JP2003530106A5 - - Google Patents

Description

【特許請求の範囲】
【請求項１】 分泌又は部分分泌の為のシグナル配列を担持するポリペプチドをコードする注目の遺伝子を、遺伝子ライブラリーから同定及び単離をする為の方法であって：
ａ）ゲノムＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを用意し；
ｂ）前記ライブラリーへ、分泌レポーターをコードするプロモーターを有しない及び分泌シグナルを有しないポリヌクレオチドを含んで成るトランスポゾンであって、トランスポゾン境界領域と分泌レポーターコーディング領域との間に連続したオープンリーディングフレームが存在するトランスポゾンを挿入し；
ｃ）ホスト細胞に当該挿入した当該トランスポゾンを含んで成る当該ライブラリーを導入し；
ｄ）活性分泌レポーターを分泌又は部分的に分泌するホスト細胞をスクリーニング及び選択し；
ｅ）当該挿入したトランスポゾンに隣接するＤＮＡのシーケンシングにより、選択ホスト細胞中の当該分泌レポーターの挿入された注目の遺伝子を同定し、；そして
ｆ）段階ｅ）において同定された注目の完全な遺伝子を単離する、
段階を含んで成る当該方法。
【請求項２】 段階（ｆ）における注目の完全な遺伝子を段階（ａ）の当該ライブラリーから単離する、請求項１記載の方法。
【請求項３】 段階（ｂ）をin vitroで実行する請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】 前記ゲノムＤＮＡライブラリー又は前記ｃＤＮＡライブラリーを標準化する請求項１〜３記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】 前記ゲノムＤＮＡライブラリー又は前記ｃＤＮＡライブラリーは微生物由来である請求項１〜４記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】 前記微生物が真菌、糸状菌又は酵母菌である請求項５記載の方法。
【請求項７】 前記微生物が細菌である請求項５記載の方法。
【請求項８】 前記微生物が古細菌である請求項５記載の方法。
【請求項９】 前記ゲノムＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーが多細胞生物由来、好適には哺乳類細胞由来、最も好ましくはヒトの細胞由来である請求項１〜４記載のいずれか１項記載方法。
【請求項１０】 トランスポゾンがＭｕＡトランスポゾンを含んで成る請求項１〜９記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】 前記トランスポゾンがホスト細胞中で機能的な複製開始点を含んで成り、好適には複製開始点が大腸菌（Escherichia coli）中で機能的であり、更に好適には当該複製開始点がｃｏｌＥ１、ｏｒｉＶ、Ｐ１５Ａ又はｃｏｌＤＦ１３の誘導体であり、最も好ましくは複製開始点がｃｏｌＥ１である請求項１〜１０記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】 分泌レポーターがタンパク質であり、それはホスト細胞から分泌した時、本来前記細胞の増殖を妨害する物質の存在の下で前記細胞を増殖に至らせる請求項１〜１１記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】 分泌レポーターがβ−ラクタマーゼ又はインベルターゼである請求項１２記載の方法。
【請求項１４】 段階（ｂ）の前記トランスポゾンのポリヌクレオチドが、タンパク質分解解裂の為の特異的標的部位を含んで成るＮ末端ペプチドリンカーを担持する分泌レポーターをコードする請求項１〜１３記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】 ホスト細胞が細菌である請求項１〜１４記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】 細菌ホスト細胞がエスケリキア（Escherichia）、ラクトコッカス（Lactococcus）、ストレプトミセス（Streptomyces）、エンテロコッカス（Enterococcus）又はバチルス（Bacillus）細胞であり、好ましくは、大腸菌（Escherichia coli）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトミセス・コエリコール（Streptomyces coelicor）、エンテロコッカス・ファエカリス（Enterococcus faecalis）、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラウシ（Bacillus clausii）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・ロータス（Bacillus lautus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、枯草菌（Bacillus subtilis）又はバチルス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）の種である請求項１５記載の方法。
【請求項１７】 ホスト細胞が真菌である請求項１〜１４記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】 真菌ホスト細胞が、カンジダ（Candida）、クルイベロミセス(Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、ヤロウィア（Yarrowia）、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルジルス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、フィリバシヂウム（Filibasidium）、フザリウム（Fusarium）、ヒューミコーラ（Humicola）、マグナポーゼ（Magnaporthe）、ムコール（Mucor）、ミセリオピゾーラ（Myceliophthora）、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ニューロスポーラ（Neurospora）、パエシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ピロミセス（Piromyces）、シゾフィリウム（Schizophyllum）、タラロミセス（Talaromyces）、サーモアスカス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラヂウム（Tolypocladium）又はトリコデルマ（Trichoderma）の属の細胞である請求項１７記載の方法。
【請求項１９】 サッカロミセス・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae）、アスペルジルス・アクレアタス（Aspergillus aculeatus）、アスペルジルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルジルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルジルス・ニガー（Aspergillus niger）又はアスペルジルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）の種の真菌ホスト細胞である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】 前記ホスト細胞が哺乳類である請求項１〜１４記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】 請求項１におけるシーケンシング段階を、請求項１のトランスポゾンに対して特異的な１以上のプライマーを用いて行う、又は請求項１のＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーをクローニングしたベクターに特異的な１以上のプライマーを使用して行う請求項１〜２０記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】 注目の完全な遺伝子の単離を、請求項１記載のシーケンシング段階において得たＤＮＡ配列情報を利用して行う請求項１〜２１記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】 前記注目の完全な遺伝子が、当該ホスト細胞から分泌される酵素をコードする請求項１〜２２記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】 前記注目の完全な遺伝子が、膜−結合レセプター、好適には２成分シグナル（ＴＣＳ）伝達レセプター、更に好適にはサイトカインレセプターをコードする請求項１〜２２記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】 前記注目の完全な遺伝子が、分泌ポリペプチドサイトカインをコードする請求項１〜２２いずれか１項記載の方法。
【請求項２６】 前記注目の完全な遺伝子が、ヒトにおける免疫応答を誘導するポリペプチドをコードする請求項１〜２２記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】 前記注目の完全な遺伝子が、バクテリオシンをコードする請求項１〜２２記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】 前記注目の完全な遺伝子が、植物病原性ポリペプチドをコードする請求項１〜２２記載のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】 請求項１において単離した注目の完全な遺伝子を含んで成る発現系の構築の更なる段階を行う請求項１〜２８記載のいずれか１項記載の方法。