CN107043760A - 一种胰激肽原酶及其制备工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种胰激肽原酶及其制备工艺，胰激肽原酶的制备步骤为：冻猪胰脏解冻、绞碎、磨制、预处理、纤维分离、活化、活化胰浆过滤、醇沉、重相压滤、制粒等19个步骤，最终获得胰激肽原酶。本发明实现了胰脏中胰激肽原酶和弹性蛋白酶充分激活，为胰激肽原酶及胰弹性蛋白酶进一步联产创造可能性；本发明中所得胰激肽原酶中胰弹性酶活力非常高；本发明极大提高了过滤速度，实现工业化生产；本发明采用沸腾干燥方式，投资小、耗时短、活力损耗小。

Description

一种胰激肽原酶及其制备工艺
技术领域
本发明涉及一种胰激肽原酶及其制备工艺，属于胰激肽原酶的制备技术领域。
背景技术
胰激肽原酶又称胰激肽释放酶、血管舒缓素，其普遍存在于人体的胰脏、颌下腺与唾液中，其中以胰脏中含量最高。现有技术中，胰激肽原酶是从猪胰腺中提取的蛋白水解酶类，由18中氨基酸和4种糖所组成，为一种内切蛋白水解酶类，分子量为26800，在生物体内，该酶是以酶原，即激肽释放酶原形式存在的。
目前市场上胰激肽原酶基本都是从胰脏中直接提取的。先把胰脏绞碎，再用醋酸缓冲液把胰激肽原酶从胰脏中提取出来。新鲜胰脏必须先去除脂肪和结缔组织，经过机械破碎，再用有机溶剂除去大部分脂溶性杂质后才能用水提取。对于冰冻的胰脏，还要经过刨切机将胰脏刨切成片状或丝状，然后再进行捣碎、研磨、匀浆等操作；其次是胰脏中的酶均是以无活性的酶原形式存在，还需采用多种活化剂在适当条件下对其活化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胰激肽原酶及其制备工艺，本发明首先把胰脏中胰激肽原酶激活，再从中分离出来，解决了现有技术中胰激肽原酶不能规模化生产中的难题。本发明的技术方案如下：
一种胰激肽原酶的制备工艺，具体步骤如下：
(1)冻猪胰脏解冻
冻猪胰脏在无菌的解冻间解冻架上解冻至半化状态，保证胰脏中心温度≤0℃，解冻间温度为15-20℃，空气相对湿度≥80％RH；
解冻间用臭氧进行消毒、解冻架等工器具用热碱水或二氧化氯消毒液消毒。
原料在转运过程中应避免污染，不得接触地面等污染源(托盘等工器具应事先消毒)。
(2)绞碎
将解冻后的猪胰脏在切绞一体机中进行切绞，切绞过程猪胰脏浆的温度≤10℃。
切绞一体机的消毒：采用热碱水或二氧化氯消毒液对切绞一体机进行消毒。
(3)磨制
将绞碎的猪胰脏浆置于无菌的磨机中，进行磨浆，经两台串联胶体磨机研磨两遍后送入1号提取罐，边搅拌边加入胰脏活化液、碳酸氢钠和乳酸，转速为30HZ；胰脏活化液、碳酸氢钠、乳酸的终浓度(质量浓度)分别为5-10％、0.01％和0.05％；
优选的，胰脏活化液、碳酸氢钠、乳酸的终浓度(质量浓度)分别为8.5％、0.01％和0.05％。
使用完毕的磨机清洗消毒。先用清水(或结合毛刷等工具)清洗干净，再用热碱水消毒10min以上，最后用热水(85℃)冲洗干净。
(4)预处理
物料在1号提取罐中搅拌5min后，缓慢升温5小时，使物料温度升至36-48℃，升温过程中间隙搅拌，每小时搅拌一次，每次15min；
优选的，1号提取罐中，搅拌5min后，缓慢升温5小时，使物料温度升至40℃。
(5)纤维分离
将预处理后的物料通过除浆机分离纤维，获得纤维组织和浆液，浆液中不含纤维，然后将浆液打入2号提取罐；
(6)活化
2号提取罐中，启动搅拌，转速为15HZ，利用夹层热水对2号提取罐内的物料缓慢升温，物料在8-10小时缓慢升至10-15℃，物料在10-15℃条件下保温6小时；
优选的，利用夹层热水对2号提取罐内的物料缓慢升温，物料在10小时缓慢升至12℃，物料在12℃条件下保温6小时。
(7)活化胰浆过滤
把保温后的物料打入隔膜压滤机，收集滤液，隔膜压滤机中的每秒每平方米滤布的透气量为500-600L，滤布材质为丙纶单丝布；优选的，隔膜压滤机中的每秒每平方米滤布的透气量为550L。
(8)醇沉
将滤液预冷至10℃，搅拌下加入15℃的无水乙醇，至酒精度为55°时截止，然后静止3小时；
(9)重相压滤
抽去醇沉后的上清液，把醇沉重相打入压滤机压滤，压至滤饼不再出液，收集压滤饼；
(10)制粒
将收集的压滤饼过旋转式制粒机进行破碎至粒径为2-3mm，以利于脱脂、脱水；制粒过程中温度小于等于80℃；加入压滤饼速度应均匀，不得出现堵塞现象。
(11)脱脂、脱水
制粒物料投入脱脂罐，加入无水乙醇至浸没物料，进行脱脂、脱水，去除轻相，收集重相；
(12)提取
把脱脂后物料抽入3号提取罐，加入10倍物料重量浓度为0.02mol/L的醋酸钠溶液，且醋酸钠溶液中含1mmol/L氯化钙，45℃下搅拌4h，加热至65℃并保温30分钟，立即速冷至室温，然后进行离心，转速为4000rpm，时间为10min；
(13)吸附
收集上清液打入1号吸附罐，加入2倍量纯水，投入处理过的DEAE纤维素树脂，每吨上清液投入10kgDEAE纤维素树脂，65℃搅拌吸附2小时，静置10分钟，排除料液，收集树脂；
DEAE纤维素树脂的处理方法：用pH为7.0的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液浸泡DEAE纤维素树脂24小时；
(14)洗脱
将吸附后的树脂加入洗脱罐，用质量分数为5％的硫酸铵洗脱树脂常温洗脱2.5小时，重复洗脱一次，合并两次的洗脱液；
(15)醇沉
把合并的两次洗脱液打入醇沉罐，加入温度为零下10℃的无水乙醇，至酒精度为65度，继续搅拌1小时，转速为15HZ，静置1小时；
(16)重相压滤
将醇沉后的物料虹吸上清液，把醇沉重相打入隔膜压滤机开启压滤，至不出液为止，收集压滤饼；
(17)制粒
把收集的压滤饼通过旋转式制粒机进行破碎至粒径为2-3mm，制粒过程中温度小于等于80℃；加入压滤饼速度应均匀，不得出现堵塞现象；
(18)脱水
将制粒好的物料投入脱水桶，加入无水乙醇浸没物料，进行脱水，然后进行离心，转速为4000rpm，时间为10min，收集固体物料；
(19)干燥
将脱水后的物体物料转移至沸腾干燥箱内干燥，密封好后，开启进风，待乙醇抽去完成后，开启进风加热，进风温度为45℃，干燥时间为3-5小时，干燥后即得。优选的，干燥时间为4小时。
本发明还包括获得的胰激肽原酶。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
(1)本发明实现了胰脏中胰激肽原酶和弹性蛋白酶充分激活，为胰激肽原酶及胰弹性蛋白酶进一步联产创造可能性。
(2)本发明中所得胰激肽原酶中胰弹性酶活力非常高。
(3)本发明极大提高了过滤速度，实现工业化生产。
(4)本发明采用沸腾干燥方式，投资小、耗时短、活力损耗小。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1一种胰激肽原酶的制备工艺，具体步骤如下：
(1)冻猪胰脏解冻
冻猪胰脏在无菌的解冻间解冻架上解冻至半化状态，保证胰脏中心温度≤0℃，解冻间温度为18℃，空气相对湿度≥80％RH；
解冻间用臭氧进行消毒、解冻架等工器具用热碱水或二氧化氯消毒液消毒。
原料在转运过程中应避免污染，不得接触地面等污染源(托盘等工器具应事先消毒)。
(2)绞碎
将解冻后的猪胰脏在切绞一体机中进行切绞，切绞过程猪胰脏浆的温度≤10℃。
切绞一体机的消毒：采用热碱水或二氧化氯消毒液对切绞一体机进行消毒。
(3)磨制
将绞碎的猪胰脏浆置于无菌的磨机中，进行磨浆，经两台串联胶体磨机研磨两遍后送入1号提取罐，边搅拌边加入胰脏活化液、碳酸氢钠和乳酸，转速为30HZ；胰脏活化液、碳酸氢钠、乳酸的终浓度(质量浓度)分别为8.5％、0.01％和0.05％；
使用完毕的磨机清洗消毒。先用清水(或结合毛刷等工具)清洗干净，再用热碱水消毒10min以上，最后用热水(85℃)冲洗干净。
(4)预处理
物料在1号提取罐中搅拌5min后，缓慢升温5小时，使物料温度升至40℃，升温过程中间隙搅拌，每小时搅拌一次，每次15min；
(5)纤维分离
将预处理后的物料通过除浆机分离纤维，获得纤维组织和浆液，浆液中不含纤维，然后将浆液打入2号提取罐；
(6)活化
2号提取罐中，启动搅拌，转速为15HZ，利用夹层热水对2号提取罐内的物料缓慢升温，物料在10小时缓慢升至12℃，物料在12℃条件下保温6小时；
(7)活化胰浆过滤
把保温后的物料打入隔膜压滤机，收集滤液，隔膜压滤机中的每秒每平方米滤布的透气量为550L，滤布材质为丙纶单丝布；
(8)醇沉
将滤液预冷至10℃，搅拌下加入15℃的无水乙醇，至酒精度为55°时截止，然后静止3小时；
(9)重相压滤
抽去醇沉后的上清液，把醇沉重相打入压滤机压滤，压至滤饼不再出液，收集压滤饼；
(10)制粒
将收集的压滤饼过旋转式制粒机进行破碎至粒径为2-3mm，以利于脱脂、脱水；制粒过程中温度小于等于80℃；加入压滤饼速度应均匀，不得出现堵塞现象。
(11)脱脂、脱水
制粒物料投入脱脂罐，加入无水乙醇至浸没物料，进行脱脂、脱水，去除轻相，收集重相；
(12)提取
把脱脂后物料抽入3号提取罐，加入10倍物料重量浓度为0.02mol/L的醋酸钠溶液，且醋酸钠溶液中含1mmol/L氯化钙，45℃下搅拌4h，加热至65℃并保温30分钟，立即速冷至室温，然后进行离心，转速为4000rpm，时间为10min；
(13)吸附
收集上清液打入1号吸附罐，加入2倍量纯水，投入处理过的DEAE纤维素树脂，每吨上清液投入10kgDEAE纤维素树脂，65℃搅拌吸附2小时，静置10分钟，排除料液，收集树脂；
DEAE纤维素树脂的处理方法：用pH为7.0的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液浸泡DEAE纤维素树脂24小时；
(14)洗脱
将吸附后的树脂加入洗脱罐，用质量分数为5％的硫酸铵洗脱树脂常温洗脱2.5小时，重复洗脱一次，合并两次的洗脱液；
(15)醇沉
把合并的两次洗脱液打入醇沉罐，加入温度为零下10℃的无水乙醇，至酒精度为65度，继续搅拌1小时，转速为15HZ，静置1小时；
(16)重相压滤
将醇沉后的物料虹吸上清液，把醇沉重相打入隔膜压滤机开启压滤，至不出液为止，收集压滤饼；
(17)制粒
把收集的压滤饼通过旋转式制粒机进行破碎至粒径为2-3mm，制粒过程中温度小于等于80℃；加入压滤饼速度应均匀，不得出现堵塞现象；
(18)脱水
将制粒好的物料投入脱水桶，加入无水乙醇浸没物料，进行脱水，然后进行离心，转速为4000rpm，时间为10min，收集固体物料；
(19)干燥
将脱水后的物体物料转移至沸腾干燥箱内干燥，密封好后，开启进风，待乙醇抽去完成后，开启进风加热，进风温度为45℃，干燥时间为4小时，干燥后即得。
实施例2一种胰激肽原酶的制备工艺，具体步骤如下：
(1)冻猪胰脏解冻
冻猪胰脏在无菌的解冻间解冻架上解冻至半化状态，保证胰脏中心温度≤0℃，解冻间温度为16℃，空气相对湿度≥80％RH；
解冻间用臭氧进行消毒、解冻架等工器具用热碱水或二氧化氯消毒液消毒。
原料在转运过程中应避免污染，不得接触地面等污染源(托盘等工器具应事先消毒)。
(2)绞碎
将解冻后的猪胰脏在切绞一体机中进行切绞，切绞过程猪胰脏浆的温度≤10℃。
切绞一体机的消毒：采用热碱水或二氧化氯消毒液对切绞一体机进行消毒。
(3)磨制
将绞碎的猪胰脏浆置于无菌的磨机中，进行磨浆，经两台串联胶体磨机研磨两遍后送入1号提取罐，边搅拌边加入胰脏活化液、碳酸氢钠和乳酸，转速为30HZ；胰脏活化液、碳酸氢钠、乳酸的终浓度(质量浓度)分别为5.5％、0.01％和0.05％；
使用完毕的磨机清洗消毒。先用清水(或结合毛刷等工具)清洗干净，再用热碱水消毒10min以上，最后用热水(85℃)冲洗干净。
(4)预处理
物料在1号提取罐中搅拌5min后，缓慢升温5小时，使物料温度升至37℃，升温过程中间隙搅拌，每小时搅拌一次，每次15min；
(5)纤维分离
将预处理后的物料通过除浆机分离纤维，获得纤维组织和浆液，浆液中不含纤维，然后将浆液打入2号提取罐；
(6)活化
2号提取罐中，启动搅拌，转速为15HZ，利用夹层热水对2号提取罐内的物料缓慢升温，物料在8小时缓慢升至10℃，物料在10℃条件下保温6小时；
(7)活化胰浆过滤
把保温后的物料打入隔膜压滤机，收集滤液，隔膜压滤机中的每秒每平方米滤布的透气量为510L，滤布材质为丙纶单丝布；
(8)醇沉
将滤液预冷至10℃，搅拌下加入15℃的无水乙醇，至酒精度为55°时截止，然后静止3小时；
(9)重相压滤
抽去醇沉后的上清液，把醇沉重相打入压滤机压滤，压至滤饼不再出液，收集压滤饼；
(10)制粒
将收集的压滤饼过旋转式制粒机进行破碎至粒径为2-3mm，以利于脱脂、脱水；制粒过程中温度小于等于80℃；加入压滤饼速度应均匀，不得出现堵塞现象。
(11)脱脂、脱水
制粒物料投入脱脂罐，加入无水乙醇至浸没物料，进行脱脂、脱水，去除轻相，收集重相；
(12)提取
把脱脂后物料抽入3号提取罐，加入10倍物料重量浓度为0.02mol/L的醋酸钠溶液，且醋酸钠溶液中含1mmol/L氯化钙，45℃下搅拌4h，加热至65℃并保温30分钟，立即速冷至室温，然后进行离心，转速为4000rpm，时间为10min；
(13)吸附
收集上清液打入1号吸附罐，加入2倍量纯水，投入处理过的DEAE纤维素树脂，每吨上清液投入10kgDEAE纤维素树脂，65℃搅拌吸附2小时，静置10分钟，排除料液，收集树脂；
DEAE纤维素树脂的处理方法：用pH为7.0的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液浸泡DEAE纤维素树脂24小时；
(14)洗脱
将吸附后的树脂加入洗脱罐，用质量分数为5％的硫酸铵洗脱树脂常温洗脱2.5小时，重复洗脱一次，合并两次的洗脱液；
(15)醇沉
把合并的两次洗脱液打入醇沉罐，加入温度为零下10℃的无水乙醇，至酒精度为65度，继续搅拌1小时，转速为15HZ，静置1小时；
(16)重相压滤
将醇沉后的物料虹吸上清液，把醇沉重相打入隔膜压滤机开启压滤，至不出液为止，收集压滤饼；
(17)制粒
把收集的压滤饼通过旋转式制粒机进行破碎至粒径为2-3mm，制粒过程中温度小于等于80℃；加入压滤饼速度应均匀，不得出现堵塞现象；
(18)脱水
将制粒好的物料投入脱水桶，加入无水乙醇浸没物料，进行脱水，然后进行离心，转速为4000rpm，时间为10min，收集固体物料；
(19)干燥
将脱水后的物体物料转移至沸腾干燥箱内干燥，密封好后，开启进风，待乙醇抽去完成后，开启进风加热，进风温度为45℃，干燥时间为4.5小时，干燥后即得。
实施例3一种胰激肽原酶的制备工艺，具体步骤如下：
(1)冻猪胰脏解冻
冻猪胰脏在无菌的解冻间解冻架上解冻至半化状态，保证胰脏中心温度≤0℃，解冻间温度为20℃，空气相对湿度≥80％RH；
解冻间用臭氧进行消毒、解冻架等工器具用热碱水或二氧化氯消毒液消毒。
原料在转运过程中应避免污染，不得接触地面等污染源(托盘等工器具应事先消毒)。
(2)绞碎
将解冻后的猪胰脏在切绞一体机中进行切绞，切绞过程猪胰脏浆的温度≤10℃。
切绞一体机的消毒：采用热碱水或二氧化氯消毒液对切绞一体机进行消毒。
(3)磨制
将绞碎的猪胰脏浆置于无菌的磨机中，进行磨浆，经两台串联胶体磨机研磨两遍后送入1号提取罐，边搅拌边加入胰脏活化液、碳酸氢钠和乳酸，转速为30HZ；胰脏活化液、碳酸氢钠、乳酸的终浓度(质量浓度)分别为7％、0.01％和0.05％；
使用完毕的磨机清洗消毒。先用清水(或结合毛刷等工具)清洗干净，再用热碱水消毒10min以上，最后用热水(85℃)冲洗干净。
(4)预处理
物料在1号提取罐中搅拌5min后，缓慢升温5小时，使物料温度升至45℃，升温过程中间隙搅拌，每小时搅拌一次，每次15min；
(5)纤维分离
将预处理后的物料通过除浆机分离纤维，获得纤维组织和浆液，浆液中不含纤维，然后将浆液打入2号提取罐；
(6)活化
2号提取罐中，启动搅拌，转速为15HZ，利用夹层热水对2号提取罐内的物料缓慢升温，物料在9小时缓慢升至14℃，物料在14℃条件下保温6小时；
(7)活化胰浆过滤
把保温后的物料打入隔膜压滤机，收集滤液，隔膜压滤机中的每秒每平方米滤布的透气量为580L，滤布材质为丙纶单丝布；
(8)醇沉
将滤液预冷至10℃，搅拌下加入15℃的无水乙醇，至酒精度为55°时截止，然后静止3小时；
(9)重相压滤
抽去醇沉后的上清液，把醇沉重相打入压滤机压滤，压至滤饼不再出液，收集压滤饼；
(10)制粒
将收集的压滤饼过旋转式制粒机进行破碎至粒径为2-3mm，以利于脱脂、脱水；制粒过程中温度小于等于80℃；加入压滤饼速度应均匀，不得出现堵塞现象。
(11)脱脂、脱水
制粒物料投入脱脂罐，加入无水乙醇至浸没物料，进行脱脂、脱水，去除轻相，收集重相；
(12)提取
把脱脂后物料抽入3号提取罐，加入10倍物料重量浓度为0.02mol/L的醋酸钠溶液，且醋酸钠溶液中含1mmol/L氯化钙，45℃下搅拌4h，加热至65℃并保温30分钟，立即速冷至室温，然后进行离心，转速为4000rpm，时间为10min；
(13)吸附
收集上清液打入1号吸附罐，加入2倍量纯水，投入处理过的DEAE纤维素树脂，每吨上清液投入10kgDEAE纤维素树脂，65℃搅拌吸附2小时，静置10分钟，排除料液，收集树脂；
DEAE纤维素树脂的处理方法：用pH为7.0的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液浸泡DEAE纤维素树脂24小时；
(14)洗脱
将吸附后的树脂加入洗脱罐，用质量分数为5％的硫酸铵洗脱树脂常温洗脱2.5小时，重复洗脱一次，合并两次的洗脱液；
(15)醇沉
把合并的两次洗脱液打入醇沉罐，加入温度为零下10℃的无水乙醇，至酒精度为65度，继续搅拌1小时，转速为15HZ，静置1小时；
(16)重相压滤
将醇沉后的物料虹吸上清液，把醇沉重相打入隔膜压滤机开启压滤，至不出液为止，收集压滤饼；
(17)制粒
把收集的压滤饼通过旋转式制粒机进行破碎至粒径为2-3mm，制粒过程中温度小于等于80℃；加入压滤饼速度应均匀，不得出现堵塞现象；
(18)脱水
将制粒好的物料投入脱水桶，加入无水乙醇浸没物料，进行脱水，然后进行离心，转速为4000rpm，时间为10min，收集固体物料；
(19)干燥
将脱水后的物体物料转移至沸腾干燥箱内干燥，密封好后，开启进风，待乙醇抽去完成后，开启进风加热，进风温度为45℃，干燥时间为3.5小时，干燥后即得。
实施例4一种胰激肽原酶的制备工艺，具体步骤如下：
(1)冻猪胰脏解冻
冻猪胰脏在无菌的解冻间解冻架上解冻至半化状态，保证胰脏中心温度≤0℃，解冻间温度为17℃，空气相对湿度≥80％RH；
解冻间用臭氧进行消毒、解冻架等工器具用热碱水或二氧化氯消毒液消毒。
原料在转运过程中应避免污染，不得接触地面等污染源(托盘等工器具应事先消毒)。
(2)绞碎
将解冻后的猪胰脏在切绞一体机中进行切绞，切绞过程猪胰脏浆的温度≤10℃。
切绞一体机的消毒：采用热碱水或二氧化氯消毒液对切绞一体机进行消毒。
(3)磨制
将绞碎的猪胰脏浆置于无菌的磨机中，进行磨浆，经两台串联胶体磨机研磨两遍后送入1号提取罐，边搅拌边加入胰脏活化液、碳酸氢钠和乳酸，转速为30HZ；胰脏活化液、碳酸氢钠、乳酸的终浓度(质量浓度)分别为9％、0.01％和0.05％；
使用完毕的磨机清洗消毒。先用清水(或结合毛刷等工具)清洗干净，再用热碱水消毒10min以上，最后用热水(85℃)冲洗干净。
(4)预处理
物料在1号提取罐中搅拌5min后，缓慢升温5小时，使物料温度升至42℃，升温过程中间隙搅拌，每小时搅拌一次，每次15min；
(5)纤维分离
将预处理后的物料通过除浆机分离纤维，获得纤维组织和浆液，浆液中不含纤维，然后将浆液打入2号提取罐；
(6)活化
2号提取罐中，启动搅拌，转速为15HZ，利用夹层热水对2号提取罐内的物料缓慢升温，物料在9小时缓慢升至13℃，物料在13℃条件下保温6小时；
(7)活化胰浆过滤
把保温后的物料打入隔膜压滤机，收集滤液，隔膜压滤机中的每秒每平方米滤布的透气量为590L，滤布材质为丙纶单丝布；
(8)醇沉
将滤液预冷至10℃，搅拌下加入15℃的无水乙醇，至酒精度为55°时截止，然后静止3小时；
(9)重相压滤
抽去醇沉后的上清液，把醇沉重相打入压滤机压滤，压至滤饼不再出液，收集压滤饼；
(10)制粒
将收集的压滤饼过旋转式制粒机进行破碎至粒径为2-3mm，以利于脱脂、脱水；制粒过程中温度小于等于80℃；加入压滤饼速度应均匀，不得出现堵塞现象。
(11)脱脂、脱水
制粒物料投入脱脂罐，加入无水乙醇至浸没物料，进行脱脂、脱水，去除轻相，收集重相；
(12)提取
把脱脂后物料抽入3号提取罐，加入10倍物料重量浓度为0.02mol/L的醋酸钠溶液，且醋酸钠溶液中含1mmol/L氯化钙，45℃下搅拌4h，加热至65℃并保温30分钟，立即速冷至室温，然后进行离心，转速为4000rpm，时间为10min；
(13)吸附
收集上清液打入1号吸附罐，加入2倍量纯水，投入处理过的DEAE纤维素树脂，每吨上清液投入10kgDEAE纤维素树脂，65℃搅拌吸附2小时，静置10分钟，排除料液，收集树脂；
DEAE纤维素树脂的处理方法：用pH为7.0的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液浸泡DEAE纤维素树脂24小时；
(14)洗脱
将吸附后的树脂加入洗脱罐，用质量分数为5％的硫酸铵洗脱树脂常温洗脱2.5小时，重复洗脱一次，合并两次的洗脱液；
(15)醇沉
把合并的两次洗脱液打入醇沉罐，加入温度为零下10℃的无水乙醇，至酒精度为65度，继续搅拌1小时，转速为15HZ，静置1小时；
(16)重相压滤
将醇沉后的物料虹吸上清液，把醇沉重相打入隔膜压滤机开启压滤，至不出液为止，收集压滤饼；
(17)制粒
把收集的压滤饼通过旋转式制粒机进行破碎至粒径为2-3mm，制粒过程中温度小于等于80℃；加入压滤饼速度应均匀，不得出现堵塞现象；
(18)脱水
将制粒好的物料投入脱水桶，加入无水乙醇浸没物料，进行脱水，然后进行离心，转速为4000rpm，时间为10min，收集固体物料；
(19)干燥
将脱水后的物体物料转移至沸腾干燥箱内干燥，密封好后，开启进风，待乙醇抽去完成后，开启进风加热，进风温度为45℃，干燥时间为5小时，干燥后即得。
试验例1本发明制备的胰激肽原酶的酶效价检测
磷酸盐缓冲液(pH10.8)取磷酸氢二钠6.8g，磷酸二氢钠3.6g，加水约500ml使溶解，调pH值至10.8，再加水稀释至1000m1。
Tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷缓冲液)(pH6.0)称取三羟甲基氨基甲烷6.87g，加水500ml溶解，用2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.0，加水稀释至1000m1。
标准品溶液的制备取胰激肽原酶标准品适量，加上述磷酸盐缓冲液(pH10.8)制成每lml中含10单位的溶液。
供试品溶液的制备取解析液1.0ml，加磷酸盐缓冲液(pH10.8)制成每lml中约含10单位的溶液。
底物溶液的制备取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐25.3mg，胰糜酶抑制剂10mg,加Tris缓冲液(pH6.0)定容至500ml，4℃保存。
测定方法量取85±0.5℃水浴中放置的底物溶液8.5ml，置lcm比色池中，精密加入供试品溶液或标准品溶液0.1ml，混匀，立即计时，在85±0.5℃，按照“紫外-可见分光光度法”(TC0005-03)于486nm波长处，以底物溶液为空白，准确读取1分钟的吸光度A0和3分钟的吸光度A，标准品溶液和供试品溶液需平行测定3次，分别求得标准品溶液和供试品溶液的△A值(△A＝A—A0)的平均值代入下式计算胰激肽原酶的效价：
检测数据
取胰激肽原酶成品1000g，用10000g醋酸缓冲液溶解。用300目滤布过滤。所得解析液检测胰激肽原酶活力，本发明实施例1-4获得的胰激肽原酶中胰激肽原酶活力检测结果如表1所示，市售胰激肽原酶活力检测结果如表2所示：
表1
样品 胰激肽原酶活力企业标准 胰激肽原酶活力数据
实施例1 ≥800U/g 1103U/g
实施例2 ≥800U/g 1056U/g
实施例3 ≥800U/g 998U/g
实施例4 ≥800U/g 1078U/g
平均数值 - 1059U/g
表2
样品 检测日期 胰激肽原酶活力数据
对照样品1 2016.12.06 720U/g
对照样品2 2016.12.06 680U/g
试验例2本发明制备的胰激肽原酶中胰弹性酶效价的检测
Tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷缓冲液)(pH6.0)称取三羟甲基氨基甲烷6.87g，加水500ml溶解，用2mol/L盐酸溶液调节pH值至7.0，加水稀释至1000m1。
碳酸氢钠溶液称取40mg碳酸氢钠，以Tris缓冲液(pH6.0)溶解稀释至100.0ml，冷藏备用。
弹性酶底物溶液(STANA溶液)精密称取STANA 15mg，以Tris缓冲液(pH6.0)溶解稀释至10.0ml，冷藏备用。
标准品溶液的制备精密称取对照品p-硝基胺0.13g，加入70mL醋酸溶解后，再用醋酸定容至100.0mL，吸取5.0mL，以Tris缓冲液(pH6.0)定容至100.0mL，再吸取该溶液5.0mL，加碳酸氢钠2.5mL，加水定容至50.0mL作为对照品溶液，用水作空白，按照紫外-可见分光光度法(Ch.p.2010年版二部附录ⅣA)(TC005-03)在206nm波长处测得AS。
供试品溶液的制备取离心清液适量，加上述冷藏的Tris缓冲液(pH6.0)，在水浴中振摇溶解，加上述Tris缓冲液定容至10.0ml，吸取该溶液2ml，加5ml碳酸氢钠试液，加上述pH6.0Tris缓冲液定容至50.0ml，使其吸光度为0.8-1.2。
测定方法取3个10ml容量瓶，分别吸入2ml弹性酶底物溶液(STANA溶液)，其中2个容量瓶平行加入供试品溶液，另1个加碳酸氢钠溶液作为空白，置65+0.1℃恒温槽保温15min。
在上述三个已加底物溶液的容量瓶中，分别加入0.5ml置于65+0.1℃恒温槽保温15min的供试品溶液和碳酸氢钠溶液，置95±0.1℃恒温槽保温10min后，分别加入0.5ml碳酸氢钠，激烈振摇终止反应，并加水稀释至10ml，以水作空白，按照“紫外-可见分光光度法”(Ch.p.2010年版二部附录ⅣA)(TC005-03)于206nm波长处测得AT，A0，并由AT计算平均值
一个弹性酶STANA单位相当于在上述测定条件下，每分钟产生1μmol p-硝基苯胺的一个酶活性单位，通过下列方程式来计算按弹性蛋白酶的效价：
本发明实施例1-4制备的胰激肽原酶中胰弹性酶效价胰弹性酶活力检测结果如表3所示，市售胰弹性酶效价胰弹性酶活力检测结果如表4所示：
表3
样品 胰弹性酶活力企业标准 胰弹性酶活力数据
实施例1 ≥200U/g 260U/g
实施例2 ≥200U/g 218U/g
实施例3 ≥200U/g 226U/g
实施例4 ≥200U/g 220U/g
平均数值 - 231U/g
表4
样品编号 检测日期 胰弹性酶活力数据
对照样品1 2016.12.06 39U/g
对照样品2 2016.12.06 61U/g

Claims (9)

1.一种胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于，制备工艺具体步骤如下：
(1)冻猪胰脏解冻
冻猪胰脏在无菌的解冻间解冻架上解冻至半化状态，保证胰脏中心温度≤0℃，解冻间温度为15-20℃，空气相对湿度≥80％RH；
(2)绞碎
将解冻后的猪胰脏在切绞一体机中进行切绞，切绞过程猪胰脏浆的温度≤10℃；
(3)磨制
将绞碎的猪胰脏浆置于无菌的磨机中，进行磨浆，经两台串联胶体磨机研磨两遍后送入1号提取罐，边搅拌边加入胰脏活化液、碳酸氢钠和乳酸，转速为30HZ；胰脏活化液、碳酸氢钠、乳酸的终浓度(质量浓度)分别为5-10％、0.01％和0.05％；
(4)预处理
1号提取罐中，搅拌5min后，缓慢升温5小时，使物料温度升至36-48℃，升温过程中间隙搅拌，每小时搅拌一次，每次15min；
(5)纤维分离
将预处理后的物料通过除浆机分离纤维，获得纤维组织和浆液，浆液中不含纤维，然后将浆液打入2号提取罐；
(6)活化
2号提取罐中，启动搅拌，转速为15HZ，利用夹层热水对2号提取罐内的物料缓慢升温，物料在8-10小时缓慢升至10-15℃，物料在10-15℃条件下保温6小时；
(7)活化胰浆过滤
把保温后的物料打入隔膜压滤机，收集滤液，隔膜压滤机中的每秒每平方米滤布的透气量为500-600L，滤布材质为丙纶单丝布；
(8)醇沉
将滤液预冷至10℃，搅拌下加入15℃的无水乙醇，至酒精度为55°时截止，然后静止3小时；
(9)重相压滤
抽去醇沉后的上清液，把醇沉重相打入压滤机压滤，压至滤饼不再出液，收集压滤饼；
(10)制粒
将收集的压滤饼过旋转式制粒机进行破碎至粒径为2-3mm，制粒过程中温度小于等于80℃；
(11)脱脂、脱水
制粒物料投入脱脂罐，加入无水乙醇至浸没物料，进行脱脂、脱水，去除轻相，收集重相；
(12)提取
把脱脂后物料抽入3号提取罐，加入10倍物料重量浓度为0.02mol/L的醋酸钠溶液，且醋酸钠溶液中含1mmol/L氯化钙，45℃下搅拌4h，加热至65℃并保温30分钟，立即速冷至室温，然后进行离心，转速为4000rpm，时间为10min；
(13)吸附
收集上清液打入1号吸附罐，加入2倍量纯水，投入处理过的DEAE纤维素树脂，每吨上清液投入10kgDEAE纤维素树脂，65℃搅拌吸附2小时，静置10分钟，排除料液，收集树脂；
DEAE纤维素树脂的处理方法：用pH为7.0的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液浸泡DEAE纤维素树脂24小时；
(14)洗脱
将吸附后的树脂加入洗脱罐，用质量分数为5％的硫酸铵洗脱树脂常温洗脱2.5小时，重复洗脱一次，合并两次的洗脱液；
(15)醇沉
把合并的两次洗脱液打入醇沉罐，加入温度为零下10℃的无水乙醇，至酒精度为65度，继续搅拌1小时，转速为15HZ，静置1小时；
(16)重相压滤
将醇沉后的物料虹吸上清液，把醇沉重相打入隔膜压滤机开启压滤，至不出液为止，收集压滤饼；
(17)制粒
把收集的压滤饼通过旋转式制粒机进行破碎至粒径为2-3mm，制粒过程中温度小于等于80℃；
(18)脱水
将制粒好的物料投入脱水桶，加入无水乙醇浸没物料，进行脱水，然后进行离心，转速为4000rpm，时间为10min，收集固体物料；
(19)干燥
将脱水后的物体物料转移至沸腾干燥箱内干燥，密封好后，开启进风，待乙醇抽去完成后，开启进风加热，进风温度为45℃，干燥时间为3-5小时，干燥后即得。
2.根据权利要求1所述的一种胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于，所述步骤(1)中解冻间用臭氧进行消毒、解冻架等工器具用热碱水或二氧化氯消毒液消毒。
3.根据权利要求1所述的一种胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于，所述步骤(2)中解冻间用臭氧进行消毒、解冻架等工器具用热碱水或二氧化氯消毒液消毒。
4.根据权利要求1所述的一种胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于，所述步骤(3)中胰脏活化液、碳酸氢钠、乳酸的终浓度(质量浓度)分别为8.5％、0.01％和0.05％。
5.根据权利要求1所述的一种胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于，所述步骤(4)中1号提取罐中，搅拌5min后，缓慢升温5小时，使物料温度升至40℃。
6.根据权利要求1所述的一种胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于，所述步骤(6)中利用夹层热水对2号提取罐内的物料缓慢升温，物料在10小时缓慢升至12℃，物料在12℃条件下保温6小时。
7.根据权利要求1所述的一种胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于，所述步骤(7)中隔膜压滤机中的每秒每平方米滤布的透气量为550L。
8.根据权利要求1所述的一种胰激肽原酶的制备工艺，其特征在于，所述步骤(19)中干燥时间4小时。
9.如权利要求1-8任一制备工艺获得的胰激肽原酶。
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Denomination of invention: A pancreatic kininogenase and its preparation process

Effective date of registration: 20211207

Granted publication date: 20210212

Pledgee: Industrial and Commercial Bank of China Limited Linyi Lanshan sub branch

Pledgor: LINYI XINCHENG JINLUO MEAT PRODUCTS Co.,Ltd.

Registration number: Y2021980014055