KR20120058665A - 탄저균 방어항원(ｐａ) 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바실러스 서브틸리스의 세포외단백질분해효소의 발현을 촉진하는 spo0A유전자와 세포의 용해를 유도하는 lytC유전자가 제거된 바실러스 서브틸리스발현균주, spo0A 유전자와 lytC 유전자가 제거된 바실러스 서브틸리스 균주를 세포의 성장에 영향을 주지 않으면서 목적단백질을 안정적으로 발현 증가시킬 수 있는 프로모터를 포함하는 방어항원(PA)의 발현벡터로 형질전환시킨 바실러스 서브틸리스 형질전환체 및 바실러스 서브틸리스의 spo0A 유전자와 lytC 유전자를 제거한 발현균주에서 방어항원(PA)의 과발현 방법에 관한 것이다.
본 발명을 이용하여, 안전한 차세대 탄저백신인 방어항원 PA을 안전한 GRAS 미생물인 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)의 돌연변이 균주로 도입을 하여, 방어항원 PA를 발현양이 g/L 수준으로 과발현하여 산업적 경제성을 확보할 수 있다. 따라서, 보다 안정하고 경제적으로 탄저균을 치료할 수 있는 백신을 얻을 수 있다.

Description

탄저균 방어항원(ＰＡ) 생산방법{Method for producing protective antigen of Bacillus anthracis}

본 발명은 바실러스 서브틸리스의 세포외단백질분해효소의 발현을 촉진하는 spo0A유전자와 세포의 용해를 유도하는 lytC유전자가 제거된 바실러스 서브틸리스발현균주, spo0A 유전자와 lytC 유전자가 제거된 바실러스 서브틸리스 균주를 세포의 성장에 영향을 주지 않으면서 목적단백질을 안정적으로 발현 증가시킬 수 있는 프로모터를 포함하는 방어항원(PA)의 발현벡터로 형질전환시킨 바실러스 서브틸리스 형질전환체 및 바실러스 서브틸리스의 spo0A 유전자와 lytC 유전자를 제거한 발현균주에서 방어항원(PA)의 과발현 방법에 관한 것이다.

탄저는 그람 양성 간균인 탄저균(Bacillus anthracis)에 의하여 주로 가축에게 감염되나 사람에게도 발병하는 인수 공통 감염성 질환이다.상기 탄저균은 오래 전부터 생물학 무기로 개발되어 왔는데, 최근에는 실전에도 배치될 정도가 되어1990년 걸프전 때와 1998년에 재외주둔 미군에 탄저 백신이 접종되는 사태에 이르러 일반인에게도 주요 관심사로 대두되고 있다. 탄저균 감염에 의해서 발생하는 탄저병은 매우 치사율이 높은 것으로 알려져 있는데 치료방법은 다른 세균 감염질환과 마찬가지로 세 가지 접근방법이 가능하다. 첫째는 탄저균 감염을 사전에 봉쇄하는 예방접종이고 둘째는 감염된 탄저균을 항생제로 무력화시키는 것이고 셋째는 감염된 탄저균이 분비하는 주요 병 독소를 해독시키는 것이다. 일단 감염되면 항생제와 해독제를 투여하여 병균과 병독소를 동시에 무력화시키는 것이 가장 이상적이나 현재 일반적으로 항생제에 비해 해독제의 개발이 미미해 주로 항생제에 의존하는 형편이다. 우리 나라에도 이를 법정 전염병으로 분류하여 대응하고 있으며, 실제 국내에서도 가축 및 폐사우의 식육을 섭취한 후 사망한 사례가 보고된 바 있음으로써 탄저에 대한 방제의 필요성이 대두되었다.

탄저병 균을 죽이는 항생제는 이미 개발돼 있지만 이 약물은 이미 생성된 탄저 독소에는 전혀 영향을 미치지 못하는 단점을 가지고 있다. 그리고 탄저병 백신의 경우에도 부작용 문제 때문에 광범위한 사용이 어려운 형편이다. 더욱이 높은 치사율을 보이는 탄저의 경우 질병 발병 초기단계에서 발견하여 이에 대한 대중적 치료가 매우 중요하다. 또한 국내 육류소비량의 절반이상이 생물학적 테러위험성(탄저)이 높은 미국 의존적 수입경로를 감안할 때 축산물 수입에 대한 철저한 검역시스템 도입이 절실하다. 그러나 질병증상이 나타나지 않는 감염초기 및 진행기의 가축의 가공물의 경우 질병 원인균의 농도가 매우 낮아 진단 여부가 매우 어려우며 많은 양의 검역이 어렵다.

이같은 탄저균의 병원성은 독소 생성 능력과 협막 형성에 의해 결정되는 것으로 알려져 있다. 이중 탄저의 독소 생성 능력에 영향을 주는 단백질은 방어항원 (protective antigen, PA), 부종요소 (edemafactor, EF). 치사요소 (lethal factor, LF) 임이 알려져 이들에 대한 연구가 진행 중이다. 이들 각각은 독성을 나타내지 못하나, 방어항원 (PA)과 부종요소 (EF)가 결합하여 부종독소 (EdTx, edema toxin)를 형성하고, 방어항원 (PA)과 치사요소 (LF)가 결합하여 치사독소 (LeTx, ethal toxin)를 형성한다. 여기서 PA는 대식세포와 같은 감염 세포주 표면의 수용체 단백질 (ATR)에 결합한 후 단백질 분해효소 (furin family protease)에 의해 PA20과 PA63으로 잘리는데, 이중 PA63이 헵타머화되면서 LF 혹은 EF와 결합하여 이를 세포 내로 운반시키는 독소 단백질 운반체 (Toxin delivery channel)의 역할을 수행하는 것이 널리 보고되어 있다. 이들 복합체는 엔도시토시스 기전으로 세포 내로 들어가고 엔도좀의 pH가 낮아지면 PA63 헵타머의 구조적 변화가 생기며 엔도좀 멤브레인에 기공을 형성하고 결과적으로 LF 혹은 EF는 세포질로 유리되어 독성효과를 나타내게 된다. 그러므로 PA는 탄저의 질병 예방과 치료법을 위한 관심 있는 대상이라 할 수 있다. 따라서 탄저 독소를 저해하는 다양한 접근 방법들은 PA에 의거해 많은 연구들이 진행 중이다.

최초의 사람용 탄저 백신은 러시아(구 소련)와 미국, 영국에서 개발되었고 이후 중국과 이스라엘에서도 개발되었다. 러시아에서 개발한 탄저 백신은 중국에서 개발한 백신과 같이 약독화한 포자를 이용한 생백신의 형태로 항원 성분만을 이용한 성분 백신보다 유효성이 높은 것으로 알려져 있지만 부작용이 매우 높은 것으로 보고되고 있다. 영국과 미국에서 개발된 백신은 pXO2 플라스미드가 결여된 변이주의 배양액을 정제하여 사용한 성분 백신인데 방어항원 이외에 다른 독소성분인 부종인자와 치사인자가 미량 섞여있어 비교적 높은 부작용 발생을 보이고 있다.

1970년대 미국에서 승인받은 AVA(Anthrax Vaccine Absorbed) 백신은 현재 Emergent Biosolution사에서 생산하여 'BioThrax' 라는 상품명으로 판매되고 있다. AVA는 pOX2 플라스미드가 없어 독소는 분비하나 협막을 생산하지 않는 비병원성 탄저균인 바실러스 안트라시스 (B.anthracis) V770-NR-R의 배양액을 알루미늄 하이드록사이드(Aluminum hydroxide) 등으로 흡착하여 제조하고 있으며, 방어 항원을 주성분으로 하여 제조조건에 따라 치사인자, 부종인자 등 기타 기능이 알려지지 않은 성분이 미량 포함되는 것으로 알려져 있다. 비록 이 백신은 충분한 효능을 지닌 것으로 보고되고 있지만 이 백신의 생산용 균주가 포자를 생성할 수 있고 3가지 독소를 모두 생산할 수 있는 균주이며 생산 공정에 따라 방어항원 생산수준이 달라질 수 있다. 그리고 활성이 불분명한 방어 항원의 단백효소 분획 성분들이 섞여있을 수 있고, 치사인자, 부종인자 등 기타 세균의 생성물들이 포함되는 등의 문제점이 있다. 또한, 처음 백신을 접종한 뒤 2, 4주, 6, 12, 18개월째 등 총 18개월 동안 6차례 연속하여 피하주사를 실시하고 지속적으로 면역력을 유지하기 위해서는 매년 재접종이 필요한 문제가 있다. 이외에도 종종 통증이나 부종을 수반하는 국소적인 부작용의 우려가 있고, 동물실험 결과 모든 병원성 탄저균에 대해서 동일하게 방어력을 가지지는 못하였으며 약독화한 포자를 이용한 백신보다 효능이 떨어지는 것으로 보고되기도 하였다.

이와 같이 기존 백신의 안정성 문제와 부작용이 알려지면서 안정성과 효능이 뛰어나고 부작용이 없어야 하며 주사 횟수는 최소한으로 하되 면역효과가 지속될 수 있는 차세대 탄저 백신 개발의 필요성이 강력히 부각되었다. 차세대 탄저 백신은 유전자재조합 기술을 도입하여 탄저균에 감염된 사람이나 동물에서 유효한 면역 반응을 보이는 방어항원을 표적으로 하여 개발되고 있다.

이에 본 발명자들은 안전한 숙주를 이용하여 PA를 과발현하기 위한 시도를 하고 이 발명을 완성하였다.

바실러스 서브틸리스는 대장균 및 효모와 함께 산업적으로 유용한 단백질을 생산하는 주요한 숙주로 사용되어져 왔다. 바실러스 서브틸리스균이 단백질 생산 숙주로써의 장점은 (1) 인체에 무해하고 (2) 많은 양의 단백질을 세포 외로 분비할 수 있으며 (3) 내독소를 생산하지 않고 (4) FDA에 의해 GRAS (generally regared as safe)로 규정되어 있으며 (5)코돈 치우침(codon bias)이 없고 (6) 유전자 조작, 형질전환 및 대량배양이 용이하며 (7) 게놈정보가 알려져 있다 (ShumannW. 2007. Adv. Appl. Microbiol. 62: 137-189). 현재 전 세계 산업효소의 약 60% 정도가 바실러스를 숙주균으로 생산되고 있으며 (Westers L. 2004. Biochimica et Biophysica Acta 1694: 299-310) 인체에 무해한 GRAS(generally regarded as safe) 미생물이라는 특성으로 인해 식품용 또는 의약용 단백질 생산에 적합하다고 알려져 있다 (Schallmey M. 2004. Can. J. Microbiol. 50: 117).

그러나, 현재까지 바실러스 서브틸리스를 숙주균으로 생산된 단백질 의약품이 시장진입에 성공한 예가 없는데, 그 이유는 (1) 대장균과 비교하여 여전히 강력한 동시에, 조절 가능한 프로모터가 없고, (2) 많은 단백질 분해 효소의 존재로 인해 발현된 단백질의 안정성에 문제가 있으며, (3) 발현된 단백질의 세포외 분비시 세포막에 존재하는 단백질 분해효소에 의한 분해가 일어나기 때문이라고 해석되고 있다 (Schallmey M. 2004. Can. J. Microbiol. 50: 1-17). 고전적으로 유용 효소 또는 단백질을 대량으로 생산시키기 위하여 돌연변이 유도물질 처리, 자외선 또는 방사선조사 등을 통해 숙주균을 돌연변이 시키는 방법이 사용되어 왔으나 상기 방법들은 비선택적 돌연변이로 인해 종종 숙주균의 성장속도가 저하되거나, 배지조성 및 배양조건을 최적화시키기 까다로운 경우가 많다. 또한, 돌연변이 균주의 경우에는 균주 퇴화가 일어나며, 각각의 목적 단백질 생산을 위한 숙주균을 따로 개발해야 하므로 시간과 노력이 많이 소요되는 고전적인 방법이다.

이에 본 발명자들은 PA를 안정하게 발현할 수 있도록, 안전한 숙주인 바실러스 서브틸리스 균주의 세포 외 단백질 분해효소의 발현을 촉진하는 spo0A유전자와 세포의 용해를 유도하는 lytC유전자가 제거된 바실러스 서브틸리스 균주를 제조하고, 세포의 성장에 영향을 주지 않으면서 PA를 안정적으로 발현 증가시킬 수 있는 프로모터를 포함하는 PA 발현벡터를 상기 균주에 도입함으로써 PA를 대량 제조할 수 있다는 것을 밝혀내고 이에 관한 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 바실러스 서브틸리스의 세포외 단백질 분해효소의발현을 촉진하는 spo0A 유전자와 세포의 용해를 유도하는lytC 유전자가 제거된 바실러스 서브틸리스 발현균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바실러스 서브틸리스 균주를 세포의 성장에 영향을 주지 않으면서 PA를 안정적으로 발현 증가시킬 수 있는 프로모터를 포함하는 방어항원(PA)의 발현벡터로 형질전환시킨 바실러스 서브틸리스 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 서브틸리스의 spo0A 유전자와 lytC 유전자를 제거한 발현균주에서의 방어항원(PA)의 과발현 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서 본 발명은 바실러스 서브틸리스의 세포외 단백질 분해효소의 발현을 촉진하는 spo0A유전자와 세포의 용해를 유도하는 lytC 유전자가 제거된 바실러스 서브틸리스 발현균주를 제공한다.

본 발명에서의 용어 '바실러스 서브틸리스'란 바실러스 속 균으로서 (Bacillus sp.), 막대모양의 형태를 가지며, 산소를 좋아하는 호기성이며 40℃정도의 온도에서 잘 증식되는 내열성 균을 의미한다. 미국 바실러스보존센터 (Bacillus Genetic Stock Center, Ohio)에 기탁된 균주를 사용할 수 있으며, 구체적으로는 BGSC ID: 1A1 인 Bacillus subtilis subsp. subtilis를 사용할 수 있다.

야생형 바실러스 서브틸리스 균주를 이용할 경우, 같은 종에서 유래된 단백질보다 외래단백질의 경우 단백질 분해효소의 영향이 더 커지므로 외래 단백질의 생산수율이 낮을 뿐만 아니라, 생산된 외래 단백질의 안정성이 저하되는 현상이 빈번하게 관찰되었다. 따라서, 외래 단백질을 안정하게 발현시킬 수 있는 바실러스 서브틸리스 균주를 개발하고자, 본 발명자는 세포외 단백질 분해효소의 발현을 촉진하는 spo0A 유전자를 돌연변이 시켰다. 더욱이, 세포용해를 유도하는 lytC 유전자가 단백질 분해효소의 결손으로 활성 증가되는 것을 억제하면 숙주세포의 안정성이 높아져 외래 목적단백질의 발현 효율을 높일 수 있음을 밝혀내었다.

본 발명에서의 용어 'spo0A 유전자' 이란, 포자형성반응 조절자 (Sporulation response regulator)로서 포자를 형성하는 그람양성균의 세포학적 분화와 형성에 필수적인 요소이며, 세포외 단백질 분해효소의 발현을 촉진하고, 세포내의 세포용해효소를 분해하는 기능을 가진 유전자를 말한다. 상기 유전자의 서열은 당업자에게 공지된 데이터베이스로부터 이용할 수 있다.

본 발명에서의 용어 'lytC유전자' 이란, 바실러스 서브틸리스에서 세포벽 가수분해효소 (vegetative cell wall hydrolases)중 하나로써, 세포용해를 유도하는 가장 대표적인 세포벽 용해유전자이다. 상기 유전자의 서열은 당업자에게 공지된 데이터베이스로부터 이용할 수 있다.

본 발명에서의 용어 '유전자가 제거된' 이란, 해당 유전자의 전부 또는 일부가 결실되어 해당 유전자의 기능을 잃게 된 것을 의미한다. 본 발명의 실시예에 기재된 방법에 의하여 해당 유전자를 제거할 수 있으나, 그 방법에 한정된 것은 아니고, 당업자에게 알려진 유전자 결실방법을 사용할 수 있다. 예를 들어 제거 대상 유전자의 특정 부위를 벡터에 클로닝한 후 단일크로스오버(single-crossover)에 의해 벡터 전체가 삽입되도록 하는 유전자 결실방법이나 upp, mazF, sacB 등 카운터선택마커(counter-selectable marker)를 이용하여 항생제 저항성 유전자와 같은 외래 유전자의 삽입이 없는 유전자 결실방법을 사용할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 spo0A유전자와 lytC유전자가 제거된 바실러스 서브틸리스 균주를 숙주 미생물로 사용하여 세포의 성장에 영향을 주지 않으면서 PA를 안정적으로 발현 증가시킬 수 있는 프로모터를 포함하는 방어항원(PA)의 발현벡터로 형질전환시킨 바실러스 서브틸리스 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 구체적 실시예에서, 세포의 성장에 영향을 주지 않으면서 PA를 안정적으로 발현 증가시킬 수 있는 프로모터를 포함하는 벡터는 목적 단백질(PA)의 발현을 유도하기 위해 목적 단백질을 코딩하는 유전자와 작동 가능하게 연결되며, 이와 같이 제작된 벡터를 이용하여 목적 단백질의 발현을 위해 spo0A 유전자와 lytC 유전자가 제거된 바실러스 서브틸리스 균주에 형질전환시킬 수 있다.

본 발명에서의 용어 '형질전환'이란 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 DMSO (dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다. 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.

본 발명에서의 용어 '방어항원(PA)'이란, 탄저독소 중의 하나로서, 이 자체에는 독성이 없어서 현재 탄저백신을 개발하는데 주요 타겟이 되고 있다. 상기 방어항원을 코딩하는 핵산서열은 당업자가 공지의 데이터베이스로 부터 이용할 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 6 일 수 있다.

본 발명에서 용어, '프로모터'는 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산 서열을 말한다. 원핵생물에서의 프로모터는 대개 RNA중합효소가 결합하는 전사 시작지점(Transcription Start Site) 바로 근처의 결합부위로 정의된다. 원핵생물에서의 프로모터는 전사시작지점으로부터 앞쪽으로 각각 10 염기쌍, 35 염기쌍 떨어져 있는 두 개의 짧은 염기서열로 구성되어 있다. 10 염기쌍 앞쪽에 있는 염기서열을 프리브노박스(pribnow box) 또는 -10엘리먼트(-10 element, -10 부위)라고 부르며 일반적으로 TATAAT의 6개의 염기서열로 이루어져 있다. 프리브노 박스는 원핵생물에서 전사를 시작하기 위해 반드시 필요하다. 35 염기쌍 앞쪽에 있는 염기서열(-35 부위)은 일반적으로 TTGACA의 6개의 염기서열로 이루어져 있고 전사가 활발히 일어날 수 있도록 해 주는 역할을 한다.

본 발명에서 프로모터는 바실러스 서브틸리스 숙주에서 세포의 성장에 영향을 주지 않으면서 PA를 안정적으로 발현 증가시킬 수 있는 프로모터 서열을 사용할 수 있고, 구체적으로는 바실러스 츄린겐시스 (Bacillus thringiensis), 바실러스 시리우스 (Bacillus cereus) 또는 바실러스 안스라시스 (Bacillus anthracis)의 cry3Aa 프로모터 -35 부위 및 -10 부위가 돌연변이되고, cry3Aa 구조 유전자의 N-말단의 1 내지 100개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 사용할 수 있다. 상기 프로모터들은 세포성장 정지기에서 특이적으로 발현이 유도되는 바실러스 츄린겐시스(바실러스 츄린겐시스 분리균 BR31, Park SH. et al. 1997. Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 25:159-165) cryAa 프로모터의 전사개시 활성을 가지는 -35와 -10 부위를 변이시키고(대한민국 특허출원 제10-2008-0122155호 참조), 천연 cry3Aa 프로모터의 N-말단 부위를 추가로 포함하고, cry3Aa 구조유전자의 N-말단을 추가로 포함시킨 프로모터이다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 -35 부위를 TTGACA로, -10 부위를 TATAA로 변이시켜 사용하였다. 상기 cry3Aa 구조유전자의 N-말단 부위의 길이는 목적 유전자 발현을 증가시키기 위해 당업자의 선택에 의해 조절될 수 있다. 바람직하게 상기 길이는 N-말단으로부터 1 내지 100개의 뉴클레오티드 서열일 수 있고, 보다 바람직하게는 1 내지 50개 일 수 있다. 보다 더욱 바람직하게는 10 내지 20 및 40 내지 49개의 서열로 이루어질 수 있고, 가장 바람직하게는 49개의 구조유전자 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 P84 프로모터 (서열번호 1), P86 프로모터 (서열번호 2), P87 프로모터 (서열번호 3), P88 프로모터 (서열번호 4) 또는 P89 프로모터 (서열번호 5)를 사용할 수 있고, 가장 구체적으로는 P84 프로모터를 사용할 수 있다. 상기 P84 프로모터는 cry3Aa 구조유전자 N-말단의 49개의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 프로모터 P86, P87, P88 및 P89는 cry3Aa 구조유전자의 N-말단의 40, 30, 20, 10개의 뉴클레오티드 서열을 포함한다(대한민국 특허 10-2010-0010044 참조). 또한, 상기 핵산서열과 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있다. "상동성"이란 천연형 (wild type) 또는 동일 활성을 갖는 변이체의 핵산 서열과의 동일한 활성을 나타내는 것으로, 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다. 상기 프로모터 서열과 상동성을 갖는 변이체는 본 발명에서 목적하는 유전자 발현을 위한 프로모터 활성을 보유하는 한, 본 발명에서 유래된 염기서열과 균등한 것임은 당업자에게 자명하다. 상기 변이는 본 발명의 분야에서 공지된 다양한 방법에 의하여 이루어질 수 있으며, 그 예는 error-prone PCR법, DNA shuffling법, site-directed mutagenesis법 등이 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 서열의 프로모터를 사용할 경우 목적 단백질의 발현을 유의적으로, 구체적으로는 20 내지 30배 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 용어, '벡터' 란, 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 예컨대 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, P84 프로모터 서열을 포함하는 플라스미드 벡터인 pD84를 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능을 할 수 있으며, 일부 경우엔 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

상기 용어 "작동 가능하게 연결된"이란 프로모터 서열이 상기 코딩 서열의 전사를 개시 및 매개하도록, 상기 코딩 서열과 프로모터가 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

또한, 본 발명의 벡터는 필요에 따라 선택 마커(selection marker)를 포함할 수 있다. 선택 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선택 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 바실러스 서브틸리스의 spo0A 유전자와 lytC 유전자를 제거한 발현균주에서의 방어항원(PA)의 과발현 방법을 제공한다. 본 발명에서 목적 단백질의 제조는 상기 목적 단백질을 코딩한 유전자를 발현시켜 목적 단백질을 생산하는 것을 의미한다. 본 발명에서 목적 단백질을 제조하는 방법은 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하여 상기 목적 단백질을 발현시키는 방법이다. 본 발명에서 형질전환체의 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도 및 시간, 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 이들 공지된 배양 방법은 문헌[Chmiel; Bioprozesstechnik 1.Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991), 및 Storhas; Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)]에 상세히 기술되어 있다. 사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, "Manual of Methods for General Bacteriology" from American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)). 배지 내 탄소 공급원은 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유,해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 이용할 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 질소 공급원은 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)을 이용할 수 있으며, 이들 물질 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 인 공급원으로서 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 이용할 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필수적인 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철)을 함유할 수 있으며, 최종적으로, 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 상기 언급한 물질 외에 사용할 수 있다. 적합한 전구체를 상기 배양 배지에 추가로 가할 수 있다. 상기 공급 물질은 배양물에 한번에 모두 가하거나, 배양중 적절하게 공급할 수 있다. 배양물의 pH는 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 적절히 사용하여 조절할 수 있다. 발포는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 거포제를 사용하여 조절할 수 있다. 플라스미드의 안정성은 선택적으로 작용하는 적합한 물질, 예를 들어 항생제를 배지에 가하여 유지할 수 있다. 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물, 예를 들어 공기를 배양물 중으로 도입시켜 호기성 조건을 유지시킬 수 있다. 배양 온도는 통상적으로 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃이다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 야생형(wild-type)과 lytC 돌연변이주에서는 PA의 발현을 거의 관찰할 수 없었으나, spo0A 돌연변이주와 spo0A/lytC 이중 돌연변이주에서는 PA의 과발현을 관찰할 수 있었으며, 발현양을 정량한 결과 1.44 g/L 수준이었다(도 1A). 이는 기존에 보고되었던 PA의 발현양에 비해 최소 3배 이상 높은 수치이다. 이를 통해, 발현된 방어항원의 분해를 유발하는 바실러스 서브틸리스의 세포외 단백질 분해효소의 발현을 저해시킨 spo0A 돌연변이주에서는 과발현된 방어항원이 안정화되고, lytC 및 spo0A 이중 돌연변이시킴으로써, spo0A 불활성화로 인하여 유발된 세포벽 용해효소 활성 증가를 극복하여 세포의 안정성(stability)을 증진시켜 PA를 대량생산할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

결국, 본 발명은 세포의 성장에 영향을 주지 않으면서 PA를 안정적으로 발현 증가시킬 수 있는 프로모터 서열을 사용하고, lytC 및 spo0A 이중 돌연변이시킴으로써, spo0A 불활성화로 인하여 유발된 세포벽 용해효소 활성 증가를 극복하여 세포의 안정성(stability)을 증진시켜 최종적으로 PA를 g/L 수준으로 대량생산할 수 있다.

본 발명을 이용하여, 안전한 차세대 탄저백신인 방어항원 PA을 안전한 GRAS 미생물인 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)의 돌연변이 균주로 도입을 하여, 방어항원 PA를 발현양이 g/L 수준으로 과발현하여 산업적 경제성을 확보할 수 있다. 따라서, 보다 안정하고 경제적으로 탄저균을 치료할 수 있는 백신을 얻을 수 있다.

도 1은 바실러스 서틸리스에서 탄저균 방어항원 발현을 단백질 전기영동(A)과 웨스턴 블롯(B)으로 확인한 그림이다. 레인1은 탄저균 방어항원 유전자가 포함되지 않은 바실러스 서틸리스 168의 배양상등액을, 레인 2부터 5는 탄저균 방어항원 유전자가 포함된 바실러스균의 배양상등액을 분석한 결과이다. 레인 2는 바실러스 서틸리스 168, 레인 3은 spo0A 돌연변이주, 레인 4는 lytC 돌연변이주, 레인 5는 spo0A/lytC 이중 돌연변이주를 나타낸다.
도 2는 바실러스균의 성장곡선이다. 다이아몬드는 천연 바실러스 서틸리스 168, 네모는 spo0A 돌연변이주, 세모는 lytC 돌연변이주, 원은 spo0A lytC 이중 돌연변이주를 나타낸다.
도 3은 프로모터 P84를 도식화한 그림이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. PA 발현벡터 제작

탄저균 방어항원을 발현하기 위해 플라스미드 pA84 (대한민국 특허 10-2010-0010044, 도 3) 를 EcoRI과 BamHI으로 절단하여 프로모터 P84를 분리하고 이를 플라스미드 pDG1661 (Guerout-Fleury, A.M. et al. 1996. Gene 180, 571)의 같은 제한효소 부위에 삽입하여 플라스미드 pD84를 완성하였다. 탄저균 방어항원 유전자는 합성하였다 (서열번호 6). 합성된 방어항원 유전자는 프라이머 pagA-F2 (서열번호 7)와 pagA-R1 (서열번호 8)을 이용하여 PCR로 증폭한 후 BamHI과 BsiWI으로 절단하고 이를 플라스미드 pD84의 해당 사이트에 삽입하여 플라스미드 pD84pagA를 완성하였다.

실시예 2. 바실러스 서브틸리스 168 돌연변이 균주의 제작

spo0A 돌연변이주는 spo0A 돌연변이주인 바실러스 서틸리스 MO699 (Shin BS et al. 1999. J. Biochem. 126: 333-339)의 염색체를 형질전환법으로 도입하여 제작하였고 lytC 돌연변이주는 다음과 같이 제작하였다. lytC 5' 말단은 프라이머 lytC-5 (aaaggatcctcaaataggc, 서열번호 9)와 lytC-6 (aaactcattccctgatctcgatttaatacttatccccaagc, 서열번호 10), lytC 3' 말단은 프라이머 lytC-7 (catgttggttacgtatttattcaatggactccttgagaaag, 서열번호 11)와 lytC-8 (aaaggatccatcttgcttctgtgccc, 서열번호 12)을 이용하여 B. subtilis 168 염색체로부터 PCR로 증폭하였다. 네오마이신 저항성 유전자는 프라이머 mlkneoF2 (tcgagatcagggaatgagttt, 서열번호 13)와 mlk83neoR (aataaatacgtaaccaacatg, 서열번호 14)를 이용하여 플라스미드 pMLK83 (Karow ML and Piggot PJ. 1994. Gene 163: 69-74)으로부터 PCR로 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 융합 PCR(fusion PCR)을 통해 lytC 5' 말단-네오마이신 저항성 유전자-3' 말단 순으로 서로 연결하였고 이를 B. subtilis 168 균주에 도입함으로써 lytC 돌연변이주를 제작하였다. spo0A/lytC 이중 돌연변이주는 lytC 돌연변이주를 바실러스 서틸리스 MO699 염색체를 이용하여 형질전환함으로써 제작하였다.

실시예 3. 방어항원(PA) 발현벡터를 이용한 형질전환체 제작

실시예 1에서 완성된 플라스미드 pD84pagA 를 실시예 2 에서 제작한 각각의 바실러스 서브틸리스 돌연변이 균주에 형질전환 시켰다. 형질전환은 Cutting과 Vander Horn이 저술한 방법에 따라 자연도입법으로 수행하였다 (Harwood CR and Cutting SM. (ed). 1990. Molecular biological methods for Bacillus. p67. John Wiley & Sons, Inc. New York, NY).

실시예 4. 방어항원(PA) 발현

실시예 3에서 제작한 형질전환체를 LB 배지에서 37℃, 16시간 배양한 후 배양상등액을 10% SDS-PAGE로 분석하였다. 그 결과 야생형(wild-type)과 lytC 돌연변이주에서는 PA의 발현을 거의 관찰할 수 없었으나, spo0A 돌연변이주와 spo0A/lytC 이중 돌연변이주에서는 PA의 과발현을 관찰할 수 있었으며, 발현양을 정량한 결과 1.44 g/L 수준이었다(도 1A). 이는 기존에 보고되었던 PA의 발현양에 비해 최소 3배 이상 높은 수치이다. 발현된 단백질 밴드를 방어항원에 특이적인 항체 (Goat anti-protective antigen, List Biological Laboratories Inc.)를 이용하여 Western blotting을 수행한 결과 과발현된 단백질은 방어항원임을 확인하였다 (도 1B).

또한 실제로 lytC 불활성화가 세포를 안정화시켰는 지 알아보기 위하여 세포성장곡선을 그려보았다. 그 결과 lytC 돌연변이주는 세포가 안정하게 유지됨을 알 수 있었다 (도 2).

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for producing protective antigen of Bacillus anthracis <130> PA100532/KR <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 904 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cry3Aa promoter variant (P84) <400> 1 tcagcagtag aagttttgac caaaattaaa aaaataccca atcaagagaa tattcttaat 60 tacaatacgt tttgcgagga acatattgat tgaaatttaa taaatttagt cctaaaattt 120 aaagaaattt aagtttttca tatttttatg aactaacaag aataaaaatt gtgtttattt 180 attattcttg ttaaatattt gataaagaga tatatttttg gtcgaaacgt aagatgaaac 240 cttagataaa agtgcttttt ttgttgacat tgaagaatta ttaatgttat aattaattaa 300 agataatatc tttgaattgt aacgcccctc aaaagtaaga actacaaaaa aagaatacgt 360 tatatagaaa tatgtttgaa ccttcttcag attacaaata tattcggacg gactctacct 420 caaatgctta tctaactata gaatgacata caagcacaac cttgaaaatt tgaaaatata 480 actaccaatg aacttgttca tgtgaattat cgctgtattt aattttctca attcaatata 540 taatatgcca atacattgtt acaagtagaa attaagacac ccttgatagc cttactatac 600 ctaacatgat 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primer(lytC-5) <400> 9 aaaggatcct caaataggc 19 <210> 10 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer(lytC-6) <400> 10 aaactcattc cctgatctcg atttaatact tatccccaag c 41 <210> 11 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer(lytC-7) <400> 11 catgttggtt acgtatttat tcaatggact ccttgagaaa g 41 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer(lytC-8) <400> 12 aaaggatcca tcttgcttct gtgccc 26 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer(mlkneoF2) <400> 13 tcgagatcag ggaatgagtt t 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer(mlk83neoR) <400> 14 aataaatacg taaccaacat g 21

Claims (11)

1. 게놈 상의 spo0A 유전자 및 lytC 유전자가 제거되고, 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터가 도입된, 목적 단백질의 생산능을 갖는 바실러스(Bacillus) 속 균주.
2. 제1항에 있어서, 상기 바실러스(Bacillus) 속 균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)인 균주.
3. 제1항에 있어서, 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 방어항원(PA) 유전자인 바실러스(Bacillus) 속 균주.
4. 제3항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 6으로 표시되는 것인 바실러스(Bacillus) 속 균주.
5. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 P84 프로모터, P86 프로모터, P87 프로모터, P88 프로모터 및 P89 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택되는 프로모터인 바실러스(Bacillus) 속 균주.
6. 게놈 상의 spo0A 유전자 및 lytC 유전자가 제거되고, P84 프로모터 및 방어항원(PA)을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터가 도입된, 방어항원(PA)의 생산능을 갖는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주.
7. (a) 바실러스(Bacillus) 속 균주의 게놈 상의 spo0A 유전자 및 lytC 유전자를 제거하여 spo0A 유전자 및 lytC 유전자가 제거된 바실러스(Bacillus) 속 균주를 제조하는 단계;
   (b) 상기 spo0A 유전자 및 lytC 유전자가 제거된 바실러스(Bacillus) 속 균주에 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 도입시켜 재조합 바실러스(Bacillus) 속 균주를 제조하는 단계; 및
   (c) 상기 재조합 바실러스(Bacillus) 속 균주를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 바실러스(Bacillus) 속 균주를 이용한 단백질의 생산 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 바실러스(Bacillus) 속 균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)인 방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 방어항원(PA) 유전자인 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 6으로 표시되는 것인 방법.
11. 제7항에 있어서, 상기 프로모터는 P84 프로모터, P86 프로모터, P87 프로모터, P88 프로모터 및 P89 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택되는 프로모터인 방법.

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