CN109824796A - 燕麦麸皮中β-葡聚糖的提取、分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种燕麦麸皮中β‑葡聚糖的提取、分离纯化方法，属于农产品深加工技术领域，其包括以下步骤：粉碎，过筛，收集燕麦麸皮，通过水提法、超声波处理得到燕麦β‑葡聚糖溶液，依次加入纤维素酶，ɑ‑淀粉酶，糖化酶，胰蛋白酶，灭酶处理，过滤、离心收集上清液，膜分离，浓缩(乙醇醇沉法)，脱色，过滤，真空冷冻干燥，得到高纯度燕麦β‑葡聚糖成品；本发明方法可以从燕麦麸皮中分离提取纯度高达90％以上的燕麦β‑葡聚糖，同时燕麦麸皮中β‑葡聚糖的提取率也达到90％以上，从而提高燕麦深加工附加值，做到燕麦麸皮的高值化利用，提高经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及农产品深加工技术领域，尤其涉及一种燕麦麸皮中β-葡聚糖的提取、分离纯化方法。
背景技术
目前,生物医学界普遍认为燕麦β-葡聚糖具有降血糖、清肠、降低胆固醇、提高机体免疫力的四大功能。其中燕麦β-葡聚糖在食品工业中具有多种用途，燕麦β-葡聚糖可以在低能量食品中作为脂肪替代品，在乳制品及饮料中还可以起到良好的增稠效果和乳化作用，还可以作为益生菌发酵的底物。燕麦β-葡聚糖在生物医药、护肤保健等方面也有着广泛的应用,其具有广泛开发和利用前景。
有关燕麦β-葡聚糖提取工艺的研究已有多年的历史,目前采用的提取方法主要有物理法、化学法等方法。物理法主要是通过干磨、筛分、空气分级机技术制备富含β-葡聚搪的燕麦粉。燕麦β-葡聚糖的化学提取法主要有水提法、碱提法和酸提法三种。
目前国内外常用的纯化燕麦β-葡聚糖的方法有透析法、超滤法、酶法、乙醇沉淀结合聚酞胺柱层析纯化、等电点脱蛋白结合溶剂沉淀法等。
在燕麦β-葡聚糖的提取中，蛋白质及淀粉是最常见的伴随杂质，这些杂质的存在将给燕麦β-葡聚糖的分离纯化带来极大的困难。因此在燕麦β-葡聚糖的提取过程中不仅仅要考虑燕麦β-葡聚糖的提取率，同时应尽可能的降低蛋白质及淀粉的溶出率。
公开号为CN 108191992 A的中国专利申请公开了一种从燕麦麸皮中提取燕麦β-葡聚糖的方法，由于未对燕麦β-葡聚糖粗品进行纯化，所得的燕麦β-葡聚糖纯度不理想；
公开号为CN 107082825 A的中国专利申请公开了β-葡聚糖的分离纯化方法，引入了有机溶剂，成本高，不易去除。
公开号为CN 101857646 A的中国专利申请公开了从燕麦麸皮中提取高纯度β-葡聚糖、燕麦全粉的方法，该方法加水搅拌并加入ɑ-淀粉酶进行提取，然后加入糖化酶、戊聚糖酶，果胶酶，中性蛋白酶，灭酶微滤膜过滤，离子交换树脂处理，超滤膜浓缩得到β-葡聚糖，最后得到的β-葡聚糖纯度可达到90-97％以上，但此法的提取工艺较为繁琐，酶的使用较多，温度、pH的调节次数频繁，导致工艺流程复杂，生产成本太高，增加工业化大批量生产的难度
发明内容
本发明的目的就在于提供一种新的燕麦麸皮中β-葡聚糖的提取、分离纯化方法，以解决上述问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种燕麦麸皮中β-葡聚糖的提取、分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)取燕麦粉碎，得到燕麦麸皮；
(2)在燕麦麸皮中加入水,搅拌均匀，调节pH，进行超声处理；
(3)然后在水浴下提取，得到提取液；
(4)静置提取液，然后离心，得到富集有β-葡聚糖的上清液；
(5)在所述上清液中依次分别加入纤维素酶、ɑ-淀粉酶、糖化酶和蛋白酶进行反应；
(6)将步骤(5)反应后的反应液进行灭酶处理；
(7)将步骤(6)中灭酶处理后过滤所得提取液静置，离心，以分离得到β-葡聚糖上清液；
(8)选择截留分子量为10000Da的聚丙烯晴中空纤维膜对步骤(7)离心后的上清液进行膜过滤,除去上清液中的小分子物质,将大分子的β-葡聚糖截留；
(9)浓缩，脱色，干燥，即得粉末状燕麦β-葡聚糖。
作为优选的技术方案：步骤(2)中，燕麦麸皮与水的质量比为1:10-20。
作为优选的技术方案：步骤(2)中,pH为7。
作为优选的技术方案：步骤(2)中，超声功率为400-550W，超声时间为20-30分钟。
作为优选的技术方案：步骤(3)中，水浴温度为50-60℃，提取时间为80-120min。
作为优选的技术方案：步骤(3)中，每间隔20min搅拌3min。
作为优选的技术方案：步骤(5)中，加入的纤维素酶的量，按照每g原料即燕麦麸皮加入30U-80U纤维素酶；加入纤维素酶后的反应温度为55-65℃，反应时间为40-50min。
更进一步优选加入的纤维素酶的量，按照每g原料燕麦麸皮加入50U纤维素酶。除杂更彻底且纤维素酶用量更少。
作为优选的技术方案：步骤(5)中，加入的ɑ-淀粉酶的量，按照每g原料燕麦麸皮加入5U-15Uɑ-淀粉酶；加入ɑ-淀粉酶后的反应温度为55-65℃，反应时间为45-55min。
作为优选的技术方案：步骤(5)中，加入的糖化酶的量，按照每g原料燕麦麸皮加入45U-55U糖化酶；加入糖化酶后的反应温度为55-65℃，反应时间为45-55min。
作为优选的技术方案：步骤(5)中，加入的蛋白酶的量，按照每g原料即燕麦麸皮加入1000U-5000U胰蛋白酶；加入胰蛋白酶后的反应温度为35℃，反应时间为45-55min。
更进一步优选加入的蛋白酶的量，按照每g原料燕麦麸皮加入2000U胰蛋白酶。除杂更彻底且胰蛋白酶用量更少。
作为优选的技术方案：步骤(9)中，按照1：2的比例加入95乙醇进行醇沉，低速离心后弃上清液，沉淀加入一定量的蒸馏水，得到β-葡聚糖浓缩液；然后使用活性碳对所述高浓度β-葡聚糖溶液进行脱色处理；再使用不锈钢滤网对脱色后的高浓度β-葡聚糖溶液进行过滤；最后对过滤液进行真空冷冻干燥，以得到粉末状燕麦β-葡聚糖。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、传统的酸提法会破坏β-葡聚糖的结构，碱提法会使设备升温而不利于工业化生产，而本发明采用水提法提取燕麦麸皮中的β-葡聚糖，条件温和，环保绿色，并且可以保证β-葡聚糖的品质以及分子结构的完整性；
2、使用超声波进行辅助提取，可以有效提高β-葡聚糖提取效率，并且有助于β-葡聚糖的溶出。
3、通过酶法去除燕麦β-葡聚糖粗品中的淀粉、蛋白质等杂质，可以提高燕麦β-葡聚糖纯度，最终得到纯度高达90％以上的燕麦β-葡聚糖；同时，由于酶法具有高度的专一性，可以有效避免β-葡聚糖化学结构被破坏。
4、与高温干燥法相比，真空冷冻干燥法所制备的β-葡聚糖冻干粉具有明显的优势。在冷冻干燥工艺过程中，原料的色泽、质地、口感、营养物质均不会受到破坏，同时产品具有优异的溶解度、便利度、新鲜度，便于保存、运输，真空冷冻干燥还可以提高生产效率，减轻操作人员负担，可以适应工业化大生产的要求，具有生产过程简单，操作控制方便的优势。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
一种燕麦麸皮中β-葡聚糖的提取、分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)称取燕麦，粉碎，使用孔径大小为0.5mm的筛网分离燕麦麸皮和燕麦粉，收集燕麦麸皮；
(2)燕麦麸皮100g，加入1500g蒸馏水,搅拌均匀，调节pH为7.0，超声功率430W，超声时间20分钟；
(3)在55℃水浴下水提100分钟，每隔20分钟均匀搅拌3分钟；
(4)静置提取液30分钟，以7000r/min的转速离心15分钟，得到富集了β-葡聚糖的上清液；
(5)按照原料30U/g的比例加入纤维素酶，在60℃的水浴中反应55分钟；按照原料10U/g的比例加入ɑ-淀粉酶，置于在60℃水浴中，反应50分钟；按照原料50U/g的比例加入糖化酶，置于60℃水浴中，反应50分钟。按照2000U/g的比例加入胰蛋白酶，置于60℃水浴中，反应50分钟；
(6)将反应液置于在沸水浴中进行灭酶处理，反应时间为40分钟；
(7)使用不锈钢滤网对提取液进行过滤，静置提取液30分钟，以2000r/min离心15分钟，以分离得到β-葡聚糖上清液；
(8)选择截留分子量为10000Da的聚丙烯晴中空纤维膜对离心后的清液进行膜过滤,除去清液中的小分子物质,将大分子的β-葡聚糖截留；
(9)先使用薄膜蒸发器对上述截留的β-葡聚糖进行浓缩，得到高浓度β-葡聚糖溶液；然后使用活性碳对所述高浓度β-葡聚糖溶液进行脱色处理；再使用不锈钢滤网对脱色后的高浓度β-葡聚糖溶液进行过滤；最后对过滤液进行真空冷冻干燥，以得到粉末状燕麦β-葡聚糖4.20g。
将所得的燕麦β-葡聚糖进行纯度检测，检测方法为β-Glucan(Mixed linkage)Assay Kit(Megazyme,Ireland)试剂盒检测，具体步骤为：
根据β-Glucan(Mixed linkage)Assay Kit(Megazyme,Ireland)试剂盒说明书，按照其流程对β-葡聚糖含量进行检测，取0.01239g样品进行检测，平行三次,试剂空白调0，510nm检测其吸光度，结果如下：
A1＝1.419，A2＝1.411，A3＝1.404，A(反应空白)＝0.038,A(葡萄糖标准液：1mg/ml)＝1.006
β-葡聚糖1＝ΔA1×(F÷W)×FV×D×0.9＝93.73％
β-葡聚糖2＝93.19％
β-葡聚糖3＝92.72％
β-葡聚糖(平均)＝93.21％
ΔA：A测试-A0
F：100μg葡萄糖÷100μgD-葡萄糖的吸光度
W：待检样品质量mg
FV：最终体积--9.4ml
D：稀释倍数
0.9：β-葡聚糖水解为葡萄糖的转化系数
即测得燕麦β-葡聚糖纯度为93.21％；
采用β-Glucan检测试剂盒方法测得步骤(2)中的燕麦麸皮中β-葡聚糖的含量为4.27％，从而可得β-葡聚糖的得率为91.68％。
实施例2：
一种燕麦麸皮中β-葡聚糖的提取、分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)称取燕麦，粉碎，使用孔径大小为0.3mm的筛网分离燕麦麸皮和燕麦粉，收集燕麦麸皮；
(2)燕麦麸皮100g，加入2000g蒸馏水,搅拌均匀；
(3)在50℃水浴下水提120分钟，每隔20分钟均匀搅拌3分钟，调节pH为7.0，超声功率450W，超声时间20分钟；
(4)静置提取液35分钟，以7000r/min的转速离心15分钟，得到富集了β-葡聚糖的上清液；
(5)按照原料50U/g的比例加入纤维素酶，在60℃的水浴中反应45分钟；按照原料8U/g的比例加入ɑ-淀粉酶，置于在60℃水浴中，反应50分钟；按照原料45U/g的比例加入糖化酶，置于60℃水浴中，反应45分钟。按照1000U/g的比例加入胰蛋白酶，置于60℃水浴中，反应50分钟；
(6)将反应液置于在沸水浴中进行灭酶处理，反应时间为40分钟；
(7)使用不锈钢滤网对提取液进行过滤，静置提取液35分钟，以2000r/min离心15分钟，以分离得到β-葡聚糖上清液；
(8)选择截留分子量为10000Da的聚丙烯晴中空纤维膜对离心后的清液进行膜过滤,除去清液中的小分子物质,将大分子的β-葡聚糖截留；
(9)先使用薄膜蒸发器对上述截留的β-葡聚糖进行浓缩，得到高浓度β-葡聚糖溶液；然后使用活性碳对所述高浓度β-葡聚糖溶液进行脱色处理；再使用不锈钢滤网对脱色后的高浓度β-葡聚糖溶液进行过滤；最后对过滤液进行真空冷冻干燥，以得到粉末状燕麦β-葡聚糖7.09g。
将所得的燕麦β-葡聚糖进行纯度检测，检测方法为β-Glucan(Mixed linkage)Assay Kit(Megazyme,Ireland)试剂盒检测，
具体步骤为：
取0.01041g样品进行检测，平行三次,试剂空白调0，510nm检测其吸光度，结果如下：
A1＝1.19，A2＝1.21，A3＝1.20，A(反应空白)＝0.058,A(葡萄糖标准液：1mg/ml)＝1.006
β-葡聚糖1＝ΔA1×(F÷W)×FV×D×0.9＝91.45％
β-葡聚糖2＝93.06％
β-葡聚糖3＝92.25％
β-葡聚糖(平均)＝92.25％
即其结果为92.25％；
采用β-Glucan检测试剂盒方法测得步骤(2)中的燕麦麸皮中β-葡聚糖的含量为7.21％，从而可得β-葡聚糖的得率为90.71％。
实施例3：
一种燕麦麸皮中β-葡聚糖的提取、分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)称取燕麦，粉碎，使用孔径大小为0.7mm的筛网分离燕麦麸皮和燕麦粉，收集燕麦麸皮；
(2)燕麦麸皮100g，加入1000g蒸馏水,搅拌均匀，调节pH为7.0，超声功率500W，超声时间25分钟；
(3)在60℃水浴下水提80分钟，每隔20分钟均匀搅拌3分钟；
(4)静置提取液25分钟，以1500r/min的转速离心20分钟，得到富集了β-葡聚糖的上清液；
(5)按照原料80U/g的比例加入纤维素酶，在60℃的水浴中反应40分钟；按照原料15U/g的比例加入ɑ-淀粉酶，置于在60℃水浴中，反应60分钟；按照原料55U/g的比例加入糖化酶，置于60℃水浴中，反应50分钟。按照5000U/g的比例加入胰蛋白酶，置于60℃水浴中，反应50分钟；
(6)将反应液置于在沸水浴中进行灭酶处理，反应时间为40分钟；
(7)使用不锈钢滤网对提取液进行过滤，静置提取液30分钟，以2000r/min离心15分钟，以分离得到β-葡聚糖上清液；
(8)选择截留分子量为10000Da的聚丙烯晴中空纤维膜对离心后的清液进行膜过滤,除去清液中的小分子物质,将大分子的β-葡聚糖截留；
(9)先使用薄膜蒸发器对上述截留的β-葡聚糖进行浓缩，得到高浓度β-葡聚糖溶液；然后使用活性碳对所述高浓度β-葡聚糖溶液进行脱色处理；再使用不锈钢滤网对脱色后的高浓度β-葡聚糖溶液进行过滤；最后对过滤液进行真空冷冻干燥，以得到粉末状燕麦β-葡聚糖6.12g。
将所得的燕麦β-葡聚糖进行纯度检测，检测方法为β-Glucan(Mixed linkage)Assay Kit(Megazyme,Ireland)试剂盒检测，
具体步骤为：
取0.009325g样品进行检测，平行三次,试剂空白调0，510nm检测其吸光度，结果如下：
A1＝1.011，A2＝1.014，A3＝1.016，A(反应空白)＝0.002,A(葡萄糖标准液：1mg/ml)＝1.006
β-葡聚糖1＝ΔA1×(F÷W)×FV×D×0.9＝90.99％
β-葡聚糖2＝91.26％
β-葡聚糖3＝91.44％
β-葡聚糖(平均)＝91.23％
即结果为91.23％；
采用β-Glucan检测试剂盒方法测得步骤(2)中的燕麦麸皮中β-葡聚糖的含量为6.08％，从而可得β-葡聚糖的得率为91.83％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种燕麦麸皮中β-葡聚糖的提取、分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取燕麦粉碎，得到燕麦麸皮；
(2)在燕麦麸皮中加入水,搅拌均匀，调节pH，进行超声处理；
(3)然后在水浴下提取，得到提取液；
(4)静置提取液，然后离心，得到富集有β-葡聚糖的上清液；
(5)在所述上清液中依次分别加入纤维素酶、ɑ-淀粉酶、糖化酶和蛋白酶进行反应；
(6)将步骤(5)反应后的反应液进行灭酶处理；
(7)将步骤(6)中灭酶处理后过滤所得提取液静置，离心，以分离得到β-葡聚糖上清液；
(8)选择截留分子量为10000Da的聚丙烯晴中空纤维膜对步骤(7)离心后的上清液进行膜过滤,除去上清液中的小分子物质,将大分子的β-葡聚糖截留；
(9)浓缩，脱色，干燥，即得粉末状燕麦β-葡聚糖。
2.根据权利要求1所述的燕麦麸皮中β-葡聚糖的提取、分离纯化方法，其特征在于：步骤(2)中，燕麦麸皮与水的质量比为1:10-20。
3.根据权利要求1所述的燕麦麸皮中β-葡聚糖的提取、分离纯化方法，其特征在于：步骤(2)中，超声功率为400-500W，超声时间为20-30分钟。
4.根据权利要求1所述的燕麦麸皮中β-葡聚糖的提取、分离纯化方法，其特征在于：步骤(3)中，水浴温度为50-60℃，提取时间为80-120min。
5.根据权利要求1所述的燕麦麸皮中β-葡聚糖的提取、分离纯化方法，其特征在于：步骤(3)中，每间隔20min搅拌3min。
6.根据权利要求1所述的燕麦麸皮中β-葡聚糖的提取、分离纯化方法，其特征在于：步骤(5)中，加入的纤维素酶的量，按照每g原料即燕麦麸皮加入30U-80U纤维素酶；加入纤维素酶后的反应温度为55-65℃，反应时间为40-50min。
7.根据权利要求1所述的燕麦麸皮中β-葡聚糖的提取、分离纯化方法，其特征在于：步骤(5)中，加入的ɑ-淀粉酶的量，按照每g原料即燕麦麸皮加入5U-15Uɑ-淀粉酶；加入ɑ-淀粉酶后的反应温度为55-65℃，反应时间为45-55min。
8.根据权利要求1所述的燕麦麸皮中β-葡聚糖的提取、分离纯化方法，其特征在于：步骤(5)中，加入的糖化酶的量，按照每g原料即燕麦麸皮加入45U-55U糖化酶；加入糖化酶后的反应温度为55-65℃，反应时间为45-55min。
9.根据权利要求1所述的燕麦麸皮中β-葡聚糖的提取、分离纯化方法，其特征在于：步骤(5)中，加入的蛋白酶的量，按照每g原料即燕麦麸皮加入1000U-5000U胰蛋白酶；加入胰蛋白酶后的反应温度为35℃，反应时间为45-55min。
10.根据权利要求1所述的燕麦麸皮中β-葡聚糖的提取、分离纯化方法，其特征在于：步骤(9)中，按照1：2的比例加入95乙醇进行醇沉，低速离心后弃上清液，沉淀加入一定量的蒸馏水，得到β-葡聚糖浓缩液；然后使用活性碳对所述高浓度β-葡聚糖溶液进行脱色处理；再使用不锈钢滤网对脱色后的高浓度β-葡聚糖溶液进行过滤；最后对过滤液进行真空冷冻干燥，以得到粉末状燕麦β-葡聚糖。
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