤，或对于中严格性在T_m-30℃实施洗涤。

在杂交程序的一个实例中，含有固定的DNA的膜(例如硝化纤维膜或尼龙膜)在含有标记探针的杂交缓冲液(50％去离子甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt′s液(0.1％聚蔗糖、0.1％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％牛血清白蛋白)、0.1％SDS和200mg/mL变性的鲑鱼精子DNA)中42℃杂交过夜。然后将该膜进行两次连续的中等严格性洗涤(即2×SSC、0.1％SDS中45℃持续15min，然后2×SSC、0.1％SDS中50℃持续15min)，然后进行两次连续的更高严格性洗涤(即0.2×SSC、0.1％SDS中55℃持续12min，然后0.2×SSC、0.1％SDS溶液中60-68℃持续12min)。

本发明的实施方案还包括使用ADH嵌合或融合蛋白来将多糖或寡糖转化为适合的单糖或适合的寡糖。如本文使用的ADH“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括连接到非ADH多肽的ADH多肽。“非ADH多肽”是指具有对应于与ADH蛋白不同的蛋白的氨基酸序列的多肽，并且该多肽来源于相同或不同生物体。所述融合蛋白的ADH多肽可以对应于ADH氨基酸序列的全部或如本文所述片段的部分。在优选的实施方案中，ADH融合蛋白包括至少一个(或两个)ADH蛋白的生物活性部分。非ADH多肽可以融合到ADH多肽的N-末端或C-末端。

融合蛋白可以包括与配体具有高亲和力的部分。例如，所述融合蛋白可以是GST-ADH融合蛋白，其中ADH序列融合到GST序列的C-末端。此类融合蛋白便于重组ADH多肽的纯化。可选地，融合蛋白可以是在N-末端含有异源信号序列的ADH蛋白。在某些宿主细胞中，ADH蛋白的表达和/分泌可以通过使用异源信号序列而增加。

在某些实施方案中，本发明的ADH分子可以在微生物系统或分离的/重组的微生物中应用，从而将来自例如藻酸盐的生物质的多糖和寡糖转化为适合的单糖或适合的寡糖，例如2-酮基-3-脱氧-D-葡萄糖酸-6-磷酸(KDG)，并进一步转化为例如生物燃料的大量生产型化学品。

作为背景，大规模水生种植业可以生成大量的生物质，而不会用能量作物生产代替粮食作物生产、采伐森林和再耕种目前未经耕作的土地，因为大部分水圈，包括海洋、河流和湖泊仍旧未被开发。作为一个实例，北美洲的太平洋海岸具有充足的对于大规模水生种植业所必需的矿物质。生活在该区域的巨藻生长速度达到1米/天，是地球上生长最快的植物，并且可以生长长达50米。此外，水生种植业具有其他的益处，包括避免赤潮爆发和建立鱼类友好型环境。

与木质纤维素生物质相反，水生生物质易于降解。水生生物质缺乏木质素，明显比木质纤维素生物质更脆，因此能够使用酶类或化学催化剂(例如甲酸)容易地降解。使用酶类或化学催化可以容易地将海草转化为单糖，因为海草与木质纤维素(葡萄糖：24.1-39％、甘露糖：0.2-4.6％、半乳糖：0.5-2.4％、木糖：0.4-22.1％、阿拉伯糖：1.5-2.8％，和糖醛酸：1.2-20.7％，并且总的糖含量是干重的36.5-70％)相比具有明显更简单的主要糖组分(藻酸盐30％、甘露醇15％)。使用例如海草的水生生物质的糖化作用和发酵作用比使用木质纤维素简单地多。

例如正烷类是所有油产品的主要组分，例如汽油、柴油、煤油和重油。微生物系统或重组微生物可以用于生产不同碳长度的正烷类，例如C7到超过C20:C7用于汽油(例如机动车辆)、C10-C15用于柴油(例如机动车辆、火车和船只)，C8-C16用于煤油(例如航空和船只)，所有的都可由于重油。

中级醇类和环状醇类也可以代替汽油和柴油。例如中级醇类和环状醇类具有更高的氧含量可以降低一氧化碳(CO)排放，它们具有较高的辛烷值可以降低发动机爆震，提高很多较低级的美国原油产品的质量，并且它们代替有害的芳香族辛烷增强剂(例如苯)，具有可与汽油相比的能量密度，它们的不混溶性显著降低国会的支出，对于冷启动较低的汽化潜热是有利的，4-辛醇的毒性显著低于乙醇和丁醇。

作为将海生生物质转化为例如生物燃料的大量生产型化学品的早期步骤，可以使用能够以多糖(例如藻酸盐)作为能量和碳的来源生长的微生物系统和重组微生物。仅仅作为解释，约50％的海草干重包含多种糖组分，其中藻酸盐和甘露醇是主要组分，分别对应海草干重的30％和15％。尽管例如大肠杆菌(E.coli)的微生物通常被认为是合成生物学中的宿主生物体，该微生物能够代谢甘露醇，但是它们完全缺乏降解和代谢藻酸盐的能力。本发明的实施方案包括能够利用诸如藻酸盐的多糖作为能量和碳的来源的微生物，诸如大肠杆菌，所述微生物含有本申请的ADH分子。

能够降解和解聚藻酸盐(水生或海生生物质的主要组分)并将其作为能量和碳的来源使用的微生物系统可以将一系列水生或海生生物质降解酶类(例如多糖降解或解聚酶类，例如藻酸盐裂解酶(ALs))并入该微生物系统。仅仅作为解释，藻酸盐是β-D-甘露糖醛酸(M)和α-D-古罗糖醛酸(G)(M和G是C5-羧基团的差向异构体)的嵌段共聚物。每个藻酸盐聚合物包含全部M(polyM)、全部G(polyG)和/或M和G的混合物(polyMG)的区域。ALs根据其催化作用主要分为两个不同的亚家族：内作用ALs(EC 4.2.2.3)和外作用ALs(EC 4.2.2.-)。内作用(endo-acting)Als根据其催化特异性进一步分为：M特异性ALs和G特异性ALs。内作用ALs通过β-消去反应机制随机切割藻酸盐，并主要将藻酸盐解聚为二糖、三糖和四糖。每个寡糖的非还原性末端的糖醛酸被转化为不饱和糖醛酸，4-脱氧-L-赤-hex-4烯吡喃糖醛酸。外作用(exo-acting)Als进一步催化这些寡糖的解聚，并且释放可以被非酶促地转化为单糖的不饱和单糖，包括糖醛酸，4-脱氧-L-赤-5-己酮糖糖醛酸(DEHU)。微生物系统或分离的微生物的某些实施方案可以包括内M作用Als、内G作用Als和外作用Als以将诸如藻酸盐的水生或海生生物质多糖降解或解聚为诸如诸如DEHU的单糖。

藻酸盐裂解酶可以在细胞质内将藻酸盐解聚为单糖(例如DEHU)，或者可以被分泌到培养基中来解聚藻酸盐。当藻酸盐在培养基中被解聚时，某些实施方案可以包括能够将单糖(例如DEHU)从培养基中转运到细胞质中从而有效地利用这些作为能量和碳的来源的单糖的微生物系统或分离的微生物。仅仅作为一个实例，编码诸如DEHU通透酶的单糖通透酶的基因可以从以诸如藻酸盐的多糖作为能量和碳的来源生长的细菌中分离，并且可以并入本微生物系统或分离的微生物的实施方案。作为另外的实例，实施方案还可以包括具有改变的单糖(例如DEHU)转运特异性的重新设计的天然的通透酶。

如本文所公开的，微生物系统或分离的微生物的某些实施方案可以并入编码ADH多肽的基因或其变体，其中所述微生物系统或微生物可以以例如藻酸盐的多糖作为能量和碳的来源生长。某些实施方案包括含有ADH多肽的微生物系统或分离的微生物，例如具有DEHU脱氢酶活性的ADH多肽，其中诸如DEHU的多种单糖可以还原为适合生物燃料的生物合成的单糖，诸如2-酮基-3-脱氧-D-葡萄糖酸-6-磷酸(KDG)或D-甘露醇。

在其他实施方案中，诸如藻酸盐的水生或海生生物质多糖可以利用诸如酸类的化学催化剂通过化学方式进行降解。仅仅作为解释，由化学催化剂催化的反应是水解，而不是由酶促催化剂催化的β-消去反应。酸催化剂通过水解切割糖苷键，释放寡糖，并进一步将这些寡糖解聚为不饱和单糖，所述单糖经常被转化为D-甘露糖醛酸。某些实施方案可以包括用强矿物酸煮沸藻酸盐，强矿物酸可以从D-甘露糖醛酸释放二氧化碳并形成D-来苏糖，D-来苏糖是很多微生物通常使用的糖。某些实施方案可以使用例如甲酸、盐酸、硫酸和本领域已知的其他合适的酸作为化学催化剂。

某些实施方案可以使用与本文所述或本领域技术人员已知的那些相似的变化的化学催化反应，包括适于与水生或海生生物质相关的多糖一起使用的改进的或重新设计的化学催化方法。某些实施方案包括所得到的单糖糖醛酸是D-甘露糖醛酸的那些。

按照本发明的某些实施方案，微生物系统或分离的微生物还可包含催化单糖(例如D-甘露糖醛酸和D-来苏糖)从培养基转运到微生物系统的通透酶。仅仅作为实例，编码土壤气单胞菌(Aeromonas)的D-甘露糖醛酸通透酶的基因可以并入如本文所述的微生物系统中。

作为可选的一个实例，微生物系统或微生物可以包含经重新设计以改变它们对有效的单糖转运诸如D-甘露糖醛酸和D-来苏糖的转运特异性的天然的通透酶。例如，大肠杆菌含有能够转运诸如D-甘露糖醛酸和D-来苏糖的单糖或糖类的几种通透酶，包括用于2-酮基-3-脱氧-D-葡萄糖酸(KDG)转运子的KdgT、用于诸如D-半乳糖醛酸和D-葡糖醛酸转运子的aldohexuronates的ExuT、用于葡萄糖/果糖醛酸转运子的GntPTU、用于葡萄糖苷酸转运体的uidB、用于L-海藻糖转运子的fucP、用于半乳糖转运子的galP、用于羟乙酸酯转运子的yghK、用于D-半乳糖酸转运子的dgoT、用于磷酸己糖转运子的uhpT、用于乳清酸盐/柠檬酸盐转运子的dctA、用于葡萄糖酸转运子的gntUT、用于麦芽糖转运子的malEGF、用于D-阿洛糖转运子的alsABC、用于L-艾杜糖酸/D-葡萄糖酸转运子的idnT、用于质子驱动的α-酮基戊二酸转运子的KgtP、用于乳糖/半乳糖转运子的lacY、用于D-木糖转运子的xylEFGH、用于L-阿拉伯糖转运子的araEFGH和用于D-核糖转运子的rbsABC。在某些实施方案中，微生物系统或分离的微生物可以包含如上文所述经重新设计用于转运例如D-甘露糖醛酸和D-来苏糖的某些单糖的通透酶。

某些实施方案可以包括以诸如D-甘露糖醛酸和D-来苏糖的单糖作为能量和碳的来源有效生长的微生物系统或分离的微生物，并且包括包含本申请的ADH分子的微生物系统或微生物，包括具有D-甘露糖醛酸脱氢酶活性的ADH多肽。

某些实施方案可以包括具有将诸如DEHU、D-甘露糖醛酸和D-木酮糖的单糖转化为诸如KDG的适于生物燃料生物合成途径的单糖提高的效率的微生物系统或分离的微生物。仅仅作为解释，D-甘露糖醛酸和D-木酮糖是例如大肠杆菌的微生物中的代谢物。D-甘露糖醛酸由D-甘露糖醛酸脱氢酶转化为KDG。D-木酮糖进入戊糖磷酸途径。在某些实施方案中，D-甘露糖醛酸脱氢酶(uxuA)可以过表达。在其他实施方案中，例如kgdK、nad和kdgA的合适的基因也可以过表达。

本发明的某些实施方案还可以包括用于将多糖转化为适合的单糖或寡糖的方法，所述方法包含使多糖与微生物系统接触，其中所述微生物系统包含微生物，并且其中所述微生物包含按照本公开内容的ADH多核苷酸，其中所述ADH多核苷酸编码具有氢化酶活性的ADH多肽，所述氢化酶活性例如醇脱氢酶活性、DEHU氢化酶活性和/或D-甘露糖醛酸氢化酶活性。

另外的实施方案包括用于催化D-甘露糖醛酸还原(氢化)的方法，所述方法包含使D-甘露糖醛酸与微生物系统接触，其中所述微生物系统包含微生物，并且其中所述微生物包含按照本公开内容的ADH多核苷酸。

另外的实施方案包括用于催化DEHU还原(氢化)的方法，所述方法包含使DEHU与微生物系统接触，其中所述微生物系统包含微生物，并且其中所述微生物包含按照本公开内容的ADH多核苷酸。

另外的实施方案包括包含分离的多核苷酸的载体，并且可以包括下述载体，其中所述分离的多核苷酸可操作地连接在表达调控区，并且其中所述多核苷酸编码具有氢化酶活性的ADH多肽，所述氢化酶活性例如醇脱氢酶活性、DEHU氢化酶活性和/或D-甘露糖醛酸氢化酶活性。

另外的实施方案包括用于将多糖转化为适合的单糖或寡糖的方法，所述方法包含使多糖与微生物系统接触，其中所述微生物系统包含微生物，并且其中所述微生物包含按照本公开内容的ADH多肽。

另外的实施方案包括用于催化D-甘露糖醛酸还原(氢化)的方法，所述方法包含使D-甘露糖醛酸与微生物系统接触，其中所述微生物系统包含微生物，并且其中所述微生物包含按照本公开内容的ADH多肽。

另外的实施方案包括用于催化糖醛酸、4-脱氧-L-赤式-5-己酮糖糖醛酸(DEHU)还原(氢化)的方法，所述方法包含使DEHU与微生物系统接触，其中所述微生物系统包含微生物，并且其中所述微生物包含按照本公开内容的ADH多肽。

另外的实施方案包括用于将多糖转化为适合的单糖或寡糖的微生物系统，其中所述微生物系统包含微生物，并且其中所述微生物包含选自以下的分离的多核苷酸：

另外的实施方案包括用于将多糖转化为适合的单糖或寡糖的微生物系统，其中所述微生物系统包含微生物，并且其中所述微生物包含选自以下的分离的多肽：

在某些实施方案中，所述微生物系统包含重组微生物，其中所述重组微生物包含如本文所述的载体、多核苷酸和/或多肽。鉴于快速的生长速度、充分了解的遗传学、可用遗传工具的多样性和产生异源蛋白的能力，基因修饰的大肠杆菌可以用在如本文所述的微生物系统的实施方案中，不论是用于降解例如藻酸盐的多糖或用于生物燃料的形成或生物合成。按照本说明书，部分基于酶类和代谢物对于宿主生物体的相容性，可以使用其他微生物。例如，按照本发明，可以使用以下的其他微生物：醋化醋杆菌、无色杆菌、嗜酸菌、不动杆菌、马杜拉放线菌、游动放线菌、嗜热古生菌、土壤杆菌、产碱杆菌、菠萝(M)、节细菌、黑曲霉、米曲霉、蜂蜜曲霉、粉状曲霉、佐氏曲霉、酱油曲霉、宇佐美曲霉、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌活菌、浸麻芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草杆菌、双歧杆菌、短短芽孢杆菌、洋葱布克氏菌、柱状假丝酵母、皱褶假丝酵母、番木瓜(L)、纤维菌、头孢霉、毛壳菌、细丽毛壳菌、梭状芽孢杆菌、酪酸梭菌、丙酮丁醇梭菌、热纤维梭菌、(谷氨酸)棒状杆菌、棒状杆菌、大肠杆菌、肠球菌、菊欧文氏菌、葡糖杆菌、葡糖醋杆菌、嗜盐古菌、特异腐质霉、Humicola nsolens、西唐北里孢菌、克雷柏氏杆菌、产酸克雷柏氏杆菌、克鲁维斯酵母、脆壁克鲁维斯酵母、乳酸克鲁维斯酵母、考克氏菌、乳酸乳杆菌、乳酸杆菌、发酵乳酸杆菌、清酒乳酸杆菌、乳球菌、乳酸乳球菌、明串珠菌、甲基孢囊菌、西西里甲烷叶菌、嗜器官产甲烷菌、布氏甲烷杆菌、蛾微杆菌、溶壁微球菌、小月菌、爪哇毛霉、分支杆菌、漆斑菌、硝化杆菌、亚硝化单胞菌、诺卡氏菌、番木瓜、小球菌、嗜盐片球菌、青霉、沙门柏干酪青霉、桔青霉、埃默森青霉、娄地青霉、薄青霉、多色青霉、异养硝化-好氧反硝化菌、丙酸杆菌、假单胞菌、荧光假单胞菌、脱氮假单胞菌、热球菌、激烈热球菌、极端嗜热球菌、根瘤菌、米赫根毛霉、微小根毛霉、根霉、戴尔根霉、日本根霉、雪白根霉、米根霉、少孢根霉、红球菌、酿酒酵母、核盘菌、多食鞘氨醇杆菌、鞘氨醇杆菌、鞘氨醇单胞菌、链球菌、嗜热链球菌、链霉菌、灰色链霉菌、变铅青链霉菌、鼠链霉菌、锈赤链霉菌、紫红链霉菌、轮枝链霉菌、四联球菌、嗜热菌、泛养硫球菌、栓菌、木霉)、长梗木霉、里氏木霉、绿色木霉、青霉毛孢子菌、溶藻弧菌、黄杆菌、酵母、鲁氏酵母、酵单胞菌和运动发酵单胞菌等。

为了使本发明更易理解并且达到实施的效果，接下来通过下文非限定性实施例描述特别优选的实施方案。

实施例

实施例1

醇脱氢酶的克隆

除非另作说明，所有的化学品和酶类分别购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，Co.)和纽英伦生物技术公司(New England Biolabs，Inc)。因为甘露醇1-脱氢酶(MTDH)催化与DEHU氢化酶相似的反应，所以使用衍生自芹菜(Apium graveolens)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的氨基酸序列MTDHs设计引物。使用这些作为查询的引物(参见表1)，在根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58的基因组序列中检索同源基因序列。发现了大约16个编码锌依赖的醇脱氢酶的基因。在这些基因中，具有高E值的前10个基因序列用PCR进行扩增：98℃持续10秒、55℃持续15秒以及72℃持续60秒，重复30次。总体积100μl的反应混合物含有1×Phusion缓冲液、2mM dNTP、0.5μM正向引物和反向引物(表1中列出)，2.5U Phusion DNA聚合酶(Finezyme)和作为模板的根瘤土壤杆菌C58细胞的等分试样。因为ADH1和ADH4具有内部NdeI位点，以及ADH3具有BamHI位点，所以这些基因利用上述PCR的操作方案，使用重叠PCR(over-lap PCR)的方法来扩增。正向引物(5′-GCGGCCTCGGCCACATGGCCGTCAAGC-3′)(SEQ ID NO：39)和反向引物(5′-GCTTGACGGCCATGTGGCCGAGGCCGC-3′)(SEQ ID NO：40)用于从ADH1中删除Ndel位点。正向引物(5′-TGGCAATACCGGACCCCGGCCCCGGTG-3′)(SEQ ID NO：41)和反向引物(5′-CACCGGGGCCGGGGTCCGGTATTGCCA-3′)(SEQ ID NO：42)用于从ADH3中删除BamHI位点。正向引物(5′-AGGCAACCGAGGCGTATGAGCGGCTAT-3′)(SEQ ID NO：43)和反向引物(5′-ATAGCCGCTCATACGCCTCGGTTGCCT-3′)(SEQ ID NO：44)用于从ADH4中删除Ndel位点。这些扩增的片段用NdeI和BamHI进行消化并使用T4 DNA连接酶连接到用相同的酶预消化的pET29内，以形成10个不同的质粒，pETADHl到pETADHl0。将构建的质粒进行测序(ElimBiophamaceuticals)并且证实了这些插入物的DNA序列。

将所有的质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中。含有各自的醇脱氢酶(ADH)基因的BL21(DE3)的单集落接种到50ml含有50μg/ml卡那霉素(Km⁵⁰)的LB培养基中。这些菌株生长在37℃、200rpm的轨道摇床中。当OD_600nm达到0.6时，每个培养物加入0.2mM IPTG，然后使诱导的培养物生长在20℃、200rpm的轨道摇床中。诱导后24小时，将细胞在4000rpm×g离心10分钟后收获，并将沉淀团重悬到2ml含有10μlLysonase^TM生物处理试剂(Lysonase^TM Bioprocessing Reagent，Novagen)的Bugbuster(Novagen)中。将溶液再次在4000rpm×g离心10分钟，收集上清。

表1用于扩增ADH的引物

实施例2

醇脱氢酶的表征

来自根瘤土壤杆菌C58的寡聚藻酸盐裂解酶Atu3025的制备.基于pET29质粒的骨架构建了pETAtu3025。寡聚藻酸盐裂解酶Atu3025通过PCR扩增：98℃持续10秒、55℃持续15秒和72℃持续60秒，重复30次。总体积100μl的反应混合物含有1×Phusion缓冲液、2mM dNTP、0.5μM正向引物(5′-GGAATTCCATATGCGTCCCTCTGCCCCGGCC-3′)(SEQ ID NO：45)和反向引物(5′-CGGGATCCTTAGAACTGCTTGGGAAGGGAG-3′)(SEQ ID NO：46)，2.5U Phusion DNA聚合酶(Finezyme)和作为模板的根瘤土壤杆菌C58(获赠于华盛顿大学的Eugene Nester教授)细胞的等分试样。扩增的片段用NdeI和BamHI进行消化并使用T4 DNA连接酶连接到用相同的酶预消化的pET29内，以形成pETAtu3025。将构建的质粒进行测序(ElimBiophamaceuticals)并且证实了这些插入物的DNA序列。

pETAtu3025转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中。含有pETAtu3025的BL21(DE3)的单集落接种到50ml含有50μg/ml卡那霉素(Km⁵⁰)的LB培养基中。这一菌株生长在37℃、200rpm的轨道摇床中。当OD_600nm达到0.6时，向培养物中加入0.2mM IPTG，然后诱导的培养物生长在20℃、200rpm的轨道摇床中。诱导后24小时，所述细胞在4000rpm×g离心10分钟后收获，并将沉淀团重悬到2ml含有10μl Lysonase^TM生物处理试剂(Novagen)的Bugbuster(Novagen)中。将溶液再次在4000rpm×g离心10分钟，收集上清。

约2％DEHU溶液的制备.DEHU溶液是使用酶学方法制备。通过向500ml的20mM Tris-HCl(pH7.5)溶液中加入10g低粘度藻酸盐来制备2％藻酸盐溶液。向该藻酸盐溶液中加入约10mg来自黄杆菌属(Flavobacterium sp)(购自Sigma-aldrich)的藻酸盐裂解酶。将250ml该溶液转移到另一个瓶中，加入上述部分制备的含有Atu3025的大肠杆菌细胞裂解液。藻酸盐降解室温过夜完成。得到的产物用薄层色谱法进行分析，并证实了DEHU的形成。

D-甘露糖醛酸溶液的制备.D-甘露糖醛酸溶液是基于之前Spoehr(Archive of Biochemistry，14：ppl53-155)描述的操作方案使用化学方法制备。50mg的藻酸盐溶解在800μl的90％的甲酸中。该溶液在100℃孵育过夜。然后蒸发甲酸，残余的物质使用纯的乙醇洗涤两次。所述残余的物质再次溶解到纯的乙醇中并过滤。蒸发乙醇，将残余的物质重悬到20ml的20mM Ths-HCl(pH 8.0)中，并且过滤溶液以得到D-甘露糖醛酸溶液。将该D-甘露糖醛酸溶液稀释五倍，用于检测。

DEHU氢化酶检测.为鉴定DEHU氢化酶，我们进行了NADPH依赖的DEHU氢化作用检测。20μl的制备好的含有每种ADH的细胞裂解液加入到160μl的上述部分制备的20倍稀释的DEHU溶液。因为使用根瘤土壤杆菌C58细胞裂解液的初步研究显示DEHU氢化反应需要NADPH作为辅因子，所以加入20μl的2.5mg/ml的NADPH溶液(20mMTris-HCl，pH 8.0)来启动氢化反应。使用ThermoMAX 96孔板读数器(Molecular Devises)的动力学模式监测340nm的吸光度30分钟来监测NADPH的消耗。含有缺乏部分N-末端结构域的醇脱氢酶(ADH)10的大肠杆菌细胞裂解液在对照反应混合物中使用。

D-甘露糖醛酸氢化酶检测.为鉴定D-甘露糖醛酸氢化酶，我们进行了NADPH依赖的D-甘露糖醛酸氢化作用检测。20μl的制备好的含有每种ADH的细胞裂解液加入到160μl的上述部分制备的D-甘露糖醛酸溶液。加入20μl的2.5mg/ml的NADPH溶液(20mM Tris-HCl，pH 8.0)来启动氢化反应。使用ThermoMAX 96孔板读数器(Molecular Devises)的动力学模式监测340nm的吸光度30分钟来监测NADPH的消耗。含有缺乏部分N-末端结构域的醇脱氢酶(ADH)10的大肠杆菌细胞裂解液在对照反应混合物中使用。

结果显示在图1、图2和图24中。与其他氢化酶相比，ADH1和ADH2显示出明显更高的DEHU氢化酶活性(图1)。另外，与其他氢化酶相比，ADH3、ADH4和ADH9显示出明显更高的D-甘露糖醛酸氢化酶活性(图2)。ADH11和ADH20也显示出显著的DEHU氢化酶活性(图23)

实施例3

将大肠杆菌改造为在作为唯一碳源的藻酸盐上生长

野生型大肠杆菌不能利用藻酸盐聚合物或降解的藻酸盐作为其唯一的碳源(参见图4)。但是，已知灿烂弧菌能够代谢藻酸盐来支持生长。为生成利用降解的藻酸盐作为其唯一的碳源的重组大肠杆菌，构建了灿烂弧菌的fosmid文库并克隆到大肠杆菌中(参加例如相关的美国申请第12/245,537号，将其通过引用的方式整体并入本文)。

为制备灿烂弧菌的fosmid文库，使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从灿烂弧菌B01(获赠于麻省理工学院(MIT)的Martin Polz博士)中分离了基因组DNA。然后使用拷贝对照Fosmid文库生成试剂盒(Copy Control Fosmid Library Production Kit)(Epicentre，Madison，WI)构建了fosmid文库。由约40kb的随机基因组片段构成的该文库被插入到载体pCC1FOS(Epicentre，Madison，WI)中。

所述fosmid文库包装到噬菌体中，并且用该噬菌体文库转染含有携带某些灿烂弧菌基因(V12B01_02425至V12B01_02480；编码II型分泌器(secretion apparatus))的pDONR221质粒的大肠杆菌DH10B细胞。该secretome区编码来自灿烂弧菌的II型分泌器，其被克隆到pDONR221质粒中并导入大肠杆菌菌株DH10B。

基于氯霉素抗性选择转化体，然后基于其在降解的藻酸盐上生长的能力进行筛选。基于在降解的藻酸盐培养基上的生长筛选得到的转化体。通过将2％藻酸盐(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、10mM磷酸钠缓冲液、50mM KCl、400mM NaCl与来自黄杆菌属的藻酸盐裂解酶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)在室温下孵育至少一星期来制备降解的藻酸盐培养基。将该降解的藻酸盐稀释到0.8％的浓度来制备生长培养基，该培养基的终浓度为1×M9盐、2mM MgSO₄、100μM CaCl₂、0.007％亮氨酸、0.01％酪蛋白氨基酸、1.5％NaCl(这包括所有钠的来源：M9、稀释的藻酸盐和加入的NaCl)。

分离了一个在该培养基上生长良好的含有fosmid的大肠杆菌克隆。使用FosmidMAX DNA纯化试剂盒(Epicentre，Madison，WI)分离并制备了来自该克隆的fosmid DNA。将该分离的fosmid转移回DH10B细胞中，并且测试这些细胞在藻酸盐上生长的能力。

结果在图22中显示，其表明某些含有fosmid的大肠杆菌克隆能够生长在作为唯一碳源的藻酸盐上。根瘤土壤杆菌提供了阳性对照(参见阴影线圆圈)。作为阴性对照，大肠杆菌DH10B细胞不能生长在藻酸盐上(参见紧靠阳性对照的左边)。

这些结果还证明包含在该源自灿烂弧菌的fosmid克隆中的序列足以赋予大肠杆菌在作为唯一碳源的降解的藻酸盐上生长的能力。因此，包含在pDONR221载体中的II型分泌系统序列对于在降解的藻酸盐上生长不是必需的，所述pDONR221载体包含在最初的DH10B细胞中。

足以赋予在作为唯一碳源的藻酸盐上生长的分离的fosmid使用ElimBiopharmaceuticals(Hayward，CA)进行测序。测序结果显示该载体含有基因组DNA节段，所述基因组DNA节段含有全长基因V12B01_24189至V12B01_24249。在该序列中，有在fosmid克隆中被截断的V12B01_24189前的大的基因。所述大的基因V12B01_24184是与自动转运体相似的推定的蛋白并且属于COG3210，其是包括参与血红素的利用或粘附的大的外蛋白(exoprotein)的直向同源蛋白簇。在fosmid克隆中，V12B01_24184在N-末端被截断，这样开始的5893bp从预期的开放读码框(总共预期包含22889bp)中失去。

实施例4

从藻酸盐产生乙醇

测试了重组大肠杆菌通过在作为唯一碳源的藻酸盐上生长来产生乙醇的能力。为了生成重组大肠杆菌，编码运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶(pdc)和两种醇脱氢酶(adhA和adhB)的DNA序列用聚合酶链反应(PCR)进行扩增。对于来自运动发酵单胞菌的示例性的pde序列，参见美国专利第7,189,545号，在此通过引用将其有关这些序列的信息并入。对于来自运动发酵单胞菌的示例性的adhA和adhB序列，参见Keshav et al，JBacteriol.172：2491-2497，1990，在此通过引用将其有关这些序列的信息并入。

这些扩增片段用凝胶纯化并且通过另一轮PCR拼接在一起。最终扩增的DNA片段用BamHI和XbaI进行消化，并连接到用相同限制性内切酶预消化的克隆载体pBBR1MCS-2中。得到的质粒称作pBBRPdc-AdhA/B。

大肠杆菌用pBBRPdc-AdhA/B或pBBRPdc-AdhA/B+1.5Fos(含有V12B01_24189和V12B01_24249之间的基因组区的fosmid克隆；这些序列赋予大肠杆菌利用作为唯一碳源的降解的藻酸盐的能力，参见实施例3)进行转化，生长在含有藻酸盐的m9培养基中，并测试乙醇的产生。结果在图23中显示，其证实了含有pBBRPdc-AdhA/B+1.5FOS的菌株在藻酸盐上生长时显示了显著升高的乙醇产量。这些结果表明pBBRPdc-AdhA/B+1.5FOS在乙醇的产生中能够利用藻酸盐作为碳源。

Claims

1.分离的多核苷酸，选自：

其中所述分离的核苷酸编码具有脱氢酶活性的多肽。

2.用于将多糖转化为单糖或寡糖的方法，所述方法包含使多糖与重组微生物接触，其中所述重组微生物包含如权利要求1所述的多核苷酸。

3.用于催化糖醛酸，D-甘露糖醛酸还原(氢化)的方法，其包含使所述糖醛酸，D-甘露糖醛酸与重组微生物接触，其中所述重组微生物包含如权利要求1所述的多核苷酸。

4.用于催化糖醛酸，4-脱氧-L-赤-5-己酮糖糖醛酸(DEHU)还原(氢化)的方法，其包含使DEHU与重组微生物接触，其中所述重组微生物包含如权利要求1所述的多核苷酸。

5.包含如权利要求1所述的分离的多核苷酸的载体。

6.如权利要求5所述的载体，其中所述分离的多核苷酸可操作地连接到表达调控区。

7.包含重组微生物的微生物系统，其中所述重组微生物包含如权利要求5所述的载体。

8.包含重组微生物的微生物系统，其中所述重组微生物包含如权利要求1所述的多核苷酸，并且其中所述多核苷酸整合到所述重组微生物的基因组中。

9.如权利要求8所述的微生物系统，其中所述分离的多核苷酸可操作地连接到表达调控区。

10.如权利要求7或8所述的重组微生物，其中所述微生物选自醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)、无色杆菌(Achromobacter)、嗜酸菌(Acidiphilium)、不动杆菌(Acinetobacter)、马杜拉放线菌(Actinomadura)、游动放线菌(Actinoplanes)、嗜热古生菌(Aeropyrum pernix)、土壤杆菌(Agrobacterium)、产碱杆菌(Alcaligenes)、菠萝(Ananas comosus)(M)、节细菌(Arthrobacter)、黑曲霉(Aspargillus niger)、米曲霉(Aspargillus oryze)、蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)、粉状曲霉(Aspergillus pulverulentus)、佐氏曲霉(Aspergillus saitoi)、酱油曲霉(Aspergillus sojea)、宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、缓慢芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽胞杆菌活菌(Bacillus licheniformis)、浸麻芽孢杆菌(Bacillus macerans)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)、洋葱布克氏菌(Burkholderia cepacia)、柱状假丝酵母(Candida cylindracea)、皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、番木瓜(Caricapapaya)(L)、纤维菌(Cellulosimicrobium)、头孢霉(Cephalosporium)、毛壳菌(Chaetomium erraticum)、细丽毛壳菌(Chaetomium gracile)、梭状芽孢杆菌(Clostridium)、酪酸梭菌(Clostridium butyricum)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)、(谷氨酸)棒状杆菌(Corynebacterium(glutamicum))、efficiens棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠球菌(Enterococcus)、菊欧文氏菌(Erwina chrysanthemi)、葡糖杆菌(Gliconobacter)、葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter)、嗜盐古菌(Haloarcula)、特异腐质霉(Humicola insolens)、Humicola nsolens、西唐北里孢菌(Kitasatospora setae)、克雷柏氏杆菌(Klebsiella)、产酸克雷柏氏杆菌(Klebsiella oxytoca)、克鲁维斯酵母(Kluyveromyces)、脆壁克鲁维斯酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)、考克氏菌(Kocuria)、乳酸乳杆菌(Lactlactis)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)、清酒乳酸杆菌(Lactobacillus sake)、乳球菌(Lactococcus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、明串珠菌(Leuconostoc)、甲基孢囊菌(methylocystis)、西西里甲烷叶菌(methanolobus siciliae)、嗜器官产甲烷菌(Methanogenium organophilum)、布氏甲烷杆菌(Methanobacterium bryantii)、蛾微杆菌(Microbacterium imperiale)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、小月菌(Microlunatus)、爪哇毛霉(Mucorjavanicus)、分支杆菌(Mycobacterium)、漆斑菌(Myrothecium)、硝化杆菌(Nitrobacter)、亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)、诺卡氏菌(Nocardia)、番木瓜(Papaya carica)、小球菌(Pediococcus)、嗜盐片球菌(Pediococcushalophilus)、青霉菌(Penicillium)、沙门柏干酪青霉(Penicilliurncamemberti)、桔青霉(Penicillium citrinum)、埃默森青霉(Peniclliumemersonii)、娄地青霉(Penicillium roqueforti)、薄青霉(Penicilliumlilactinum)、多色青霉(Penicillium multicolor)、异养硝化-好氧反硝化菌(Paracoccus pantotrophus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)、热球菌(Pyrococcus)、激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)、极端嗜热球菌(Pyrococcus horikoshii)、根瘤菌(Rhizobium)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus Lindt)、根霉(Rhizopus)、戴尔根霉(Rhizopus delemar)、日本根霉(Rhizopusjaponicus)、雪白根霉(Rhizopus niveus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、少孢根霉(Rhizopusoligosporus)、红球菌(Rhodococcus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、核盘菌(Sclerotina libertina)、多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriummultivorum)、鞘氨醇杆菌(Sphingobium)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、链球菌(Streptococcus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Y-1、链霉菌(Streptomyces)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、鼠链霉菌(Streptomyces murinus)、锈赤链霉菌(Streptomyces rubiginosus)、紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)、轮枝链霉菌(Streptoverticillium mobaraense)、四联球菌(Tetragenococcus)、嗜热菌(Thermus)、泛养硫球菌(Thiosphaera pantotropha)、栓菌(Trametes)、木霉(Trichoderma)、长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、绿色木霉(Trichoderma viride)、青霉毛孢子菌(Trichosporon penicillatum)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、黄杆菌(Xanthomonas)、酵母(yeast)、鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、酵单胞菌(Zymomonas)和运动发酵单胞菌(Zymomonus mobilis)。

11.分离的多肽，选自：

其中所述分离的多肽具有脱氢酶活性。

12.用于将多糖转化为单糖或寡糖的方法，其包含使所述多糖与重组微生物接触，其中所述重组微生物包含如权利要求11所述的多肽。

13.用于催化糖醛酸，D-甘露糖醛酸还原(氢化)的方法，其包含使所述糖醛酸，D-甘露糖醛酸与重组微生物接触，其中所述重组微生物包含如权利要求11所述的多肽。

14.用于催化糖醛酸，4-脱氧-L-赤-5-己酮糖糖醛酸(DEHU)还原(氢化)的方法，其包含使DEHU与重组微生物接触，其中所述重组微生物包含如权利要求11所述的多肽。

15.用于将多糖转化为单糖或寡糖的微生物系统，其中所述微生物系统包含重组微生物，并且其中所述重组微生物包含选自以下的分离的多核苷酸：

16.用于将多糖转化为单糖或寡糖的微生物系统，其中所述微生物系统包含重组微生物，并且其中所述重组微生物包含选自以下的分离的多肽：

17.如权利要求1或15所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽包含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、NADH、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)或NADPH结合基序中的至少一个，所述结合基序选自Y-X-G-G-X-Y(SEQ ID NO：67)、Y-X-X-G-G-X-Y(SEQ IDNO：68)、Y-X-X-X-G-G-X-Y(SEQ ID NO：69)、Y-X-G-X-X-Y(SEQ IDNO：70)、Y-X-X-G-G-X-X-Y(SEQ ID NO：71)、Y-X-X-X-G-X-X-Y(SEQ IDNO：72)、Y-X-G-X-Y(SEQ ID NO：73)、Y-X-X-G-X-Y(SEQ ID NO：74)、Y-X-X-X-G-X-Y(SEQ ID NO：75)和Y-X-X-X-X-G-X-Y(SEQ ID NO：76)；其中Y独立地选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸，其中G是甘氨酸，并且其中X独立地选自基因编码的氨基酸。

18.如权利要求11或16所述的分离的多肽，其中所述多肽包含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、NADH、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)或NADPH结合基序中的至少一个，所述结合基序选自Y-X-G-G-X-Y(SEQ ID NO：67)、Y-X-X-G-G-X-Y(SEQ ID NO：68)、Y-X-X-X-G-G-X-Y(SEQ ID NO：69)、Y-X-G-X-X-Y(SEQ ID NO：70)、Y-X-X-G-G-X-X-Y(SEQID NO：71)、Y-X-X-X-G-X-X-Y(SEQ ID NO：72)、Y-X-G-X-Y(SEQ IDNO：73)、Y-X-X-G-X-Y(SEQ ID NO：74)、Y-X-X-X-G-X-Y(SEQ ID NO：75)和Y-X-X-X-X-G-X-Y(SEQ ID NO：76)；其中Y独立地选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸，其中G是甘氨酸，并且其中X独立地选自基因编码的氨基酸。

19.用于将多糖转化为乙醇的方法，其包含使所述多糖与重组微生物接触，其中所述重组微生物能够在作为唯一碳源的所述多糖上生长。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述重组微生物包含至少一种编码至少一种丙酮酸脱羧酶的多核苷酸和至少一种编码醇脱氢酶的多核苷酸。

21.如权利要求19所述的方法，其中所述多糖是藻酸盐。

22.如权利要求19所述的方法，其中所述重组微生物包含一种或多种含有灿烂弧菌的V12B01_24189和V12B01_24249之间的基因组区的多核苷酸。

23.如权利要求19所述的方法，其中所述至少一种丙酮酸脱羧酶来自运动发酵单胞菌。

24.如权利要求19所述的方法，其中所述至少一种醇脱氢酶来自运动发酵单胞菌。

25.如权利要求19所述的方法，其中所述重组微生物是大肠杆菌。