CN103805697B - 一种可用于快速鉴定微生物全基因组基因功能的方法 - Google Patents

一种可用于快速鉴定微生物全基因组基因功能的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开的一种可用于快速鉴定微生物全基因组基因功能的方法，其包括如下步骤：（1）混合DNA的制备步骤；（2）特异引物的合成步骤；（3）特异引物扩增步骤；（4）测序引物插入步骤；（5）按照常规高通量测序的后续步骤进行测序。通过生物信息分析，发现得到的突变体密度是平均每17个碱基就有一个转座子插入，插入密度可以覆盖整个基因组中所有编码基因，由此证明利用本发明的方法可以非常快速有效的在全基因组层面鉴定基因功能。

Description

一种可用于快速鉴定微生物全基因组基因功能的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中应用于全基因组基因功能鉴定的方法，特别涉及一种可用于快速鉴定微生物全基因组基因功能的方法。
背景技术
传统意义鉴定基因功能方法是通过正向遗传学，找到单个基因功能缺失的突变体，然后通过分子遗传学的方法找到该突变基因所在区域。这种方法缺点是一次只能找到一个突变基因，不能全基因组层面鉴定，比较耗费人力、物力和时间，效率较低。
目前，随着高通量测序技术的进步，业界已经可以利用高通量测序技术将基因组，特别小基因组，例如病原微生物基因组的结构完整解析。但即使是病原微生物，也至少编码数千个基因，这些基因分别具有什么功能，哪些基因是微生物繁殖、生长、传播、侵染所必须的，这些问题仅仅通过基因组结构和序列的解析无法有效回答。
本发明正是基于上述情况，通过创建一种有效的方法学，要达到既能够大规模，快速地在全基因组层面来分析，同时又需要对每个基因的功能做出探索。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对鉴定微生物全基因组基因功能的方法存在的不足而提供一种可用于快速鉴定微生物全基因组基因功能的方法。
本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：
一种可用于快速鉴定微生物全基因组基因功能的方法，包括如下步骤：
(1)混合DNA的制备步骤
用病原微生物菌株作为载体，利用Tn转座子可以随机插入微生物基因组的特性，培养一批不同插入密度的细菌突变体菌体，在达到一定生长曲线后，将所有突变菌株DNA释放出来，这时，释放的DNA为各种不同突变菌株的混合DNA；
(2)特异引物的合成步骤
将步骤(1)得到的混合DNA进行片段化处理，所述片段化处理是取长度在300-800bp的末端突出的DNA片段；然后将所有片段化DNA连接一DNA粘端接头，该DNA粘端接头的5’端为Y型分叉，其序列式分别为：
5-ACACTCTATCGCTACACGACGCTCTTCCCTAC*T-3；
5-GTAGGGAAGAGCTCGTATGCCCTCTTCTGATTG-3；
在DNA片段两端分别连接上不同的DNA粘端接头后，合成特异引物，该特异引物含有与DNA粘端接头退火的5‘端，又含有Tn转座子插入基因组DNA的最旁界的序列的3’端，其序列式为：
5-ACACTCTATCGCTACACGACGCTCTTCCCTACTGTTACCAGGTCACAACCAAT-3
(3)特异引物扩增步骤
用步骤(2)制备的特异引物与DNA粘端接头的3‘端引物序列进行PCR扩增，富集出来的DNA片段是含有转座子插入基因组的边界序列和基因组DNA序列；
(4)测序引物插入步骤
将测序引物位于Tn插入基因组边界的13个bp，这样测序得到的序列是转座子边界13bp序列和插入基因组DNA的所有序列信息；
(5)按照常规高通量测序的后续步骤进行测序。
通过生物信息分析，发现得到的突变体密度是平均每17个碱基就有一个转座子插入，插入密度可以覆盖整个基因组中所有编码基因，由此证明利用本发明的方法可以非常快速有效的在全基因组层面鉴定基因功能。
附图说明
图1为本发明可用于快速鉴定微生物全基因组基因功能的方法流程示意图。
图2为本发明的突变菌株混合DNA检测图。
图3为本发明的混合DNA片段化处理后长度分布图。
图4为本发明建库后DNA片段分布图。
图5为本发明数据分析使用该方法后，可以鉴定出得突变基因在基因组中的分布密度示意图。X轴代表基因组的坐标位置，从第1个碱基到第5000000个碱基，Y轴代表可以检测到Tn插入的丰度。
具体实施方式
一种可用于快速鉴定微生物全基因组基因功能的方法，包括如下步骤：
(1)混合DNA的制备步骤
用病原微生物菌株作为载体，利用Tn转座子可以随机插入微生物基因组的特性，培养一批不同插入密度的细菌突变体菌体，在达到一定生长曲线后，将所有突变菌株DNA释放出来，这时，释放的DNA为各种不同突变菌株的混合DNA；
(2)特异引物的合成步骤
将步骤(1)得到的混合DNA进行片段化处理，所述片段化处理是取长度在300-800bp的末端突出的DNA片段；然后将所有片段化DNA连接一DNA粘端接头，该DNA粘端接头的5’端为Y型分叉，其序列式分别为：
5-ACACTCTATCGCTACACGACGCTCTTCCCTAC*T-3；
5-GTAGGGAAGAGCTCGTATGCCCTCTTCTGATTG-3；
在DNA片段两端分别连接上不同的DNA粘端接头后，合成特异引物，该特异引物含有与DNA粘端接头退火的5‘端，又含有Tn转座子插入基因组DNA的最旁界的序列的3’端，其序列式为：
5-ACACTCTATCGCTACACGACGCTCTTCCCTACTGTTACCAGGTCACAACCAAT-3
(3)特异引物扩增步骤
用步骤(2)制备的特异引物与DNA粘端接头的3‘端引物序列进行PCR扩增，富集出来的DNA片段是含有转座子插入基因组的边界序列和基因组DNA序列；
(4)测序引物插入步骤
将测序引物位于Tn插入基因组边界的13个bp，这样测序得到的序列是转座子边界13bp序列和插入基因组DNA的所有序列信息；
(5)按照常规高通量测序的后续步骤进行测序。
下面给出一个具体实施例来说明本发明。
DNA出发量为1ug左右，使用Y型接头，在43.5ul连接体系中，加入6.5ulDNA粘端接头，加接头纯化后的PCR扩增体系如表1所示：
表1
纯化(去除200bp以下DNA片段)
1.将XP(Beckman，美国)磁珠重悬混匀；
2.按照磁珠/DNA溶液体积比为0.8/1的比例，将40ul磁珠加入到50ul的library中混匀，室温静置5min；
3.置于磁力架DynaMagTM-SpinMagnet(life，美国)上5min至溶液澄清，离心管保持在磁力架上，吸出上清；
4.离心管保持在磁力架上，加入80％乙醇静置30sec，吸取乙醇；
5.重复步骤4，吸净乙醇；
6.在磁力架上静置5min晾干，从磁力架上取下离心管；
7.加53ul去离子水重悬磁珠，室温静置2min，置磁力架上5min至溶液澄清，小心吸取50ul上清至新离心管；
8.重复步骤1～6；
9.加33ul去离子水重悬磁珠，室温静置2min，置磁力架上5min至溶液澄清，小心吸取30ul上清至新离心管；
10.Onedrop定量纯化后文库浓度，然后用AgilentHighSensitivityDNAchip检测文库片段大小。

Claims (1)

1.一种可用于快速鉴定微生物全基因组基因功能的方法，包括如下步骤：
(1)混合DNA的制备步骤
用病原微生物菌株作为载体，利用Tn转座子可以随机插入微生物基因组的特性，培养一批不同插入密度的细菌突变体菌体，在达到一定生长曲线后，将所有突变菌株DNA释放出来，这时，释放的DNA为各种不同突变菌株的混合DNA；
(2)特异引物的合成步骤
将步骤(1)得到的混合DNA进行片段化处理，所述片段化处理是取长度在300-800bp的末端突出的DNA片段；然后将所有片段化DNA连接一DNA粘端接头，其两条单链DNA的序列式分别为序列式(Ⅰ)和序列式(Ⅱ)：
5-ACACTCTATCGCTACACGACGCTCTTCCCTAC*T-3；(Ⅰ)
5-GTAGGGAAGAGCTCGTATGCCCTCTTCTGATTG-3；(Ⅱ)
在DNA片段两端分别连接上不同的DNA粘端接头后，合成正向特异引物，正向特异引物含有DNA粘端接头的序列(Ⅰ)，又含有Tn转座子插入基因组DNA的最旁界的3’端序列，其完整序列式为：
5-ACACTCTATCGCTACACGACGCTCTTCCCTACTGTTACCAGGTCACAACCAAT-3
(3)特异引物扩增步骤
用步骤(2)制备的正向特异引物与DNA粘端接头的3’端引物序列进行PCR扩增，富集出来的DNA片段是含有转座子插入基因组的边界序列和基因组DNA序列；
(4)测序引物插入步骤
将测序引物位于Tn插入基因组边界的13个bp，这样测序得到的序列是转座子边界13bp序列和插入基因组DNA的所有序列信息；
(5)按照常规高通量测序的后续步骤进行测序。
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