CN115927653A - 一种用于鉴定鲤鱼体色性状的snp分子标记、引物及应用 - Google Patents

一种用于鉴定鲤鱼体色性状的snp分子标记、引物及应用 Download PDF

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陈忠
邓潜
林勇
覃俊奇
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Abstract

本发明涉及一种用于鉴定鲤鱼体色性状的SNP分子标记、引物及应用，涉及基因技术领域，所述SNP分子标记位于B19染色体第21286787位碱基，所述碱基为C或G。若所述SNP分子标记的基因型为CC或CG，则对应的鲤鱼体色性状为正常体色，若所述SNP分子标记的基因型为GG，则对应的鲤鱼体色性状为虹彩细胞缺失性状。实现了鲤鱼的虹彩细胞缺失性状的杂合子鉴定，通过分子标记辅助选育加快鲤鱼体色性状改良利用，提高养殖效益。

Description

一种用于鉴定鲤鱼体色性状的SNP分子标记、引物及应用
技术领域
本发明涉及基因技术领域，具体涉及一种用于鉴定鲤鱼体色性状的SNP分子标记、引物及应用。
背景技术
鲤是我国重要的水产养殖品种之一，其种质资源丰富、体色多样性高，如青灰鲤、瓯江彩鲤、荷包红鲤，兴国红鲤等。虹彩细胞缺失性状是鲤鱼体色的另一个类型，外观上表现为鳃盖、腹部肌肉具有半透明特点，鱼鳃和内脏隐约可见，具有该性状的典型鲤鱼群体是位于广西北部的稻田养殖群体“全州禾花鲤”，虹彩细胞缺失性状是判断其种质来源和界定经济价值的依据，直接决定其养殖效益。遗传分析表明，虹彩细胞缺失性状为单基因控制的隐性性状。若利用该群体开展杂交选育或遗传研究，则其后代携带相关基因的杂合子个体从外观上无法区分，影响选择效率。
单苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记是一种发生在基因组特定位点的单个核苷酸突变的遗传标记，其丰富度高、密度大、易于进行基因分型，广泛应用于动植物育种、抗病性基因标记、优势品种筛选和疾病相关基因的鉴定中。
目前，关于鲤鱼的虹彩细胞缺失性状的分子标记开发极少，可用于鉴定该性状或用以辅助选择SNP分子标记未见报道。因此，本发明提供一种用于鉴定鲤鱼体色性状的SNP分子标记、引物及应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于鉴定鲤鱼体色性状的SNP分子标记、引物及应用。目的是建立用于鲤鱼的虹彩细胞缺失性状的杂合子鉴定或性状提纯的分子标记辅助选育方法，加快鲤鱼体色性状改良利用，提高养殖效益。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
本发明为了解决上述技术问题，第一个目的是提供一种用于鉴定鲤鱼体色性状的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于B19染色体第21286787位碱基，所述碱基为C或G。
若所述SNP分子标记的基因型为CC或CG，则对应的鲤鱼体色性状为正常体色，若所述SNP分子标记的基因型为GG，则对应的鲤鱼体色性状为虹彩细胞缺失性状。
本发明的有益效果是：通过采用SNP分子标记，实现了鲤鱼的虹彩细胞缺失性状的杂合子鉴定，通过分子标记辅助选育加快鲤鱼体色性状改良利用，提高养殖效益。
第二个目的是提供一种用于鉴定如上述所述鲤鱼体色性状的SNP分子标记的引物，所述引物包括上游分型引物F1，下游分型引物F2及下游通用引物R，所述上游分型引物F1的核苷酸序列为SEQ ID No:1，所述下游分型引物F2的核苷酸序列为SEQ ID No:2，所述游通用引物R的核苷酸序列为SEQ ID No:3。
进一步，所述上游分型引物F1的5'端连接有荧光分子FAM或荧光分子HEX；所述下游分型引物F2的5'端连接有荧光分子FAM或荧光分子HEX。
进一步，所述上游分型引物F1的5'端连接有荧光分子FAM；所述下游分型引物F2的5'端连接有荧光分子HEX。
采用上述方案的有益效果是：采用连接有荧光分子的引物实现了鲤鱼的虹彩细胞缺失性状的杂合子快速鉴定，进行基因型的分型。
第三个目的是提供一种用于鉴定鲤鱼体色性状的SNP分子标记的试剂盒，包含上述所述引物。
采用上述方案的有益效果是：实现虹彩细胞缺失性状的杂合子快速鉴定。
第四个目的是提供一种鉴定鲤鱼体色性状的SNP分子标记应用，上述所述SNP分子标记在鲤鱼体色性状鉴定中的应用；或上述所述SNP分子标记在鲤鱼辅助育种中的应用。
第五个目的是提供一种鉴定鲤鱼体色性状的SNP分子标记的引物的应用，上述所述引物在鲤鱼体色性状鉴定中的应用；或上述所述引物在鲤鱼辅助育种中的应用。
第六个目的是提供一种鉴定鲤鱼体色性状的SNP分子标记的试剂盒的应用，上述所述试剂盒在鲤鱼体色性状鉴定中的应用；或上述所述试剂盒在鲤鱼辅助育种中的应用。
第七个目的是一种鉴定鲤鱼体色性状的方法，包括如下步骤：
步骤1：提取待测样品鲤鱼的DNA作为DNA模板，
步骤2：利用上述所述的引物或试剂盒对DNA模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
步骤3：对PCR扩增产物进行荧光扫描，根据颜色不同进行基因型分析，若基因型为CC或CG，则对应的鲤鱼体色性状为正常体色，若基因型为GG，则对应的鲤鱼体色性状为虹彩细胞缺失性状。
进一步，先在95℃下变性10min，循环1次，然后在95℃下变性20s，在61-55℃下退火延伸60s，循环10次，再在95℃下变性20s，在55℃下退火延伸60s，循环28-45次，最后在25℃读取数据30s。
附图说明
图1为本发明F2代家系体色性状分离情况图；
图2为本发明G统计量的的曼哈顿图；
图3为本发明欧式距离算法的曼哈顿图；
图4为本发明样本编号1-92号个体的KASP分型结果图；
图5为本发明样本编号93-183号个体的KASP分型结果图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实验试剂和仪器：
(1)试剂和耗材
KASP 2X PCR mix，STO Rox、96孔PCR TAPE,封板膜(或石蜡油)
(2)主要实验仪器
Bio-Rad CFX Connect Real-Time System，BIO-RAD；移液器，德国Eppendorf公司。
实施例1:与鲤的虹彩细胞缺失性状紧密相关的SNP分子标记的定位
1.1虹彩细胞缺失性状分离群体构建
F1代家系构建：选择全州禾花鲤为父本、建鲤为母本，采用人工催产孵化技术进行杂交繁育，获得2000尾以上的F1代家系，在600m2水池中进行培育，待鱼苗30日龄后随机保留200尾继续培育至性成熟。结果表明，F1代所有个体体色性状与母本一致。
F2代家系构建：在F1代家系选择性成熟个体为亲本，通过人工催产技术进行家系内近交，获得F2代5000尾以上，在面积1000m2以上的池塘中培育F2代至100日龄。对1100尾个体性状鉴定表明F2代发生性状分离，正常体色与虹彩细胞缺失性状个体比例为3:1(845:255)，符合单基因控制质量性状遗传规律(详见附图1)。
1.2亲本与不同体色类群的基因组重测序
使用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取F1父本、F1母本及F2代两种体色个体混池各30尾的DNA。基因组DNA用酶随机打断成短的DNA片段后，进行平末端修复。然后在DNA片段两端连接dA尾，并连接测序接头。加上接头的DNA片段经过AMPure XP磁珠进行纯化，并选择300-400bp范围的片段进行PCR扩增，构建文库。构建好的文库经过纯化、库检，HiSEQ X10PE150上机测序。结果显示，2个亲本和2个子代混池的基因组重测序结果显示，4个测序池获得清晰数据量为48582261300～50735146500bp，Q20值为95.30％～95.94％，与参考基因组(GCA_905221575.1；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_905221575.1)比对率在95％以上，详见表1，其中表1中FB表示父本(正常表型)，GA表示母本(虹彩细胞缺失)，GB是与父本性状一致的F2代混池，MA是与母本性状一致的F2代混池。
表1禾花鲤不同体色样本基因组重测序情况
样本名 数据量(bp) Q20(％) 比对率(％)
FB 50735146500 95.93 95.43
GA 50618450100 95.94 95.44
GB 49517571600 95.73 95.28
MA 48582261300 95.30 95.32
1.3 SNP分析与筛选
使用GATK软件检测SNP位点，结果显示2个亲本和2和子代混池累计获得SNP位点15800497个。为尽量控制背景噪音，依照以下标准进行SNP/Indel位点的过滤，满足以下条件的位点用于后续的BSA分析：1)当两个亲本都存在时，亲本间要有差异且分离形式符合群体类型(F1群体保留的标记的分离形式为nnxnp、lmxll、hkxhk，其他群体保留的标记的分离形式为aaxbb)；2)当亲本存在时，(两个)亲本的测序深度要大于等于给定的阈值，本次分析使用的阈值是5X；3)两个子代池都不缺失；4)每个子代池的测序深度要大于10X并且小于500X；5)至少有一个子代池的SNP-index大于0.3；6)至少有一个子代池的SNP小于0.7；过滤前后的标记位点数目为1233418个。
表2禾花鲤体色分离群体SNP和InDel筛选情况
Figure BDA0003806444010000051
Figure BDA0003806444010000061
1.4 BSA定位分析
采用SNP-index、G统计量、欧式距离(Euclidean Distance，ED)算法和Fisher精确检验4种方法分别进行了BSA分析，结果显示：SNP-index法和Fisher精确检验2种分析方法没有在染色体上获得显著区间。G统计量和欧式距离(Euclidean Distance，ED)算法获得较为统一的定位区间1个，位于B19号染色体20200001bp至第22200000bp区间(详见附图2和3)。
1.5 SNP位点查找定位
根据两个亲本的全基因组重测序数据，查找B19号染色体20200001bp至第22200000bp区间内的SNP变异位点。在21286787bp位置查找到一个SNP位点变异T/G。
实施例2：SNP分子标记及KASP引物的验证实验
2.1实验材料
⑴实验鱼
在实施例1中的F2群体中采集149尾体色正常个体和43尾虹彩细胞缺失个体作为实验材料，提取基因组DNA。
2.2引物设计合成及KASP分型
根据37371324bp位置SNP位点上下游300bp的序列，利用primerpremier 5.0软件设计KASP引物。引物序列如表3，其中上游分型引物F1(21286787-F)的5'端连接有荧光分子FAM，下游分型引物F2(21286787-V)的5'端连接有荧光分子HEX，下游通用引物R(21286787-R)。
表3引物的序列列表
Figure BDA0003806444010000071
合成引物，用TE(pH 8.0)溶解至50μM，然后按照上游分型引物F1：下游分型引物F2：下游通用引物R＝1:1:3的比例混合后上机，每10μL反应体系加0.5μL引物混合物。
PCR反应：96孔板反应体系的总反应体积为10ul(详见表4)，DNA在反应体系中为2.5μL(浓度在10ng/μl左右)。对96孔PCR反应板进行封膜，震荡，离心，保证反应体系混合均匀。离心后进行PCR反应，反应条件如下表5。
表4 PCR反应体系
Figure BDA0003806444010000072
表5 PCR反应条件
Figure BDA0003806444010000081
使用TECAN infinite M1000酶标仪读取荧光信号，出现了3种荧光信号。在线软件snpdecoder(http://www.snpway.com/snpdecoder/)解析转换荧光信号，得到清晰直观的分型图，并根据颜色不同，输出基因型结果检测。
2.3结果与分析
利用实施例1的SNP分子标记及设计合成的KASP引物，对F2分离群体(183尾)进行检测，结果详见表6，其中C:C的荧光信号有48尾，G:C的荧光信号有83尾，G:G的荧光信号有51尾。其中，C:C的荧光信号个体全部为正常性状，G:C的荧光信号个体中6尾(3.28％)为虹彩细胞缺失性状，其余为正常性状。G:G的荧光信号个体中9尾(4.92％)为正常性状，其余为虹彩细胞缺失性状。可知，检测结果与表型一致的准确率为91.8(168/183)。其中183尾中编号为124的个体pcr扩增失败，未检出荧光信号，其中Undetermined表示未检出荧光信号。
表6 KASP分型结果
Figure BDA0003806444010000082
Figure BDA0003806444010000091
Figure BDA0003806444010000101
KASP分型结果如图4和5所示，图4和5中左上角的分型结果为C:C，对应的试验鱼为正常体色纯合子。图4和5中中间部分型结果为C:G，对应的试验鱼为正常体色杂合子，携带虹彩细胞缺失基因。图4和5中右下角的分型结果为G:G，对应的试验鱼为虹彩细胞缺失性状纯合子。因此，利用该SNP分子标记可用于区分鲤虹彩细胞缺失性状。
实施例3：利用SNP分子标记鉴定鲤鱼体色性状的方法
一种鉴定鲤鱼体色性状的方法，包括如下步骤：
步骤1：提取待测样品鲤鱼的DNA作为DNA模板；提取的方法可以参考实施例1中的DNA提取。
步骤2：利用实施例2中所述的设计合成引物及KASP分型方法对DNA模板进行PCR扩增，得到扩增产物；
步骤3：对PCR的扩增产物进行荧光扫描，后进行基因型分析，若基因型为CC或CG，则对应的鲤鱼体色性状为正常体色，若基因型为GG，则对应的鲤鱼体色性状为虹彩细胞缺失性状。
综上所述，实施例1的SNP分子标记，变异位点C与鲤体色正常性状紧密连锁，G与虹彩细胞缺失性状紧密连锁。利用该标记对亲本材料进行检测，就能区分正常体色的亲本是否携带虹彩细胞缺失性状相关基因，从而挑选目标个体，减少后期筛选鉴定的工作量，加速育种进程。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种用于鉴定鲤鱼体色性状的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记位于B19染色体第21286787位碱基，所述碱基为C或G。
2.一种用于鉴定如权利要求1所述鲤鱼体色性状的SNP分子标记的引物，其特征在于，所述引物包括上游分型引物F1，下游分型引物F2及下游通用引物R，所述上游分型引物F1的核苷酸序列为SEQ ID No:1，所述下游分型引物F2的核苷酸序列为SEQ ID No:2，所述游通用引物R的核苷酸序列为SEQ ID No:3。
3.根据权利要求2所述引物，其特征在于，所述上游分型引物F1的5'端连接有荧光分子FAM或荧光分子HEX；所述下游分型引物F2的5'端连接有荧光分子FAM或荧光分子HEX。
4.根据权利要求2所述引物，其特征在于，所述上游分型引物F1的5'端连接有荧光分子FAM；所述下游分型引物F2的5'端连接有荧光分子HEX。
5.一种用于鉴定鲤鱼体色性状的SNP分子标记的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2至4任一项所述引物。
6.一种鉴定鲤鱼体色性状的SNP分子标记的应用，其特征在于，权利要求1所述SNP分子标记在鲤鱼体色性状鉴定中的应用；或权利要求1所述SNP分子标记在鲤鱼辅助育种中的应用。
7.一种鉴定鲤鱼体色性状的SNP分子标记的引物的应用，其特征在于，权利要求2至4任一项所述引物在鲤鱼体色性状鉴定中的应用；或权利要求2至4任一项所述引物在鲤鱼辅助育种中的应用。
8.一种鉴定鲤鱼体色性状的SNP分子标记的试剂盒的应用，其特征在于，权利要求5所述试剂盒在鲤鱼体色性状鉴定中的应用；或权利要求5所述试剂盒在鲤鱼辅助育种中的应用。
9.一种鉴定鲤鱼体色性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：提取待测样品鲤鱼的DNA作为DNA模板，
步骤2：利用权利要求2至4任一项所述的引物或权利要求5所述试剂盒对DNA模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
步骤3：对PCR扩增产物进行荧光扫描，根据颜色不同进行基因型分析，若基因型为CC或CG，则对应的鲤鱼体色性状为正常体色，若基因型为GG，则对应的鲤鱼体色性状为虹彩细胞缺失性状。
10.根据权利要求9所述一种鉴定鲤鱼体色性状的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应步骤为：先在95℃下变性10min，循环1次，然后在95℃下变性20s，在61-55℃下退火延伸60s，循环10次，再在95℃下变性20s，在55℃下退火延伸60s，循环28-45次，最后在25℃读取数据30s。
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