CN102586213B

CN102586213B - 一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法

Info

Publication number: CN102586213B
Application number: CN201210047823.0A
Authority: CN
Inventors: 韩志萍; 黄茂芳; 李普旺
Original assignee: Agricultural Products Processing Research Institute of CATAS
Current assignee: Agricultural Products Processing Research Institute of CATAS
Priority date: 2012-02-28
Filing date: 2012-02-28
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2032-02-28
Also published as: CN102586213A

Abstract

本发明提供了一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法，包括如下步骤：(1)壳聚糖羧化衍生物的制备；(2)菠萝汁预处理；(3)菠萝蛋白酶的吸附；(4)菠萝蛋白酶的洗脱；(5)菠萝蛋白酶的精制和干燥；本发明的优点在于：(1)所得酶活力高、安全可靠；(2)工艺对超滤膜污染小，同时生产效率高；(3)使菠萝蛋白酶的生产不受菠萝采收期的限制；(4)可以同时得到菠萝蛋白酶和菠萝清汁两种产品；(5)工艺灵活，可选超滤或盐析收集菠萝蛋白酶，使用盐析法时，菠萝蛋白酶溶液的体积只有原菠萝汁的1/20，所用盐量大大减少。

Description

一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法

【技术领域】

本发明涉及菠萝蛋白酶的提取方法，特别涉及一种用壳聚糖羧化衍生物提取果菠萝蛋白酶的方法。

【背景技术】

菠萝蛋白酶(简称菠萝酶)是从菠萝植株中提取的一类多肽水解酶的总称，主要存在于菠萝茎和果实中。根据提取部位的不同，分为茎菠萝蛋白酶(EC3.4.22.32)和果菠萝蛋白酶(EC 3.4.22.33)。从菠萝皮、果中提取的为果菠萝蛋白酶，从菠萝茎中提取的为茎菠萝蛋白酶。本发明是针对果菠萝蛋白酶的分离提取。

菠萝蛋白酶属于巯基蛋白酶，具有很强的水解活性，在食品、生物化学领域有广泛应用。同时，由于其能加强体内纤维蛋白的水解作用，将阻塞于组织的纤维蛋白及血凝块溶解，促进药物对病灶的渗透和扩散，且不破坏凝血所必需的纤维蛋白原，因而在医药领域也有很好的应用前景。目前，受酶活力低和原料供应不稳定的限制，其在医药领域的应用还未完全开发。

目前提取菠萝蛋白酶的方法可归为三类，即：盐析法、有机溶剂沉淀法和超滤法。

盐析法，如张桂香(张桂香，王元秀，矫强，等.盐法提取菠萝蛋白酶的研究.食品工业科技，2004，(6)：103-104.)报道了用(NH₄)₂SO₄沉降提取菠萝蛋白酶的方法。其提取菠萝蛋白酶的工艺步骤为：菠萝皮-清洗-榨汁-过滤-收集滤液-加苯甲酸钠-10℃加白陶土-吸附沉降-收集沉淀物-复溶-加(NH₄)₂SO₄-洗脱-粗酶液-调节pH-精酶液。简化的盐析法在小型企业中比较常见，具体步骤为：菠萝皮-清洗-榨汁-过滤-收集滤液-加(NH₄)₂SO₄-收集沉淀-干燥。盐析法所得酶的活力低，盐使用量多、如(NH₄)₂SO₄的添加量一般为菠萝汁体积的20-25％，(NH₄)₂SO₄不易回收，菠萝汁也不能回用，工艺比较落后。

有机溶剂沉淀法，如中国专利CN101696404A提供了一种通过有机溶剂沉降来提取菠萝蛋白酶的方法。菠萝经清洗榨汁后，滤液用聚丙烯酸吸附沉降，沉淀物用醋酸钙溶液处理，使菠萝蛋白酶游离出来，得到菠萝蛋白酶粗酶液，再经透析、冷冻干燥后，得到菠萝蛋白酶干粉。这种方法操作简单、快速、高效、分离量大、聚丙烯酸原料来源广泛，但实际操作中，聚丙烯酸受其单体制备方法的影响，其中常残留丙烯酰胺，这是一种有毒有害成分，在食品等行业中是限制使用的，且聚丙烯酸具有成膜性，能快速地在溶液中形成分子膜，阻碍透析的进行，不利于菠萝蛋白酶的纯化。

超滤法，如中国专利CN1908165A提供了一种超滤法提取菠萝蛋白酶的方法。它包括以下步骤：原料-清洗-粗粉碎-细粉碎-预处理-榨汁-离心-冷冻-过滤-超滤-干燥-成品，该工艺依靠先进分离提取手段，所用人工较少，酶活力也较高，缺点是菠萝汁不经去糖、去杂碎细胞处理，直接超滤，超滤膜易被污染，每次使用前后都要进行清洗，清洗时间超过生产时间，而且重复使用效果差，需频繁更换膜块，生产成本较高。

因此，目前还需要提供一种提取菠萝蛋白酶的方法，该方法能够解决盐析法、有机溶剂沉淀法和超滤法提取菠萝蛋白酶存在的不足。

【发明内容】

本发明的目的在于提供一种原料是纯天然产物、无毒无害、来源广泛，工艺操作简便、生产效率高，产品纯度好、活力高的菠萝蛋白酶的提取方法。

具体地说，本发明提供了一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法。

该方法包括如下步骤：

(1)壳聚糖羧化衍生物的制备；(2)菠萝汁预处理；(3)菠萝蛋白酶的吸附；(4)菠萝蛋白酶的洗脱；(5)菠萝蛋白酶的精制和干燥。

该方法可以同时得到菠萝蛋白酶和菠萝汁两种产品，二者的生产互不干涉，且菠萝汁透明澄清，无需离心等处理，可直接回收再利用.

本发明的具体实施方案如下：

(1)壳聚糖羧化衍生物的制备：称取适量的壳聚糖溶胀在异丁醇中，制成一定浓度的悬浮液，边搅拌边向其中加入适量的饱和NaOH溶液，加完后在室温下继续搅拌30分钟，得到壳聚糖原料溶液，将该溶液置于一定温度下的水浴中，边缓慢搅拌边向其中加入适量的固体氯乙酸，反应一定的时间后，过滤，收集沉淀物，用乙醇反复洗涤后，在适当的温度下烘干，得到壳聚糖羧化衍生物；

(2)菠萝汁预处理：将菠萝果皮清洗后榨汁，过滤除去大颗粒杂质后，测量滤液体积，然后将其置于适当温度下的冷藏罐中，向其中加入适量的粉末NaHSO₃、半胱氨酸和EDTA(乙二胺四乙酸)，缓慢搅拌均匀；

(3)菠萝蛋白酶的吸附：称取适量的步骤(1)所得的壳聚糖羧化衍生物，用少量菠萝汁溶解，缓慢搅拌步骤(2)所得菠萝汁，向其中均匀加入溶解后的壳聚糖羧化衍生物，加完后继续搅拌5分钟，然后静置，直到上层溶液十分清澈；回收上清液，即是澄清的菠萝汁，可直接利用，取下层溶液，在3000rpm条件下，离心10分钟，收集沉淀物，得到菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物；

(4)菠萝蛋白酶的洗脱：配制适量的一定浓度和pH的NaHCO₃溶液，将步骤(3)得到的复合物溶于NaHCO₃溶液中，用饱和Na₂CO₃溶液调节pH至一定的范围，再向其中加入适量的一定浓度的CaCl₂溶液，搅拌均匀后静置一定的时间，然后在3000rpm条件下，离心10分钟，收集上清液，得到菠萝蛋白酶溶液；

(5)菠萝蛋白酶的精制和干燥：配制一定浓度和pH的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，用其将步骤(4)所得的菠萝蛋白酶溶液稀释一定的倍数，在一定的温度条件下，先由分子截留量为100K的超滤除去大分子杂质，再经分子截留量为10K的超滤浓缩一定的倍数，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得干酶粉；或将步骤(4)所得菠萝蛋白酶溶液，经盐析收集蛋白酶，盐析时，将菠萝蛋白酶溶液置于一定的温度下，调节溶液pH值至一定的范围，边缓慢搅拌边向其中均匀地加入适量粉末(NH₄)₂SO₄，然后静置一定的时间，取下层溶液，在3000rpm的条件下，离心10分钟，收集沉淀物，真空冷冻干燥，得干酶粉。

本发明所述的用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法，作为步骤(1)，所述的壳聚糖异丁醇悬浮液的浓度，可优选的以质量浓度计为0.8～1.1％，最优选的为1％；所述饱和NaOH溶液的用量，可优选的是其溶质质量为壳聚糖的0.65～0.80倍，最优选的为0.75倍；所述的固体氯乙酸的用量，可优选的为壳聚糖质量的1.1～1.3倍，最优选的为1.2倍；所述的反应温度，可优选的为65～75℃，最优选的为70℃；所述的反应时间，可优选的是2.5～3.0小时，最优选的为2.7小时；所述的烘干温度，可优选的为60～70℃，最优选的为65℃。作为步骤(2)，所述的滤液置于的温度，可优选的为8～14℃，最优选的为11℃；所述的单位体积菠萝汁中粉末NaHSO₃的加入量，可优选的为3×10^-4～4×10^-4g/L，最优选的为3.5×10^-4g/L；所述的单位体积菠萝汁中粉末半胱氨酸的加入量，可优选的为5.5×10^-5～6.5×10^-5g/L，最优选的6.0×10^-5g/L；所述的单位体积菠萝汁中粉末EDTA(乙二胺四乙酸)的加入量，可优选为4.5×10^-4～5.5×10^-4g/L，最优选的为5.0×10^-4g/L。作为步骤(3)，所述的单位体积菠萝汁中壳聚糖羧化衍生物的加入量，可优选的为1～3.5g/L，最优选的为2.5g/L。作为步骤(4)，所述的NaHCO₃溶液的浓度，可优选的为0.05～0.12mol/L，最优选的为0.10mol/L；所述的NaHCO₃溶液的pH值，可优选的为7.8～8.5，最优选的为8.0；所述的NaHCO₃溶液的用量，可优选的以质量计为菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物的7.5～9倍，最优选的为8倍；所述的用饱和Na₂CO₃溶液调节壳聚糖-羧化衍生物复合物复溶后的溶液的pH值，可优选的为6.5～7.0，最优选的为6.8；所述的CaCl₂溶液的浓度，可优选的以质量浓度计为5.0～7.0％，最优选的为5.5％所述的CaCl₂溶液的用量，可优选的为每千克菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物加入CaCl₂溶液0.5～0.75L，最优选的为0.64L；所述的加入CaCl₂后静置一定的时间，可优选的为10～20分钟，最优选的为12分钟。作为步骤(5)所述的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液的浓度，可优选的为0.03～0.07mol/L，最优选的为0.05mol/L；所述的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液的pH值，可优选的为6.5～7.0，最优选的为6.8；所述的菠萝蛋白酶溶液的稀释倍数，可优选的为4～8倍，最优选的为5倍；所述的超滤过程的控制温度，可优选的为8～14℃，最优选的为11℃；所述的超滤的浓缩倍数，可优选的为4～6倍，最优选的为5倍；所述的盐析过程控制温度，可优选的为12～18℃，最优选的为15℃；所述的盐析时，溶液pH值调节至一定的范围，可优选的为4～5，最优选的为4.5；所述的粉末(NH₄)₂SO₄的用量，可优选的以质量-体积百分浓度计为18～25％，最优选的为20％；所述的(NH₄)₂SO₄加完后，静置一定的时间，可优选的为8～16小时，最优选的为12小时。

因此，本发明所述的用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法，优选采用如下实施方案：

(1)壳聚糖羧化衍生物的制备：称取适量的壳聚糖溶胀在异丁醇中，制成质量浓度为0.8～1.1％的悬浮液，边搅拌边向其中加入含有溶质质量是壳聚糖0.65～0.80倍的饱和NaOH溶液，加完后在室温下继续搅拌30分钟，得到壳聚糖原料溶液；将该溶液置于65～75℃水浴中，边缓慢搅拌边向其中加入质量是壳聚糖1.1～1.3倍的固体氯乙酸，反应2.5～3.0小时后，过滤，收集沉淀物，用乙醇反复洗涤后，在60～70℃下烘干，得到壳聚糖羧化衍生物。

(2)菠萝汁预处理：将菠萝果皮清洗后榨汁，过滤除去大颗粒杂质后，测量滤液体积，然后将其置于8～14℃的冷藏罐中，向其中加入粉末NaHSO₃、半胱氨酸和EDTA(乙二胺四乙酸)，单位体积菠萝汁中的加入量分别为3×10^-4～4×10^-4g/L、5.5×10^-5～6.5×10^-5g/L和4.5×10^-4～5.5×10^-4g/L，缓慢搅拌均匀。

(3)菠萝蛋白酶的吸附：按照单位体积菠萝汁中壳聚糖羧化衍生物的用量1～3.5g/L，称取步骤(1)所得的壳聚糖羧化衍生物，称好后用少量菠萝汁溶解，缓慢搅拌步骤(2)中所得菠萝汁，向其中均匀地加入溶解后的壳聚糖羧化衍生物，加完后继续搅拌5分钟，然后静置，直到上层溶液十分清澈。回收上清液，即是澄清的菠萝汁，可直接利用，取下层溶液，在3000rpm条件下，离心10分钟，收集沉淀物，得到菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物。

(4)菠萝蛋白酶的洗脱：配制浓度为0.05～0.12mol/L、pH7.8～8.5的NaHCO₃溶液，使其质量为菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物的7.5～9倍，将步骤(3)所得的复合物溶于NaHCO₃溶液中，用饱和Na₂CO₃溶液调节pH至6.5～7.0范围内，然后向其中加入质量浓度为5.0～7.0％的CaCl₂溶液，加入量为每千克菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物0.5～0.75L，搅拌均匀后静置10～20分钟，在3000rpm条件下，离心10分钟，收集上清液，得到菠萝蛋白酶溶液。

(5)菠萝蛋白酶的精制和干燥：配制浓度为0.03～0.07mol/L、pH值为6.5～7.0的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，用其将步骤(4)所得的菠萝蛋白酶溶液稀释4～8倍，8～14℃的条件下，先由分子截留量为100K的超滤除去大分子杂质，再经分子截留量为10K的超滤浓缩4～6倍，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得干酶粉；或将步骤(4)所得菠萝蛋白酶溶液，经盐析收集蛋白酶，盐析时，将菠萝蛋白酶溶液置于12～18℃的温度下，调节溶液pH值至4～5，然后边缓慢搅拌边均匀地加入粉末(NH₄)₂SO₄，其用量以质量-体积百分浓度计为18～25％，静置8～16小时，取下层溶液，在3000rpm的条件下，离心10分钟，收集沉淀物，真空冷冻干燥，得干酶粉。

本发明的技术关键点在于：

(1)甲壳素是虾、蟹和昆虫等外壳的重要成分，其脱乙酰基后得到壳聚糖。壳聚糖学名聚脱乙酰氨基葡萄糖，是一种高分子多糖，也是良好的阳离子絮凝剂。壳聚糖是天然产物，安全无毒，无刺激、无热源，可溶于水或弱酸，对化合物有良好的吸附和离子交换性能。改性后的壳聚糖，由图1可以看出，在1400cm^-1波长处有明显的特征峰，说明羧基已经链接到壳聚糖的分子链中，其不仅可增强壳聚糖的水溶性，而且可与菠萝蛋白酶的氨基结合，形成菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物。

(2)用壳聚糖羧化衍生物吸附菠萝蛋白酶时，单位菠萝汁中加入的壳聚糖羧化衍生物不能超过3.5g/L，否则将对菠萝蛋白酶起到分散的作用。

(3)菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物溶于NaHCO₃溶液后，溶液的pH值须在6.5～7.0范围内，若超出此范围，则用饱和Na₂CO₃溶液调节，否则会影响壳聚糖羧化衍生物的洗脱效果。

本发明用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法，具有如下优点：

(1)壳聚糖是天然产物，安全无毒，无刺激、无热源，具有良好的水溶性、吸附性，非常适合具有热敏性的菠萝蛋白酶的提取，所得酶纯度好、活力高、安全可靠；

(2)经过吸附沉降、洗脱和pH调节后，菠萝蛋白酶溶液中只含微量的糖分和胶质，超滤提纯和浓缩时，对滤膜污染小、通量大，膜块使用寿命长、生产效率高；

(3)经壳聚糖羧化衍生物吸附沉降后，每吨菠萝汁可产菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物约8kg，该复合物可冷冻保存6个月，因而在收获季节可大量进行沉降处理，待到菠萝淡季时，再行提酶，可大大提高产值；

(4)可以同时得到菠萝蛋白酶和菠萝清汁两种产品；

(5)完成上述步骤(4)后，可由超滤法或盐析法收集菠萝蛋白酶，若用盐析法，菠萝蛋白酶溶液的体积只有原菠萝汁的1/20，所用盐量大大减少，又可节约超滤设备的投入，适合小型企业生产。

【附图说明】

图1为壳聚糖及其羧化衍生物的红外图谱，改性后的壳聚糖在1400cm^-1波长处有明显的特征峰，说明羧基已经链接到壳聚糖的分子链中。

【具体实施方式】

实施例1(超滤收集菠萝蛋白酶)

(1)将质量为100g的壳聚糖溶胀在异丁醇中，制成质量浓度为0.8％的悬浮液，边搅拌边向其中加入含65g溶质的饱和NaOH溶液，加完后在室温下继续搅拌30分钟，得到壳聚糖原料溶液；将该溶液置于65℃水浴中，边缓慢搅拌边向其中加入固体氯乙酸110g，反应2.5小时后，过滤，收集沉淀物，用乙醇反复洗涤后，在60℃下烘干，得到壳聚糖羧化衍生物。

(2)称取20kg菠萝果皮，清洗后压榨，过滤除去大颗粒杂质后，得菠萝汁11L，将其置于8℃的冷藏罐中，向其中加入粉末NaHSO₃0.0033g、半胱氨酸0.0006g、EDTA(乙二胺四乙酸)0.0049g，缓慢搅拌均匀。

(3)取步骤(1)所得的壳聚糖羧化衍生物11g，用少量菠萝汁溶解，缓慢搅拌步骤(2)中所得菠萝汁，向其中均匀加入溶解后的壳聚糖羧化衍生物，加完后继续搅拌5分钟，然后静置，直到上层溶液十分清澈，回收上清液，得澄清的菠萝汁9.3L，取下层溶液，在3000rpm的条件下，离心10分钟，收集沉淀物，得到菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物85g。

(4)配制0.05mol/L pH 7.8的NaHCO₃溶液640mL，将步骤(3)所得的菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物溶于其中，用饱和Na₂CO₃溶液调节pH至6.5，再向其中加入质量浓度为5％的CaCl₂溶液43mL，搅拌均匀后静置10分钟，在3000rpm的条件下，离心10分钟，收集上清液，得到菠萝蛋白酶溶液710mL。

(5)制备0.03mol/L pH 6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液3.2L，用其将步骤(4)所得的菠萝蛋白酶溶液稀释，8℃的条件下，先后经分子截留量为100K和10K的膜进行超滤，待其体积减少到约0.8L时，停止超滤，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得到干酶粉9g，经测其酶活力为1.72×10⁶U/g。

实施例2(超滤收集菠萝蛋白酶)

(1)将质量为100g的壳聚糖溶胀在异丁醇中，制成质量浓度为1.1％的悬浮液，边搅拌边向其中加入含80g溶质的饱和NaOH溶液，加完后在室温下继续搅拌30分钟，得到壳聚糖原料溶液。将该溶液置于75℃水浴中，边缓慢搅拌边向其中加入固体氯乙酸130g，反应3.0小时后，过滤，收集沉淀物，用乙醇反复洗涤后，在70℃下烘干，得到壳聚糖羧化衍生物。

(2)称取30kg菠萝果皮，清洗后压榨，过滤除去大颗粒杂质后，得菠萝汁16L，将其置于14℃的冷藏罐中，向其中加入粉末NaHSO₃0.0064g、半胱氨酸0.0010g、EDTA 0.0088g，缓慢搅拌均匀。

(3)取步骤(1)所得的壳聚糖羧化衍生物56g，用少量菠萝汁溶解，缓慢搅拌步骤(2)中所得菠萝汁，向其中均匀加入溶解后的壳聚糖羧化衍生物，加完后继续搅拌5分钟，然后静置，直到上层溶液十分清澈，回收上清液，得澄清的菠萝汁12.6L，取下层溶液，在3000rpm的条件下，离心10分钟，收集沉淀物，得到菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物134g。

(4)取0.12mol/L pH 8.5的NaHCO₃溶液1200mL，将步骤(3)所得的菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物溶于其中，用饱和Na₂CO₃溶液调节pH至7.0，再向其中加入质量浓度为7％的CaCl₂溶液100mL，搅拌均匀后静置20分钟，在3000rpm的条件下，离心10分钟，收集上清液，得到菠萝蛋白酶溶液1340mL。

(5)制备0.07mol/L pH 7.0的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液9.1L，用其将步骤(4)所得的菠萝蛋白酶溶液稀释，14℃的条件下，先后经分子截留量为100K和10K的膜进行超滤，待其体积减少到约1.5L时，停止超滤，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得到干酶粉18g，经测其酶活力为1.85×10⁶U/g。

实施例3(超滤收集菠萝蛋白酶)

(1)将质量为100g的壳聚糖溶胀在异丁醇中，制成质量浓度为0.9％的悬浮液，边搅拌边向其中加入含70g溶质的饱和NaOH溶液，加完后在室温下继续搅拌30分钟，得到壳聚糖原料溶液。将该溶液置于70℃水浴中，向其中缓慢搅拌加入固体氯乙酸120g，反应2.8小时后，过滤，收集沉淀物，用乙醇反复洗涤后，在65℃下烘干，得到壳聚糖羧化衍生物。

(2)称取50kg菠萝果皮，清洗后压榨，过滤除去大颗粒杂质后，得菠萝汁28L，将其置于10℃的冷藏罐中，向其中加入粉末NaHSO₃0.0098g、半胱氨酸0.0017g、EDTA 0.014g，缓慢搅拌均匀。

(3)取步骤(1)所得的壳聚糖羧化衍生物76g，用少量菠萝汁溶解，缓慢搅拌步骤(2)中所得菠萝汁，向其中均匀加入溶解后的壳聚糖羧化衍生物，加完后继续搅拌5分钟，然后静置，直到上层溶液十分清澈，回收上清液，得澄清的菠萝汁25.2L，取下层溶液，在3000rpm的条件下，离心10分钟，收集沉淀物，得到菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物220g。

(4)取0.08mol/L pH 8.2的NaHCO₃溶液1800mL，将步骤(3)所得的菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物溶于其中，用饱和Na₂CO₃溶液调节pH至6.8，再向其中加入质量浓度为6％的CaCl₂溶液135mL，搅拌均匀后静置15分钟，在3000rpm的条件下，离心10分钟，收集上清液，得到菠萝蛋白酶溶液1960mL。

(5)制备0.05mol/L pH 6.8的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液12L，用其将步骤(4)所得的菠萝蛋白酶溶液稀释，10℃的条件下，先后经分子截留量为100K和10K的膜进行超滤，待其体积减少到约2.4L时，停止超滤，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得到干酶粉39g，经测其酶活力为2.25×10⁶U/g。

实施例4(超滤收集菠萝蛋白酶)

(1)将质量为100g的壳聚糖溶胀在异丁醇中，制成质量浓度为1.0％的悬浮液，边搅拌边向其中加入含75g溶质的饱和NaOH溶液，加完后在室温下继续搅拌30分钟，得到壳聚糖原料溶液。将该溶液置于70℃水浴中，边缓慢搅拌边向其中加入固体氯乙酸120g，反应2.7小时后，过滤，收集沉淀物，用乙醇反复洗涤后，在65℃下烘干，得到壳聚糖羧化衍生物。

(2)称取40kg菠萝果皮，清洗后压榨，过滤除去大颗粒杂质后，得菠萝汁24L，将其置于11℃的冷藏罐中，向其中加入粉末NaHSO₃0.0085g、半胱氨酸0.0014g、EDTA 0.012g，缓慢搅拌均匀。

(3)取步骤(1)所得的壳聚糖羧化衍生物60g，用少量菠萝汁溶解，缓慢搅拌步骤(2)中所得菠萝汁，向其中均匀加入溶解后的壳聚糖羧化衍生物，加完后继续搅拌5分钟，然后静置，直到上层溶液十分清澈，回收上清液，得澄清的菠萝汁21.2L，取下层溶液，在3000rpm的条件下，离心10分钟，收集沉淀物，得到菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物203g。

(4)取0.10mol/L pH 8.0的NaHCO₃溶液1620mL，将步骤(3)所得的菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物溶于其中，用饱和Na₂CO₃溶液调节pH至6.8，再向其中加入质量浓度为5.5％的CaCl₂溶液130mL，搅拌均匀后静置12分钟，在3000rpm的条件下，离心10分钟，收集上清液，得到菠萝蛋白酶溶液1800mL。

(5)制备0.05mol/L pH 6.8的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液9L，用其将步骤(4)所得的菠萝蛋白酶溶液稀释，11℃的条件下，先后经分子截留量为100K和10K的膜进行超滤，待其体积减少到约1.8L时，停止超滤，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得到干酶粉43g，经测其酶活力为3.12×10⁶U/g。

实施例5(盐析收集菠萝蛋白酶)

(1)将质量为100g的壳聚糖溶胀在异丁醇中，制成质量浓度为1.0％的悬浮液，边搅拌边向其中加入含75g溶质的饱和NaOH溶液，加完后在室温下继续搅拌30分钟，得到壳聚糖原料溶液。将该溶液置于70℃水浴中，向其中缓慢搅拌加入固体氯乙酸210g，反应2.7小时后，过滤，收集沉淀物，用乙醇反复洗涤后，在65℃下烘干，得到壳聚糖羧化衍生物。

(5)将步骤(4)所得的菠萝蛋白酶溶液置于15℃的温度下，调节溶液pH至4.5，边缓慢搅拌边均匀地加入粉末(NH₄)₂SO₄360g，然后静置12小时，取下层溶液，在3000rpm的条件下，离心10分钟，收集沉淀物，真空冷冻干燥，得干酶粉46g，经测其酶活力为1.41×10⁶U/g。

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Claims

1.一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)壳聚糖羧化衍生物的制备：称取适量的壳聚糖溶胀在异丁醇中，制成一定浓度的悬浮液，边搅拌边向其中加入适量的饱和NaOH溶液，加完后在室温下继续搅拌30分钟，得到壳聚糖原料溶液，将该溶液置于一定温度下的水浴中，边缓慢搅拌边向其中加入适量的固体氯乙酸，反应一定的时间后，过滤，收集沉淀物，用乙醇反复洗涤后，在适当的温度下烘干，得到壳聚糖羧化衍生物；所述的壳聚糖异丁醇悬浮液的质量浓度在0.8～1.1%的范围内；固体NaOH的用量在壳聚糖质量的0.65～0.80倍的范围内，使用前配制成饱和溶液；固体氯乙酸的用量在壳聚糖质量的1.1～1.3倍的范围内；反应温度在65～75℃的范围内；反应时间在2.5～3.0小时的范围内；烘干温度在60～70℃的范围内；

(2)菠萝汁预处理：将菠萝果皮清洗后榨汁，过滤除去大颗粒杂质后，测量滤液体积，然后将其置于适当温度下的冷藏罐中，向其中加入适量的粉末NaHSO₃、半胱氨酸和EDTA（乙二胺四乙酸），缓慢搅拌均匀；所述的菠萝汁预处理，过滤后的菠萝汁需置于8～14℃的冷藏罐中，单位体积菠萝汁中粉末NaHSO₃、半胱氨酸和EDTA（乙二胺四乙酸）的加入量分别在3×10^-4～4×10^-4g/L、5.5×10^-5～6.5×10^-5g/L和4.5×10^-4～5.5×10^-4g/L的范围内；

(3)菠萝蛋白酶的吸附：称取适量的步骤(1)所得的壳聚糖羧化衍生物，用少量菠萝汁溶解，缓慢搅拌步骤(2)所得菠萝汁，向其中均匀加入溶解后的壳聚糖羧化衍生物，加完后继续搅拌5分钟，然后静置，直到上层溶液十分清澈，回收上清液，即是澄清的菠萝汁，可直接利用，取下层溶液，在3000rpm条件下，离心10分钟，收集沉淀物，得到菠萝蛋白酶－壳聚糖羧化衍生物复合物；所述的单位体积菠萝汁中壳聚糖羧化衍生物的加入量在1～3.5g/L的范围内；

(4)壳聚糖羧化衍生物的洗脱：配制适量的一定浓度和pH的NaHCO₃溶液，将步骤(3)得到的复合物溶于NaHCO₃溶液中，用饱和Na₂CO₃溶液调节pH至一定的范围，再向其中加入适量的一定浓度的CaCl₂溶液，搅拌均匀后静置一定的时间，然后在3000rpm条件下，离心10分钟，收集上清液，得到菠萝蛋白酶溶液；所述的NaHCO₃溶液的浓度在0.05～0.12mol/L的范围内，NaHCO₃溶液的pH值在7.8～8.5的范围内，NaHCO₃溶液的用量以质量计为菠萝酶－壳聚糖羧化衍生物复合物的7.5～9倍的范围内，用饱和Na₂CO₃溶液调节壳聚糖－羧化衍生物复合物复溶后的溶液的pH值在6.5～7.0的范围内，CaCl₂溶液的质量浓度在5.0～7.0%的范围内，CaCl₂溶液的用量在每千克菠萝酶－壳聚糖羧化衍生物复合物加入CaCl₂溶液0.5～0.75L的范围内，加入CaCl₂溶液后需静置的时间在10～20分钟的范围内；

(5)菠萝蛋白酶的精制和干燥：配制一定浓度和pH的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，用其将步骤(4)所得的菠萝蛋白酶溶液稀释一定的倍数，在一定的温度条件下，先由分子截留量为100K的超滤除去大分子杂质，再经分子截留量为10K的超滤浓缩一定的倍数，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得干酶粉；或将步骤(4)所得菠萝蛋白酶溶液，经盐析收集蛋白酶，盐析时，将菠萝蛋白酶溶液置于一定的温度下，调节溶液pH至一定的范围，边缓慢搅拌边向其中均匀地加入适量粉末(NH₄)₂SO₄，然后静置一定的时间，取下层溶液，在3000rpm的条件下，离心10分钟，收集沉淀物，真空冷冻干燥，得干酶粉；所述的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液的浓度在0.03～0.07mol/L的范围内，Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液的pH值在6.5～7.0范围内，菠萝蛋白酶溶液的稀释倍数在4～8倍的范围内，超滤过程的控制温度在8～14℃的范围内，超滤的浓缩倍数在4～6倍的范围内；所述的将步骤(4)所得菠萝蛋白酶溶液，经盐析收集蛋白酶，盐析过程控制温度为12～18℃，溶液pH值调节至4～5，盐析时粉末(NH₄)₂SO₄的用量以质量-体积百分浓度计在18～25%的范围内，加完后静置的时间在8～16小时的范围内。