ES2276691T3 - Peptidos señales aislados de lactococcus lactis. - Google Patents

Abstract

Una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de ADN que codifica para un péptido señal seleccionado a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO:42 (310mut1), SEQ ID NO:43 (310mut2), SEQ ID NO:44 (310mut3), SEQ ID NO:45 (310mut4), SEQ ID NO:46 (310mut5), SEQ ID NO:47 (310mut6), SEQ ID NO:48 (310mut7), SEQ ID NO:49 (310mut8), SEQ ID NO:51 (310mut10), SEQ ID NO:52 (310mut11), SEQ ID NO:53 (310mutA), SEQ ID NO:54 (310mutB), SEQ ID NO:55 (310mutC), SEQ ID NO:56 (310mutA1), SEQ ID NO:57 (310mutB1), SEQ ID NO:58 (310mutD2), SEQ ID NO:59 (310mutD7), SEQ ID NO:60 (310mutE2), SEQ ID NO:61 (310mutE11) y SEQ ID NO:62 (310mutF2).

Description

Péptidos señales aislados de Lactococcus lactis.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de los sistemas de expresión microbianos, en particular, a medios para mejorar el nivel de secreción de productos génicos homólogos o heterólogos en células huésped recombinantes. Específicamente, se proporcionan nuevos péptidos señal aislados a partir de Lactococcus spp., y mutantes de tales péptidos señal que tienen una mayor eficacia.

Antecedentes de la técnica y técnica anterior

El grupo de bacterias Gram positivas, denominadas generalmente bacterias del ácido láctico, incluyendo Lactococcus spp. tales como Lactococcus lactis, Lactobacillus spp., Streptococcus spp., Leuconostoc spp. y Oenococcus spp. se usan comúnmente en la fabricación de productos de alimentación y alimentos, por ejemplo, como cultivos de fermentación láctea en la fabricación de productos lácteos fermentados tales como mantequilla, queso y yogur. La Lactococcus lactis es un ejemplo típico de una bacteria Gram positiva usada para la fabricación de un amplio rango de productos lácteos fermentados.

Además, las bacterias del ácido láctico se usan actualmente como células huésped recombinantes para la producción de productos génicos heterólogos y homólogos tales como productos farmacéuticamente activos o enzimas. Entre las aplicaciones industriales emergentes para L. lactis, el trabajo reciente de los inventores se ha enfocado hacia la producción de proteínas heterólogas con un potencial como vacunas, agentes terapéuticos o enzimas. El sistema de expresión usado incluye un promotor fuerte regulado y ha permitido una producción de altos niveles de \beta-galactosidasa de Leuconostoc mesenteroides recombinante, LacLM (Madsen et al., 1999).

Con el desarrollo de microorganismos como fábricas de células para la producción de proteínas heterólogas, se han establecido un número de herramientas genéticas para conseguir una mejor expresión génica. Éstas incluyen a fuertes promotores, vectores de número de copia altos, el uso de codon optimizado y mejores cepas de producción, y su uso ha causado un aumento de los niveles de producción.

Usando estas herramientas optimizadas, la secreción de proteínas heterólogas en el sobrenadante del cultivo podría representar una etapa limitante. Por lo tanto, el conocimiento molecular de la secreción de proteínas también surge como un objeto de la investigación aplicado. Para facilitar el procesamiento corriente abajo de proteínas producidas por recombinación, generalmente se desea la secreción de la proteína. Para alcanzar una secreción eficiente de productos génicos heterólogos se requiere que sean usadas construcciones en las cuales el gen que codifica para el producto génico deseado se una operativamente a un gen que codifique para un péptido señal eficaz que pueda ser reconocido por las peptidasas de señal de la célula huésped.

El proceso de secreción en la bacteria incluye acontecimientos que ocurren justo después de la traducción del mRNA, es decir, el reconocimiento subsecuente del péptido señal (SP) en la cadena de polipéptidos desdoblada naciente por el aparato Sec y la división por la peptidasa señal en el desplazamiento a través de la membrana celular.

La ruta dependiente de Sec es el mejor sistema estudiado para la exportación de proteínas. Aunque se sepa que prácticamente todas las proteínas exportadas vía este mecanismo requieren un SP, no se entiende claramente cómo la estructura del SP interactúa con los diferentes componentes de la maquinaria de secreción en la célula. La reciente caracterización de una ruta independiente de Sec que es conservadora entre E. coli y plantas ilustra el hecho de que las proteínas sean exportadas por un número de rutas distintas (Settles y Martienssen, 1998; Stephens 1995). Los mecanismos implicados requieren normalmente la presencia de motivos de secuencia en la proteína exportada.

Los SP son las extensiones del extremo N-terminal presentes en las proteínas secretadas dependientes de Sec. La estructura de un SP típico incluye tres regiones distintas: (i) una región del extremo N-terminal que contiene un número de aminoácidos positivamente cargados, lisina y arginina; (ii) un corazón hidrófobo central y; (iii) un extremo C-terminal hidrófilo que contiene el motivo de secuencia reconocido por la peptidasa señal (von Heijne, 1990). A pesar de las semejanzas estructurales, se observa una gran variación de la secuencia entre los diferentes SP. Esta variación ha sido asociada recientemente con la selección específica de las proteínas secretadas (Martoglio y Dobberstein, 1998).

Los estudios de secreción en Escherichia coli han mostrado la influencia de la región del núcleo hidrófobo de SP en un procesamiento eficiente. Los SP con regiones del núcleo altamente hidrófobas soportaron una alta tasa de transporte incluso cuando se usó una región del extremo N-terminal cambiada con carga negativa (Izard et al., 1996). PhoA ha sido usado como una proteína modelo para estudios de secreción detallados en esta bacteria. El efecto de la eliminación de restos que rompen hélices (Gly o Pro) puede ser compensado por una mayor hidrofobia (Izard et al., 1995). En experimentos competitivos, dos SP idénticos fueron colocados extremo desde el extremo N-terminal al PhoA y la tasa de utilización ambos SP se demostró que era dependiente en pequeños aumentos de la hidrofobia de uno del SP (Chen et al., 1996). Además, se mostró que una carga negativa reducida en el extremo amino terminal causaba una afinidad total inferior para la ruta de transporte (Izard et al., 1996).

La caracterización de numerosas proteínas extracelulares ha permitido el desarrollo de un método para la predicción de la presencia y la localización de sitios de división del péptido señal en secuencias de aminoácidos de diferentes organismos incluyendo procariotas gram positivo y gram negativo, y eucariotas (Nielsen et al., 1997). El método implica una predicción de sitios de división y una predicción del péptido señal/péptido no señal basada en una combinación de varias redes neuronales artificiales. El uso de este método permite el diseño preliminar y el análisis de derivados de SP antes de su construcción y del ensayo in vivo.

Las proteínas que son seleccionadas para la secreción incluyen una secuencia señal o péptido señal (SP) en el extremo N-terminal. Los SP son reconocidos y divididos por una peptidasa líder o señal, un componente de la maquinaria de secreción de la célula, durante el desplazamiento a través de la membrana celular (Martoglio y Dobberstein, 1998). Los SP tienen normalmente de 25 a más de 35 aminoácidos (aa) en tamaño en bacterias Gram positivas. Los SP no comparten la homología de secuencia, pero a menudo están compuestos de un extremo amino-terminal que incluye uno o varios aa básicos, un corazón hidrófobo central de siete o más aa, y un extremo carboxi-terminal hidrófilo que contiene el motivo que es reconocido por las peptidasas de señal (Martoglio y Dobberstein, 1998). Una revisión de los SP disponible de L. lactis sugirió el uso del SP a partir de Usp45, la principal proteína de lactococos secretada (van Asseldonk et al., 1990). Este SP, según se comentaba, era funcional en la secreción de varias proteínas heterólogas en L. lactis (van Asseldonk et al., 1993).

Estrategias tradicionales para la identificación de los SP en L. lactis han seguido la construcción de genotecas genómicas en un vector que llevaba un gen indicador sin promotor. En general, el trabajo en bacterias Gram positivas ha implicado el uso de genes indicadores con una funcionalidad demostrada para la identificación de los SP en bacterias Gram negativas. Estos indicadores incluyen BlaM, la \beta-lactamasa de E. coli (Sibakov et al., 1991; Pérez-Martínez et al., 1992). El uso de BlaM para la identificación de SP de L. lactis implicaba una limitación en la posibilidad del rastreo directo en L. lactis y esto ha sido asumido que es debido a diferencias del uso del codon y a los requerimientos de plegamiento de la proteína para BlaM (Pouquet et al., 1998). Por lo tanto, el rastreo primario de genotecas genómicas de bacterias Gram positivas ha sido llevado a cabo hasta ahora en E. coli y consecuentemente han sido analizados clones positivos en L. lactis (Sibakov et al., 1991; Pérez-Martínez et al., 1992) imponiéndose así una tediosa y laboriosa etapa de selección para la funcionalidad en el huésped primario. Un indicador de secreción más apropiado, la \beta-amilasa extracelular de Bacillus licheniformis también se ha usado en el rastreo para los SP de lactococos, pero siguiendo la misma estrategia de rastreo (Pérez-Martínez et al., 1992). Estas estrategias causaron el aislamiento de los SP del tipo I exclusivamente. Además, algo de la funcionalidad de las secuencias identificadas fue debida a la presencia de restos de aminoácidos derivados de sitios de clonación múltiples en el vector. Estos aminoácidos satisficieron los requerimientos para la región del extremo C-terminal de estos tipos de SP (Pérez-Martínez et al., 1992).

Sumario de la invención

En consecuencia, la invención se refiere, en un primer aspecto, a una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de ADN que codifica para un péptido señal seleccionado a partir del grupo que consiste en 310mut1 (SEQ ID NO:42), 310mut2 (SEQ ID NO:43), 310mut3 (SEQ ID NO:44), 310mut4 (SEQ ID NO:45), 310mut5 (SEQ ID NO:46), 310mut6 (SEQ ID NO:47), 310mut7 (SEQ ID NO:48), 310mut8 (SEQ ID NO:49), 310mut10 (SEQ ID NO:51), 310mut11 (SEQ ID NO:52), 310mutA (SEQ ID NO:53), 310mutB (5EQ ID NO:54), 310mutC (SEQ ID NO:55), 310mutA1 (SEQ ID NO:56), 310mutB1 (SEQ ID NO:57), 310mutD2 (SEQ ID NO:58), 310mutD7 (SEQ ID NO:59), 310mutE2 (SEQ ID ND:60), 310mutE11 (SEQ ID NO:61) y 310mutF2 (SEQ ID NO:62).

En un aspecto más, la presente invención se refiere a una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de ADN que codifica para el péptido señal SP310 (SEQ ID NO:41).

Otros aspectos más de la presente invención se refieren a un plásmido recombinante y a una bacteria recombinante que comprende una secuencia de ADN de acuerdo con la invención.

En un aspecto todavía más, la presente invención se refiere al uso de una bacteria de acuerdo con la invención para la producción de un producto génico deseado.

Descripción detallada de la invención

Un objetivo principal de la presente invención es proporcionar un nuevo elemento transponible que permita la identificación directa, es decir, sin uso de una especie bacteriana intermedia, en el genoma de una bacteria del ácido láctico de una secuencia que codifica para un SP. Tal elemento puede ser proporcionado por un método para construir un derivado de transposón para identificar en una bacteria del ácido láctico una secuencia de ADN que codifica para un péptido señal (SP).

En una primera etapa, se selecciona una molécula de ADN que comprende un transposón, que incluye entre su extremo izquierdo (EI) y su extremo derecho (ED) una secuencia que comprende un gen indicador promotor sin promotor y un sitio de unión del ribosoma (RBS). En el contexto presente, una tal molécula de ADN útil es una que comprende el transposón Tn917 o un derivado de éste. Un derivado de Tn917 particularmente útil es el plásmido pLTV1 que además del transposón Tn917 comprende un gen lacZ sin promotor y un sitio de unión del ribosoma (RBS).

A partir de la molécula de ADN transponible básica seleccionada se suprime una región, localizada entre el EI y el gen indicador sin promotor, para obtener una molécula de ADN modificada que conserva su transponibilidad y su RBS, seguido por la inserción de un sitio de restricción único en la región restante localizada entre el EI y el gen indicador sin promotor e insertando en dicho sitio de restricción único una secuencia de ADN que codifica para una molécula indicadora de la secreción que no incluya una secuencia que codifique para un SP.

Al suprimir la región localizada entre el EI y el gen indicador sin promotor se logra que el derivado de transposón así obtenido esté sin codones de terminación en marco con la molécula indicadora de la secreción permitiendo, en la transposición, fusiones translacionales corriente arriba del EI.

Entre los indicadores de la secreción que pueden ser usados en L. lactis y otras especies bacterianas del ácido láctico, los genes que codifican para nucleasas se prefieren en la presente, incluyendo la nucleasa (Nuc) de Staphylococcus aureus, una proteína extracelular natural que se ha demostrado que es útil en L. lactis como indicador de la secreción (Poquet et al., 1998). El Nuc es adecuado para el rastreo de SP ya que la proteína es inactiva intracelularmente y su estructura es bastante simple (es un monómero, carece de puentes disulfuro). Además, el uso del codon en el gen nuc es apropiado por el alto nivel de expresión en lactococos, y el ensayo de placa para la detección de secreción no es tóxico, eliminando la necesidad del replicación en placa.

Las moléculas derivadas del transposón son útiles para la identificación en una bacteria del ácido láctico de una secuencia de ADN que codifica para un péptido señal (SP). Tal molécula comprende un primer elemento en forma de una molécula de ADN que comprende un elemento transposón incluyendo entre su extremo izquierdo (EI) y su extremo derecho (ED) una secuencia que comprende un gen indicador promotor sin promotor y un sitio de unión del ribosoma. Un ejemplo de un gen indicador promotor útil es el gen lacZ.

Es una propiedad significativa de este primer elemento que la molécula de ADN esté sin codones de terminación en la región corriente arriba del gen indicador del promotor que está en marco con la molécula indicadora de la secreción del segundo elemento inferior, lo que permite, en la transposición del derivado de transposón, la expresión de fusiones translacionales corriente arriba del EI.

La molécula del derivado de transposón comprende, como un segundo elemento, una secuencia de ADN que codifica para una molécula indicadora de la secreción, estando dicha secuencia de ADN sin una secuencia que codifique para un SP. En una realización preferida en la presente invención, el gen indicador de secreción es un gen que codifica para una nucleasa tal como el gen nuc derivado de Staphylococcus aureus.

En realizaciones útiles, el derivado de transposón se deriva a partir de Tn917 o su derivado incluyendo pLTV1. Un derivado del transposón particularmente útil de acuerdo con la invención es el pTnNuc, cuya construcción y función se describen detalladamente en los ejemplos siguientes. Además de los primeros y segundos elementos anteriores, el derivado del transposón puede comprender además un marcador de selección, por ejemplo, un gen con resistencia a antibióticos o una mutación que confiera auxotrofía contra un componente nutritivo esencial.

La identificación, en una bacteria del ácido láctico, de una secuencia de ADN que codifica para un péptido señal (SP) puede ser lograda por el método descrito en este documento. El método comprende las etapas de transformar una bacteria del ácido láctico con una molécula de derivado de transposón como se describe anteriormente y seleccionar de la bacteria del ácido láctico transformada, células en las cuales el gen indicador promotor sin promotor se exprese y se secrete el producto génico de la secuencia de ADN que codifica para una molécula indicadora de la secreción.

Será apreciado que una expresión del gen indicador del promotor es una indicación de que el elemento transponible ha sido integrado en un gen de la célula bacteriana de ácido láctico en una posición en la que se une operativamente a un promotor en el cromosoma de la célula. El rastreo simultáneo para la expresión del gen indicador sin promotor y el gen indicador de secreción en el medio, que son indicativos para el producto de fusión del gen indicador promotor y el gen indicador de secreción, permite la identificación directa de clones que comprenden una secuencia que codifica para un SP funcional.

La bacteria del ácido láctico, que se usa en lo anterior como una fuente para los SP funcionales, puede ser de cualquier especie que pertenezca al grupo de bacterias generalmente conocido como bacterias del ácido láctico. Este grupo incluye Lactococcus spp., tales como Lactococcus lactis, Lactobacillus spp. incluyendo como ejemplos Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus plantarum, Leuconostoc spp. tales como Leuconostoc mesenteroides, Oenococcus spp. y Streptococcus spp.

En realizaciones preferidas, el derivado de transposón es transpuesto al azar o casi al azar.

Será apreciado que cuando los clones, que comprenden una secuencia que codifica para un SP funcional, han sido identificados usando el método anterior, tal secuencia puede ser aislada conforme a técnicas convencionales para aislar secuencias de nucleótidos. Habiendo aislado tal secuencia, de ser deseado, puede ser insertada en especies homólogas o heterólogas con el objetivo de mejorar u optimizar la secreción de los productos génicos deseados.

Las moléculas de ADN adecuadas incluyen tales moléculas en las que la secuencia de ADN que codifica para un péptido señal es el clon SP310 como se describe en los ejemplos siguientes, y su mutante.

Se ha encontrado que es posible realzar la eficacia de secreción de un producto génico deseado uniendo operativamente el gen que codifica para el producto génico a un mutante de una secuencia que codifica para un SP que se da naturalmente. Tal mutación puede ser producida por técnicas de mutagénesis convencionales tales como mutagénesis mediante irradiación UV o usando mutágenos químicos. Sin embargo, se ha encontrado que la mutagénesis dirigida es un medio conveniente y eficaz para producir a mutantes de SP que tienen mejores características funcionales. Tal mutagénesis puede causar la sustitución, deleción o adición de uno o varios restos de aminoácidos. En los ejemplos siguientes, se describe un rango de tales SP mutados, de los cuales varios muestran una eficacia de secreción más alta que el SP tipo silvestre correspondiente. Estos mutantes incluyen los designados en este documento como 310mut1, 310mut2, 310mut3, 310mut4, 310mut5, 310mut6, 310mut7, 310mut8, 310mut10, 310mut11, 310mutA, 310mutB, 310mutC, 310mutA1, 310mutB1, 310mutD2, 310mutD7, 310mutE2, 310mutE11 y 310mutF2, respectivamente.

La invención también proporciona plásmidos recombinantes que comprenden una molécula de ADN aislada de la invención. Un ejemplo de tal plásmido incluye \Delta310::Nuc como se describe en este documento. En realizaciones útiles, el plásmido recombinante de acuerdo con la invención comprende a un promotor regulable operativamente unido al gen indicador de secreción. La regulación de la actividad del promotor preferiblemente está causada por factores condicionantes del crecimiento para la célula huésped que lleva el plásmido tales como la temperatura de crecimiento, el pH, la fase de crecimiento y los cambios de la composición nutritiva del medio que ocurren durante el crecimiento de la célula huésped. En el contexto presente, un promotor útil es el promotor P170 como se describe a continuación en este documento.

En un aspecto todavía más, la invención se refiere a una bacteria recombinante que comprende una secuencia de ADN de la invención. Una tal bacteria recombinante es cualquier bacteria gram positivo o gram negativo que se use como célula huésped en la producción de los productos génicos deseados. Los ejemplos típicos de bacterias gram positivo incluyen las especies bacterianas del ácido láctico, las especies Bacillus spp. y Streptomyces y los ejemplos de bacterias Gram negativas incluyen como un ejemplo típico E. coli.

La invención será ilustrada a continuación en los siguientes ejemplos no limitantes y los dibujos en los que:

La figura 1A ilustra la construcción de pTnNuc, una herramienta indicador de secreción en L. lactis. Los detalles de la construcción de TnNuc son descritos en el Ejemplo 1. Los plásmidos no son dibujados para escalar y sólo se muestran las propiedades relevantes. Sitios de restricción. A: AatII; B: BsmI; E: EcoRV; N: NsiI; R: RsrII; S: SmaI. Los plásmidos pPRA contienen el fragmento 3.1 de EcoRV a partir del pLTV1 que atraviesa de la región de codificación del gen tet (flecha de tet abierta) a dentro del gen lacZ (flecha de lacZ rayada) y que incluye la repetición izquierda de Tn917 (caja de EI rellena). Este fragmento (caja de LTV1 abierta) y la posición del EI (caja de EI rellena) se muestra en los plásmidos pPRA para su claridad. La región delecionada entre EI y lacZ es representada como un triángulo abierto en pPRA4B.

La figura 1B ilustra los detalles de las posiciones nt usadas en el análisis de deleción del derivado Tn917 en pLTV1 y son indicados junto con la funcionalidad de los diferentes derivados pPRA5 en la transposición;

La figura 2 resume un análisis de la eficacia de secreción para los SP de L. lactis seleccionados. Fueron corridos sobrenadantes concentrados (20 veces) de cepa PRA 157 (columna 1), PRA 158 (columna 2) y PRA159 (columna 3) en un gel de Tricina del 16% y tinción de Coomasie. El volumen cargado representa el contenido de proteína total de 100 \mul (PRA157 y PRA158) o 50 \mul (PRA159) de sobrenadante de cultivo. Se muestra la migración de marcadores de peso molecular en kDa a la izquierda. Se muestra a la derecha la posición de NucA y la proteína de longitud completa correspondiente (\Delta13::Nuc, \DeltaNuc::307 y \DeltaNuc::310). Una banda más débil con migración similar a \Delta13::Nuc y presente
en todas las cepas corresponde a Usp45, la principal proteína secretada de L. lactis (van Asseldonk et al., 1990);

La figura 3 es una descripción de la estrategia de mutagénesis dirigida para SP310 y la secreción de Nucleasa. Se muestra más arriba el perfil obtenido a partir del análisis de SP310 (SP310) tipo silvestre utilizando SignalP. Los valores C, S e Y son los tres parámetros usados en SignalP para la identificación de un SP. La flecha indica el sitio de procesamiento principal sugerido entre los restos Ala34-Ala35, las alteraciones de la secuencia son subrayadas; y

La figura 4 muestra el rendimiento de nucleasa secretado en cepas de L. lactis que contienen un SP310 cambiado. Los sobrenadantes de cultivos de una noche fueron concentrados aproximadamente 50 veces por TCA-precipitación. Un volumen correspondiente a 0,5 ml de sobrenadante de cultivo fue corrido en 14% de SDS PAGE (Novex). Columna 1: cepa PRA76 (Usp45SP-Nuc); columna 2: cepa PRA159 (construcción original con 60 aa a partir de la secuencia de SP310 fusionada al Nuc maduro); columna 3: cepa PRA162 (sólo los 35 aa de SP310 fusionados a Nuc); columna 4: cepa PRA164 (310mut2-Nuc); columna 5: cepa PRA170 (310mutB-Nuc); columna 6: cepa PRA250 (310mut6-Nuc); La migración de marcadores de peso molecular es indicada a la izquierda en kDa.

Ejemplo 1 El desarrollo de TnNuc y su uso para el aislamiento de nuevas señales de secreción en Lactococcus lactis

Abreviaturas: aa: aminoácido(s); B.: Bacillus; bp: pares de bases; E.: Escherichia coli, Em: Eritromicina; L.: Lactococcus; EI: repetición izquierda; nuc: gen que codifica la Nucleasa; Nuc: proteína de nucleasa; nt: nucleótido; S.: Staphylococcus; SP: péptido(s) señal o señal de secreción; St.: Streptococcus.

1.1. Resumen

Se describe la construcción de un nuevo derivado de Tn917-transposón, llamado TnNuc, que incluye el gen de nucleasa (nuc) de Staphylococcus aureus como un indicador para la secreción. La transposición de TnNuc en el cromosoma de L. lactis permite la generación de fusiones en marco con el gen nuc. El TnNuc también incluye LacZ, un indicador usado para la identificación de clones relevantes de la genoteca, es decir, clones con el fenotipo Lac^{+} que es el resultado de la transposición de TnNuc en un gen funcional en el cromosoma de L. lactis. La presencia de una secuencia señal funcional en la región flanqueante corriente arriba de la repetición izquierda del elemento transpuesto proporciona la detección de la actividad de la nucleasa usando un ensayo de placa sensible. El TnNuc fue usado para la identificación de nuevas señales de secreción de L. lactis. Las secuencias identificadas incluían proteínas secretadas de lactococos conocidas y desconocidas que contenían una secuencia señal de reconocimiento de peptidasa-I o una secuencia de reconocimiento de peptidasa-II. En un caso, el gen identificado codifica para una proteína transmembrana. Las secuencias identificadas fueron usadas para estudiar la funcionalidad cuando se localiza en un plásmido bajo el control del pH y el promotor dependiente de la fase de crecimiento P170 (Madsen et al. 1999). En todos los casos la secreción simultánea de nucleasa fue observada durante la inducción de P170 en un quemoestato.

1.2. Materiales y métodos (i) Cepas y condiciones de crecimiento

La cepa K-12 de Escherichia coli DH10B (Grant et al., 1990) cultivada en LB suplementado, si era apropiado, con 100 \mug/ml de ampicilina o 200 \mug/ml de eritromicina (Em), a 37ºC fue usada con objetivos de clonación, rescate de ADN de plásmido y propagación de ADN de plásmido. La cepa de Lactococcus lactis cremoris MG1614 (Gasson 1983) fue usada en experimentos que implicaban la construcción de inserciones de transposón, rastreo, análisis de inserciones de transposón y rescate de plásmido del ADN adyacente al sitio de inserción. La cepa de L. lactis subsp. cremoris MG1614 (Gasson 1983) fue usada para el análisis de señales de translocación aisladas. Las cepas de L. lactis fueron cultivadas en GM17 o ArgM17 (Israelsen et al., 1995) a 30ºC suplementado, si era apropiado, con 1 \mug/ml de eritromicina (GM17Em o ArgM17Em). En los experimentos del fermentador, un medio definido, 3 x SAIV (Jensen y Hammer, 1993) fue usado y el pH fue mantenido usando KOH.

La transformación de la bacteria fue realizada por electroporación, de acuerdo con procedimientos publicados para E. coli (Sambrook et al., 1989) y para L. lactis (Holo y N 1959), respectivamente.

(ii) Plásmido y construcción de TnNuc

La estrategia para la construcción y el análisis de los derivados de deleción de Tn917-LTV1 (Camilli et al., 1990) se ilustra en la figura 1. El fragmento de EcoRV de 3,1 kb de pLTV1, que atraviesa del extremo 3' del gen lacZ a la región de codificación del gen tet (posiciones de 12208 a 15335) fue subclonado en pBluescript SK-EcoRV - digerido (Stratagene), dando como resultado pPRA2. El ADN del plásmido de pPRA2 fue usado como una plantilla para la PCR usando el cebador PSS1b (5'-CGATGAATGC CGGACCGAAT TGATACACTA ATGCTTTTAT ATAGGG-3' (SEQ ID NO:1) que contenía el sitio de restricción para BsmI (subrayado) y RsrII (letras cursivas), respectivamente; posición 13374-13348 en pLTV1) y el cebador PSS14 (5'-GTGTAGTCGG TTTATGCAGC-3' (SEQ ID NO:2); posición 12672-12691 en el gen lacZ). El fragmento de 720-bp amplificado fue digerido con BsmI y AatII (sitio único en el fragmento de pLTV1 de 3,1 kb en pPRA2, figura 1) y fue clonado en pPRA2 BsmI y AatII-digerido, dando como resultado pPRA3. Los cuatro productos de la PCR diferentes (designados de 2A a 2D) fueron amplificados usando el ADN de pPRA2 como plantilla. La PCR fue llevada a cabo usando el cebador PSS3 (5'-CACACATACC AATA
CATGC-3' (SEQ ID NO:3); la posición 14391-14373 en pLTV1, véase la figura 1) en combinación con los cebadores siguientes que contenían un sitio de RsrII único (letras cursivas): (i) para 2A, cebador PSS4 (5'-GCATCGGTCC GTAGGCGCTC GGGACCCC-3' (SEQ ID NO:4). posición de 13665 a 13647 en pLTV1); (ii) para 2B, cebador PSS6 (5'-GCATCGGTCC GJJCTTATCG ATACAAATTC CTCG-3' (SEQ ID NO:5), posición de 13648 a 13626 en pLTV1); (iii) para 2C, cebador PSS8 (5'-GCATCGGTCC GAAATTTTRA AATCTATTTC TTATC-3' (SEQ ID NO:6), posición de 13633 a 13608 en pLTV1) y (iv) para 2D, cebador PSS10 (5'-GCATCGGTCC GTAAATGTAC AAAATAACAG CGAAAT-3' (SEQ ID NO:7), posición de 13613 a 13589 en pLTV1).

Los fragmentos de 2A a 2D fueron digeridos con RsrII y NsiI (un sitio único de NsiI en el fragmento de EcoRV de 3,1 kb de pLTV1, véase la figura 1) y fueron clonados en pPRA3 digerido de la misma manera, dando como resultado de pPRA4A a pPRA4D, respectivamente. De PPRA4A a pPRA4D fueron digeridos con EcoRV y los insertos de 2,8-2,9 kb fueron clonados en pLTV1 EcoRV - digerido para sustituir el fragmento original de 3,1 kb, dando como resultado los plásmidos de pPRA5A a pPRA5D (figura 1).

El pPRA5B fue escogido para construir el TnNuc. Utilizando pBS::Nuc (Le Loir et al., 1997) como plantilla de ADN y los cebadores PSSnuc1 (5'-GCATCGGACC GTCACAAACA GATAACGGCG-3' (SEQ ID NO:8), sitio de RswrII en letras cursivas y PSSnuc2 (GCATCGGTCC GCATTATTGA CCTGAATCAG-3' (SEQ ID NO:9), sitio de RsrII en letras cursivas), fue obtenido un fragmento de 531 bp. La digestión con RsrII y la ligadura subsecuente en pPRA5B tratado de la misma manera fue llevada a cabo y originó el pTnNuc. El fragmento de nuc codifica para la forma de NucB de la proteína (Poquet et al., 1998).

\newpage

Las inserciones del transposón fueron hechas transformando L. lactis con el vector que llevaba el derivado de Tn917 y cultivando estos con la selección de eritromicina. Las placas con transformantes fueron puestas en placas de replicación en X-gal como se describe por Israelsen et al. (1995) seguido por ensayos de placa de Nucleasa (Nuc) de LacZ^{+}-clones o fue generada una genoteca de inserciones de transposón poniendo en placas L. lactis transformado con alta densidad en placas petri de 140 mm cada una con 200 ml de agar SGM17 suplementado con 1 \mug/ml de Em. Las placas fueron incubadas 4 días a 30ºC y los clones fueron reunidos resuspendiendo las colonias en GM17Em y glicerol del 17%. La genoteca construida fue congelada en pequeñas alícuotas. Una alícuota posteriormente fue puesta en placa a una densidad de aprox. 500 cfu/placa en GM17Em o en ArgM 17Em. Los ensayos de Nuc entonces fueron realizados en colonias para identificar los clones que secretaban Nuc.

Para el análisis de la funcionalidad de los SP aislados en plásmido, fue usado pAMJ206. El pAMJ206 contiene el promotor de L. lactis regulado P170 (Madsen et al., 1999) localizado corriente arriba del sitio de unión del ribosoma (RBS) de pAK80 (Israelsen et al., 1995). Los sitios únicos de BgIII y SalI están localizados convenientemente justo corriente abajo del RBS. Un fragmento de PCR fue obtenido a partir de pBS:Nuc (Le Loir et al., 1997) utilizando los cebadores Nuc1 y Nuc2 (respectivamente, 5'-GGAAGATCTT CACAAACAGA TAACGGC-3' (SEQ ID NO:10) y 5'-ACGCGTCGAC GAATTCGATC TAAAATTAT AAAAGTGCC-3' (SEQ ID NO:11) sitios de restricción en letras cursivas), digerido con BgIII y SalI y ligado en pAMJ206, dando como resultado p\DeltaSPNuc. Este plásmido fue usado para la construcción del plásmido pPRA157, pPRA158 y pPRA159 como sigue. En pPRA157, un fragmento de PCR fue amplificado a partir del ADN cromosómico de MG1614 de L. lactis usando el cebador PSScluA-A y PSScluA-B (respectivamente, 5'-GCATCCCGGGG TCTAGATTAG GGTAACTTTG AAAGGATATT CCTatgAAA AAAACATTGA GAGACCAGTTACTTG-3' (SEQ ID NO:12) y 5'-GCATAGATCT ACTCCAACTA TCACCTGTTG CATTTGCTC-3' (SEQ ID NO:13), sitios de restricción, SmaI y BgIII en letras cursivas, la secuencia del vector de expresión pAMJ203 está subrayada y se muestra el codon de inicio ATG del gen cluA en el caso más bajo). Este fragmento atraviesa desde el codon de inicio del gen cluA a una posición de 1200 bp corriente abajo. En esta posición, fue observada la inserción de TnNuc en el clon SP13. Este fragmento fue clonado en p\DeltaSPNuc SmaI-BgIII digerido dando como resultado una proteína de fusión en marco CluA::Nuc que contenía solamente dos diferencias de aa (Arg-Ser, derivados de los sitios de clonación) respecto a la proteína producida en SP13.

La construcción de pPRA158 y pPRA159 fue llevada a cabo de la misma manera, pero clonando un fragmento de PCR correspondiente a los 120 primeros bp de la región de codificación para los genes inactivados por la inserción de TnNuc en el clon SP307 (fragmento amplificado usando los cebadores PSS307-A, 5'-GCATCCCGGG TCTAGATTAG GGTAACTTTG AAAGGATATT CCTCATGAAT AAATCAAAAA TTATTGCTTT CTCTGC-3' (SEQ ID NO:14) y PSS307-B, 5'-GCATAGATCT ATCAATGGAA TTAACATCAG CTGCCATGC-3' (SEQ ID NO:15), respectivamente, sitios de SmaI y BgIII en letras cursivas) y SP310 (fragmento amplificado usando los cebadores PSS310-A, 5'-GCATCCCGGG TCTAGATTAG GGTAACTTTG AAAGGATATT CCTCATGAAA TTTTATAAAAA AAAGAGTTGC AATAGCC-3' (SEQ ID NO:16) y PSS310-B, 5'-GCATAGATCT GTTATCATTA AAATCACTCC GATTAAGAG-3' (SEQ ID NO:17), respectivamente, sitios SmaI y BgIII en letras cursivas), respectivamente en p\DeltaSPNuc.

Además, la cepa AMJ627 fue construida clonando un fragmento de PCR que contenía el extremo N-terminal de 29 aa que incluía el SP de Usp45 (SP_{usp}, amplificado usando los cebadores Usp1 (5'-TAGTAGGATC CCGGGTCTAG ATTAGGGTAA CTTTGAAAGG ATATTCCTCatg AAAAAAAA GATTATCTCAGC-3' (SEQ ID NO:18), sitio de SmaI en letras cursivas, el codon de inicio ATG de usp45 en el caso más bajo) y Usp2 (5'-ACGCGTCGAC CTGCAGAGAT CTTGTGTCAG CGTAAACACC-3' (SEQ ID NO:19), el sitio de BgIII en letras cursivas) en p\DeltaSPNuc SmaI-BgII-digerido. Todas las construcciones de plásmido fueron confirmadas secuenciando las regiones relevantes.

(iii) Ensayo de nucleasa

El ensayo de nucleasa en placas fue realizado por el método de recubrimiento de colonias como se describe en Lachica et al., (1971), con las modificaciones siguientes: fueron usados ADN de esperma de arenque sonicado del 0,1% y CaCl_{2} 40 \muM en el recubrimiento y el agar del 1% fue sustituido con agarosa del 0,6%. Las colonias fueron cultivadas en placas de GM17Em, ArgM17Em o LBEM con glucosa del 0,3%. Las placas fueron incubadas de 30 minutos a 6 h a 37ºC después de la solidificación del recubrimiento. Las colonias que secretaban nucleasa se desarrollaban como una zona naranja clara sobre un fondo azul verde.

(iv) Mutagénesis de inserción con Tn917 y derivados

Los experimentos de inserción de transposón fueron realizados transformando L. lactis con el vector que llevaba el derivado de Tn917 y cultivando estos con la selección de eritromicina. Los transformantes primarios fueron puestas en placas de replicación X-gal como se describe por Israelsen et al., (1995) seguido de los ensayos de placa de Nucleasa de LacZ^{+}-clones. De forma alternativa, una genoteca de inserciones de transposón fue generada poniendo en placas L. lactis transformado con alta densidad en placas petri de 140 mm cada una con 200 ml de SGM17 suplementado con 1 \mug/ml de Em. Las placas fueron incubadas 4 días a 30ºC y los clones fueron reunidos resuspendiendo las colonias en GM17Em y glicerol del 17%. La genoteca construida fue congelada en pequeñas alícuotas. Las alícuotas posteriormente fueron descongeladas y colocadas en placas a una densidad de aprox. 500 cfu/placa en GM17 o en ArgM17 suplementado con Em. El ensayo de placa fue realizado entonces en colonias para identificar a los clones que secretaban la nucleasa.

(v) Electroforesis de gel de campo pulsado

La PFGE del ADN cromosómico SmaI - digerido de clones de L. lactis con transposones integrados fue llevada a cabo como se describe (Israelsen y Hansen, 1993) para analizar la distribución aleatoria de TnNuc.

(vi) Rescate de plásmido

El ADN de regiones que flanqueaban el transposón de Tnnuc integrado fue caracterizado como sigue. Para la región de ADN flanqueaba la EI de transposón, fue digerido ADN cromosómico (2 \mug) con EcoRI, fue ligado de nuevo en un volumen grande (200 \mul) para favorecer la ligadura intramolecular y fue transformado en DH10B de E. coli. Para la región de ADN adyacente al ED, el ADN cromosómico fue digerido con MluI o con BsiWI antes de la nueva ligadura y la transformación de DH10B de E. coli.

(vii) Caracterización de la proteína

Los sobrenadantes de cultivo alternativos fueron concentrados de 20 a 30 veces usando el procedimiento de fenol-éter (Sauvé et al., 1995). Las muestras fueron corridas en geles de Tricina (Novex) del 16%, de acuerdo con el fabricante. Los geles fueron teñidos de la noche a la mañana usando el kit de tinción de Coomasie coloidal (Novex). El estándar "Mark 12 Wide Range Standard" fue usado para estimar los tamaños moleculares.

(viii) Secuenciación de ADN y análisis por ordenador

Las construcciones de plásmido y el ADN de plásmido rescatado fueron secuenciados usando un kit de secuenciación de ciclo de cebador marcado fluorescente Thermo Sequenase (Amersham), cebadores Cy5-marcados y un Secuenciador de ADN ALFexpress (Pharmacia Biotech). Los datos de la secuencia de ADN fueron analizados usando el paquete de Wisconsin de Genetics Computer Group, Inc. Las posibles señales de secreción fueron analizadas usando el servidor WWW SignalP (Nielsen et al. 1997).

(ix) Fermentación

Los experimentos de fermentación fueron llevados a cabo usando fermentadores experimentales (Applikon) que contenían 1 litro de medio y fueron puestos para funcionar a 30ºC y para mantener el pH superior a 5,2.

1.3. Resultados (i) Identificación de la región mínima requerida para la transposición de Tn917 en Lactococcus lactis

La transposición del derivado de Tn917 incluido en pLTV1 fue demostrada durante la búsqueda de promotores regulados en L. lactis (Israelsen et al., 1995). Este derivado contiene un gen lacZ sin promotor en el extremo izquierdo del transposón y un sitio de unión del ribosoma derivado del gen spoVG de Bacillus subtilis. La secuencia de SpoVG::lacZ es insertada 278 bp a partir del extremo de Tn917, en una posición donde esta inserción no suprima la transposición (Youngman, 1987). Para desarrollar una herramienta de selección basada en el transposón para la identificación de señales de secreción de L. lactis, un gen indicador que codifique para una proteína secretada debe ser insertado en el extremo izquierdo del elemento, para permitir la generación de fusiones en marco con genes que codifiquen proteínas secretadas en la transposición. Esto requiere una distancia corta desde el extremo izquierdo de Tn917 junto con la anulación de los codones de terminación que prevendrían fusiones en marco con el gen indicador. Los plásmidos de pPRA5A a pPRA5D fueron construidos como derivados de pLTV1, conteniendo cada uno una pequeña deleción que atravesaba una posición dentro de (pPRA5A) o adyacente a (de pPRA5B a pPRA5D) el EI de Tn917 a la región justo corriente arriba de spoVG::lacZ (figura 1). Un sitio de RsrII único fue introducido en todos los derivados en la deleción. El MG1614 de L. lactis fue transformado usando pLTV1 y pPRA5A-D. Los transformantes fueron cultivados para cuatro rondas de replicación en placas de GM17EM. Un número grande de los transformantes iniciales dejó de crecer durante la replicación en placa. Estos correspondieron por lo visto a aislados que contenían un plásmido replicante reducidamente libre que fue perdido durante el crecimiento subsecuente sobre las placas, produciéndolos Em-sensibles. Los clones resistentes a Em estables representan la transposición del derivado de Tn917 en el cromosoma de L. lactis, aunque la posibilidad de integración del plásmido que lleva el transposón no pueda ser excluida en una fracción de los clones (Israelsen et al., 1995). La transformación de MG1614 de L. lactis con pLTV1, pPRA5B, pPRA5D, y pPRA5D causó una frecuencia similar de transformantes estables. Sin embargo, no fue obtenido ningún transformante estable usando pPRA5A. El derivado de Tn917 en pPRA5A contiene una deleción parcial del EI del elemento. La alteración de esta propiedad estructural puede ser responsable de la carencia observada de transposición en L. lactis. Se requiere integridad de secuencia en esta región para delimitar las fronteras del elemento y se observa una alta homología de secuencia entre los elementos Tn3-relacionados como Tn917 (Sherrat et al., 1989).

En MG1614 de L. lactis, la transformación con pLTV1 causó aproximadamente el 15% de colonias azules entre los clones resistentes a Em estables en placas que contenían X-gal (Israelsen et al., 1995). Las colonias azules son el resultado de la transposición de Tn917 corriente abajo de un promotor en el cromosoma de L. lactis. No fueron observadas ningunas diferencias significativas de la frecuencia de clones azules con pPRA5B, pPRA5D, o pPRA5D, comparado con pLTV1 (datos no mostrados) indicando que estos derivados eran funcionales en L. lactis.

Ya que pPRA5B incluía la deleción más grande y conservaba la funcionalidad, fue escogido para clonar un indicador de la secreción, el gen nuc de S. aureus.

(ii) Construcción de TnNuc, una herramienta para la identificación de péptidos señal en L. lactis

Un fragmento de PCR que incluía el nuc entero que codifica la región corriente abajo del SP (véase la sección 2.2) fue clonado en el sitio de RsrII único de pPRA5B, dando como resultado el pTnNuc (figura 1). En esta construcción, los codones de terminación en marco con el gen nuc son evitados permitiendo fusiones de translación corriente arriba del EI. El nuevo transposón, denominado TnNuc, fue usado para la construcción de una colección de mutantes en MG1614 de L. lactis. El TnNuc conserva la región codificante de lacZ original y el sitio de unión del ribosoma. Esta propiedad adicional de TnNuc proporciona un rasgo fenotípico (Lac^{+}) para revelar la presencia de actividad del promotor de secuencias corriente arriba del EI en la transposición, independientemente de la función génica. Así, la selección primaria para las colonias azules identifica a los clones de L. lactis cuando ocurre la transposición verdadera y cuando ocurre la transcripción en el TnNuc. Entre ellas, se espera que una proporción de clones contenga el TnNuc adyacente al extremo 5' de un gen que codifica para una proteína secretada.

(iii) Construcción y rastreo de una colección de integrantes de TnNuc

Fueron llevados a cabo dos experimentos de transformación independientes de MG1614 de L. lactis con pTnNuc. Ya que la identificación de un péptido señal funcional requiere tanto a un promotor activo como a un gen que codifique una proteína secretada, el rastreo inicial se dirigió a acontecimientos de transposición que conducen a la expresión de lacZ, excluyendo a los acontecimientos de integración que no causan una fusión con un promotor en la orientación correcta. En el primer experimento, los clones de 147 Lac^{+} fueron aislados y analizados respecto a la secreción de nucleasa usando el ensayo de recubrimiento de placa. Un número de clones que formaban colonias azules oscuras en placas X-gal mostraron una débil actividad de Nuc en las placas. Estos clones representaron la transposición de TnNuc en un gen fuertemente expresado, y el bajo nivel de Nuc en las placas podía ser el resultado de lisis celular limitada y no de una secreción real. Doce clones que mostraban un fenotipo de Lac^{+} débil y un nivel bajo de Nuc fueron seleccionados simultáneamente para posteriores análisis, ya que en estos casos la secreción verdadera de Nuc era más concebible.

En el segundo tipo de experimentos, fue inventado un procedimiento mejorado para reducir el rastreo elaborado y secuencial mencionado anteriormente y para tener en cuenta la recuperación de los clones que serían perdidos durante la replicación en placa de integrantes primarios debido a la actividad del promotor limitante dando lugar a colonias blancas en placas de X-gal. En este procedimiento, fueron puestos en placas transformantes primarios en placas de SGM15EM y fueron incubadas durante 4 días. Esta larga incubación sirvió para el objetivo de selección de integrantes resistentes a Em verdaderos y estables. Las colonias fueron reunidas y almacenadas como una genoteca que contenía aproximadamente 10^{4} transposantes independientes. Un análisis subsecuente de la genoteca fue llevado a cabo usando el ensayo de Nuc en las placas. Los clones de Nuc^{+} entonces fueron analizados con respecto a la actividad de LacZ. De 108 clones de Nuc^{+} obtenidos, 20 clones que mostraban (i) un fenotipo Nuc^{+} fuerte o (ii) un Nuc^{+} débil junto con un fenotipo Lac^{+} débil fueron seleccionados para análisis posteriores. Fue asumido que estos clones últimos incluían una integración de TnNuc en un gen de L. lactis funcional.

Para estudiar la distribución de TnNuc en el cromosoma de L. lactis, fue llevado a cabo PFGE en ADN cromosómico SmaI - digerido a partir de 49 clones de LacZ^{+} independientes. La presencia de TnNuc introduce dos sitios SmaI adyacentes, incluidos en la secuencia de TnNuc (figura 1), en el cromosoma de L. lactis. Así, la desaparición de un fragmento de SmaI solo a partir del perfil de PFGE de MG1363 de L. lactis y la presencia de dos bandas de SmaI nuevas demuestra la presencia de TnNuc. Entre los clones examinados, 35 mostraron la presencia de TnNuc en fragmento cromosómico de SmaI más grande de 600 kb. Esta frecuencia (71%) es compatible con la frecuencia de transposición antes mencionada (60%) de un sistema similar de Tn917, TV32, en la misma región cromosómica en MG1614 de L. lactis (Israelsen y Hansen, 1993). Dos clones tenían una o dos copias de TnNuc, respectivamente, en el fragmento cromosómico de SmaI de 310 kb. La transposición de TnNuc en los fragmentos cromosómicos de SmaI de 280 kb, 140 kb y 120 kb fue observada para 3, 2 y 2 clones, respectivamente. Para los 6 clones restantes, no fue detectado ningún cambio aparente en el perfil de PFGE. La inserción de TnNuc en uno de los fragmentos de SmaI más pequeños es asumida ya que el cambio de tamaño para estos fragmentos no sería detectado en las condiciones usadas para el PFGE (Israelsen y Hansen, 1993). Estos resultados confirmaron la distribución quasi-aleatoria de la transposición de TnNuc en L. lactis.

(iv) Análisis de secuencia de genes de L. lactis que codifican para proteínas secretadas

Todos los 32 clones obtenidos que mostraban un fenotipo Nuc^{+}/Lac^{+} positivo fueron usados en experimentos de rescate de plásmido para caracterizar los genes afectados por la transposición de TnNuc. En dos casos, el rescate de plásmido en E. coli no proporcionó ninguna transformante y los clones correspondientes no fueron analizados más. El ADN cromosómico (de 300 a 400 bp) que flanqueaba el EI de TnNuc fue secuenciado en plásmidos rescatados. En dos casos, la secuencia obtenida correspondió al pTnNuc. La integración de pTnNuc pero no la transposición puede haber ocurrido en estos clones de L. lactis. Para los 28 clones restantes, una secuencia del cromosoma de L. lactis fue identificada adyacente al EI de TnNuc, representando acontecimientos de transposición verdaderos. El análisis de ADN reveló la presencia de codones de terminación en la secuencia justo corriente arriba de la inserción de TnNuc, en marco con el gen nuc en 10 clones. Entre los 18 clones restantes, SP13 y SP36 incluyeron una inserción de TnNuc en el gen cluA. CluA es una proteína transmembrana implicada en la agregación de células entre bacterias donantes y receptoras durante la conjugación lactocócica (Godon et al., 1994). CluA tiene de hecho un péptido señal típico, objetivo para la peptidasa I de señal (Tabla 1). Nueve clones fueron identificados que contenían una inserción de TnNuc en 5 posiciones diferentes dentro del mismo gen. Este gen codifica para una supuesta proteína que contiene un péptido señal. Un clon representativo de este grupo, SP310, mostró una fuerte actividad de Nuc y una baja actividad de LacZ, indicando una secuencia señal eficaz responsable del Nuc secretado.

TABLA 1 Análisis de expresión y secreción de integrantes de TnNuc seleccionados. Búsqueda de homología y tipo de péptido señal

1

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{1}   \begin{minipage}[t]{150mm} Se muestra el número de
clones independientes con una inserción de Tn Nuc  en el mismo
 locus . También se da el número de localizaciones diferentes
dentro del gen objetivo entre paréntesis.\end{minipage} \cr 
 ^{2}  La actividad de Nuc fue registrada en placas usando el ensayo
de recubrimiento (véase la sección 2.3).\cr   ^{3}  La actividad de
LacZ fue registrada en placas que contenían
X  -  gal.\cr   ^{4}   \begin{minipage}[t]{150mm} El
análisis del péptido señal usando la red neuronal de SignalP
(Nielsen  et al ., 1997); I: péptido señal tipo I; II: péptido
señal tipo II (lipoproteína).\end{minipage} \cr   ^{5}  Gen
idéntico interrumpido que en el integrante de transposón antes
aislado PA243 (Israelsen  et al ., 1995)\cr   ^{6} 
 \begin{minipage}[t]{150mm}  dexB  de  Streptococcus
mutans , codifica una exoglicosilasa implicaba n el metabolismo
de almidón extracelular (Whiting  et al .,
1993).\end{minipage} \cr   ^{7}  Hialuronano sintasa (HAS) de
 Streptococcus equilisimus  (Ashbaugh  et al ., 1998).\cr 
 ^{8}  Homología frente a proteínas transportadoras de catión de
 E. coli .\cr  ND: Secuencia no disponible para el extremo 5'
del gen
relevante.\cr}

Los clones SP10 contenían la inserción de TnNuc en un locus cromosómico adyacente al operon thr que fue identificado previamente durante la búsqueda de promotores lactocócicos regulados usando pLTV1 (Madsen et al., 1996). SP10 mostró una fuerte actividad del promotor (LacZ), como fue mencionado para el integrante pLTV1 en el mismo locus, PA234 (Madsen et al., 1996). La proteína codificada contenía un supuesto péptido señal (Tabla 1).

El clon SP307 abrigaron una inserción de TnNuc en un gen que codificaba un homólogo de la hialuronasa sintasa estreptocócica (HAS), implicado en la síntesis de cápsula (Ashbaugh et al., 1998). Un péptido señal de lipoproteína (von Hejne, 1989)) está presente en el extremo N-terminal de la proteína codificada (Tabla 1).

El análisis de los clones SP11 y SP25 reveló una inserción de TnNuc en dos posiciones diferentes, 103 y 49 bp, respectivamente a partir del codon de inicio de ATG del gen interrumpido. Para SP25, la secuencia corta no es suficientemente larga para conformar un SP. Sin embargo, una relación favorable entre la actividad de Nuc y LacZ fue observada tanto a partir de SP11 como de SP25 (Tabla 1). La actividad de nucleasa observada puede ser debida al procesamiento parcial y a la secreción de la proteína de fusión de Nuc. De forma alternativa, el gen inactivado puede ser responsable de un componente de la maquinaria de secreción o de la membrana celular, conduciendo a una mayor secreción o salida de la proteína.

En dos clones, SP240 y SP330, no fue identificado ningún SP en el gen modificado. Para SP240, una búsqueda en la base de datos identificó una homología significativa respecto al gen dexB de St. mutans. dexB codifica una exoglicosilasa implicada en la degradación del almidón extracelular (Whiting et al., 1993). De modo interesante, ningún SP fue encontrado en DexB (Tabla 1). El mecanismo que es la base de la secreción de Nuc observada en SP240 y SP330 todavía es confuso.

Finalmente un gen que codifica una proteína de membrana fue el objetivo de inserción en el clon SP323. La supuesta proteína mostró homología frente a transportadores de Mg^{2+} de E. coli (Tabla 1).

(v) Análisis funcional de señales de secreción seleccionadas en un plásmido multicopia en L. lactis

Cuatro SP que representan secuencias a partir de genes conocidos (SP13) y desconocidos previamente (SP10, SP307 y SP310) y que pertenecían a SP reconocidos por la peptidasa señal I o II, fueron escogidos para posteriores análisis. Para analizar la eficacia de secreción para las parejas de fusión identificadas con TnNuc en el hábitat natural, fueron llevadas a cabo construcciones del plásmido para clonar la región mínima (es decir, la posición más cercana de inserción al codon de inicio ATG correspondiente, véase la sección 2.2). Los resultados preliminares mostraron que una fusión de proteína CluA-Nuc que llevaba una región CluA del extremo N-terminal incluyendo los primeros 60-150 aa no proporcionó cantidades detectables de Nuc secretado (datos no mostrados). Por lo tanto, fue usada una región que incluía 400 aa del extremo N-terminal de CluA correspondientes a la posición más cercana de inserción de TnNuc respecto al extremo 5' de cluA identificado en este documento para su comparación (SP13).

Para todos los otros SP, fue introducida una región del extremo N-terminal de 60 aa de la proteína (SP10, SP307 y SP310) como una fusión de proteína con Nuc (en adelante en este documento denominado \Delta10::Nuc, \Delta13::Nuc, \DeltaNuc::307 y \DeltaNuc::310, respectivamente), dando como resultado la cepa PRA156 (\Delta10::Nuc), PRA157 (\Delta13::Nuc), PRA158 (\Delta307::Nuc) y PRA159 (\Delta310::Nuc). El fragmento de Nuc usado en este estudio corresponde a la forma de NucB de la proteína. Esta forma es procesada además en una forma de 19 a 21 aa más corta, NucA (Pouquet et al., 1998). Las cepas de PRA156 a PRA159 incluyen un promotor dependiente del pH y de la fase de crecimiento, P170, para la expresión regulada (Madsen et al., 1999). La expresión conducida por P170 ocurre durante la transición a la fase estacionaria, cuando el medio de crecimiento es mantenido a pH\sim6,5. Los experimentos del fermentador fueron llevados a cabo usando las cepas anteriores, y fueron tomadas muestras al inicio de la fase estacionaria cuando fueron obtenidos los niveles de producción máximos (Madsen et al., 1999). Las medidas iniciales mostraron sólo niveles de actividad de Nuc de base en los sobrenadantes de cultivo de PRA156. Esta cepa por lo tanto no fue analizada posteriormente.

Fueron usados sobrenadantes de cultivo concentrados de PRA157, PRA158 y PRA159 para correr la SDS-PAGE. Como se muestra, fue observada secreción de NucA en las tres cepas (una banda de 19-kDa en las columnas 1-3, figura 2). Una banda adicional que correspondió en tamaño a la proteína de fusión de longitud entera fue identificada en PRA157 (una banda de 42-kDa) y PRA158 (una banda de 22-kDa; figura 2). En la cepa PRA159, fueron detectados dos productos adicionales de tamaño similar (aproximadamente 23 kDa), sugiriendo sitios de procesamiento alternativos del SP en SP310). Esta posibilidad fue apoyada por la identificación de dos supuestos sitios de procesamiento de la secuencia de aa primaria, en las posiciones 27 y 34 del Met inicial, utilizando SignalP (disponible en http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP, datos no mostrados). En general, la eficacia de secreción fue la más alta para PRA159 (\Delta310::Nuc) y la más baja para PRA157 (\DeltaCluA:; Nuc). Las muestras fueron usadas para la medida de la actividad de Nuc (Tabla 2).

Como comparación, fue usada la cepa AMJ627. AMJ627 abriga una construcción similar a lo anterior, y esto incluye el SP completo de Usp45 fusionado al Nuc (SP_{Usp}::Nuc; véase la sección 2.2). Los valores obtenidos confirmaron la eficacia de SP de Usp45 en la secreción. El SP usado en PRA159 (\Delta310::Nuc) secretó 67 mg/L de Nuc, o aproximadamente el 60% comparado con SP_{Usp}. Los niveles de actividad fueron inferiores para PRA158 (31%) y PRA157 (6%).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Actividad de nucleasa en sobrenadantes de cultivo de los clones seleccionados

2

Ejemplo 2 Caracterización molecular y modificación de SP310, un péptido señal de Lactococcus lactis 2.1 Resumen

Entre los péptidos señal (SP) identificados en el Ejemplo 1, SP310 mostró el nivel más alto de secreción. Sin embargo, los niveles obtenidos fueron inferiores a los obtenidos usando el péptido señal de Usp45 (SP_{Usp}), la principal proteína lactocócica secretada. En este ejemplo se describe un enfoque de mutagénesis dirigida para SP310 diseñado para mejorar los niveles de secreción y estudiar los requerimientos para la secreción dependiente de Sec en L. lactis. Uno de los mutantes analizados, SP310mut2, mostró un nivel de secreción similar a SP_{Usp}, proporcionando más de 150 mg/L de nucleasa (Nuc) de Staphylococcus aureus en el fermentador. Esto representa una mejora del 45% con respecto a la secuencia de SP310 tipo silvestre. El análisis de secreción de Nuc en los mutantes permitió el establecimiento de algunos de los requerimientos para la secreción eficiente en L. lactis. Las propiedades comunes para la ruta de secreción dependiente de Sec de L. lactis difieren de las propiedades mencionadas para Escherichia coli.

2.2. Materiales y métodos (i) Cepas y condiciones de crecimiento

La cepa DH10B de K-12 de Escherichia coli cultivada en LB o TB suplementado, si era apropiado, con 100 \mug/ml de ampicilina o 200 \mug/ml de eritromicina (Em) a 37ºC fue usada con objetivos de clonación, rescate de ADN de plásmido y propagación de ADN de plásmido. La cepa MG1363 de Lactococcus lactis cremoris (Gasson 1983) fue usada para el análisis de SP. Las cepas de L. lactis fueron cultivadas en GM17 (Israelsen et al., 1995) a 30ºC suplementado, si era apropiado, con 1 \mug/ml de eritromicina (GM17Em o ArgM17Em). En los experimentos del fermentador fue usado SAIV, un medio definido, (Jensen y Hammer, 1993) y el pH fue mantenido usando HCl o NaOH. La transformación de la bacteria fue realizada por electroporación, de acuerdo con procedimientos publicados (Sambrook et al., 1989) para E. coli y L. lactis (Holo y Nes 1989), respectivamente.

(ii) Mutagénesis dirigida de SP310 y construcciones del plásmido

Fueron usados los cebadores PSS310-A (5'-GCATCCCGGG TCTAGATTAG GGTAACTTTG AAAGGATATT CCTCATGAAA TTTTAATAAAA AAAGAGTTGC AATAGCC-3' (SEQ ID NO:20), sitio de SmaI en letras cursivas) y PSS310-B0 (5'-CTATTGGTTT GATTACGTCG GCTTTCTAGA TACG-3' (SEQ ID NO:21), sitio de BgIII en letras cursivas) para amplificar la secuencia de SP310 tipo silvestre (en adelante en este documento denominado SP310) usando el ADN de pPRA159 como plantilla. El fragmento amplificado fue digerido con SmaI y BgIII, fue purificado con geles de agarosa y clonado.

Para la construcción de 310mut1, fueron usados PSS310-A y PSS310-B1 (5'-GGTTCTATTG GTTCGATTAC GTCGGCTTTC TAGATACG-3' (SEQ ID NO:22), sitio de BgIII en letras cursivas, mutación subrayada). PSS310-A y PSS310-B2 (5'-GTTATAGTAG TTAGGTTCTA CGAGTT - - - CGTCGGCTTTCTAGATACG-3' (SEQ ID NO:23), sitio de BgIII en letras cursivas, mutaciones subrayadas y deleción mostrada como guiones) fueron usados para obtener 310mut2.

Fue producido 310mut3 usando PSS310-A y PSS310B3 (5'-CTATAAACAT TCAAAAAAAT GTTAT - - - TAGG
GT - - - TTGTGACGAG TTCGTCGGCT TTCTAGATAC G-3' (SEQ ID NO:24), sitio BgIII en letras cursivas, mutaciones subrayadas y deleción mostrada como guiones).

Fue construido 310mut4 usando PSS310-A y PSS310-B4 (5'-CTATAAACAT TCAAAAAAT GTTAT - - - TAGGT
T - - - TTGGTTIGAT TACGTCGGCT TTCTAGATAC G-3' (SEQ ID NO:25), sitio BgIII en letras cursivas, mutaciones subrayadas y deleción mostrada como guiones).

Fue obtenido 310mut5 usando PSS310-A y PSS310-B5 (5'-CTATAAACAT TCAAAAAAAT GTTAT - - - TAGGT
T - - - TTGGTTCGAT TACGTCGGCT TTCTAGATAC G-3' (SEQ ID NO:26), sitio de BgIII en letras cursivas, mutaciones subrayadas y deleción mostrada como guiones).

Fue construido 310mut6 usando el cebador PSS310-A y PSS310-B6 (5'-GTTATAGTAG TTAGGTTCTA CGAGTT - - - CGTCTATG A TCTAGATAC G-3' (SEQ ID NO:27), sitio de BgIII en letras cursivas, mutaciones subrayadas y deleción mostrada como guiones).

Fue obtenido 310mut7 usando los cebadores PSS310-A y PSS310-B2\DeltaQ (5'-GTTATAGTAG TTAG - - - CTA CGAGTT - - - CGTCGGCT TTCTAGATAC G-3' (SEQ ID NO:28), sitio de BgIII en letras cursivas, mutaciones subrayadas y deleción mostrada como guiones).

Fue producido 310mut8 usando el cebador PSS310-A y PSS310-B2\DeltaD (5'-GTTATAGTAG TTAGGTT - - - CGAGTT - - - CGTCGGCT TTCTAGATAC G-3' (SEQ ID NO:29), sitio de BgIII en letras cursivas, mutaciones subrayadas y deleción mostrada como guiones).

Fue construido 310mut10 usando el cebador PSS310-A y PSS310-B21F (5'-CGTTATCGGT GCAAATAAAA AAACTATAAA CATTCAAAAA AATGTTATAG TAGTTAGGTT CTACGAGTT - - - CGTCG GCTTTCTAGA TAC
G-3' (SEQ ID NO:30), sitio de BgIII en letras cursivas, mutaciones subrayadas y deleción mostrada como guiones).

Fue obtenido 310mut11 usando el cebador PSS310-A y PSS310-B22F (5'-CGTTATCGGT GCAAATAAAA AAA
CTATAAA CATAAAAAAA AATGTTATAG TAGTTAGGTT CTACGAGTT - - - CGTCG GCTTTCTAGA TACG-3' (SEQ ID NO:31), sitio de BgIII en letras cursivas, mutaciones subrayadas y deleción mostrada como guiones).

Para la construcción de 310mutA, fueron usados el cebador PSS310-AA (5'-CCTCCCGGGT CTAGATTAGG GTAACTTTGA AAGGATATTC CTCatgAAAT TTAATAAAAA AAGAGTTGCA ATAGCCTTGT TTATTGCTTT GATATTTGTA CTTTTTTTTC TTATATCATC-3' (SEQ ID NO:32), el sitio de SmaI en letras cursivas, el codon de inicio ATG en el caso más bajo y mutaciones subrayadas) y PSS310-B0.

Fue obtenido 310mutB usando el cebador PSS310-AB (5'-CCTCCCGGGT CTAGATTAGGG TAACTTTGAAA GGATATTCCTC atgAAATTTTA ATAAAAAAAG AGTTCTTATA CTTTTGTTTA TTCTTTTGAT ATTTGTACTT TTTTTTCTTA TATCATC-3' (SEQ ID NO:33), el sitio de SmaI en letras cursivas, el codon de inicio ATG en el caso más bajo y mutaciones subrayadas) y PSS310-BO. 310mutC fue obtenido usando el cebador PSS310-AC (5'-CCTCCCGGGT CTAGATFAGG GTAACTTTGA AAGGATATTC CTCatgAAAT TTAATAAAAA AAGACTTTTG CTTTTGCTTT TGCTTTTGCT TTTACTTCTT TTG-3' (SEQ ID NO:34), el sitio de SmaI en letras cursivas, el codon de inicio ATG en el caso más bajo y mutaciones subrayadas) y PSS310-AC (5'-GAAAATGAAG AAAACGAAAA CGAATATAGT AGTTAGGTTC TATTGGTTTG ATTACGTCGG CTTTCTAGAT ACG-3' (SEQ ID NO:35), sitio BgIII en letras cursivas y mutaciones subrayadas).

Fue construido 310mutA1 usando el cebador PSS310-AA y PSS310-B1 (5'-GGTTCTATTG GTTCGATTAC GTCGGCTTTC TAGATACG-3' (SEQ ID NO:36), sitio de BgIII en letras cursivas y mutación subrayada).

Fue obtenido 310mutB1 usando el cebador PSS310-AB (5'-CCTCCCGGGT CTAGATTAGG GTAACTTTGA AAGGATATTC CTCatgAAAT TTAATAAAA AAAGAGTTCT TATACTTTTTG TTTATTCTTT TGATATTTGT AC
TTTTTTTTT CTTATATCAT C-3' (SEQ ID NO:37), el sitio de SmaI en letras cursivas, el codon de inicio ATG en el caso más bajo y mutaciones subrayadas) y PSS310-B1.

La construcción de 310mutD2 fue realizada usando el cebador PSS310-A\DeltaF (5'-GCATCCCGGG TCTAGATTAG GGTAACTTTG AAAGGATATT CCTCatgAAA - - - AATAAAA AAAGAGTTGC AATAGCC-3' (SEQ ID NO:38), el sitio de SmaI en letras cursivas, el codon de inicio ATG en el caso más bajo, mutaciones subrayadas y deleciones mostradas como guiones) y PSS310B2.

Fue construido 310mutD7 usando el cebador PSS310-A\DeltaF y PSS310-B2\DeltaQ. 310mut E2 fue obtenido usando el cebador PSS310-A\DeltaN (5'-GCATCCCGGG TCTAGATTAG GGTAACTTTG AAAGGATATT CCTCatgAAA TTT-AAAA AAAGAGTTGC AATAGCC-3' (SEQ ID NO:39), sitio de SmaI en letras cursivas, el codon de inicio ATG en el caso más bajo y deleciones mostradas como guiones) y PSS310-B2.

La construcción de 310mutE11 fue realizada usando el cebador PSS310-A\DeltaF y PSS310-B22F.

\newpage

Fue construido 310mutF2 usando el cebador PSS310-AK (5'-GCATCCCGGG TCTAGATTAG GGTAACTTTG AAAGGATATT CCTCatgAAA TTTAAAAAAA AAAGAGTTGC AATAGCC-3' (SEQ ID NO:40), sitio de SmaI en letras cursivas, el codon de inicio ATG en el caso más bajo y mutaciones subrayadas) y PSS310-2.

En todos los casos, los clones fueron introducidos en E. coli por electroporación, y se confirmó la presencia de mutaciones en la secuencia 310 secuenciando ambas cadenas usando un kit de secuenciación de ciclo de cebador fluorescentemente marcado Thermo Sequenase (Amersham), cebadores Cy5-marcados y un Secuenciador de ADN ALFexpress (Pharmacia Biotech). El ADN del plásmido fue introducido posteriormente en MG1363 de L. lactis.

(iii) Análisis de proteínas y SDS-PAGE

Fueron concentrados sobrenadantes de cultivo de 20 a 30 veces usando el procedimiento de fenol-éter (Sauvé et al., 1995). Las muestras fueron corridas en geles de Tricina del 16% (Novex), de acuerdo con el fabricante. Los geles fueron teñidos de la noche a la mañana usando el kit de tinción de Coomassie Coloidal (Novex). Fue usado el estándar "Mark 12 Wide Range Standard" (Novex) para estimar tamaños moleculares.

(iv) Análisis de secuencia de proteínas

Fueron analizados derivados de SP310 usando el servidor WWW de SignalP disponible en http://www.cbs.dtu.dk/
services/SignalP/index.html (Nielsen et al. 1997) para predecir su conveniencia como SP.

(v) Fermentación

Fueron llevados a cabo experimentos de fermentación usando fermentadores experimentales (Applikon), conteniendo 1 litro de medio y puestos a funcionar a 30ºC y manteniendo el pH superior a 5,2.

2.3. Resultados (i) Un sistema experimental para el análisis de la eficacia de secreción en L. lactis

En el Ejemplo 1, un número de nuevos SP fue construido usando mutagénesis de inserción con un derivado de Tn917 que contenía el gen nuc. Entre estos, fue seleccionado SP310 para su posterior trabajo ya que su uso proporcionó los rendimientos de secreción más altos de Nucleasa (Nuc), cuando la expresión de la fusión génica de SP310-nuc fue conducida por el promotor P170 en un plásmido multicopia. Comparado con el SP de Usp45 (SPUSP), la principal proteína lactocócica secretada, el rendimiento de secreción de Nuc obtenido usando SP310 fue considerablemente inferior.

Para mejorar el nivel de secreción de SP310 y permitir la identificación fácil de mutantes con mayor secreción de Nuc, fueron comparados los niveles de Nuc en sobrenadantes de cultivo a partir de cultivos de una noche cultivados en GM17 con el nivel obtenido durante el crecimiento en el fermentador en medio SAIV. Como se muestra, el uso de la secuencia tipo silvestre de 35 aa de SP mínima incluyendo la Ala en la posición +1 (Ala^{+1}, el aa del extremo N-terminal de la proteína procesada) proporcionó un nivel de secreción de 5,67 mg/L de Nuc. Esto representa aproximadamente el 78% del nivel observado usando SP_{Usp} (cepa PRA76) después del crecimiento de una noche en GM17 (Tabla 3). Los valores totales de Nuc secretados fueron inferiores que los niveles de Nuc obtenidos en el fermentador, pero la eficacia relativa de SP310 fue del mismo orden de magnitud comparado con SP_{Usp}, es decir, más del 58% (106 frente a 182 mg/L respectivamente). Así, se decidió para medir la secreción de Nuc en los sobrenadantes de cultivo de una noche cultivados en GM17 para el rastreo inicial de mutantes SP310.

En general, fue obtenida aproximadamente una disminución de 20 veces en la cantidad total de secreción de Nuc en cultivos de una noche de GM17 comparado con los fermentadores. Esto es debido principalmente a la diferente regulación del promotor de P170, las desiguales condiciones fisiológicas y el medio usado. Para SP310, fueron medidos 5,67 mg/L en sobrenadantes del cultivo de GM17 y 106 mg/L en el fermentador. Los resultados de los cultivos de GM17 se resumen en la tabla 3.

\newpage

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}

3

\newpage

(ii) Mutagénesis dirigida de la secuencia señal de SP310 de L. lactis

El análisis inicial de la secuencia de aa de SP310 primaria fue llevado a cabo usando SignalP. Los SP bacterianos eficientes muestran un Ala en la posición -3, -1 y +1. La secuencia de SP310 incluía un Thr, un aa relativamente infrecuente, en la posición -3 (Thr^{-3}). Como se muestra, la sustitución del resto Thr^{-3} por Ala^{-3} (en la cepa 310mut1) causó un aumento significativo de la secreción de Nuc (Tabla 3). Era evidente que la región del extremo C-terminal de SP310 (figura 3), era excepcionalmente larga y que incluía un número de restos (posición de -10 a -2; Ser^{-9}, Ser^{-10}, Asn^{-5}, Gln^{-4}, Gln^{-7}, Asp^{-6} y Thr^{-3}) normalmente no presentes en este dominio de SP gram positivo. La deleción de Thr^{-3} y Asn^{-2} y la sustitución de Asn^{-5} por Ala^{-3} fue incorporada por lo tanto en 310mut2. Este mutante conserva Ala en la posición -3, -1 y +1 (figura 3). El análisis de secreción de Nuc en 310mut2 mostró un aumento de hasta el 24% comparado con el SP310 tipo silvestre y también un aumento con respecto a los niveles observados con 310mut1 en cultivos de una noche cultivados en GM17 (Tabla 3). Estos resultados confirmaron que el acortamiento de la región del extremo C-terminal y el mantenimiento de los restos Ala en el sitio de división causaban una mejora considerable de la secreción de Nuc en L. lactis.

El análisis de SP de bacterias Gram positivas usando el SignalP predijo que una vuelta que favorece a los aa (por ejemplo, Gly o Pro) es localizada a menudo en la posición entre el corazón hidrófobo y el dominio del extremo C-terminal. En SP310, dos restos Ser (Ser^{-10} y Ser^{-9}) se localizan en esta región. Los inventores construyeron a un mutante que carecía de estos dos restos y Asp^{-6} (310mut4). Estas alteraciones causaron una reducción considerable del nivel de Nuc comparado con SP310 (Tabla 3), sugiriendo que la presencia de Ser y/o Asp en la región del extremo C-terminal de SP310 era una exigencia para la secreción eficaz en L. lactis. Una sustitución sencilla en 310mut4 para incorporar un resto Ala en la posición -3 (en 310mut5) no afectó a la eficacia de secreción (Tabla 3), indicando el fuerte papel esencial de estos restos. Sin embargo, la sustitución de Asn^{-2}, Gln^{-4} con aa más frecuentes encontrados en estas posiciones (Gln^{-2} y Thr^{-4}), junto con una sustitución de Gln^{-6} a Pro^{-6} en 310mut3 causó un nivel más alto de secreción comparado con SP310, pero más bajo que 310mut2. Pro también se encuentra en esta región en el SP de las dos principales proteínas de L. lactis extracelulares, PrtP y Usp45 (Tabla 4 debajo) y los resultados obtenidos con 310mut3 apoyan el papel de este aa en la secreción. De modo interesante, una doble Ser está también presente en esta región en Exp2, otra proteína extracelular de L. lactis cuyo SP fue identificado recientemente (Poquet et al., 1998).

TABLA 4 Estructura del péptido señal en L. lactis

4

El análisis de cambios adicionales diseñados para acortar la región del extremo C-terminal eliminando tanto Gln^{-7} (cepa 310mut7) como Asp^{-6} (cepa 310mut8) causó una disminución significativa de la secreción (Tabla 3). Permanece confuso si el cambio de longitud o la alteración en la carga en la región del extremo C-terminal son responsables de la disminución en la eficacia de la secreción.

Los restos del extremo N-terminal de la proteína madura también pueden ser importantes para el procesamiento eficaz por la maquinaria de secreción. En Usp45 y Exp2 de L. lactis, Asp y Thr son los dos primeros aa en la proteína procesada (Tabla 4). Así, fue estudiado un mutante que incluía estos dos aa en la posición +1 y +2, conservando la secuencia de 310mut2 en el SP. Como se muestra, este mutante, 310mut6 secretaba una cantidad ligeramente inferior de Nuc comparado con 310mut2, aunque los niveles obtenidos fueran más altos comparados con SP310 (Tabla 3).

Una serie de mutantes fueron construidos y caracterizados para estudiar el papel del corazón hidrófobo en la secreción en L. lactis. En E. coli, el corazón hidrófobo parece efectuar un papel esencial en la secreción, y el aumento de la hidrofobia de esta región compensa los defectos en el extremo N-terminal o en la región de procesamiento (REF). Por lo tanto, fue analizada la sustitución de Ala^{-20} solo (en 310mut10) o en combinación con Ser^{-15} (cepa 310mut11) a Phe. Como se muestra, fue observada una correlación entre la disminución en la eficacia de secreción y el número de Phe introducidos. La secreción de Nuc en la cepa 310mut11 fue muy inferior a la de 310mut2 y ligeramente menor que SP310 (Tabla 3).

En E. coli la presencia de Leu en la región hidrófoba también se ha probado como potenciadora de la secreción. Una serie de mutantes fue construido por lo tanto que incluían tres, seis o catorce restos Leu además del Leu^{-19} presente en SP310. En 310mutA, 310mutB y 310mutC, fue introducido Leu en posiciones diferentes en la región hidrófoba que mantiene la secuencia de tipo silvestre en la región del extremo C-terminal (Tabla 3). Una gran reducción de la eficacia (del 46% comparado con SP310) fue observada en 310mutA, y fueron obtenidos rendimientos aún inferiores en 310mutB (41%) y 310mutC (35%), indicando que cantidades crecientes de Leu causan una disminución gradual en el nivel de secreción. Una versión modificada de 310mutA y 310mutB que incorporaba también un Ala en la posición -3 (correspondiente a la región del extremo C-terminal de 310mut1) fue estudiada. En uno de estos mutantes, 310mutA1, el nivel de secreción fue algo más alto (63% comparado con SP310) indicando que las posiciones Ala conservadas en la región de procesamiento compensan parcialmente la presencia de un exceso moderado de Leu en el corazón hidrófobo en L. lactis. Sin embargo, cuando seis Leu estaban presentes (cepa 310mut1), el rendimiento obtenido fue similar a 310mutB, indicando que el contenido de Leu más alto en el corazón hidrófobo no puede ser compensado por la presencia de Ala^{-3} (Tabla 3).

Una serie de mutantes fue construida para investigar la influencia de la región del extremo N-terminal en la secreción. En esta serie, fue usada la región del extremo C-terminal de 310mut2 (o 310mut7) y fue llevada a cabo la eliminación de Phe o Asn de la región del extremo N-terminal, para aumentar la carga total positiva. En 310mutD2, la eliminación de Phe^{-33} causó niveles de secreción más altos que en SP310, pero más bajos que en 310mut2 (Tabla 3). Cuando fue usada la región del extremo C-terminal de 310mut7 fue obtenido un rendimiento aún inferior, proporcionando pruebas adicionales de que la carencia de Gln^{-7} es atenuada en un SP que lleva una región más corta o más polar del extremo N-terminal. La eliminación de Asn^{-32} (cepa 310mutE2) causó niveles máximos de secreción idénticos a 310mut (Tabla 3), sugiriendo un papel mínimo de este resto en la eficacia. Una disminución drástica fue observada cuando la región hidrófoba y del extremo C-terminal de 310 mut11 fueron combinadas con la región del extremo N-terminal de 310mutD2 en la cepa 310mutE11, confirmando el fuerte papel principal del corazón hidrófobo en el funcionamiento total durante la secreción (Tabla 3). En la cepa 310 mutF2, la región del extremo N-terminal fue modificada por la sustitución de Asn^{-32} en Lys, para aumentar la carga neta positiva. Esta alteración causó un nivel más bajo de secreción de Nuc observado entre todos los mutantes analizados (Tabla 3). Así, la carga neta de la región del extremo N-terminal de SP310 podría representar el máximo permitido para una secreción eficiente
en L. lactis.

(ii) Procesamiento y secreción de Nuc usando SP310 y mutantes seleccionados

Fueron analizados 310mutB y 310mutB en SDS-PAGE a partir de sobrenadantes de cultivos de una noche de AMJ627, PRA159 y mutantes PRA164. En AMJ627, fue observada una banda fuerte que corresponde en tamaño a la proteína de Nuc procesada, además de la proteína principal de Usp45 de 45 kDa (figura 4, columna 1). Para PRA159, la fusión génica incluye el SP310 de longitud completa y 25 codones adicionales correspondientes al extremo N-terminal de la proteína procesada (Ejemplo 1). Una banda principal de 19 kD fue observada que es el tamaño esperado de un Nuc de longitud completa con una extensión de 25 aa del extremo N-terminal. Las bandas menores en esta preparación podrían corresponder a un procesamiento posterior de la proteína de fusión en el Nuc de cadena completa (fue detectada una banda de 16 kDa; figura 4, columna 2). En la cepa PRA164, la presencia de dos bandas de Nuc principales apoyó el sitio de procesamiento alternativo sugerido por el análisis de secuencia usando SignalP (figura 3). Una sola banda de Nuc fue detectada en PRA164, 310mutB y 310mut6, indicando que solo se usa un sitio de procesamiento en estos mutantes. Las cantidades relativas de Nuc eran consistentes con los niveles de actividad medidos en estas cepas (Tabla 3).

(iii) Análisis de secreción de Nuc en el fermentador

Como se menciona anteriormente, los niveles de producción usando el sistema de expresión P170-dependiente de L. lactis son al menos 20 veces más altos durante el crecimiento controlado en el medio definido en el fermentador comparado con los niveles obtenidos en los cultivos de una noche cultivados en medio rico en GM17. Por lo tanto, el SP310 tipo silvestre y los tres mutantes que representan la eficacia de secreción máxima (310mut2), media (310mut6) o baja (310mutB) fueron usados en comparación con AMJ627 (SPUSP). Como se muestra, 310mut2 proporcionó más de 150 mg/L de Nuc representando una mejora del 45% con respecto a SP310 (Tabla 5 debajo). Para 310mut6, los valores obtenidos confirmaron un mejor funcionamiento (una mejora del 25% comparado con SP310) y 310mutB proporcionó el 50% de la cantidad secretada usando SP310 simulando los resultados del rastreo inicial en GM17. De modo interesante, el rendimiento de 310mut2 en el fermentador es comparable con SP_{Usp}, alcanzando el 85% de la cantidad de Nuc secretado por éste.

TABLA 5 Secreción de nucleasa en el fermentador

5

Las cepas fueron cultivadas en SAIV en un fermentador puesto a 30ºC, pH 5,2.

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias

Ashbaugh, C. D., Alberti, S. y Wessels, M. R. (1998) Molecular analysis of the capsule gene region of group A Streptococcus: the hasAB genes are sufficient for capsule expression. J Bacteriol 180:4955-4959.

Camilli, A., Portnoy, A. y Youngman, P. (1990) Insertional mutagenesis of Listeria monocytogenes with a novel Tn917 derivative that allows direct cloning of DNA flanking transposon insertions. J Bacteriol 172:3738-3744.

Chen, M., y Nagarajan, V. (1994) Effect of alteration of charged residues at the N termini of signal peptides on protein export in Bacillus subtilis. J Bacteriol 176:5796-5801.

Chen, H., Kim, J., y Kendall, D. A. (1996) Competition between functional signal peptides demonstrates variation in affinity for the secretion pathway. J Bacteriol 178:6658-6664.

Collier, D. N. (1994) Escherichia coli signal peptides direct inefficient secretion of an outer membrane protein (OmpA) and periplasmic proteins (maltose-binding protein, ribose-binding protein, and alkaline phosphatase) in Bacillus sublilis. J Bacteriol 176:3013-3020.

Gasson, M. (1983) Plasmid complements of Streptococcus lactis NCDO712 and other lactic streptococci after protoplast-induced curing. J Bacteriol 154:1-9.

Godon, J. J., Jury, K., Shearman, C. A. y Gasson M. J. (1994) The Lactococcus lactis sex-factor aggregation gene cluA. Mol Microbiol 12:655-663

Grant, S. G., Jesse, J., Bloom, F. R. y Hanahan, D. (1990) Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutants. Proc Natl Acad Sci USA 87:4645-4649.

Holo, H., y Nes, I. F. (1989) High-frequency transformation, by electroporation of Lactococcus lactis subsp. cremoris grown with glycine in osmotically stabilized media. Appl Environ Microbiol 55:3119-3123.

Israelsen, H. y Hansen, E. B. (1993) Insertion of transposon Tn917 derivatives into the Lactococcus lactis subsp. lactis chromosome. Appl Environ Microbiol 59:21-26.

Israelsen, H., Madsen, S. M., Vrang, A., Hansen, E. B., y Johansen, E. (1995) Cloning and partial characterization of regulated promoters from Lactococcus lactis Tn917-lacZ integrants with the new promoter probe vector pAK80. Appl Environ Microbiol 61:2540-2547.

Jensen, P. R., y Hammer, K. (1993) Minimal requirements for exponential growth Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol 59:4363-4366.

Izard, J. W., Doughty, M. B., Kendall, D. A. (1995) Physical and conformational properties of synthetic idealized signal sequences parallel their biological function. Biochemistry 34:9904-9912.

Izard, J. W., Rusch, S. L., y Kendall, D. A. (1996) The amino-terminal charge and core region hydrophobicity interdependently contribute to the function of signal sequences. J Biol Chem 271:21579-21582.

Lachica, R. V., Genigeorgis, C. y Hoeprich, P. D. (1971) Metachromatic agar-diffusion methods for detecting staphylococcal nuclease activity. Appl Microbiol 21:585-587.

Le Loir, Y., Gruss, A., hrlich, S. D., y Langella, P. (1994) Direct screening of recombinants in gram-positive bacteria using the secreted staphylococcal nuclease as a reporter. J Bacteriol 176:5135-5139.

Madsen S. M., Albrechtsen, B., Hansen, E. B. y Israelsen, H. (1996) Cloning and transcriptional analysis of two threonine biosynthetic genes from Lactococcus lactis MG1614. J Bacteriol 178:3689-3694.

Madsen, S. M., Amau, J., Vrang, A., Givskov, M., y Israelsen, H. (1999) Molecular characterization of the pH-inducible and growth phase-dependent promoter P170 of Lactococcus lactis. Mol Microbiol 32:75-87.

Martoglio, B., y Dobberstein, B. (1998) Signal sequences: more than just greasy peptides. Trends Cell Biol 8:410-415.

Nielsen, H., Engelbrecht, J., Brunak, S., y von Heijne, G. (1997) A neural network method for identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Int. Neural Sys 8:581-599.

Poquet, I., Ehrlich, S. D., y Gruss, A. (1998) An export-specific reporter designed for gram-positive bacteria: application to Lactococcus lactis. J Bacteriol 180:1904-1912.

Ravn, P., Amau, J., Madsen, S., Vrang, A., y Israelsen, H. (1999) The development of TnNuc and its use for the isolation of novel secretion signals in Lactococcus lactis. (en prensa).

Sambrook, J., Fritsch, E. F., y Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

Santini, C. L., Ize, B., Chanal, A., Muller, M., Giordano, G. Wu, L. F. (1998) A novel sec-independent periplasmic protein translocation pathway in Escherichia coli. EMBO J 17:101-112.

Sauve D. M., Ho, D. T. y Roberge, M. (1995) Concentration of dilute protein for gel electrophoresis. Anal Biochem 226:382-383.

Settles, A. M., y Martienssen, R. (1998) Old and new pathways of protein export in chloroplasts and bacteria. Trends Cell Biol 8:494-501.

Sherrat, D. (1989) Tn3 and related transposable elements: site-specific recombination and transposition. En: Berg, E. D. y Howe, M. M. (eds.) Mobile DNA, American Society for Microbiology, Washington D.C., USA, págs. 163-184.

Stephens, C. (1998) Protein secretion: getting folded proteins across membranes. Curr Biol 8:578-581.

Takimura, Y., Kato, M., Ohta, T., Yamagata, H., y Udaka, S. (1997) Secretion of human interleukin-2 in biologically active form by Bacillus brevis directly into culture medium. Biosci Biotechnol Biochem 61:1858-1861.

van Asseldonk M., Rutten, G., Oteman, M., Siezen, R. J., de Vos, W. M. y Simons G. (1990) Cloning of usp45, a gene encoding a secreted protein from Lactococcus lactis subsp. lactis MG1363. Gene 95:155-60.

van Asseldonk M., de Vos. W. M., y Simons, G. (1993) Functional analysis of the Lactococcus lactis usp45 secretion signal in the secretion of a homologous proteinase and a heterologous alpha-amylase. Mol Gen Genet 240:428-434.

von Heijne, G. (1990) The signal peptide. J Mol Biol 115:195-201.

Wang, L. F., Kortt, A. A. y Stewart, D. J. (1993) Use of a gram- signal peptide for protein secretion by gram+hosts: basic protease of Dichelobacter nodosus is produced and secreted by Bacillus subtilis. Gene 131:97-102.

Weiner, J. H., Bilous, P. T., Shaw, G. M., Lubitz, S. P., Frost, L., Thomas, G. H., Cole, J. A y Turner, R. J. (1998) A novel and ubiquitous system for membrane targeting and secretion of cofactor-containing proteins. Cell 93:93-101.

Whiting. G. C., Sutcliffe, I. C. y Russell, R. R. (1993) Metabolism of polysaccharides by the Streptococcus mutants dexB gene product. J Gen Microbiol 139:2019-2026.

Youngman, P. (1987) Plasmid vectors for recovering and exploiting Tn917 transpositions in Bacillus and other Gram-positive bacteria. En: Hardy, K. G. (ed) Plasmids, a practical approach, IRL Press, Oxford, UK, págs. 79-103.

<110> Bioteknologisk Institut

\vskip0.400000\baselineskip

<120> MÉTODO PARA AISLAR SEÑALES DE SECRECIÓN EN BACTERIAS DEL ÁCIDO LÁCTICO Y NUEVAS SEÑALES DE SECRECIÓN AISLADAS DE LACTOCOCCUS LACTIS

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 21813PC1

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para la Versión 3.0 de Windows

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatgaatgc cggaccgaat tgatacacta atgcttttat ataggg

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgtagtcgg tttatgcagc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacacatacc aatacatgc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcatcggtcc gtaggcgctc gggacccc

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcatcggtcc gttcttatcg atacaaattc ctcg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcatcggtcc gaaattttta aatctatttc ttatc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcatcggtcc gtaaatgtac aaaataacag cgaaat

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcatcggacc gtcacaaaca gataacggcg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcatcggtcc gcattattga cctgaatcag

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaagatctt cacaaacaga taacggc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgcgtcgac gaattcgatc taaaattata aaagtgcc

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcatagatct actccaacta tcacctgttg catttgctc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcatagatct atcaatggaa ttaacatcag ctgccatgc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcatagatct gttatcatta aaatcactcc gattaagag

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgcgtcgac ctgcagagat cttgtgtcag cgtaaacacc

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctattggttt gattacgtcg gctttctaga tacg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggttctattg gttcgattac gtcggctttc tagatacg

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttatagtag ttaggttcta cgagttcgtc ggctttctag atacg

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttatagtag ttaggttcta cgagttcgtc tatgatctag atacg

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttatagtag ttagctacga gttcgtcggc tttctagata cg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttatagtag ttaggttcga gttcgtcggc tttctagata cg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggttctattg gttcgattac gtcggctttc tagatacg

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Phe Asn Lys Lys Arg Val Ala Ile Ala Thr Phe Ile Ala Leu}

\sac{Ile Phe Val Ser Phe Phe Thr Ile Ser Ser Ile Gln Asp Asn Gln Thr}

\sac{Asn Ala Ala Glu Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Phe Asn Lys Lys Arg Val Ala Ile Ala Thr Phe Ile Ala Leu}

\sac{Ile Phe Val Ser Phe Phe Thr Ile Ser Ser Ile Gln Asp Asn Gln Ala}

\sac{Asn Ala Ala Glu Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Phe Asn Lys Lys Arg Val Ala Ile Ala Thr Phe Ile Ala Leu}

\sac{Ile Phe Val Ser Phe Phe Thr Ile Ser Ser Ile Gln Asp Ala Gln Ala}

\sac{Ala Glu Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Phe Asn Lys Lys Arg Val Ala Ile Ala Thr Phe Ile Ala Leu}

\sac{Ile Phe Val Ser Phe Phe Thr Ile Ile Pro Asn Thr Ala Gln Ala Ala}

\sac{Glu Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Phe Asn Lys Lys Arg Val Ala Ile Ala Thr Phe Ile Ala Leu}

\sac{Ile Phe Val Ser Phe Phe Thr Ile Ile Gln Asn Gln Thr Asn Ala Ala}

\sac{Glu Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Phe Asn Lys Lys Arg Val Ala Ile Ala Thr Phe Ile Ala Leu}

\sac{Ile Phe Val Ser Phe Phe Thr Ile Ile Gln Asn Gln Ala Asn Ala Ala}

\sac{Glu Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Phe Asn Lys Lys Arg Val Ala Ile Ala Thr Phe Ile Ala Leu}

\sac{Ile Phe Val Ser Phe Phe Thr Ile Ser Ser Ile Gln Asp Ala Gln Ala}

\sac{Asp Thr Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Phe Asn Lys Lys Arg Val Ala Ile Ala Thr Phe Ile Ala Leu}

\sac{Ile Phe Val Ser Phe Phe Thr Ile Ser Ser Ile Asp Ala Gln Ala Ala}

\sac{Glu Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Phe Asn Lys Lys Arg Val Ala Ile Ala Thr Phe Ile Ala Leu}

\sac{Ile Phe Val Ser Phe Phe Thr Ile Ser Ser Ile Gln Ala Gln Ala Ala}

\sac{Glu Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Phe Asn Lys Lys Arg Val Ala Ile Ala Thr Phe Ile Ala Leu}

\sac{Ile Phe Val Ser Phe Phe Thr Ile Ser Ser Ile Gln Asp Ala Gln Ala}

\sac{Ala Glu Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Phe Asn Lys Lys Arg Val Ala Ile Ala Thr Phe Ile Phe Leu}

\sac{Ile Phe Val Ser Phe Phe Thr Ile Ser Ser Ile Gln Asp Ala Gln Ala}

\sac{Ala Glu Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Phe Asn Lys Lys Arg Val Ala Ile Ala Thr Phe Ile Phe Leu}

\sac{Ile Phe Val Phe Phe Phe Thr Ile Ser Ser Ile Gln Asp Ala Gln Ala}

\sac{Ala Glu Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido señal sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Phe Asn Lys Lys Arg Val Ala Ile Ala Leu Phe Ile Ala Leu}

\sac{Ile Phe Val Leu Phe Phe Leu Ile Ser Ser Ile Gln Asp Asn Gln Thr}

\sac{Asn Ala Ala Glu Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Phe Asn Lys Lys Arg Val Leu Ile Leu Leu Phe Ile Leu Leu}

\sac{Ile Phe Val Leu Phe Phe Leu Ile Ser Ser Ile Gln Asp Asn Gln Thr}

\sac{Asn Ala Ala Glu Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Phe Asn Lys Lys Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu}

\sac{Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile Ser Ser Ile Gln Asp Asn Gln Thr}

\sac{Asn Ala Ala Glu Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Phe Asn Lys Lys Arg Val Ala Ile Ala Leu Phe Ile Ala Leu}

\sac{Ile Phe Val Leu Phe Phe Leu Ile Ser Ser Ile Gln Asp Asn Gln Ala}

\sac{Asn Ala Ala Glu Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Phe Asn Lys Lys Arg Val Leu Ile Leu Leu Phe Ile Leu Leu}

\sac{Ile Phe Val Leu Phe Phe Leu Ile Ser Ser Ile Gln Asp Asn Gln Ala}

\sac{Asn Ala Ala Glu Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Asn Lys Lys Arg Val Ala Ile Ala Thr Phe Ile Ala Leu Ile}

\sac{Phe Val Ser Phe Phe Thr Ile Ser Ser Ile Gln Asp Ala Gln Ala Ala}

\sac{Glu Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Asn Lys Lys Arg Val Ala Ile Ala Thr Phe Ile Ala Leu Ile}

\sac{Phe Val Ser Phe Phe Thr Ile Ser Ser Ile Asp Ala Gln Ala Ala Glu}

\sac{Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Phe Lys Lys Arg Val Ala Ile Ala Thr Phe Ile Ala Leu Ile}

\sac{Phe Val Ser Phe Phe Thr Ile Ser Ser Ile Gln Asp Ala Gln Ala Ala}

\sac{Glu Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Asn Lys Lys Arg Val Ala Ile Ala Thr Phe Ile Phe Leu Ile}

\sac{Phe Val Phe Phe Phe Thr Ile Ser Ser Ile Gln Asp Ala Gln Ala Ala}

\sac{Glu Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Phe Lys Lys Lys Arg Val Ala Ile Ala Thr Phe Ile Ala Leu}

\sac{Ile Phe Val Ser Phe Phe Thr Ile Ser Ser Ile Gln Asp Ala Gln Ala}

\sac{Ala Glu Arg Ser}

Claims (8)

1. Una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de ADN que codifica para un péptido señal seleccionado a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO:42 (310mut1), SEQ ID NO:43 (310mut2), SEQ ID NO:44 (310mut3), SEQ ID NO:45 (310mut4), SEQ ID NO:46 (310mut5), SEQ ID NO:47 (310mut6), SEQ ID NO:48 (310mut7), SEQ ID NO:49 (310mut8), SEQ ID NO:51 (310mut10), SEQ ID NO:52 (310mut11), SEQ ID NO:53 (310mutA), SEQ ID NO:54 (310mutB), SEQ ID NO:55 (310mutC), SEQ ID NO:56 (310mutA1), SEQ ID NO:57 (310mutB1), SEQ ID NO:58 (310mutD2), SEQ ID NO:59 (310mutD7), SEQ ID NO:60 (310mutE2), SEQ ID NO:61 (310mutE11) y SEQ ID NO:62 (310mutF2).

2. Una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de ADN que codifica para la SEQ ID NO:41 del péptido señal (SP310).

3. Un plásmido recombinante que comprende la secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

4. El plásmido de acuerdo con la reivindicación 3 que comprende además a un promotor regulable operativamente unido a una fusión de dicho péptido señal y el gen nuc.

5. Una bacteria recombinante que comprende la secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

6. La bacteria de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la secuencia de ADN se une operativamente a un gen que expresa un producto génico deseado por el cual el producto génico es secretado.

7. La bacteria de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6 que es una bacteria del ácido láctico.

8. El uso de una bacteria de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-7 para la producción de un producto génico deseado.