DE60033037T2

DE60033037T2 - Signalpeptide aus lactococcus lactis

Info

Publication number: DE60033037T2
Application number: DE60033037T
Authority: DE
Inventors: Peter Ravn; Soeren Michael Madsen; Astrid Vrang; Hans Israelsen; Mads Groenvold Johnsen; Lars Bredmose; Jose Arnau
Original assignee: Bioneer AS
Current assignee: Bioneer AS
Priority date: 1999-08-06
Filing date: 2000-08-04
Publication date: 2007-07-19
Anticipated expiration: 2020-08-05
Also published as: EP1206556A2; WO2001011060A3; US20040038263A1; JP4271396B2; ATE351912T1; US7186815B2; CA2381184A1; WO2001011060A2; EP1206556B1; ES2276691T3; AU772650B2; NZ517079A; CA2381184C; DK1206556T3; JP2003516119A; AU6426700A; DE60033037D1

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Fachgebiet der mikrobiellen Expressionssysteme, genauer gesagt Mittel zur Verbesserung des Sekretionslevels an homologen oder heterologen Genprodukten in rekombinanten Wirtszellen. Spezifisch werden neuartige Signalpeptide, die von Lactococcus ssp. Isoliert sind, und Mutanten derartiger Signalpeptide mit einer erhöhten Effizienz bereitgestellt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG UND STAND DER TECHNIK
Die Gruppe der Gram-positiven Bakterien, die im Allgemeinen als Milchsäurebakterien bezeichnet werden und Lactococcus ssp., wie Lactococcus lactis, Lactobacillus ssp., Streptococcus ssp., Leuconostoc ssp. und Oenococcus ssp., umfassen, wird üblicherweise in der Herstellung von Lebensmittelprodukten und Nahrungsmitteln, wie Butter, Käse und Joghurt, eingesetzt. Lactococcus lactis gilt als ein typisches Beispiel für ein Gram-positives Bakterium, das für die Herstellung von sehr vielen verschiedenen fermentierten Milchprodukten eingesetzt wird.
Außerdem werden Milchsäurebakterien gegenwärtig als rekombinante Wirtszellen für die Produktion von heterologen und homologen Genprodukten, wie pharmazeutisch aktiven Produkten oder Enzymen, eingesetzt. Unter den immer mehr aufkommenden industriellen Anwendungen für L. lactis konzentrierte sich eine neuere Arbeit der Erfinder auf die Produktion von heterologen Proteinen mit einer möglichen Verwendung als Impfstoffe, Therapeutika oder Enzyme. Das eingesetzte Expressionssystem umfasste einen stark regulierten Promotor und gestattete eine hochgradige Produktion von rekombinanter Leuconostoc mesenteroides β-Galactosidase, LacLM, (Madsen et al., 1999).
Mit der Entwicklung von Mikroorganismen zu Zellfabriken für die Produktion von heterologen Proteinen sind zahlreiche genetische Werkzeuge für eine verbesserte Genexpression geschaffen worden. Diese umfassen starke Promotoren, Vektoren mit hoher Kopienzahl, optimierte Codon-Nutzung und verbesserte Produktionsstämme, wobei ihre Verwendung zu einer Verbesserung der Produktionslevels geführt hat.
Bei Verwendung dieser optimierten Werkzeuge könnte die Sekretion von heterologen Proteinen in den Kulturüberstand einen limitierenden Schritt darstellen. Deshalb ist das molekulare Wissen über die Proteinsekretion auch zu einem Gegenstand der angewandten Forschung geworden. Um die später erfolgende Weiterverarbeitung der rekombinant produzierten Proteine zu erleichtern, ist im Allgemeinen die Sekretion des Proteins erwünscht. Um eine effiziente Sekretion heterologer Genprodukte zu erreichen, ist es erforderlich, Konstrukte zu verwenden, in denen das für das erwünschte Genprodukt codierende Gen operativ an ein Gen geknüpft ist, das für ein wirksames Signalpeptid codiert, das von der Signalpeptidase der Wirtszelle erkannt werden kann.
Der Sekretionsprozess in Bakterien umfasst Ereignisse, die unmittelbar nach der Translation der mRNA geschehen, d.h. die nachfolgende Erkennung des Signalpeptids (SP) in der entstehenden, nicht gefalteten Polypeptidkette durch den Sec-Apparat und die Abspaltung durch die Signalpeptidase nach Translokation durch die Zellmembran.
Der Sec-abhängige Weg ist das am besten untersuchte System für den Proteinexport. Obwohl es bekannt ist, dass praktisch alle Proteine, die über diesen Mechanismus transportiert werden, ein SP benötigen, ist es nicht klar verstanden, wie die Struktur des SP mit den verschiedenen Komponenten des Sekretionsmechanismus in der Zelle interagiert. Die vor kurzem erfolgte Charakterisierung eines Sec-abhängigen Weges, der zwischen E. coli und Pflanzen konserviert ist, verdeutlicht die Tatsache, dass Proteine über mehrere verschiedene Wege exportiert werden (Settles und Martienssen, 1998; Stephens 1998). Die beteiligten Mechanismen erfor dern gewöhnlich das Vorhandensein von Sequenzmotiven in dem exportierten Protein.
SPs sind die N-terminalen Extensionen, die in Sec-abhängig sezernierten Proteinen vorhanden sind. Die Struktur eines typischen SP umfasst drei verschiedene Regionen: (i) eine N-terminale Region, die mehrere positiv geladene Aminosäuren, Lysin und Arginin, enthält; (ii) einen zentralen hydrophoben Kern und; (iii) einen hydrophilen C-Terminus, der das von der Signalpeptidase erkannte Sequenzmotiv enthält (von Heijne 1990). Trotz struktureller Ähnlichkeiten wird eine große Sequenzvariation unter verschiedenen SPs beobachtet. Diese Variation ist neuerdings mit dem spezifischen Anzielen der sezernierten Proteine in Verbindung gebracht worden (Martoglio und Dobberstein, 1998).
Untersuchungen der Sekretion in Escherichia coli haben den Einfluss der hydrophoben Kernregion des SP auf ein effizientes Prozessieren gezeigt. SPs mit sehr hydrophoben Kernregionen unterstützten eine hohe Transportrate, selbst wenn eine veränderte N-terminale Region mit einer negativen Ladung verwendet wird (Izard et al., 1996). PhoA ist als ein Modellprotein für detaillierte Untersuchungen der Sekretion in diesem Bakterium verwendet worden. Die Wirkung der Entfernung der Helixbrechenden Reste (Gly oder Pro) kann durch eine erhöhte Hydrophobizität kompensiert werden (Izard et al., 1995). In Kompetitionsversuchen wurden zwei identische SPs N-terminal an PhoA angehängt, und es wurde gezeigt, dass die Nutzungsrate eines jeden SP von geringen Zunahmen der Hydrophobizität von einem der SPs abhängig war (Chen et al., 1996). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass eine verminderte negative Ladung am Amino-Terminus zu einer geringeren Gesamtaffinität für den Transportweg führte (Izard et al., 1996).
Die Charakterisierung zahlreicher extrazellulärer Proteine hat eine Entwicklung eines Verfahrens für die Vorhersage des Vorhandenseins und der Lokalisierung von Signalpeptid-Schnittstellen in Aminosäuresequenzen von verschiedenen Organismen, einschließlich Gram-positiver und Gram-negativer Prokaryoten und Eukaryoten, erlaubt (Nielsen et al., 1997). Das Verfahren umfasst eine Vorhersage von Schnittstellen und eine Signalpeptid/Nicht-Signalpeptid-Vorhersage basierend auf einer Kombi nation mehrerer künstlicher neuraler Netzwerke. Der Einsatz dieses Verfahrens erlaubt die vorausschauende Gestaltung und Analyse von SP-Derivaten vor ihrer Konstruktion und ihrem Test in vivo.
Proteine, die für eine Sekretion vorgesehen sind, umfassen eine Signalsequenz oder ein Signalpeptid (SP) am N-Terminus. SPs werden von einer Leader- oder einer Signalpeptidase, einer Komponente des Sekretionsmechanismus der Zelle, während der Translokation durch die Zellmembran hindurch erkannt und geschnitten (Martoglio und Dobberstein, 1998). SPs umfassen gewöhnlich 25 bis 35 Aminosäuren (as) in Gram-positiven Bakterien. SPs besitzen keine Sequenzhomologie, bestehen aber oftmals aus einem Amino-Terminus, der ein oder mehrere basische as enthält, aus einem zentralen hydrophoben Kern aus sieben oder mehr as und aus einem hydrophilen Carboxy-Terminus, der das Motiv enthält, das von der Signalpeptidase erkannt wird (Martoglio und Dobberstein, 1998). Eine Untersuchung von verfügbaren SPs von L. lactis legte die Verwendung des SP von Usp45 nahe, das am häufigsten sezernierte Lactococcus-Protein (van Asseldonk et al., 1990). Es wurde berichtet, dass dieses SP bei der Sekretion von mehreren heterologen Proteinen in L. lactis eine Funktion besitzt (van Asseldonk et al., 1993).
Herkömmliche Strategien zur Identifizierung von SPs in L. lactis haben die Konstruktion genomischer Bibliotheken in einem Vektor befolgt, der ein promotorloses Reportergen trägt. Im Allgemeinen hat ein Arbeiten mit Gram-positiven Bakterien die Verwendung von Reportergenen mit einer nachgewiesenen Funktionsfähigkeit bei der Identifizierung von SPs in Gram-negativen Bakterien umfasst. Diese Reporter umfassen BlaM, die E. coli β-Lactamase (Sibakov et al., 1991; Perez-Martinez et al., 1992). Die Verwendung von BlaM für die Identifizierung von L. lactis SPs bedeutete eine Beschränkung der Möglichkeit einer direkten Durchmusterung in L. lactis, wobei dieses auf vermutete Unterschiede in der Codon-Nutzung und Erfordernissen bei der Proteinfaltung für BlaM zurückgeführt worden ist (Pouquet et al., 1998). Deshalb ist eine erste Durchmusterung von genomischen Bibliotheken Gram-positiver Bakterien bis heute in E. coli durchgeführt worden, wobei positive Klone anschließend in L. lactis getestet wurden (Sibakov et al., 1991; Perez-Martinez et al., 1992), was einen zeitraubenden und arbeitsaufwändigen Selektionsschritt auf die Funktionsfähigkeit im ersten Wirt auferlegt hat. Ein geeigneterer Sekretionsreporter, die extrazelluläre β-Amylase von Bacillus licheniformis, ist ebenfalls bei der Durchmusterung auf Lactococcus-SPs eingesetzt worden, jedoch unter Befolgung derselben Durchmusterungsstrategie (Perez-Martinez et al., 1992). Diese Strategien führten ausschließlich zur Isolierung von SPs des Typs I. Darüber hinaus war ein Teil der Funktionsfähigkeit der identifizierten Sequenzen auf das Vorhandensein von Aminosäureresten zurückzuführen, die von der multiplen Klonierungsstelle in dem Vektor stammten. Diese Aminosäuren erfüllten die Voraussetzungen für die C-terminale Region dieses Typs von SPs (Perez-Martinez et al., 1992).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Demgemäß betrifft die Erfindung mit einem ersten Aspekt ein isoliertes DNA-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein Signalpeptid codiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 310mut1 (SEQ ID NR. 42), 310mut2 (SEQ ID NR. 43), 310mut3 (SEQ ID NR. 44), 310mut4 (SEQ ID NR. 45), 310mut5 (SEQ ID NR. 46), 310mut6 (SEQ ID NR. 47), 310mut7 (SEQ ID NR. 48), 310mut8 (SEQ ID NR. 49), 310mut10 (SEQ ID NR. 51), 310mut11 (SEQ ID NR. 52), 310mutA (SEQ ID NR. 53), 310mutB (SEQ ID NR. 54), 310mutC (SEQ ID NR. 55), 310mutA1 (SEQ ID NR. 56), 310mutB1 (SEQ ID NR. 57), 310mutD2 (SEQ ID NR. 58), 310mutD7 (SEQ ID NR. 59), 310mutE2 (SEQ ID NR. 60), 310mutE11 (SEQ ID NR. 61) und 310mutF2 (SEQ ID NR. 62).
Mit einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes DNA-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die für das Signalpeptid SP310 (SEQ ID NR. 41) codiert.
Noch weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen ein rekombinantes Plasmid und ein rekombinantes Bakterium, die eine DNA-Sequenz gemäß der Erfindung umfassen.
Mit noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Bakteriums gemäß der Erfindung für die Produktion eines gewünschten Genprodukts.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist, ein neuartiges transponierbares Element bereitzustellen, das die direkte Identifizierung, d.h. ohne die Verwendung einer zwischengeschalteten Bakterienspezies, einer Sequenz im Genom eines Milchsäurebakteriums erlaubt, die für ein SP codiert. Ein derartiges Element kann mit einem Verfahren zur Konstruktion eines Transposonderivats zur Identifizierung einer DNA-Sequenz in einem Milchsäurebakterium, die für ein Signalpeptid (SP) codiert, bereitgestellt werden.
In einem ersten Schritt wird ein DNA-Molekül ausgewählt, das ein Transposon umfasst, das zwischen seinem linken Terminus (LR) und seinem rechten Terminus (RR) eine Sequenz enthält, die ein promotorloses Reportergen und eine Ribosomenbindungsstelle (RBS) umfasst. Im vorliegenden Kontext ist ein derartiges DNA-Molekül ein Molekül, welches das Tn917-Transposon oder ein Derivat davon umfasst. Ein besonders zweckdienliches Tn917-Derivat ist das Plasmid pLTV1, das zusätzlich zu dem Tn917-Transposon ein promotorloses lacZ-Gen und eine Ribosomenbindungsstelle (RBS) umfasst.
Von dem ausgewählten transponierbaren DNA-Basismolekül wird eine zwischen dem LR und dem promotorlosen Reportergen lokalisierte Region deletiert, um ein modifiziertes DNA-Molekül zu erhalten, das seine Transponierbarkeit und seine RBS beibehalten hat, woraufhin eine singuläre Restriktionsstelle in die verbleibende Region inseriert wird, die sich zwischen dem LR und dem promotorlosen Reportergen befindet, und in diese singuläre Restriktionsschnittstelle wird eine DNA-Sequenz inseriert, die für ein Sekretionsreportermolekül codiert, das keine für ein SP codierende Sequenz enthält.
Durch die Deletion der zwischen dem LR und dem promotorlosen Reportergen liegenden Region wird erreicht, dass das so erhaltene Transposon-Derivat ohne Stop-Codons im richtigen Leserahmen mit dem Sekretionsreportermolekül ist, was nach einer Transposition translationale Fusionen von stromaufwärts des LR erlaubt.
Von den Sekretionsreportern, die in L. lactis und anderen Milchsäurebakterien-Spezies eingesetzt werden können, sind gegenwärtig Gene bevorzugt, die für Nukleasen codieren, einschließlich der Staphylococcus aureus Nuklease (Nuc), ein natürlicherweise extrazelluläres Protein, von dem gezeigt worden ist, dass es in L. lactis als Sekretionsreporter zweckdienlich ist (Pouquet et al., 1998). Nuc ist für die Durchmusterung auf SPs geeignet, da das Protein intrazellulär inaktiv ist und seine Struktur bemerkenswert einfach ist (es ist ein Monomer, dem Disulfidbindungen fehlen). Außerdem ist die Codon-Nutzung in dem nuc-Gen für eine hochgradige Expression in Lactococci geeignet, und der Plattenassay ist für den Nachweis der Sekretion nicht toxisch, was die Notwendigkeit einer Replikaplattierung überflüssig macht.
Transposonderivat-Moleküle sind für die Identifizierung einer DNA-Sequenz, die ein Signalpeptid (SP) codiert, in einem Milchsäurebakterium zweckdienlich. Ein derartiges Molekül umfasst ein erstes Element in Form eines DNA-Moleküls, umfassend ein Transposonelement, das zwischen seinem linken Terminus (LR) und seinem rechten Terminus (RR) eine Sequenz enthält, die ein promotorloses Promotorreportergen und ein Ribosomenbindungsstelle umfasst. Ein Beispiel für ein zweckdienliches Promotorreportergen ist das lacZ-Gen.
Ein signifikantes Merkmal dieses ersten Elements ist, dass das DNA-Molekül ohne Stop-Codons in der Region stromaufwärts des Promotorreportergens ist, die im richtigen Leserahmen mit dem Sekretionsreportermolekül des unteren zweiten Elements liegen, was nach Transposition des Transposon-Derivats die Expression von translationalen Fusionen von stromaufwärts der LR erlaubt.
Das Transposonderivat-Molekül umfasst als ein zweites Element eine DNA-Sequenz, die für ein Sekretionsreportermolekül codiert, wobei diese DNA-Sequenz ohne eine Sequenz ist, die für ein SP codiert. In einer gegenwärtig bevorzugten Anwendungs form ist das Sekretionsreportergen ein für eine Nuklease codierendes Gen, wie das von Staphylococcus aureus stammende nuc-Gen.
In zweckdienlichen Anwendungsformen ist das Transposonderivat von Tn917 oder einem Derivat hiervon, einschließlich pLTV1, abgeleitet. Ein besonders zweckdienliches Transposonderivat gemäß der Erfindung ist pTnNuc, dessen Konstruktion und Funktion detailliert in den nachfolgenden Beispielen beschrieben sind. Zusätzlich zu dem oberen ersten und zweiten Element kann das Transposonderivat außerdem einen Selektionsmarker, z.B. ein Antibiotikaresistenzgen, oder eine Mutation umfassen, die eine Auxotrophie für einen essentiellen Nahrungsbaustein verleiht.
Die Identifizierung in einem Milchsäurebakterium einer DNA-Sequenz, die für ein Signalpeptid (SP) codiert, kann mit dem hier beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Das Verfahren umfasst die Schritte der Transformierung eines Milchsäurebakteriums mit einem wie oben beschriebenen Transposonderivat-Molekül und der Selektion, von den transformierten Milchsäurebakterien, der Zellen, in denen das promotorlose Promotorreportergen exprimiert und das Genprodukt der DNA-Sequenz, die für ein Sekretionsreportermolekül codiert, sezerniert wird.
Es ist einzusehen, dass eine Expression des Promotorreportergens ein Hinweis ist, dass das transponierbare Element in ein Gen der Milchsäurebakterienzelle an einer Position integriert worden ist, wo es an einen Promotor in dem Chromosom der Zelle operativ geknüpft ist. Eine gleichzeitige Durchmusterung auf eine Expression des promotorlosen Promotorreportergens und des Sekretionsreportergens auf Medien, die das Fusionsprodukt des Promotorreportergens und des Sekretionsreportergens anzeigen, erlaubt die direkte Identifizierung von Klonen, die eine für ein funktionsfähiges SP codierende Sequenz umfassen.
Das Milchsäurebakterium, das in obigem als eine Quelle für funktionsfähige SPs verwendet wird, kann eine beliebige Spezies sein, die zu der allgemein als Milchsäurebakterien bezeichneten Bakteriengruppe gehört. Diese Gruppe umfasst Lactococcus spp., wie Lactococcus lactis, Lactobacillus spp., einschließlich beispielsweise Lactobacillus acidophilus und Lactobacillus plantarum, Leuconostoc spp., wie Leuconostoc mesenteroides, Oenococcus spp. und Streptococcus spp.
In bevorzugten Anwendungsformen wird das Transposonderivat zufällig oder quasizufällig transponiert.
Es ist einzusehen, dass, wenn Klone mit Hilfe des obigen Verfahrens identifiziert worden sind, die eine für ein funktionsfähiges SP codierende Sequenz umfassen, eine derartige Sequenz gemäß herkömmlichen Techniken für eine Isolierung von Nukleotidsequenzen isoliert werden kann. Wenn eine derartige Sequenz isoliert worden ist, kann sie, falls erwünscht, in homologe oder heterologe Spezies mit dem Ziel inseriert werden, die Sekretion erwünschter Genprodukte zu verbessern oder zu optimieren.
Geeignete DNA-Moleküle umfassen diejenigen Moleküle, in denen die für ein Signalpeptid codierende DNA-Sequenz der Klon SP310 ist, wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, und eine Mutante davon ist.
Es ist festgestellt worden, dass die Verbesserung der Sekretionseffizienz eines erwünschten Genprodukts möglich ist, indem das Gen, das für das Genprodukt codiert, an eine mutierte Sequenz operativ geknüpft wird, die für ein natürlich vorkommendes SP codiert. Eine derartige Mutation kann durch herkömmliche Mutagenesetechniken, wie Mutagenese mit Hilfe von UV-Bestrahlung oder unter Verwendung chemischer Mutagene, erhalten werden. Es ist jedoch festgestellt worden, dass eine ortsgerichtete Mutagenese ein geeignetes und wirksames Mittel zur Herstellung von SP-Mutanten mit verbesserten funktionellen Charakteristika ist. Eine derartige Mutagenese kann zu einer Substitution, Deletion oder Addition eines oder mehrerer Aminosäurereste führen. In den nachfolgenden Beispielen wird ein ganzes Spektrum mutierter SPs beschrieben, von denen einige eine höhere Sekretionseffizienz als das entsprechende SP des Wildtyps zeigen. Diese Mutanten umfassen die hier als 310mut1, 310mut2, 310mut3, 310mut4, 310mut5, 310mut6, 310mut7, 310mut8, 310mut10, 310mut11, 310mutA, 310mutB, 310mutC, 310mutA1, 310mutB1, 310mutD2, 310mutD7, 310mutE2, 310mutE11 beziehungsweise 310mutF2 bezeichneten Mutanten.
Die Erfindung stellt ebenfalls rekombinante Plasmide bereit, die ein isoliertes DNA-Molekül der Erfindung umfassen. Ein Beispiel eines derartigen Plasmids beinhaltet Δ310::Nuc, wie es hier beschrieben ist. In zweckdienlichen Anwendungsformen umfasst das rekombinante Plasmid gemäß der Erfindung einen regulierbaren Promotor, der an das Sekretionsreportergen operativ geknüpft ist. Die Regulation der Promotoraktivität erfolgt bevorzugt durch Wachstumsbedingungsfaktoren für die Wirtszelle, die das Plasmid trägt, wie die Wachstumstemperatur, den pH, die Wachstumsphase und Änderungen der Nährstoffzusammensetzung des Mediums, die während des Wachstums der Wirtszelle stattfinden. Im vorliegenden Kontext ist ein zweckdienlicher Promotor der P170-Promotor, wie er unten beschrieben ist.
Mit einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein rekombinantes Bakterium, das eine DNA-Sequenz der Erfindung umfasst. Ein derartiges rekombinantes Bakterium ist ein beliebiges Gram-positives oder Gram-negatives Bakterium, das als Wirtszelle in der Produktion erwünschter Genprodukte verwendet wird. Typische Beispiele für Gram-positive Bakterien umfassen Milchsäurebakterienspezies, Bacillus spp. und Spezies von Streptomyces und Beispiele für Gram-negative Bakterien umfassen als ein typisches Beispiel E. coli.
Die Erfindung wird nun in den nachfolgenden nicht beschränkenden Beispielen und den Zeichnungen veranschaulicht, worin
1A die Konstruktion von pTnNuc, einem Sekretionsreporter-Werkzeug in L. lactis, veranschaulicht. Einzelheiten der Konstruktion von TnNuc sind in Beispiel 1 beschrieben. Plasmide sind nicht maßstäblich gezeichnet und nur relevante Merkmale sind gezeigt. Restriktionsstellen. A: AatII; B: BsmI; E: EcoRV; N: NsiI; R: RsrII; S: SmaI. Die pPRA-Plasmide enthalten das 3.1 EcoRV-Fragment von pLTV1, das sich von der codierenden Region des tet-Gens (weißer tet-Pfeil) bis in das lacZ-Gen (schraffierter lacZ-Pfeil) erstreckt und die linke Wiederholung von Tn917 (schwarze LR-Box) umfasst. Dieses Fragment (weiße LTV1-Box) und die Position der LR (schwarze LR-Box) sind in pPRA-Plasmiden zwecks Verdeutlichung gezeigt. Die zwischen der LR und lacZ deletierte Region ist als ein weißes Dreieck in pPRA4B dargestellt.
1B Einzelheiten der nt-Positionen veranschaulicht, die in der Deletionsanalyse des Tn917 Derivats in pLTV1 gemeinsam mit der Funktionsfähigkeit der verschiedenen pPRA5-Derivate in Transposition angegeben sind.
2 eine Analyse der Sekretionseffizienz für ausgewählte L. lactis SPs zusammenfasst. Aufkonzentrierte (20fach) Überstände von Stamm PRA157 (Spur 1), PRA158 (Spur 2) und PRA159 (Spur 3) liefen auf einem 16% Tricin-Gel und wurden Coomasie gefärbt. Das geladene Volumen stellt den Gesamtproteingehalt von 100 μl (PRA157 und PRA158) oder 50 μl (PRA159) Kulturüberstand dar. Die Wanderung der Molekulargewichtsmarker in kDa ist auf der linken Seite gezeigt. Die Position von NucA und dem entsprechenden volllangen Protein (Δ13::Nuc, Δ307::Nuc und Δ310::Nuc) ist auf der rechten Seite gezeigt. Eine schwächere Bande, mit einer zu Δ13::Nuc ähnlichen Wanderung, die in allen Stämmen vorhanden ist, entspricht Usp45, dem hauptsächlich sezernierten Protein von L. lactis (van Asseldonk et al., 1990).
3 ein Überblick über die Strategie der ortsgerichteten Mutagenese für SP310 und Nukleasesekretion ist. Das von der Analyse des Wildtyp SP310 (SP310) unter Verwendung von SignalP erhaltenen Profils ist oben gezeigt. C, S und Y-Scores sind die drei Parameter, die in SignalP für die Identifizierung eines SP verwendet werden. Die Pfeile zeigen auf die vermutete Hauptprozessierungsstelle zwischen den Resten Ala34–Ala35, Sequenzveränderungen sind unterstrichen; und
4 die Ausbeute an sezernierter Nuklease in L. lactis zeigt, der ein verändertes SP310 enthält. Überstande von Übernachtkulturen wurden auf das 50fache mittels TCA-Präzipitation aufkonzentriert. Ein 0,5 ml Kulturüberstand entsprechendes Volumen wurde auf einem 14% SDS PAGE (Novex) laufen gelassen. Spur 1: Stamm PRA76 (Usp45SP-Nuc); Spur 2: Stamm PRA159 (Originalkonstrukt mit 60 as von der SP310-Sequenz, an die reife Nuc fusioniert); Spur 3: Stamm PRA162 (nur die 35 as von SP310, an Nuc fusioniert); Spur 4: Stamm PRA164 (310mut2-Nuc); Spur 5: Stamm PRA170 (310mutB-Nuc); Spur 6: Stamm PRA250 (310mut6-Nuc); Die Wanderung der Molekulargewichtsmarker ist auf der linken Seite in kDA angegeben.
BEISPIEL 1
Die Entwicklung von TnNuc und seine Verwendung für die Isolierung neuartiger Sekretionssignale in Lactococcus lactis
Abkürzungen: as: Aminosäure(n); B.: Bacillus; bp: Basenpaar; E.: Escherichia coli; Em: Erythromycin; L.: Lactococcus; LR: linke Wiederholung; nuc: Nuklease codierendes Gen; Nuc: Nukleaseprotein; nt: Nukleotid; S.: Staphylococcus; SP(s): Signalpeptid(e) oder Sekretionssignal; St.: Streptococcus
1.1. Übersicht
Es wird die Konstruktion eines neuen Tn917-Transposonderivats, als TnNuc bezeichnet, welches das Staphylococcus aureus Nuklease-Gen (nuc) als einen Reporter für die Sekretion enthält, beschrieben. Die Transposition von TnNuc in das L. lactis Chromosom erlaubt die Erzeugung von Fusionen im richtigen Leserahmen mit dem nuc-Gen. TnNuc umfasst ebenfalls lacZ, einen Reporter, der für die Identifizierung relevanter Klone von der Bibliothek, d.h. Klone mit Lac⁺-Phänotyp, verwendet wird, die aus der Transposition von TnNuc in ein funktionsfähiges Gen auf dem L. lactis Chromosom resultieren. Das Vorhandensein einer funktionsfähigen Signalsequenz an der stromaufwärts flankierenden Region der linken Wiederholung des transponierten Elements ermöglicht den Nachweis der Nukleaseaktivität unter Verwendung eines empfindlichen Plattenassays. TnNuc wurde für die Identifizierung neuartiger Sekretionssignale von L. lactis verwendet. Die identifizierten Sequenzen umfassten bekannte und nicht bekannte sezernierte Lactococcen-Proteine, die entweder eine Signalpeptidase I-Erkennungssequenz oder einer Signalpeptidase II-Erkennungssequenz enthalten. In einem Fall codiert das identifizierte Gen für ein Transmembranprotein. Die identifizierten Sequenzen wurden für Untersuchungen der Funktionsfähigkeit verwendet, wenn sie in einem Plasmid unter der Kontrolle des von pH und Wachstumsphase abhängigen Promotors P170 enthalten waren (Madsen et al., 1999). In sämtlichen Fällen war eine gleichzeitige Nukleasesekretion während einer Induktion von P170 in einem Chemostat zu beobachten.
1.2. Materialien und Methoden
(i) Stämme und Wachstumsbedingungen
Escherichia coli K-12 Stamm DH10B (Grant et al., 1990), der bei 37°C in LB angezogen wurde, das gegebenenfalls mit 100 μg/ml Ampicillin oder 200 μg/ml Erythromycin (Em) supplementiert war, wurde für die Klonierung, Rettung von Plasmid-DNA und Vermehrung von Plasmid-DNA verwendet. Lactococcus lactis cremoris Stamm MG1614 (Gasson 1983) wurde in Versuchen verwendet, die eine Konstruktion von Transposoninsertionen, Durchmusterung, Analyse der Transposoninsertionen und Plasmid-Rettung der zur Insertionsstelle benachbarten DNA umfassten. L. lactis subsp. cremoris Stamm MG1614 (Gasson 1983) wurde zur Analyse isolierter Translokationssignale verwendet. L. lactis Stämme wurden in GM17 oder ArgM17 (Israelsen et al., 1995), das gegebenenfalls mit 1 μg/ml Erythromycin (GM17Em oder ArgM17Em) supplementiert war, bei 30°C angezogen. In Fermentenrersuchen wurde ein definiertes Medium, 3 × SAIV (Jensen und Hammer, 1993), verwendet, und der pH wurde unter Verwendung von KOH konstant gehalten.
Die Transformation der Bakterien wurde mittels Elektroporation gemäß den veröffentlichten Verfahren für E. coli (Sambrook et al., 1989) beziehungsweise L. lactis (Holo und Nes 1989) durchgeführt.
(ii) Plasmid- und TnNuc-Konstruktion
Die Strategie für die Konstruktion und Analyse der Deletionsderivate von Tn917-LTV1 (Camilli et al., 1990) ist in 1 veranschaulicht. Das 3,1 kb EcoRV-Fragment von pLTV1, das sich vom 3'-Ende des lacZ-Gens bis zu der codierenden Region des tet-Gens erstreckt (Positionen 12208 bis 15335), wurde in einen EcoRV-verdauten pBluescript SK-(Stratagene) subkloniert und ergab pPRA2. Die Plasmid-DNA von pPRA2 wurde als Template für eine PCR mit Hilfe des Primers PSS1b (5'-CGATGAATGC CGGACCGAAT TGATACACTA ATGCTTTTAT ATAGGG-3' (SEQ ID NR. 1), die eine Restriktionsschnittstelle für BsmI (unterstrichen) beziehungsweise RsrII (kursiv) enthielt; Position 13374–13348 in pLTV), und des Primers PSS14 (5'-GTGTAGTCGG TTTATGCAGC-3' (SEQ ID NR. 2); Position 12672–12691 im lacZ-Gen), verwendet. Das amplifizierte 720 bp Fragment wurde mit BsmI und AatII (singuläre Stelle in dem 3,1 kb pLTV1-Fragment in pPRA2, 1) verdaut und in das BsmI und AatII verdaute pPRA2 kloniert und ergab pPRA3. Vier unterschiedliche PCR-Produkte (als 2A bis 2D bezeichnet) wurden mit Hilfe der pPRA2-DNA als Template amplifiziert. Die PCR wurde mit Hilfe des Primers PSS3 (5'-CACACATACC AATACATGC-3' (SEQ ID NR. 3); Position 14391–14373 in pLTV1, siehe 1) in Kombination mit den folgenden Primern, die eine singuläre RsrII-Stelle (kursiv) enthielten, durchgeführt: (i) für 2A, Primer PSS4 (5'-GCATCGGTCC GTAGGCGCTC GGGACCCC-3' (SEQ ID NR. 4), Position 13665 bis 13647 in pLTV1); (ii) für 2B, Primer PSS6 (5'-GCATCGGTCC GTTCTTATCG ATACAAATTC CTCG-3' (SEQ ID NR. 5), Position 13648 bis 13626 in pLTV1); (iii) für 2C, Primer PSS8 (5'-GCATCGGTCC GAAATTTTTA AATCTATTTC TTATC-3' (SEQ ID NR. 6), Position 13633 bis 13608 in pLTV1) und (iv) für 2D, Primer PSS10 (5'-GCATCGGTCC GTAAATGTAC AAAATAACAG CGAAAT-3' (SEQ ID NR: 7), Position 13613 bis 13589 in pLTV1).
Die Fragmente 2A bis 2D wurden mit RsrII und NsiI (eine singuläre NsiI-Stelle in dem 3,1 kb EcoRV-Fragment von pLTV1, siehe 1) und in den ebenso verdauten pPRA3 kloniert, was in dieser Reihenfolge pPRA4A bis pPRA4D ergab. pPRA4A bis pPRA4D wurden mit EcoRV verdaut und die 2,8–2,9 kb Inserts wurden in EcoRV verdautes pLTV1 kloniert, um das ursprüngliche 3,1 kb Fragment zu ersetzen, was die Plasmide pPRA5A bis pPRA5D ergab (1).
pPRA5B wurde zur Konstruktion von TnNuc ausgewählt. Mit Hilfe von pBS::Nuc (Le Loir et al., 1997) als DNA-Template und den Primern PSSnuc1 (5'-GCATCGGACC GTCACAAACA GATAACGGCG-3' (SEQ ID NR. 8) RswrII-Stelle kursiv) und PSSnuc2 (5'-GCATCGGTCC GCATTATTGA CCTGAATCAG-3' (SEQ ID NR. 9), RsrII-Stelle kursiv) wurde ein 531 bp Fragment erhalten. Ein Verdau mit RsrII und nachfolgende Ligation in das ebenso behandelte pPRA5B wurde durchgeführt und ergab pTnNuc. Das nuc-Fragment codiert für die NucB-Form des Proteins (Pouquet et al., 1998).
Transposoninsertionen wurden durch Transformieren von L. lactis mit dem das Tn917-Derivat tragenden Vektor und Anzucht dieser mit einer Erythromycin-Selektion hergestellt. Platten mit Transformanten wurden entweder auf X-Gal-Platten replikaplattiert, wie von Israelsen et al. (1995) beschrieben, und anschließend erfolgten Nuklease-(Nuc)-Plattenassays von lacZ⁺-Klonen oder es wurde eine Bibliothek von Transposoninsertionen durch Ausplattieren transformierter L. lactis mit einer hohen Dichte auf 140 mm Petri-Schalen, jeweils mit 200 ml SGM17-Agar, der mit 1 μg/ml Em supplementiert war, hergestellt. Die Platten wurden 4 Tage bei 30°C inkubiert und die Klone wurden durch Resuspendieren der Kolonien in GM17Em und 17% Glycerol vereint. Die konstruierte Bibliothek wurde in kleine Allquote eingefroren. Ein Aliquot wurde anschließend mit einer Dichte von etwa 500 KBE/Platte entweder auf GM17Em oder ArgM17Em ausplattiert. Nuc-Assays wurden dann mit Kolonien durchgeführt, um Nuc-sezernierende Klone zu identifizieren.
Für die Analyse der Funktionsfähigkeit der isolierten SPs auf einem Plasmid wurde pAMJ206 verwendet. pAMJ206 enthält den regulierten L. lactis Promotor P170 (Madsen et al., 1999), der stromaufwärts der Ribosomenbindungsstelle (RBS) von pAK80 (Israelsen et al., 1995) lokalisiert ist. Singuläre BglII und SalI-Stellen sind bequemerweise direkt stromabwärts der RBS lokalisiert. Ein PCR-Fragment wurde von pBS:Nuc (Le Loir et al., 1997) mit Hilfe der Primer Nuc1 und Nuc2 (beziehungsweise, 5'-GGAAGATCTT CACAAACAGA TAACGGC-3' (SEQ ID NR. 10) und 5'-ACGCGTCGAC GAATTCGATC TAAAATTAT AAAAGTGCC-3' (SEQ ID NR. 11) Restriktionsschnittstellen kursiv) erhalten, mit BglII und SalI verdaut und in pAMJ206 ligiert und ergab pΔSPNuc. Dieses Plasmid wurde für die Konstruktion von Plasmid pPRA157, pPRA158 und pPRA159 folgendermaßen verwendet. In pPRA157 wurde ein PCR-Fragment von der chromosomalen DNA von L. lactis MG1614 mit Hilfe der Primer PSScluA-A und PSScluA-B amplifiziert (beziehungsweise 5'-GCATCCCGGG TCTAGATTAG GGTAACTTTG AAAGGATATT CCTCatgAAA AAAACATTGA GAGACCAGTTACTTG-3' (SEQ ID NR. 12) und 5'-GCATAGATCT ACTCCAACTA TCACCTGTTG CATTTGCTC-3' (SEQ ID NR. 13), Restriktionsschnittstellen SmaI und BglII kursiv, die Sequenz aus dem Expressionsvektor pAMJ203 ist unterstrichen und das cluA-Gen ATG-Start-Codon steht in Kleinbuchstaben). Dieses Fragment erstreckt sich vom Start-Codon des cluA-Gens bis zu einer Position 1200 bp stromabwärts. An dieser Position wurde in Klon SP13 eine Insertion von TnNuc beobachtet. Dieses Fragment wurde in SmaI-BglII verdauten pΔSPNuc kloniert und ergab ein Fusionsprotein CluA::Nuc im richtigen Leserahmen, das genau zwei Unterschiede in den as (Arg-Ser, von den Klonierungsstellen stammend) zu dem in SP13 produzierten Protein enthielt.
Die Konstruktion von pPRA158 und pPRA159 erfolgte ähnlich, aber es wurde ein PCR-Fragment, das den ersten 120 bp der codierenden Region für die Gene entsprach, die durch eine TnNuc-Insertion in Klon SP307 (Fragment, das mit Hilfe der Primer PSS307-A, 5'-GCATCCCGGG TCTAGATTAG GGTAACTTTG AAAGGATATT CCTCATGAAT AAATCAAAAA TTATTGCTTT CTCTGC-3' (SEQ ID NR. 14) beziehungsweise PSS307-B, 5'-GCATAGATCT ATCAATGGAA TTAACATCAG CTGCCATGC-3' (SEQ ID NR. 15) amplifiziert wurde, SmaI und BglII Schnittstellen kursiv) beziehungsweise SP310 inaktiviert wurden (Fragment, das mit Hilfe der Primer PSS310-A, 5'-GCATCCCGGG TCTAGATTAG GGTAACTTTG AAAGGATATT CCTCATGAA TTTATAAAAA AAAGAGTTGC AATAGCC-3' (SEQ ID NR. 16) und PSS310-B, 5'-GCATAGATCT GTTATCATTA AAATCACTCC GATTAAGAG-3' (SEQ ID NR. 17), SmaI und BglII-Stellen kursiv, amplifiziert wurde), in pΔSPNuc kloniert.
Zusätzlich wurde Stamm AMJ627 durch Klonierung eines PCR-Fragments, das die N-terminalen 29 as enthielt, die das SP von Usp45 enthielten (SP_USP, mit Hilfe der Primer Usp1 (5'-TAGTAGGATC CCGGGTCTAG ATTAGGGTAA CTTTGAAAGG ATATTCCTCatg AAAAAAAA GATTATCTCAGC-3' (SEQ ID NR. 18), SmaI-Stelle kursiv, usp45 ATG-Start-Codon in Kleinbuchstaben) und Usp2 (5'-ACGCGTCGAC CTGCAGAGAT CTTGTGTCAG CGTAAACACC-3' (SEQ ID NR. 19), BglII-Stelle kursiv) in SmaI-BglI-verdautes pΔSPNuc konstruiert. Alle Plasmid-Konstrukte wurden mittels Sequenzierung der relevanten Regionen bestätigt.
(iii) Nukleaseassay
Der Nukleaseassay auf Platten wurde mit Hilfe des Kolonie-Überschichtungsverfahrens, wie von Lachica et al. (1971) beschrieben, mit den folgenden Modifikationen durchgeführt: 0,1% beschallte Heringssperma-DNA und 40 μM CaCl₂ wurden in der Überschichtung verwendet und 1% Agar wurde mit 0,6% Agarose ersetzt. Die Kolonien wurden auf GM17Em-, ArgM17Em- oder LBEm-Platten mit 0,3% Glucose wachsen gelassen. Die Platten wurden 30 Minuten bis 6 h bei 37°C nach Verfestigung der Überschicht inkubiert. Nuklease-sezernierende Kolonien entwickelten sich als eine klare orange Zone bei einem blau-grünen Hintergrund.
(iv) Insertionsmutagenese mit Tn917 und Derivaten
Transposoninsertionsversuche wurden durch Transformieren von L. lactis mit dem das Tn917-Derivat tragenden Vektor und Anzucht dieser mit einer Erythromycin-Selektion hergestellt. Primäre Transformanten wurden auf X-Gal-Platten replikaplattiert, wie von Israelsen et al., 1995, beschrieben, woraufhin Nuklease-(Nuc)-Plattenassays von lacZ⁺-Klonen folgten. Alternativ wurde eine Bibliothek von Transposoninsertionen durch Ausplattieren transformierter L. lactis mit einer hohen Dichte auf 140 mm Petri-Schalen, jeweils mit 200 ml SGM17-Agar, der mit 1 μg/ml Em supplementiert war, hergestellt. Die Platten wurden 4 Tage bei 30°C inkubiert und die Klone wurden durch Resuspendieren der Kolonien in GM17Em und 17% Glycerol vereint. Die konstruierte Bibliothek wurde in kleine Aliquote eingefroren. Aliquote wurde anschließend aufgetaut und mit einer Dichte von etwa 500 KBE/Platte entweder auf GM17Em oder ArgM17Em ausplattiert. Plattenassays wurden dann mit Kolonien durchgeführt, um Nuklease sezernierende Klone zu identifizieren.
(v) Gelelektrophorese mit gepulstem Feld
PFGE von SmaI-verdauter chromosomaler DNA von L. lactis Klonen mit integrierten Transposons wurde, wie beschrieben (Israelsen und Hansen, 1993), durchgeführt, um die zufällige Verteilung von TnNuc zu testen.
(vi) Plasmidrettung
DNA von Regionen, die das integrierte Transposon flankieren, wurde folgendermaßen charakterisiert. Für die DNA-Region, die das Transposon LR flankiert, wurde chromosomale DNA (2 μg) mit EcoRI verdaut, in einem großem Volumen (200 μl) religiert, um eine intramolekulare Ligation zu begünstigen, und in E. coli DH10B transformiert. Für die DNA-Region, die direkt an das RR grenzt, wurde chromosomale DNA entweder mit MluI oder BsiWI vor der Ligation und Transformation von E. coli DH10B verdaut.
(vii) Proteincharakterisierung
Wahlweise wurden Kulturüberstände auf das 20- bis 30fache mit Hilfe des Phenol-Ether-Verfahrens (Sauvé et al., 1995) aufkonzentriert. Proben liefen auf 16% Tricin-Gelen (Novex) gemäß Herstellerempfehlung. Die Gele wurden über Nacht unter Verwendung des kolloidalen Coomasie Staining Kit (Novex) gefärbt. Der Mark 12 Wide Range Standard wurde zur Abschätzung der Molekülgrößen eingesetzt.
(viii) DNA-Sequenzierung und Computeranalyse
Plasmidkonstrukte und gerettete Plasmid-DNA wurden unter Verwendung eines Thermo Sequenase fluorescent labelled Primer Cycle Sequencing Kit (Amersham), Cy5-markierten Primern und einem ALFexpress DNA Sequencer (Pharmacia Biotech) durchgeführt. Die Daten der DNA-Sequenz wurden mit Hilfe des Wisconsin Package von der Genetics Computer Group, Inc., analysiert. Mögliche Sekretionssignale wurden mit Hilfe des SignalP WWW server (Nielsen et al., 1997) analysiert.
(ix) Fermentation
Fermentationsversuche wurden unter Verwendung von Tisch-Fermentern (Applikon) durchgeführt, die 1 Liter Medium enthielten und auf 30°C und Halten des pH über 5,2 eingestellt gefahren wurden.
1.3. Ergebnisse
(i) Identifizierung der minimalen Region, die für eine Transposition von Tn917 in Lactococcus lactis erforderlich ist.
Die Transposition des in pLTV1 enthaltenen Tn917-Derivats wurde bei der Suche nach regulierten Promotoren in L. lactis gezeigt (Israelsen et al., 1995). Dieses Derivat enthält ein promotorloses lacZ-Gen an dem linken Terminus des Transposons und eine Ribosomenbindungsstelle, die vom Bacillus subtilis spoVG-Gen stammt. Die SpoVG::lacZ-Sequenz ist 278 bp vom Tn917-Ende inseriert, an einer Position, an der diese Insertion die Transposition nicht stört (Youngman, 1987). Um ein Transposon-gestütztes Durchmusterungswerkzeug für die Identifizierung von Sekretionssignalen von L. lactis zu entwickeln, muss ein Reportergen, das ein sezerniertes Protein codiert, an den linken Terminus dieses Elements inseriert werden, um die Erzeugung von Fusionen mit Genen im richtigen Leserahmen zu gestatten, die sezernierte Proteine nach Transposition codieren. Dies erfordert eine kurze Distanz von dem linken Terminus von Tn917 in Verbindung mit der Vermeidung von Stop-Codons, die Fusionen mit dem Reportergen im richtigen Leserahmen verhindern würden. Plasmide pPRA5A bis pPRA5D wurden als Derivate von pLTV1 konstruiert, wobei jedes eine kleine Deletion enthält, die sich von einer Position innerhalb (pPRA5A) oder angrenzend an (pPRA5B bis pPRA5D) die LR von Tn917 bis zu der Region direkt stromaufwärts von spoVG::lacZ erstreckt (1). Eine singuläre RsrII-Stelle wurde in alle Derivate nach der Deletion eingeführt. L. lactis MG1614 wurde unter Verwendung von pLTV1 und pPRA5A–D transformiert. Transformanten wurden über vier Replikaplattierungsrunden auf GM17Em-Platten angezogen. Eine große Anzahl an ersten Transformanten stellte das Wachstum während der Replikaplattierung ein. Diese entsprachen vermutlich Isolaten, die ein schlecht frei replizierendes Plasmid enthielten, das während des anschließenden Wachstums auf Platten verloren ging, was sie Em-empfindlich machte. Stabile Em-resistente Klone weisen eine Transposition des Tn917-Derivats in das L. lactis Chromosom auf, obwohl die Möglichkeit einer Integration des Plasmids, welches das Transposon trägt, nicht in einer Fraktion der Klone ausgeschlossen werden kann (Israelsen et al., 1995). Eine Transformation von L. lactis MG1614 mit pLTV1, pPRA5B, pPRA5C und pPRA5D ergab eine ähnliche Häufigkeit stabiler Transformanten. Allerdings wurden bei einer Verwendung von pPRA5A keine stabilen Transformanten erhalten. Das Tn917-Derivat in pPRA5A enthält eine partielle Deletion der LR des Elements. Die Veränderung dieses strukturellen Merkmals kann für das beobachtete Ausbleiben einer Transposition in L. lactis verantwortlich sein. Eine vollständige Sequenz in dieser Region ist erforderlich, um die Grenzen des Elements abzugrenzen, und eine hohe Sequenzhomologie wird bei den Tn3-verwandten Elementen, wie Tn917, beobachtet (Sherrat et al., 1989).
In L. lactis MG1614 ergab die Transformation mit pLTV1 etwa 15% blaue Kolonien unter den stabilen Em-resistenten Klonen auf X-Gal-haltigen Platten (Israelsen et al., 1995). Blaue Kolonien sind das Ergebnis einer Tn917-Transposition stromabwärts eines Promotors in dem L. lactis Chromosom. Es wurden keine signifikanten Unterschiede bei der Häufigkeit der blauen Kolonien mit pPRA5B, pPRA5C oder pPRA5D verglichen mit pLTV1 (Daten nicht gezeigt) festgestellt, was darauf hin deutet, dass diese Derivate in L. lactis funktionsfähig waren.
Da pPRA5B die größte Deletion enthielt und seine Funktionsfähigkeit beibehielt, wurde es für eine Klonierung eines Sekretionsreporters, des S. aureus nuc-Gens, ausgewählt.
(ii) Konstruktion von TnNuc, einem Werkzeug für die Identifizierung von Signalpeptiden in L. lactis.
Ein PCR-Fragment, das die gesamte nuc-codierende Region stromabwärts des SP enthielt (siehe Abschnitt 2.2), wurde in die singuläre RsrII-Stelle von pPRA5B kloniert, um pTnNuc (1) zu ergeben. Bei dieser Konstruktion werden Stop-Codons im richtigen Leserahmen mit dem nuc-Gen vermieden, was translationale Fusionen von stromaufwärts der LR erlaubt. Das neue Transposon, TnNuc genannt, wurde für die Konstruktion einer Kollektion von Mutanten in L. lactis MG1614 verwendet. TnNuc behält die originale lacZ-codierende Region und Ribosomenbindungsstelle. Dieses zusätzliche Merkmal von TnNuc stellt ein phänotypisches Merkmal (Lac⁺) bereit, um das Vorhandensein einer Promotoraktivität von Sequenzen stromaufwärts der LR nach einer Transposition anzuzeigen, ungeachtet der Genfunktion. Folglich identifiziert eine erste Durchmusterung auf blaue Kolonien L. lactis Klone, bei denen eine tatsächliche Transposition stattfindet und bei denen eine Transkription in TnNuc hinein erfolgt. Unter ihnen wird ein Anteil von Klonen erwartet, die TnNuc angrenzend an das 5'-Ende eines Gens, das ein sezerniertes Protein codiert, enthalten.
(iii) Konstruktion und Durchmusterung einer Kollektion an TnNuc-Integranten
Zwei unabhängige Transformationsexperimente von L. lactis MG1614 wurden mit pTnNuc durchgeführt. Da die Identifizierung eines funktionsfähigen Signalpeptids sowohl einen aktiven Promotor als auch ein Gen erfordert, das ein sezerniertes Protein codiert, konzentrierte sich eine erste Durchmusterung auf Transpositionsereignisse, die zu einer Expression von lacZ führten, was Integrationsereignisse ausschließt, die nicht zu einer Fusionen mit einem Promotor in der korrekten Orientierung führten. In dem ersten Experiment wurden 147 Lac⁺-Klone isoliert und auf eine Nukleasesekretion mit Hilfe des Plattenüberschichtungsassays getestet. Mehrere Klone, die dunkelblaue Kolonien auf X-Gal-Platten bildeten, zeigten eine schwache Nuc-Aktivität auf Platten. Diese Klone repräsentierten eine Transposition von TnNuc in ein stark exprimiertes Gen, wobei der geringe Level von Nuc auf Platten das Ergebnis einer begrenzten Zelllyse und keiner tatsächlich erfolgten Sekretion sein könnte. Zwölf Klone, die gleichzeitig einen schwachen Lac⁺-Phänotyp und einen niederen Nuc-Level zeigen, wurden für eine weitere Analyse ausgewählt, da in diesen Fällen eine tatsächliche Sekretion von Nuc eher vorstellbar war.
In der zweiten Versuchsreihe wurde ein verbessertes Verfahren ausgedacht, um die oben beschriebene umständliche und sequenzielle Durchmusterung zu vereinfachen und das Auffinden von Klonen zu gestatten, die während der Replikaplattierung ihre primären Integranten aufgrund der limitierenden Promotoraktivität verloren haben könnten und weiße Kolonien auf X-Gal-Platten ergeben würden. Bei diesem Verfahren wurden erste Transformanten auf SGM15Em-Platten ausplattiert und 4 Tage inkubiert. Diese lange Inkubation diente der Selektion von tatsächlichen und stabilen Em-resistenten Integranten. Kolonien wurden vereint und als eine Bibliothek aufbewahrt, die ungefähr 10⁴ unabhängige Transposanten enthielt. Eine anschließende Analyse der Bibliothek wurde mit Hilfe des Nuc-Assays auf Platten durchgeführt. Nuc⁺-Klone wurden dann auf LacZ-Aktivität getestet. Von den 108 erhaltenen Nuc⁺-Klonen wurden 20 Klone, die entweder (i) einen starken Nuc⁺-Phänotyp oder (ii) einen schwachen Nuc⁺ gemeinsam mit einem schwachen Lac⁺-Phänotyp zeigten, für eine weitere Analyse ausgewählt. Von diesen letzteren Klonen wurde angenommen, dass sie eine TnNuc-Integration in einem funktionsfähigen L. lactis Gen enthalten.
Um die Verteilung von TnNuc im L. lactis Chromosom zu untersuchen, wurde eine PFGE bei SmaI-verdauter chromosomaler DNA von 49 unabhängigen LacZ⁺-Klonen durchgeführt. Das Vorhandensein von TnNuc führt zwei benachbarte SmaI-Stellen, die in der TnNuc-Sequenz enthalten sind (1), in das L. lactis Chromosom ein. Folglich zeigt das Verschwinden eines einzigen SmaI-Fragments vom PFGE-Profil von L. lactis MG 1363 und das Vorhandensein zweier neuer SmaI-Banden das Vorliegen von TnNuc an. Von den untersuchten Klonen zeigten 35 das Vorliegen von TnNuc in dem größten 600 kb chromosomalen SmaI-Fragment. Diese Häufigkeit (71%) stimmt mit der zuvor genannten Transpositionshäufigkeit (60%) eines ähnlichen Tn917-Systems, TV32, in derselben Chromosomenregion in L. lactis MG1614 überein (Israelsen und Hansen, 1993). Zwei Klone hatten eine beziehungsweise zwei Kopien von TnNuc in dem 310 kb chromosomalen SmaI-Fragment. Eine TnNuc-Transposition in dem 280 kb, 140 kb und 120 kb chromosomalen SmaI-Fragmenten wurde bei 3, 2 beziehungsweise 2 Klonen beobachtet. Bei den verbleibenden 6 Klonen wurde keine Veränderung im PFGE-Profil festgestellt. Es wird eine Insertion von TnNuc in eines der kleineren SmaI-Fragmente vermutet, da eine Größenänderung bei diesen Fragmenten unter den für die PFGE eingesetzten Bedingungen nicht festzustellen wären (Israelsen und Hansen, 1993). Diese Ergebnisse bestätigten die quasizufällige Verteilung der TnNuc-Transposition in L. lactis.
(iv) Sequenzanalyse von L. lactis Genen, die für sezernierte Proteine codieren
Alle 32 erhaltenen Klone, die einen positiven Nuc⁺/Lac⁺-Phänotyp zeigten, wurden in Plasmidrettungsversuchen eingesetzt, um die Gene zu charakterisieren, die von einer TnNuc-Transposition beeinflusst wurden. In zwei Fällen ergab eine Plasmidrettung in E. coli keine Transformanten, und die entsprechenden Klone wurden nicht weiter analysiert. Chromosomale DNA (300 bis 400 bp), die die LR von TnNuc flankierte, wurde auf den geretteten Plasmiden sequenziert. In zwei Fällen entsprach die erhaltene Sequenz pTnNuc. Es könnte eine Integration von pTnNuc, nicht aber eine Transposition in diesen L. lactis Klonen stattgefunden haben. Für die verbleibenden 28 Klone wurde eine Sequenz von dem L. lactis Chromosom angrenzend an die LR von TnNuc identifiziert, was echte Transpositionsereignisse darstellt. Eine DNA-Analyse zeigte das Vorhandensein von Stop-Codons in der Sequenz unmittelbar stromaufwärts der TnNuc-Insertion, im richtigen Leserahmen mit dem nuc-Gen in 10 Klonen. Von den verbleibenden 18 Klonen enthielten SP13 und SP36 eine TnNuc-Insertion in dem cluA-Gen. CluA ist ein Transmembranprotein, das an der Zellaggregation von Donor- und Empfänger-Bakterien während der Lactococcen-Konjugation beteiligt ist (Godon et al., 1994). CluA besitzt tatsächlich ein typisches Signalpeptid, das Ziel der Signalpeptidase 1 ist (Tabelle 1). Neun Klone wurden identifiziert, die eine TnNuc-Insertion an 5 verschiedenen Positionen innerhalb desselben Gens enthielten. Dieses Gen codiert ein mutmaßliches Protein, das ein Signalpeptid umfasst. Ein stellvertretender Klon aus dieser Gruppe, SP310, zeigte eine starke Nuc-Aktivität und geringe lacZ-Aktivität, was eine effektive Signalsequenz anzeigt, die für die sezernierte Nuc verantwortlich ist. Tabelle 1. Analyse der Expression und Sekretion ausgewählter TnNuc-Integranten. Homologie-Suche und Art des Signalpeptids

¹ Die Anzahl unabhängiger Klone mit einer TnNuc-Insertion am selben Locus wird gezeigt. Ebenso ist die Anzahl unterschiedlicher Stellen innerhalb des Zielgens in Klammern angegeben.
² Nuc-Aktivität wurde auf Platten mit Hilfe des Überschichtungsassays bewertet (siehe Abschnitt 2.3).
³ LacZ-Aktivität wurde auf X-Gal-haltigen Platten bewertet.
⁴ Signalpeptid-Analyse mit Hilfe des SignalP neuralen Netzwerks bewertet (Nielsen et al., 1997); I: Signalpeptid Typ I; II Signalpeptid Typ II (Lipoprotein).
⁵ Identisches Gen, das wie in dem bereits isolierten Transposon-Integrant PA243 unterbrochen ist (Israelsen et al., 1995).
⁶ Streptococcus mutans dexB, codiert eine Exoglycosylase, die am Metabolismus von extrazellulärer Stärke beteiligt ist (Withing et al., 1993).
⁷ Hyaluronansynthase (HAS) von Streptococcus equilisimus (Ashbaugh et al., 1998).
⁸ Homologie mit Kationtransportproteinen von E. coli.

ND:: Sequenz für das 5'-Ende des relevanten Gens nicht verfügbar.

Klon SP10 enthielt eine TnNuc-Insertion in einem chromosomalen Locus an den thr-Operon grenzend, der zuvor bei der Suche nach regulierten Lactococcen Promotoren mit Hilfe von pTLV1 (Madsen et al., 1996) identifiziert wurde. SP10 zeigte eine starke Promotoraktivität (LacZ), wie es für das pLTV1-Integrant im selben Locus, PA234, berichtet wurde (Madsen et al., 1996). Das codierte Protein umfasste ein mutmaßliches Signalpeptid (Tabelle 1).
Klon SP307 beherbergte ein TnNuc-Insertion in einem Gen, das ein Homologon der Streptococcen Hyaluronasesynthase (HAS) codierte, die an der Kapselsynthese beteiligt ist (Ashbaugh et al., 1998). Ein Lipoprotein-Signalpeptid (von Hejne, 1989) ist am N-Terminus des codierten Proteins vorhanden (Tabelle 1).
Die Analyse von Klon SP11 und Sp25 zeigte eine Insertion von TnNuc an zwei verschiedenen Positionen, 103 beziehungsweise 49 bp vom ATG-Start-Codon des unterbrochenen Gens. Bei SP25 ist die kurze Sequenz nicht hinreichend lang, um einem SP zu entsprechen. Allerdings wurde ein günstiges Verhältnis zwischen Nuc- und LacZ-Aktivität bei SP11 als auch SP25 beobachtet (Tabelle 1). Die beobachtete Nukleaseaktivität kann auf eine partielle Prozessierung und Sekretion des Nuc-Fusionsproteins zurückzuführen sein. Alternativ kann das inaktivierte Gen für eine Komponente des Sekretionsmechanismus oder der Zellmembran verantwortlich sein, was zu einer vermehrten Sekretion oder Proteinaustritt führt.
In zwei Klonen, SP240 und SP330, wurde kein SP in dem anvisierten Gen identifiziert. Bei SP240 identifizierte eine Datenbanksuche eine signifikante Homologie zu dem St. mutans dexB-Gen. dexB codiert eine Exoglycosylase, die am Abbau extrazellulärer Stärke beteiligt ist (Whithing et al., 1993). Interessanterweise wurde kein SP in DexB gefunden (Tabelle 1). Der Mechanismus, welcher der beobachteten Nuc-Sekretion in SP240 und SP230 zugrunde liegt, bleibt unklar.
Schließlich war das Insertionsziel in Klon SP323 ein Gen, das ein Membranprotein codiert. Das mutmaßliche Protein zeigte eine Homologie zu Mg²⁺-Transportern von E. coli (Tabelle 1).
(v) Funktionale Analyse ausgewählter Sekretionssignale auf einem Multicopy-Plasmid in L. lactis
Vier SPs, die Sequenzen von bekannten (SP13) oder bisher unbekannten Genen (SP10, SP307 und SP310) darstellen und zu SPs gehören, die von der Signalpeptidase I oder II erkannt werden, wurden für eine weitere Analyse ausgewählt. Um die Sekretionseffizienz für die Fusionspartner zu analysieren, die mit TnNuc im Wildtyp-Hintergrund identifiziert wurden, wurden Plasmidkonstruktionen durchgeführt, um die minimale Region (d.h. die zu dem entsprechenden ATG-Start-Codon am nächsten liegende Insertionsposition, siehe Abschnitt 2.2) zu klonieren. Erste Ergebnisse zeigten, dass eine CluA-Nuc Proteinfusion, die eine N-terminale CluA-Region einschließlich der ersten 60–150 as enthielt, keine nachweisbaren Mengen an sezernierter Nuc lieferte (Daten nicht gezeigt). Deshalb wurde eine Region einschließlich der N-terminalen 400 as von CluA, die der am nächsten liegenden Position der TnNuc-Insertion zum 5'-Ende vom hier identifizierten cluA entsprach, für einen Vergleich eingesetzt (SP13).
Bei allen vier SPs wurde eine 60 as N-terminale Region des Proteins (SP10, SP307 und SP310) als eine Proteinfusion mit Nuc (nachfolgend als Δ10::Nuc; Δ13::Nuc, Δ307::Nuc beziehungsweise Δ310::Nuc bezeichnet) eingeführt und ergaben Stamm PRA156 (Δ10::Nuc), PRA157 (Δ13::Nuc), PRA158 (Δ307::Nuc) und PRA159 (Δ310::Nuc). Das in dieser Untersuchung verwendete Nuc-Fragment entspricht der NucB-Form des Proteins. Diese Form wird zu einer 19- bis -21 as kürzeren Form, NucA weiter bearbeitet (Pouquet et al., 1998). Stämme PRA156 bis PRA159 enthalten einen von pH und Wachstumsphase abhängigen Promotor, P170, für eine regulierte Expression (Madsen et al., 1999). Eine P170-gesteuerte Expression erfolgt während eines Übergangs zur stationären Phase, wenn das Wachstumsmedium bei einem pH ~6,5 gehalten wird. Fermenterversuche wurden unter Verwendung der obigen Stämme durchgeführt und Proben wurden am Anfang der stationären Phase genommen, wo maximale Produktionslevels erhalten worden sind (Madsen et al., 1999). Erste Messungen zeigten in Kulturüberständen von PRA156 nur Nuc-Aktivitätslevels, die dem Hintergrund entsprachen. Aus diesem Grund wurde der Stamm nicht weiter untersucht.
Aufkonzentrierte Kulturüberstände von PRA157, PRA158 und PRA159 wurden auf einer SDS-PAGE laufen gelassen. Wie gezeigt, wurde eine Sekretion bei allen drei Stämmen festgestellt (eine 19 kDa Bande in Spuren 1–3, 2). Eine weitere Bande, die hinsichtlich ihrer Größe dem volllangen Fusionsprotein entsprach, wurde bei PRA157 (eine 42 kDa Bande) und PRA158 (eine 22 kDa Bande; 2) identifiziert. Bei Stamm PRA159 wurden zwei weitere Produkte ähnlicher Größe (ungefähr 23 kDa) festgestellt, was alternative Prozessierungsstellen des SP in SP310 vermuten lässt. Diese Möglichkeit wurde durch die Identifizierung zweier mutmaßlicher Prozessierungsstellen auf der primären as-Sequenz an Position 27 und 34 von dem ersten Met unter Verwendung von SignalP (erhältlich von http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP, Daten nicht gezeigt) gestützt. Insgesamt war die Sekretionseffizienz für PRA159 (Δ310::Nuc) am höchsten und für PRA157 (ΔCluA10::Nuc) am geringsten. Die Proben wurden für eine Messung der Nuc-Aktivität verwendet (Tabelle 2).
Als ein Vergleich wurde Stamm AMJ627 verwendet. AMJ627 beherbergt ein ähnliches Konstrukt wie das obere, wobei dieses das vollständige SP von Usp45 an Nuc fusioniert enthält (SP_Usp::Nuc, siehe Abschnitt 2.2). Die erhaltenen Werte bestätigten bei einer Sekretion die Effizienz des SP von Usp45. Das in PRA159 (Δ310::Nuc) verwendete SP sezernierte 67 mg/l Nuc oder etwa 60% im Vergleich zu SP_Usp. Aktivitätslevels waren für PRA158 (31%) und PRA157 (6%) geringer.
Tabelle 2. Nukleaseaktivität in Kulturüberständen ausgewählter Klone.
Es wurden Kulturüberstände der stationären Phase von Fermenterversuchen verwendet.

¹ Siehe Abschnitt 2.2 für Konstruktionsdetails

BEISPIEL 2
Molekulare Charakterisierung und Bearbeitung von SP310, einem Signalpeptid von Lactococcus lactis
2.1. Übersicht
Von den in Beispiel 1 identifizierten Signalpeptiden (SP) zeigte SP310 den höchsten Sekretionslevel. Allerdings waren die erhaltenen Levels geringer als die bei einer Verwendung des Signalpeptids von Usp45 (SPUSP), dem hauptsächlich sezernierten Lactococcen-Protein, erhaltenen Levels. In diesem Beispiel wird ein Ansatz mit einer ortsgerichtete Mutagenese für SP310 beschrieben, der für eine Verbesserung der Sekretionslevels und zur Untersuchung der Voraussetzungen für eine Sec-abhängige Sekretion in L. lactis entwickelt worden ist. Eine der analysierten Mutanten, SP310mut2, zeigte einen SPUSP ähnlichen Sekretionslevel und ergab eine Ausbeute von mehr als 150 mg/l Staphylococcus aureus Nuklease (Nuc) im Fermenter. Dies stellt eine Verbesserung von 45% bezogen auf die Sp310-Wildtyp-Sequenz dar. Die Analyse der Nuc-Sekretion in den Mutanten erlaubte die Festlegung einiger Voraussetzungen für eine effiziente Sekretion in L. lactis. Allgemeine Merkmale für den L. lactis Sec-abhängigen Sekretionsweg unterscheiden sich von den für Escherichia coli genannten Merkmale.
2.2. Material und Methoden
(i) Stämme und Wachstumsbedingungen
Escherichia coli K-12 Stamm DH10B (Grant et al., 1990), der bei 37°C in LB oder TB angezogen wurde, das gegebenenfalls mit 100 μg/ml Ampicillin oder 200 μg/ml Erythromycin (Em) supplementiert war, wurde für die Klonierung, Rettung von Plasmid-DNA und Vermehrung von Plasmid-DNA verwendet. Lactococcus lactis cremoris Stamm MG1363 (Gasson 1983) wurde für eine Analyse vom SP verwendet. L. lactis Stämme wurden in GM17 (Israelsen et al., 1995), das gegebenenfalls mit 1 μg/ml Erythromycin (GM17Em oder ArgM17Em) supplementiert war, bei 30°C angezogen. In Fermenterversuchen wurde ein definiertes Medium, SAIV (Jensen und Hammer, 1993), verwendet und der pH wurde unter Verwendung von HCl oder NaOH konstant gehalten. Die Transformation der Bakterien wurde mittels Elektroporation gemäß den veröffentlichten Verfahren für E. coli (Sambrook et al., 1989) beziehungsweise L. lactis (Holo und Nes 1989) durchgeführt.
(ii) Ortsgerichtete Mutagenese von SP310 und Plasmidkonstruktionen
Die Primer PSS310-A (5'-GCATCCCGGG TCTAGATTAG GGTAACTTTG AAAGGATATT CCTCATGAAA TTTAAATAAAA AAAGAGTTGC AATAGCC-3' (SEQ ID NR. 20), SmaI-Stelle kursiv) und PSS310-B0 (5'-CTATTGGTTT GATTACGTCG GCTTTCTAGA TACG-3' (SEQ ID NR. 21), BglII-Stelle kursiv) wurden verwendet, um die SP310 Wildtyp-Sequenz (nachstehend als SP310 bezeichnet) unter Verwendung von PRA159-DNA als Template zu amplifizieren. Das amplifizierte Fragment wurde mit SmaI und BglII verdaut, aus Agarosegelen gereinigt und kloniert.
Für die Konstruktion von 310mut1 wurden PSS310-A und PSS310-B1 (5'-GGTCTCATTG GTTCGATTAC GTCGGCTTTC TAGATACG-3' (SEQ ID NR. 22), BglII-Stelle kursiv, Mutation unterstrichen) verwendet. PSS310-A und PSS310-B2 (5'-GTTATAGTAG TTAGGTTCTA CGAGTT---- --CGTCGGCTTTCTAGATACG-3' (SEQ ID NR. 23), BglII-Stelle kursiv, Mutationen unterstrichen und Deletion als Striche dargestellt) wurden verwendet, um 310mut2 zu erhalten.
310mut3 wurde unter Verwendung von PSS310-A und PSS310-B3 (5'-CTATAAACAT TCAAAAAAAT GTTAT----- -TAGGGT--- TTGTGACGAG TTCGTCGGCTTTCTAGATACG-3' (SEQ ID NR. 24), BglII-Stelle kursiv, Mutationen unterstrichen und Deletion als Striche dargestellt) hergestellt.
310mut4 wurde unter Verwendung von PSS310-A und PSS310-B4 (5'-CTATAAACAT TCAAAAAAAT GTTAT----- -TAGGTT--- TTGGGTTTGAT TACGTCGGCTTTCTAGATACG-3' (SEQ ID NR. 25), BglII-Stelle kursiv, Mutationen unterstrichen und Deletion als Striche dargestellt) konstruiert.
310mut5 wurde unter Verwendung von PSS310-A und PSS310-B5 (5'-CTATAAACAT TCAAAAAAAT GTTAT----- -TAGGTT--- TTGGTTCGAT TACGTCGGCTTTCTAGATACG-3' (SEQ ID NR. 26), BglII-Stelle kursiv, Mutationen unterstrichen und Deletion als Striche dargestellt) erhalten.
310mut6 wurde unter Verwendung von Primer PSS310-A und PSS310-B6 (5'-GTTATAGTAG TTAGGTTCTA CGAGTT---- --CGTCTATG ATCTAGATAC G-3' (SEQ ID NR. 27), BglII-Stelle kursiv, Mutationen unterstrichen und Deletion als Striche dargestellt) konstruiert.
310mut7 wurde unter Verwendung von Primer PSS310-A und PSS310-B2ΔQ (5'-GTTATAGTAG TTAG---CTA CGAGTT---- --CGTCGGCT TTCTAGATAC G-3' (SEQ ID NR. 28), BglII-Stelle kursiv, Mutationen unterstrichen und Deletion als Striche dargestellt) erhalten.
310mut8 wurde unter Verwendung von Primer PSS310-A und PSS310-B2ΔQ (5'-GTTATAGTAG TTAGGTT--- CGAGTT---- --CGTCGGCT TTCTAGATAC G-3' (SEQ ID NR. 29), BglII-Stelle kursiv, Mutationen unterstrichen und Deletion als Striche dargestellt) hergestellt.
310mut10 wurde unter Verwendung von Primer PSS310-A und PSS310-B21F (5'-CGTTATCGGT GCAAATAAAA AAACTATAAA CATTCAAAAA AATGTTATAG TAGTTAGGTT CTACGAGTT- -----CGTCG GCTTTCTAGA TACG-3' (SEQ ID NR. 30), BglII-Stelle kursiv, Mutationen unterstrichen und Deletion als Striche dargestellt) konstruiert.
310mut11 wurde unter Verwendung von Primer PSS310-A und PSS310-B22F (5'-CGTTATCGGT GCAAATAAAA AAACTATAAA CATAAAAAAA AATGTTATAG TAGTTAGGTT CTACGAGTT- -----CGTCG GCTTTCTAGA TACG-3' (SEQ ID NR. 31), BglII-Stelle kursiv, Mutationen unterstrichen und Deletion als Striche dargestellt) erhalten.
Für die Konstruktion von 310mutA wurden Primer PSS310-AA (5'-CCTCCCGGGT CTAGATTAGG GTAACTTTGA AAGGATATTC CTCatgAAAT TTAATAAAAA AAGAGTTGCA ATAGCCTTGT TTATTGCTTT GATATTTGTA CTTTTTTTTC TTATATCATC-3' (SEQ ID NR. 32), SmaI-Stelle kursiv, ATG-Start-Codon in Kleinbuchstaben und Mutationen unterstrichen) und PSS310-B0 verwendet.
310mutB wurde unter Verwendung von Primer PSS310-AB (5'-CCTCCCGGGT CTAGATTAGGG TAACTTTGAAA GGATATTCCTC atgAAATTTA ATAAAAAAAG AGTTCTTATA CTTTTGTTTA TTCTTTTGAT ATTTGTACTT TTTTTTCTTA TATCATC-3' (SEQ ID NR. 33), SmaI-Stelle kursiv, ATG-Start-Codon in Kleinbuchstaben und Mutationen unterstrichen) und PSS310-B0 erhalten. 310mutC wurde unter Verwendung von Primer PSS310-AC (5'-CCTCCCGGGT CTAGATTAGG GTAACTTTGA AAGGATATTC CTCatgAAAT TTAATAAAAA AAGACTTTTG CTTTTGCTTT TGCTTTTGCT TTTACTTCTT TTG-3' (SEQ ID NR. 34), SmaI-Stelle kursiv, ATG-Start-Codon in Kleinbuchstaben und Mutationen unterstrichen) und PSS310-BC (5'-GAAAATGAAG AAAACGAAAA CGAATATAGT AGTTAGGTTC TATTGGTTTG ATTACGTCGG CTTTCTAGAT ACG-3' (SEQ ID NR. 35), BglII-Stelle kursiv und Mutationen unterstrichen) erhalten.
310mutA1 wurde unter Verwendung von Primer PSS310-AA und PSS310-B1 (5'-GGTTCTATTG GTTCGATTAC GTCGGCTTTC TAGATACG-3' (SEQ ID NR. 36), BglII-Stelle kursiv und Mutation unterstrichen) konstruiert.
310mutB1 wurde unter Verwendung von Primer PSS310-AB (5'-CCTCCCGGGT CTAGATTAGG GTAACTTTGA AAGGATATTC CTCatgAAAT TTAATAAAA AAAGAGTTCT TATACTTTTG TTTATTCTTT TGATATTTGT ACTTTTTTTT CTTATACATC-3' (SEQ ID NR. 37), SmaI-Stelle kursiv, ATG-Start-Codon in Kleinbuchstaben und Mutationen unterstrichen) und PSS310-B1 erhalten.
Konstruktion von 310mutD2 wurde unter Verwendung von Primer PSS310-AΔF (5'-GCATCCCGGG TCTAGATTAG GGTAACTTTG AAAGGATATT CCTCatgAAA ---AATAAAA AAAGAGTTGC AATAGCC-3' (SEQ ID NR. 38), SmaI-Stelle kursiv, ATG-Start-Codon in Kleinbuchstaben, Mutationen unterstrichen und Deletionen als Striche dargestellt) und PSS310-B2 durchgeführt.
310mutD7 wurde unter Verwendung von Primer PSS310-AΔF und PSS310-B2ΔQ konstruiert. 310mutE2 wurde unter Verwendung von Primer PSS310-AΔN (5'-GCATCCCGGG TCTAGATTAG GGTAACTTTG AAAGGATATT CCTCatgAAA TTT---AAAA AAAGAGTTGC AATAGCC-3' (SEQ ID NR. 39), SmaI-Stelle kursiv, ATG-Start-Codon in Kleinbuchstaben und Deletionen als Striche dargestellt) und PSS310-B2 erhalten.
Die Konstruktion von 310mutE11 wurde unter Verwendung von Primer PSS310-AΔF und PSS310-B22F durchgeführt.
310mutF2 wurde unter Verwendung von Primer PSS310-AK (5'-GCATCCCGGG TCTAGATTAG GGTAACTTTG AAAGGATATT CCTCatgAAA TTTAAAAAAA AAAGAGTTGC AATAGCC-3' (SEQ ID NR. 40), SmaI-Stelle kursiv, ATG-Start-Codon in Kleinbuchstaben und Mutationen unterstrichen) und PSS310-B2 konstruiert.
In allen Fällen wurden die Klone mittels Elektroporation in E. coli eingeführt, und das Vorhandensein von Mutationen in der 310-Sequenz wurde durch Sequenzierung beider Stränge mit Hilfe eines Thermo Sequenase fluorescent labelled Primer Cycle Sequencing Kit (Amersham), Cy5-markierten Primern und einem ALFexpress DNA Sequencer (Pharmacia Biotech) bestätigt. Plasmid-DNA wurde anschließend in L. lactis MG1613 eingeführt.
(iii) Proteinanalyse und SDS-PAGE
Kulturüberstände wurden auf das 20- bis 30fache mit Hilfe des Phenol-Ether-Verfahrens (Sauvé et al., 1995) aufkonzentriert. Proben liefen auf 16% Tricin-Gelen (Novex) gemäß Herstellerempfehlung. Die Gele wurden über Nacht unter Verwendung des kolloidalen Coomasie Staining Kit (Novex) gefärbt. Der Mark 12 Wide Range Standard wurde zur Abschätzung der Molekülgrößen eingesetzt.
(iv) Analyse der Proteinsequenz
Derivate von SP310 wurden unter Verwendung des SignalP WWW Servers analysiert, der unter http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/index.html verfügbar ist (Nielsen et al., 1997), um ihre Eignung als SP vorherzusagen.
(v) Fermentation
Fermentationsversuche wurden unter Verwendung von Tisch-Fermentern (Applikon) durchgeführt, die 1 Liter Medium enthielten und auf 30°C und Halten des pH über 5,2 eingestellt gefahren wurden.
2.3. Ergebnisse
(i) Ein Versuchsaufbau für die Analyse der Sekretionseffizienz in L. lactis
In Beispiel 1 wurden eine Reihe neuartiger SPs mit Hilfe der Insertionsmutagenese mit einem das nuc-Gen enthaltenden Tn917 konstruiert. Von diesen wurde SP310 für eine weitere Bearbeitung ausgewählt, da seine Verwendung die höchsten Erträge der Nuklease-(Nuc)-Sekretion ergab, wenn die Expression der SP310-nuc Genfusion von einem P170-Promotor auf einem Multicopy-Plasmid gesteuert war. Verglichen mit dem SP von Usp45 (SPUSP), dem hauptsächlich sezernierten Lactococcus-Protein, war die mit Hilfe von SP310 erhaltene Nuc-Sekretion signifikant geringer.
Um den Sekretionslevel von SP310 zu verbessern und die einfache Identifizierung von Mutanten mit einer verbesserten Nuc-Sekretion zu erlauben, wurden die Levels von Nuc in Überständen von Übernachtkulturen, die in GM17 gewachsen waren, mit dem Level verglichen, der bei einem Wachstum im Fermenter in SAIV-Medium erhalten worden war. Wie gezeigt, ergab die Verwendung der minimalen SP 35 as Wildtyp-Sequenz, einschließlich des Ala an Position +1 (Ala⁺¹, die N-terminale as des prozessierten Proteins), einen Sekretionslevel von 5,67 mg/l Nuc. Dies stellt etwa 78% des Levels dar, der unter Verwendung von SPUSP (Stamm PRA76) nach einem Wachstum über Nacht in GM17 festgestellt wurde (Tabelle 3). Gesamtlevels an sezernierter Nuc waren geringer als die im Fermenter erhaltenen Nuc-Levels, aber die relative Effizienz von SP310 lag in derselben Größenordnung verglichen mit SPUSP, d.h. über 58% (106 vs. 182 mg/l). Folglich wurde beschlossen, die Nuc-Sekretion in Überständen von in GM17 gewachsenen Übernachtkulturen für die erste Durchmusterung von SP310-Mutanten zu messen.
Insgesamt wurde eine etwa 20fache Abnahme des Gesamtbetrags der Nuc-Sekretion in GM17-Übernachtkulturen verglichen mit Fermentern erhalten. Dies ist im Wesentlichen auf eine unterschiedliche Regulation des P170-Promotors, auf ungleiche physiologische Bedingungen und verwendete Medien zurückzuführen. Für SP310 wurden 5,67 mg/l in GM17 Kulturüberständen und 106 mg/l im Fermenter gemessen. Die Ergebnisse der GM17-Kulturen sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
(ii) Ortsgerichtete Mutagenese der L. lactis SP310-Signalsequenz
Eine erste Analyse der primären SP310 as-Sequenz wurde unter Verwendung von SignalP durchgeführt. Effiziente bakterielle SPs zeigen ein Ala an Position –3, –1 und +1. Die Sequenz von SP310 enthielt ein Thr, eine relativ seltene as, an Position –3 (Thr^–3). Wie gezeigt, führte eine Substitution des Thr^–3-Restes durch Ala^–3 (in Stamm 310mut1) zu einer signifikanten Zunahme der Nuc-Sekretion (Tabelle 3). Es war offensichtlich, dass die C-terminale Region von SP310 (3) ungewöhnlich lang war und mehrere Reste (Position –10 bis –2; Ser^–9, Ser^–10, Asn^–5, Gln^–4, Gln^–7, Asp^–6 und Thr^–3) enthielt, die normalerweise in dieser Domäne Gram-positiver SPs nicht vorhanden sind. Eine Deletion von Thr^–3 und Asn^–2 und eine Substitution von Asn^–5 durch Ala^–3 wurde deshalb in 310mut2 eingebaut. Diese Mutante behält Ala an Position –3, –1 und +1 (3). Eine Analyse der Nuc-Sekretion in 310mut2 zeigte eine Zunahme von bis zu 24% verglichen mit dem Wildtyp SP310 und ebenfalls eine Zunahme bezogen auf die mit 310mut1 beobachteten Levels in GM17 gewachsenen Übernachtkulturen (Tabelle 3). Diese Ergebnisse bestätigten, dass eine Verkürzung der C-terminalen Region und Beibehaltung der Ala-Reste an der Schnittstelle zu einer beträchtlichen Verbesserung der Nuc-Sekretion in L. lactis führte.
Die Analyse von SP von Gram-positiven Bakterien unter Verwendung von SignalP sagte voraus, dass eine die Drehung begünstigende as (z.B. Gly oder Pro) häufig an der Position zwischen dem hydrophoben Kern und der C-terminalen Domäne lokalisiert ist. In SP310 sind zwei Ser-Reste (Ser^–10 und Ser^–9) in dieser Region lokalisiert. Wir konstruierten eine Mutante, der diese beiden Reste und Asp^–6 (310mut4) fehlte. Diese Veränderungen führten zu einer beträchtlichen Abnahme der Nuc-Level verglichen mit SP310 (Tabelle 3), was vermuten lässt, dass das Vorhandensein von Ser und/oder Asp in der C-terminalen Region von SP310 eine Voraussetzung für eine effektive Sekretion in L. lactis ist. Eine einzige Substitution in 310mut4, um einen Ala-Rest an Position –3 einzubauen (in 310mut5), beeinflusste nicht die Sekretionseffizienz (Tabelle 3), was sehr stark die essentielle Rolle dieser Reste aufzeigt. Allerdings führte eine Substitution von Asn^–2, Gln^–4 durch häufiger an diesen Positionen gefundenen as (Gln^–2 und Thr^–4) zusammen mit einer Substitution von Gln^–6 durch Pro^–6 in 310mut3 zu einem höheren Sekretionslevel verglichen mit SP310, aber einem geringeren als 310mut2. Pro wird ebenfalls in dieser Region des SP von zwei hauptsächlich extrazellulären L. lactis Proteinen, PrtP und Usp45, gefunden (Tabelle 4 unten) und die mit 310mut3 erhaltenen Ergebnisse stützen die Rolle dieser as bei der Sekretion. Interessanterweise ist ein doppeltes Ser in dieser Region in Exp2, einem weiteren extrazellulären L. lactis Protein, ebenfalls vorhanden, dessen SP vor kurzem identifiziert wurde (Pouquet et al., 1998).
Tabelle 4 Signalpeptid-Struktur in L. lactis
Eine Analyse weiterer Änderungen, die für eine Verkürzung der C-terminalen Region entweder durch Entfernen von Gln^–7 (Stamm 310mut7) oder Asp^–6 (Stamm 310mut8) konstruiert wurden, ergab eine signifikante Abnahme der Sekretion (Tabelle 3). Es bleibt unklar, ob die Längenänderung oder die Ladungsänderung in der C-terminalen Region für die Abnahme bei der Sekretionseffizienz verantwortlich ist.
Die N-terminalen Reste des reifen Proteins können ebenfalls für ein wirksames Prozessieren durch den Sekretionsmechanismus wichtig sein. In den L. lactis Usp45 und Exp2 sind Asp und Thr die ersten beiden as in dem prozessierten Protein (Tabelle 4). Folglich wurde eine Mutante untersucht, die diese beiden as an Position +1 und +2 enthielt, unter Beibehaltung der Sequenz von 310mut2 in dem SP. Wie gezeigt, sezernierte diese Mutante, 310mut6, eine geringfügig kleinere Menge an Nuc im Ver gleich zu 310mut2, obwohl die erhaltenen Levels verglichen mit SP310 höher waren (Tabelle 3).
Eine Reihe an Mutanten wurde konstruiert und charakterisiert, um die Rolle des hydrophoben Kerns bei der Sekretion in L. lactis zu untersuchen. In E. coli scheint der hydrophobe Kern eine wichtige Rolle bei der Sekretion zu spielen, und eine Erhöhung der Hydrophobizität dieser Region kompensiert Defekte entweder im N-Terminus oder in der Prozessierungsregion (REF). Deshalb wurde eine Substitution von ausschließlich Ala^–20 (in 310mut10) oder in Kombination mit Ser^–15 (Stamm 310mut11) durch Phe untersucht. Wie gezeigt, wurde eine Korrelation zwischen der Abnahme der Sekretionseffizienz und der Anzahl an eingeführten Phe beobachtet. Die Nuc-Sekretion in Stamm 310mut11 war viel geringer als in 310mut2 und geringfügig geringer als SP310 (Tabelle 3).
In E. coli hat sich das Vorhandensein von Leu in der hydrophoben Region ebenso als ein Verstärker der Sekretion erwiesen. Eine Reihe an Mutanten wurde deshalb konstruiert, die drei, sechs oder vierzehn Leu-Reste zusätzlich zu dem in SP310 vorhandenen Leu^–19 enthielten. In 310mutA, 310mutB und 310mutC wurde Leu an verschiedene Positionen in die hydrophobe Region eingeführt, wobei die Wildtyp-Sequenz in der C-terminalen Region beibehalten wurde (Tabelle 3). Eine große Abnahme der Effizienz (46% verglichen mit SP310) wurde in 310mutA beobachtet, und noch geringere Ausbeuten wurden in 310mutB (41%) und 310mutC (35%) erhalten, was darauf hindeutet, dass zunehmende Mengen an Leu zu einer allmählichen Abnahme des Sekretionslevels führen. Modifizierte Versionen von 310mutA und 310mutB, die ebenfalls Ala in Position –3 enthielten (entsprechend der C-terminalen Region von 310mut1), wurden ebenfalls untersucht. In einer dieser Mutanten, 310mutA1, war der Sekretionslevel etwas höher (63% verglichen mit SP310), was darauf hindeutet, dass konservierte Ala-Positionen in der Prozessierungsregion teilweise das Vorhandensein eines leichten Überschusses an Leu in dem hydrophoben Kern in L. lactis kompensieren. Wenn sechs Leu vorhanden waren (Stamm 310mutB1), war allerdings die erhaltene Ausbeute ähnlich wie von 310mutB, was darauf hindeutet, dass der höhere Leu-Gehalt in dem hydrophoben Kern nicht durch die Präsenz von Ala^–3 kompensiert werden kann (Tabelle 3).
Eine Reihe an Mutanten wurden konstruiert, um den Einfluss der N-terminalen Region auf die Sekretion zu erforschen. In dieser Reihe wurde die C-terminale Region von 310mut2 (oder 310mut7) verwendet und es erfolgte eine Entfernung von Phe oder Asn aus der N-terminalen Region, um die positive Gesamtladung zu erhöhen. In 310mutD2 führte die Entfernung von Phe^–33 zu höheren Sekretionslevels als SP310, aber geringeren als von 310mut2 (Tabelle 3). Wenn die C-terminale Region von 310mut7 verwendet wurde, wurde eine noch geringere Ausbeute erhalten, was einen zusätzlichen Beweis lieferte, dass die Auswirkungen eines fehlenden Gln^–7 in einem SP, das eine kürzere oder polarere N-terminale Region trägt, abgeschwächt wurden. Die Entfernung von Asn^–32 (Stamm 310mutE2) führte zu maximalen Sekretionslevels, die mit 310mut2 identisch waren (Tabelle 3), was eine minimale Rolle dieses Restes für die Effizienz vermuten lässt. Eine drastische Abnahme wurde beobachtet, wenn die hydrophobe und C-terminale Region von 310mut11 mit der N-terminalen Region von 310mutD2 in Stamm 310mutE11 kombiniert wurde, was die Hauptrolle des hydrophoben Kerns bei der Gesamtleistung bei der Sekretion überzeugend bestätigte (Tabelle 3). In Stamm 310mutF2 wurde die N-terminale Region durch Substitution von Asn^–32 durch Lys modifiziert, um die positive Nettoladung zu erhöhen. Diese Änderung führte zum geringsten Nuc-Sekretionslevel, der bei allen untersuchten Mutanten festgestellt wurde (Tabelle 3). Folglich dürfte die Nettoladung der N-terminalen Region von SP310 das Maximum darstellen, das eine effiziente Sekretion in L. lactis zulässt.
(ii) Prozessierung und Sekretion von Nuc unter Verwendung von SP310 und ausgewählten Mutanten
Überstände von Übernachtkulturen von AMJ627, PRA159 und Mutanten PRA164, 310mutB und 310mutB wurden mit SDS-PAGE analysiert. In AMJ627 wurde eine kräftige Bande, die mit ihrer Größe dem prozessierten Nuc-Protein entsprach, zusätzlich zu der 45 kDa Hauptbande des Usp45-Proteins beobachtet (4, Spur 1). Bei PRA159 umfasst die Genfusion das volllange SP310 und 25 weitere Codons, die dem N-Terminus des prozessierten Proteins entsprechen (Beispiel 1). Eine 19 kDa Hauptbande wurde beobachtet, welche die erwartete Größe einer volllangen Nuc mit einer 25 as N-terminalen Erweiterung ist. Kleinere Banden in diesem Präparat dürften einer weiteren Prozessierung des Fusionsproteins in volllangem Nuc entsprechen (eine 16 kDa Bande wurde nachgewiesen; 4, Spur 2). In Stamm PRA164 stützte das Auftreten zweier Nuc-Hauptbanden die alternative Prozessierungsstelle, die durch die Sequenzanalyse unter Verwendung von SignalP (3) vermutet wurde. Eine einzige Nuc-Bande wurde in PRA164, 310mutB und 310mut6 festgestellt, was anzeigt, dass eine einige Prozessierungsstelle in diesen Mutanten genutzt wird. Die relativen Mengen an Nuc entsprachen den Aktivitätslevels, die in diesen Stämmen gemessen wurden (Tabelle 3).
(iii) Analyse der Nuc-Sekretion im Fermenter
Wie oben erwähnt, sind die Produktionslevels unter Verwendung des P170-abhängigen Expressionssystem von L. lactis wenigstens 20mal höher bei einem kontrollierten Wachstum in einem definierten Medium im Fermenter verglichen mit den Levels, die in Übernachtkulturen erhalten wurden, die in GM17-Vollmedium wuchsen. Deshalb wurden der Wildtyp-SP310 und drei Mutanten, die für eine maximale (310mut2), mittlere (310mut6) oder geringe (310mutB) Sekretionseffizienz stehen, für einen Vergleich mit AMJ627 (SPUSP) verwendet. Wie gezeigt, erzielte 310mut2 über 150 mg/l Nuc, was eine 45%ige Verbesserung bezogen auf SP310 darstellt (Tabelle 5 unten). Für 310mut6 bestätigten die erhaltenen Werte eine bessere Leistung (25% Verbesserung verglichen mit SP310), und 310mutB erzielte 50% der unter Verwendung von SP310 sezernierten Menge, was den Ergebnissen der ersten Durchmusterung in GM17 ähnelt. Interessanterweise ist die Ausbeute von 310mut2 im Fermenter mit SPUSP vergleichbar und erreicht 85% der Menge an Nuc, die vom letzteren sezerniert wird.
Tabelle 5. Nukleasesekretion im Fermenter
Stämme waren in SAIV in einem auf 30°C, pH 5,2 eingestellten Fermenter gewachsen.
REFERENZEN

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SEQUENZLISTE

Claims

Isoliertes DNA-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein Signalpeptid codiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR. 42 (310mut1), SEQ ID NR. 43 (310mut2), SEQ ID NR. 44 (310mut3), SEQ ID NR. 45 (310mut4), SEQ ID NR. 46 (310mut5), SEQ ID NR. 47 (310mut6), SEQ ID NR. 48 (310mut7), SEQ ID NR. 49 (310mut8), SEQ ID NR. 51 (310mut10), SEQ ID NR. 52 (310mut11), SEQ ID NR. 53 (310mutA), SEQ ID NR. 54 (310mutB), SEQ ID NR. 55 (310mutC), SEQ ID NR. 56 (310mutA1), SEQ ID NR. 57 (310mutB1), SEQ ID NR. 58 (310mutD2), SEQ ID NR. 59 (310mutD7), SEQ ID NR. 60 (310mutE2), SEQ ID NR. 61 (310mutE11) und SEQ ID NR. 62 (310mutF2).
Isoliertes DNA-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die für das Signalpeptid SEQ ID Nr. 41 (SP310) codiert.
Rekombinantes Plasmid, umfassend die DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2.
Plasmid nach Anspruch 3, das außerdem einen regulierbaren Promotor umfasst, der an eine Fusion aus dem Signalpeptid und dem nuc-Gen operativ geknüpft ist.
Rekombinantes Bakterium, umfassend die DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2.
Bakterium nach Anspruch 5, worin die DNA-Sequenz operativ an ein Gen geknüpft ist, das ein gewünschtes Genprodukt exprimiert, wobei das Genprodukt sekretiert wird.
Bakterium nach Anspruch 5 oder 6, welches ein Milchsäure-Bakterium ist.
Verwendung eines Bakteriums nach einem der Ansprüche 5–7 für die Produktion eines gewünschten Genprodukts.