KR101948248B1

KR101948248B1 - 단백질 발현 미세 조절방법

Info

Publication number: KR101948248B1
Application number: KR1020110121250A
Authority: KR
Inventors: 최수근; 박승환
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2011-11-18
Filing date: 2011-11-18
Publication date: 2019-02-14
Also published as: KR20130055481A

Abstract

본 발명은 목적단백질의 발현 양상을 미세하게 조절하기 위한, 목적단백질 발현 양상을 나타내는 프로모터, 3의 배수로 도입된 랜덤 염기서열, 및 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터; 상기 벡터를 이용하여 생산되는 목적단백질의 발현량과의 관계를 수집하여 목적단백질 발현 양상을 조절할 수 있는 도입된 랜덤 염기서열의 정보 제공방법; 및 상기 벡터를 이용하는 목적단백질의 생산방법에 관한 것이다.
본 발명의 프로모터, 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열 및 상기 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열의 개시코돈으로 전사되는 제1 서브뉴클레오티드 서열과 두 번째 코돈으로 전사되는 제2 서브뉴클레오티드 서열 사이에 추가적으로 도입된 3의 배수의 랜덤 염기서열을 포함하는 벡터를 이용하여 목적단백질 발현 양상을 조절할 수 있고, 염기서열 분석을 이용하여 목적단백질의 발현 양상과 상기 도입된 염기서열의 관계를 정립할 수 있다. 이때, 추가적으로 도입되는 염기서열은 3의 배수로 하여 개시코돈 뒤에 도입함으로 목적단백질 유전자 업스트림의 변화없이 목적단백질의 발현량을 조절할 수 있다.

Description

단백질 발현 미세 조절방법{A method for tunable control of protein expression}

본 발명은 목적단백질의 발현 양상을 미세하게 조절하기 위한, 목적단백질 발현 양상을 나타내는 프로모터, 3의 배수로 도입된 랜덤 염기서열, 및 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터; 상기 벡터를 이용하여 생산되는 목적단백질의 발현량과의 관계를 수집하여 목적단백질 발현 양상을 조절할 수 있는 도입된 랜덤 염기서열의 정보 제공방법; 및 상기 벡터를 이용하는 목적단백질의 생산방법에 관한 것이다.

미생물은 산업적으로 화학물질이나 효소 등 유용 물질의 대량생산이나 식품발효 산업 등에 주로 사용되고 있다. 바실러스는 대장균 및 효모와 함께 산업적으로 유용한 단백질을 생산하는 주요한 숙주로 사용되어 왔다. 바실러스 균의 단백질 생산 숙주로서의 장점은 인체에 무해하고, 많은 양의 단백질을 세포 외로 분비할 수 있으며, 내독소를 생산하지 않고, FDA에 의해 GRAS(generally regarded as safe)로 규정되어 있으며, 코돈 치우침(codon bias)이 없고, 유전자 조작, 형질전환 및 대량 배양이 용이하며, 게놈정보가 알려져있다(Shumann, W., 2007, Adv . Appl. Microbiol., 62: 137-189)는 점이다. 현재 전 세계 산업효소의 60% 정도가 바실러스를 숙주균으로 생산되고 있으며(Westers, L., 2004, Biochimica et Biophysica Acta, 1694: 299-310) 인체에 무해한 GRAS 미생물이라는 특성으로 인해 식품용 또는 의약용 단백질 생산에 적합하다고 알려져 있다(Schallmey, M., 2004, Can . J. Microbiol., 50: 1217). 고전적으로 유용한 효소 또는 단백질을 대량으로 생산하기 위하여 돌연변이 유도물질 처리, 자외선 또는 방사선 조사 등을 통해 숙주균을 돌연변이 시키는 방법이 사용되어 왔으나, 상기 방법들은 비선택적 돌연변이로 인해 종종 숙주균의 성장속도가 저하되거나, 각각의 목적 단백질 생산을 위한 숙주균을 따로 개발해야 하므로 시간과 노력이 많이 소모되었다. 그러나 최근 유전자 조작 기술을 이용하여 재조합 미생물을 만들고 이를 이용하여 원하는 단백질이나 물질의 생산성을 높이는 방법이 시도되고 있으며 여기에는 강력한 프로모터를 이용하여 목적단백질의 과발현을 유도하는 방법이 기본이 되고 있다(Jana, S. and Deb, J. K., 2005, Appl . Microbiol . Biotechnol., 67: 289-298; Shumann, W., 2007, Adv . Appl . Microbiol., 62: 137-189). 그러나 목적단백질의 지나친 과발현은 종종 인클루젼바디(inclusion body)를 형성하여 불활성화된 단백질을 생성할 수 있으므로 목적단백질의 발현량을 최적의 상태로 조절하는 과정이 필요하다(Sorensen, H. P. and Mortensen, K. K., 2007, J. Biotechnol., 115: 113-128). 한편, 세포 대사산물의 대량생산에는 대사과정 중 주요 효소를 과발현시키고 불필요한 대사흐름에 관여하는 효소는 불활성화시키는 방법이 주로 사용되고 있다. 그러나 이러한 "all or nothing"의 극단적인 접근방법은 종종 세포의 생존환경이 불안정해져서 오히려 목적물질의 생산이 저하되는 결과를 가져올 수 있다(Snoep, J. L. et al ., 1995, Microbiology, 141: 2329-2337). 따라서, 최적의 대사흐름을 유지하면서 목적물질을 대량생산하기 위해서는 관련된 효소의 발현을 미세하게 조절할 수 있는 방법이 필요하다.

유전자의 발현은 프로모터에 의해 이루어지는데 미생물의 프로모터는 -35 부위, -10 부위 및 그 사이의 스페이스로 구성되어 있다. -35 부위와 -10 부위의 염기서열은 여기에 결합하는 RNA 중합효소(polymerase)의 시그마 인자(σ factor)에 따라 다양하다. 예를 들어, 시그마 A에 의해 인식되는 프로모터의 -35 부위와 -10 부위는 각각 TTGACA 및 TATAAT의 공통서열(consensus sequence)을 가지고 있다. 스페이스의 경우 공통서열은 없으나 길이가 일정하며, 시그마 A에 의해 인식되는 스페이스는 17개의 염기로 이루어져 있다. 최근 스페이스 부위가 프로모터의 세기에 영향을 준다는 보고가 있었으며(Jensen, P. R. and Hammer, K., 1998, Appl . Environ. Microbiol ., 64: 82-87), 이를 이용하여 프로모터의 세기를 미세하게 조절하는 기술들이 개발되었다(Solem, C. and Jensen, P. R., 2002, Appl . Environ . Microbiol., 68: 2397-2403; Hammer, K. et al., 2006, Trends in Biotechnol., 24: 53-55). 이들 기술들은 대개 시그마 A에 의해 인식되는 프로모터의 공통의 -35와 -10 부위를 가지고 스페이스에 랜덤 염기서열을 도입한 프로모터를 제작한 후 다양한 세기의 프로모터를 스크리닝하는 방법을 사용하고 있다. 또한 분자진화기술을 이용하여 프로모터를 다양화한 후 이를 이용하여 단백질 발현을 미세조절하는 기술이 개발되었다(Alper, H. et al., 2005, PNAS, 102: 12678-12683). 대부분의 프로모터는 세포 내의 대사흐름과 연계된 다양한 인자에 의해 발현이 조절되므로 적절한 환경과 시기에 단백질을 발현시킨다. 이러한 대사흐름과 연계된 조절은 세포가 최적의 상태를 유지하는데 도움을 준다. 그러나 현재까지 개발된 모든 단백질 발현 미세조절 기술은 프로모터를 포함한 목적단백질 유전자의 업스트림 부위가 변형된 것이어서 대사흐름과 관련된 유전자의 발현에 영향을 줄 수가 있다.

이에 본 발명자들은 목적단백질 유전자의 업스트림 부위에 변화없이 단백질 발현을 미세하게 조절할 수 있는 기술을 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 목적단백질의 개시코돈 뒤 N 말단에 짧은 길이의 랜덤 염기서열을 3의 배수로 삽입하여 목적단백질이 짧은 길이의 펩타이드가 N 말단에 결합된 형태로 발현되게 했을 때, 목적단백질이 다양한 발현량으로 생산되는 것을 확인하였다. 따라서, 목적단백질 유전자의 개시코돈 뒤에 프레임에 맞게 랜덤 염기서열을 삽입하여 목적단백질의 발현량을 미세하게 조절할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열의 개시코돈으로 전사되는 제1 서브뉴클레오티드 서열과 두 번째 코돈으로 전사되는 제2 서브뉴클레오티드 서열 사이에 추가적으로 도입된 3의 배수의 랜덤 염기서열과 생산되는 목적단백질의 발현 양상의 1:1 관계를 수집하여, 목적단백질 발현 양상(protein expression pattern of interest)을 조절할 수 있는 상기 3의 배수 랜덤 염기서열 정보의 제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열의 개시코돈으로 전사되는 제1 서브뉴클레오티드 서열과 두 번째 코돈으로 전사되는 제2 서브뉴클레오티드 서열 사이에 3의 배수의 염기서열을 포함하는 벡터를 사용하여 목적단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열의 개시코돈으로 전사되는 제1 서브뉴클레오티드 서열과 두 번째 코돈으로 전사되는 제2 서브뉴클레오티드 서열 사이에 3의 배수의 염기서열을 추가시킨 목적단백질 발현 양상 조절용 벡터를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (i) 프로모터, (ii) 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열, 및 (iii) 상기 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열의 개시코돈으로 전사되는 제1 서브뉴클레오티드 서열과 두 번째 코돈으로 전사되는 제2 서브뉴클레오티드 서열 사이에 추가적으로 도입된 3의 배수의 랜덤 염기서열을 포함하는 벡터를 제조하는 제1단계; 상기 제조된 벡터를 숙주세포에 도입하는 제2단계; 및 상기 숙주세포로부터 생산되는 목적단백질의 발현 양상과 제1단계에서 도입된 3의 배수의 랜덤 염기서열의 1:1 관계를 수집하는 제3단계를 포함하여, 목적단백질 발현 양상(protein expression pattern of interest)을 조절할 수 있는 제1 서브뉴클레오티드와 제2 서브뉴클레오티드 사이 삽입용 3의 배수 랜덤 염기서열 정보의 제공방법을 제공한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (i) 프로모터, (ii) 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열, 및 (iii) 상기 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열의 개시코돈으로 전사되는 제1 서브뉴클레오티드 서열과 두 번째 코돈으로 전사되는 제2 서브뉴클레오티드 서열 사이에 추가적으로 도입된 3의 배수의 염기서열을 포함하는 벡터를 제조하는 제1단계; 상기 제조된 벡터를 숙주세포에 도입하여 목적단백질을 생산하는 제2단계를 포함하는, 목적단백질의 생산방법을 제공한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (i) 프로모터, (ii) 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열, 및 (iii) 상기 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열의 개시코돈으로 전사되는 제1 서브뉴클레오티드 서열과 두 번째 코돈으로 전사되는 제2 서브뉴클레오티드 서열 사이에 추가적으로 도입된 3의 배수의 염기서열을 포함하는 목적단백질 발현 양상 조절용 벡터를 제공한다.

목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열에 추가적으로 도입되는 랜덤 염기서열은 (i) 개시코돈으로 전사되는 제1 서브뉴클레오티드 서열과 두 번째 코돈으로 전사되는 제2 서브뉴클레오티드 서열 사이, 즉 개시코돈으로 전사되는 DNA 서열 ATG의 바로 뒤에 삽입되고, (ii) 3의 배수로 삽입되는 것을 특징으로 한다. 따라서, 대사흐름과 연계된 프로모터에 변형을 주지 않으므로 세포가 최적의 상태를 유지하도록 할 수 있다. 또한 목적단백질의 개시코돈으로 전사되는 유전자 바로 뒤에 3의 배수로 목적단백질의 유전자와 같은 프레임으로 삽입되므로 목적단백질은 짧은 길이의 펩타이드가 N 말단에 결합된 형태로 발현되게 하였고 이것이 목적단백질의 발현량과 같은 발현패턴을 다양하게 하는 결과로 나타났다.

상기 제3단계는 염기서열 분석에 의해 삽입된 3의 배수의 랜덤 염기서열을 확인하는 것을 특징으로 한다. 염기서열 분석은 Sanger 사슬 종결 서열분석법, 염기서열분석기를 이용한 분석, PCR을 이용한 자동 염기서열 분석, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), DNA 칩을 이용한 분석 등의 방법이 사용될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법이 제한없이 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에 의하여 개시코돈으로 전사되는 DNA 서열 ATG의 바로 뒤에 3의 배수의 랜덤 염기서열을 도입시킨 벡터를 이용하여 목적단백질을 발현시키고 그 발현 양상을 탐색하여 원하는 발현 양상을 가진 세포를 선정함으로써 목적에 맞는 발현량이 조절된 단백질 생산이 가능하다.

본 발명의 용어 "프로모터"는 특정 유전자의 전사를 촉진하는 DNA 상의 영역이다. 즉, RNA 중합효소 또는 전사조절인자(transcription factor)의 결합자리를 가지고 있는 비해독 DNA 염기서열로서, 프로모터는 조절하고자 하는 해당 유전자에 가깝게 위치하며 동일 가닥 상에 존재하고 일반적으로는 업스트림 즉, 센스가닥(sense strand)의 5' 영역에 존재한다. 진핵생물에서는 전사조절인자라고 하는 단백질들이 프로모터 부분에 결합함으로써 RNA 중합효소를 끌어들이는 일에 관여한다. 프로모터는 이러한 전사조절인자들이 결합하는 모든 DNA 염기서열부위를 지칭한다고 할 수 있다. 그에 비해 원핵생물에서는 대개 RNA 중합효소가 결합하는 전사시작지점(transcription start site) 바로 근처의 결합부위로 정의된다. 원핵생물에서 프로모터는 전사시작지점으로부터 앞쪽으로 각각 10 염기쌍, 35 염기쌍 떨어져 있는 두 개의 짧은 염기서열로 구성되어 있다. 10 염기쌍 앞쪽의 염기서열을 프리브노 박스(pribnow box) 또는 -10 엘리먼트(-10 element, -10 부위)라고 부르며 일반적으로 TATAAT의 6개의 염기서열로 이루어져 있다. 프리브노 박스는 원핵생물에서 전사를 시작하기 위해 반드시 필요하다 35 염기쌍 앞쪽의 염기서열(-35 부위)은 일반적으로 TTGACA의 6개의 염기서열로 이루어져 있고 전사가 활발히 일어날 수 있도록 도와주는 역할을 한다. 본 발명의 실시예에서는 숙주세포로서 바실러스 균을 이용하므로 바실러스 균에서 발현 가능한 어떠한 프로모터라도 제한없이 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연 프로모터에 비해 기능이 향상된 프로모터 P5D를 합성하여 이용할 수 있다. 상기 합성은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있으며, 바람직하게는 다양한 플라스미드와 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 PCR 산물을 확보하고 이들을 다시 혼합하여 PCR로 합성하여 최종 목적 프로모터를 얻을 수 있다.

본 발명의 용어 "벡터"란 적단한 숙주세포에서 목적단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

일반적으로 플라스미드 벡터는 염세체외의 환형 이중가닥 DNA이고, 세포 내에 존재하여 다양한 기능을 한다. 항생물질에 내성을 가진 물질 및 박테리오신을 생산하여 유사한 균주나 종들을 죽이는 저해 물질로 작용하고, 색소 생성, 화합물 분해, 질소고정과 같은 생리학적 기능을 수행한다. 최고 약 10kb 길이의 외래 DNA 절편을 삽입하기 위해서 제한효소 부위를 가지고 있다. 벡터로 사용되는 플라스미드와 박테리오파지의 중대한 단점인 상대적으로 작은 DNA 절편만 삽입할 수 있는 것은 플라스미드와 파지 DNA의 조작된 혼성체인 코스미드를 사용하여 더 큰 DNA 절편을 클로닝 할 수 있다. 파지 입자 안으로 포장되어 들어가는 cos부위가 있고, 세균 숙주에서 복제하는 플라스미드의 복제 시작점과 플라스미드를 선별할 수 있는 유전자를 가지고 있다. 박테리오 파지 벡터 같이 시험관 내에서 단백질 외피로 포장되지만, 포장된 DNA가 대장균 숙주세포를 감염한 후에, 그 DNA는 박테리오파지 DNA보다는 플라스미드 형태로 복제하고 용균되지 않는다. 크기는 2.5kb, 숙주세포를 감염하여 포장된 후에 cos부위가 37에서 52kb까지 분리되면, 외래 DNA를 삽입체로 수용한다. 일반적으로 35에서 45kb가 코스미드 벡터로 클로닝될 수 있다. 또한 박테리오파지의 벡터의 일반적인 형태인 λ 파지의 경우는 염기쌍을 이룰 수 있는 12개 뉴클레오티드의 단일 가닥의 상보적인 말단으로된 점착성 말단(cohesive termini) 혹은 cos를 가지는 50kb의 이중가닥으로 된 야생형 게놈에서 비롯된 것으로 용균성 경로에서 숙주세포는 새로운 바이러스가 복제되고, 자손 바이러스가 방출된 후에 융균된다. 이 형태의 DNA는 전체 52kb 크기에 3kb를 더하거나 그 게놈의 5% 만도 수용할 수 있으며, 외래 DNA를 위한 공간을 만드는 벡터는 비필수적인 DNA 조각이 제거된 형태이다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어 HIV (Human immunodeficiency virus) MLV (Murine leukemia virus) ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV (Spleen necrosis virus), RSV (Rous sarcoma virus), MMTV (Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스 (Adenovirus), 아데노 관련 바이러스 (Adenoassociated virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Herpes simplex virus) 등에서 유래한 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 플라스미드 pDG1661을 EcoRI과 BsiWI을 이용하여 절단한 뒤, P5D-Lgfp 변이체 서열을 삽입함으로서 벡터를 제조하였다.

본 발명에서 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 구조 유전자의 N-말단 서열의 서로 다르게 조합된 부분을 포함하는 프로모터 변이체 핵산 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명에서 "조절 요소"란 단백질을 암호화하는 핵산서열의 전사, 번역 또는 발현의 증진을 돕거나 이에 영향을 미치는 비해독화된 핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 발현벡터는 조절요소로 본 발명의 프로모터 변이체를 필수적으로 포함하고, 단백질 발현에 영향을 미칠 수 있는 발현 조절 서열, 예를 들어, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 등을 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 시그널은 전사체의 안정성을 증가시키거나 세포질 수송을 용이하게 한다. 인핸서 서열은 프로모터에서 다양한 부위에 위치하여 인핸서 서열이 없을 때의 프로모터에 의한 전사 활성과 비교하여, 전사 활성을 증가시키는 핵산 염기서열이다. 신호서열에는 숙주가 에스케리키아(Escherichia) 속 균인 경우에는 PhoA 신호서열, OmpA 신호서열 등이, 숙주가 바실러스속 균인 경우에는 α-아밀라아제 신호서열, 서브틸리신 신호서열 등을, 숙주가 효모인 경우에는 MFα 신호서열, SUC2 신호서열 등을, 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 벡터는 복제가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산서열인 복제 원점(replication origin)을 포함할 수 있다.

상기 벡터로 목적단백질을 코딩하는 핵산서열은 프로모터 다운스트림에 삽입되어 발현된다. 상기 벡터로 삽입 가능한 목적단백질은 특별히 제한되지 않으며 의학적 목적 도는 산업적 목적의 다양한 단백질을 삽입할 수 있다. 의학, 산업적으로 유용한 목적단백질에는 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인, 효소, 효소저해제, 수송단백질, 수용체 및 수용체의 단편, 항원, 항체 및 항체 단편, 구조단백질, 조절단백질, 전사인자, 독소단백질, 생체방어 유도물질 등이 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 변이체 프로모터 서열의 다운스트림에 GFP(green fluorescence protein)를 작동 가능하도록 연결하여 벡터를 제조함으로써, 상기 벡터를 포함한 바실러스 균주의 단백질 발현 활성을 측정하였다(도 2).

본 발명에서 용어 "숙주세포"란 다른 미생물 또는 유전자를 기생시켜 영양을 공급하는 세포로, 벡터가 숙주세포에 형질전환됨으로써 숙주세포 내에서 다양한 유전적 또는 분자적 영향을 미치게 되는 세포를 의미한다. 숙주세포는 외부 DNA를 받아들일 수 있는 수용성(competence) 상태에서, 벡터와 같은 외부 DNA가 삽입될 수 있는데, 벡터가 숙주세포에 성공적으로 도입되면, 해당 벡터의 유전형질을 숙주세포에 제공하게 된다. 바람직하게 본 발명의 숙주세포는 그람 양성 세균일 수 있으며, 상기 그람 양성 세균은 바실러스 속, 락토바실러스 속, 브레비바실러스 속, 페니바실러스 속, 클로스트리디움 속, 코리네박테리움 속 또는 스트렙토마이세스 속 세균일 수 있다. 이때, 상기 바실러스 속 세균은 바실러스 서틸리스, 바실러스 리케니포미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 츄린겐시스 또는 바실러스 시리우스 균으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나일 수 있으나, 본 발명의 벡터가 형질전환될 수 있는 숙주세포가 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게 본 발명에서는 바실러스 서틸리스를 숙주세포로 사용하였고, 보다 바람직하게는 바실러스 서틸리스 168를 사용하여 목적단백질 발현 양상을 확인하였다.

숙주세포에 벡터를 도입하는 방법은 형질전환방법이 이용될 수 있다. "형질전환"이란 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 DMSO (dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있으나, 이에 제한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 방법이 제한없이 사용될 수 있다.

또한 상기 방법으로 형질전환된 숙주세포는 필요에 따라 당업계에서 통상적으로 사용되는 배양방법을 통하여 배양될 수 있으며, 사용될 수 있는 배지 및 배양기간은 필요에 따라 당업자에 의해 임의적으로 선택될 수 있다. 바람직하게 본 발명은 형질전환된 바실러스 균주를 TSB 배지에 접족하여 37℃에서 24시간 동안 배양하여 목적단백질의 생산을 유도하였다. 배양을 통해 생산된 목적단백질의 양을 측정하기 위하여 본 발명은 목적 단백질을 회수하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에서 회수되는 목적 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 플라스미드 벡터의 제조시 필요에 따라 다른 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 추가적으로 포함될 수 있는 서열은 단백질 정제용 태그서열일 수 있으며, 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6x His(hexahistidine)일 수 있으나, 상기 예들에 의하여 목적 단백질의 정제를 위하여 필요한 서열의 종류가 제한되는 것은 아니다. 상기 융합서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질의 경우, 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 예컨대, 클루타티온 S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6x His인 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 (Novagen, USA)을 이용하여 원하는 목적 단백질을 용이하게 회수할 수 있다.

본 발명의 프로모터, 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열 및 상기 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열의 개시코돈으로 전사되는 제1 서브뉴클레오티드 서열과 두 번째 코돈으로 전사되는 제2 서브뉴클레오티드 서열 사이에 추가적으로 도입된 3의 배수의 랜덤 염기서열을 포함하는 벡터를 이용하여 목적단백질 발현 양상을 조절할 수 있고, 염기서열 분석을 이용하여 목적단백질의 발현 양상과 상기 도입된 염기서열의 관계를 정립할 수 있다. 이때, 추가적으로 도입되는 염기서열은 3의 배수로 하여 개시코돈 뒤에 도입함으로 목적단백질 유전자 업스트림의 변화없이 목적단백질의 발현량을 조절할 수 있다.

도 1은 P5D 프로모터와 목적단백질 유전자의 N 말단 사이에 30개의 염기서열이 삽입된 모식도이다.
도 2는 P5D 프로모터와 N 말단에 30개의 염기서열이 삽입된 gfp 유전자의 조합을 가진 플라스미드 라이브러리가 도입된 바실러스 서틸리스 168 균주의 GFP 발현량을 분석한 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: GFP 발현의 미세 조절

GFP의 발현을 미세하게 조절하기 위하여 gfp 유전자의 N 말단에 30개의 랜덤 염기서열을 gfp 유전자와 같은 프레임으로 융합시킨 변이체(Lgfp)를 제작하였다(도 1). 이를 위해, gfp는 프라이머 Gfp-Lf(서열번호 1)와 gfp-r1(서열번호 2)을 사용하여 플라스미드 pAD123(Dunn, A. K. and Handelsman, J., 1999, Gene, 226: 297-305)으로부터 PCR로 확보하였다. 프로모터 P5D는 플라스미드 pA84(대한민국 특허 10-2010-0010044)로부터 프라이머 3Aag-f2(서열번호 3)와 P83-R1(서열번호 4)을 사용하여 확보한 PCR 산물과 플라스미드 pD52(Lee, S.-J. et al., 2010, J. Biotechnol., 149: 16-20)로부터 프라이머 P52-F1(서열번호 5)과 stabr2(서열번호 6)를 사용하여 확보한 PCR 산물을 서로 혼합하여 다시 PCR 반응을 수행하여 최종 PCR 산물인 프로모터 P5D를 확보하였다. 확보된 Lgfp는 프로모터 P5D와 다시 PCR을 수행하여 P5D-Lgfp를 확보하였다. P5D-Lgfp는 EcoRI/BsiWI으로 절단한 후 플라스미드 pDG1661(Guerout-Fleury, A. M. et al., 1996, Gene, 180: 57-61)의 같은 부위에 클로닝하여 pD5D-Lgfp 라이브러리를 완성하였다.

제작된 플라스미드 라이브러리는 대장균에 도입한 후 100 μg/ml의 암피실린(ampicillin)이 포함된 LB 아가(Luria-Bertani Agar)배지에 도말하였다. 이렇게 아가배지 위에 형성된 대장균 형질전환체를 모두 모아 플라스미드를 분리하였고 분리된 플라스미드 라이브러리는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) 168 균주(Kunst, F. et al., 1997, Nature, 390: 249-256)에 도입하였다. 제작된 바실러스 형질전환체는 형광을 나타내는 균주를 무작위로 96개를 선정한 후 TSB 배지(Difco)에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양된 균주들은 EnVision Multilabel Plate Readers(Perkin Elmer)를 이용하여 GFP의 발현량을 측정하였다. 그 결과 GFP의 발현량이 다양한 분포를 나타냄을 확인하였다(도 2).

따라서 목적단백질의 N 말단에 랜덤 펩타이드 조각이 결합하도록 목적단백질 유전자의 N 말단에 일정 길이의 염기서열을 목적단백질 유전자와 같은 프레임으로 삽입하면 목적단백질의 발현량이 다양해지고 이에 따라 목적에 맞는 발현량을 가진 벡터를 선택하여 대사공학이나 단백질 생산 등에 유용하게 사용할 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Biocience and Biotechnology <120> A method for tunable control of protein expression <130> PA110884/KR <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gfp-Lf <400> 1 gataagaaag ggaggaagaa aaatgnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnagtaa 60 aggagaagaa c 71 <210> 2 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gfp-r1 <400> 2 tttcgctcgg gaagacgtac gttatttgta tagttcatcc a 41 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3Aag-f2 <400> 3 agctgtcaaa catgagaatt cgagctctca gcagtagaag 40 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P83-R1 <400> 4 cacttttatc taaggtttc 19 <210> 5 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P52-F1 <400> 5 gaaaccttag ataaaagtgc tttttttgtt gacattgaag aattattaat gttaagctta 60 attaaagata atatctttga attg 84 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> stabr2 <400> 6 ttttcttcct ccctttctta tcataata 28

Claims

(i) 프로모터, (ii) 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열, 및 (iii) 상기 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열의 개시코돈으로 전사되는 제1 서브뉴클레오티드 서열과 두 번째 코돈으로 전사되는 제2 서브뉴클레오티드 서열 사이에 추가적으로 도입된, 서열 길이가 3 내지 30개의 서열로 이루어진, 3의 배수의 랜덤 염기서열을 포함하는 벡터를 제조하는 제1단계;
상기 제조된 벡터를 숙주세포에 도입하는 제2단계; 및
상기 숙주세포로부터 생산되는 목적단백질의 발현 양상과 제1단계에서 도입된 3의 배수의 랜덤 염기서열의 1:1 관계를 수집하는 제3단계를 포함하여,
목적단백질 발현 양상(protein expression pattern of interest)을 조절할 수 있는 제1 서브뉴클레오티드와 제2 서브뉴클레오티드 사이 삽입용 3의 배수 랜덤 염기서열 정보의 제공방법.
제1항에 있어서,
제3단계는 염기서열 분석에 의해 삽입된 3의 배수의 랜덤 염기서열을 확인하는 것을 특징으로 하는 제공방법.
(i) 프로모터, (ii) 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열, 및 (iii) 상기 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열의 개시코돈으로 전사되는 제1 서브뉴클레오티드 서열과 두 번째 코돈으로 전사되는 제2 서브뉴클레오티드 서열 사이에 추가적으로 도입된, 서열 길이가 3 내지 30개의 서열로 이루어진, 3의 배수의 염기서열을 포함하는 벡터를 제조하는 제1단계; 및
상기 제조된 벡터를 숙주세포에 원하는 발현양상으로 조절된 목적단백질을 생산하는 제2단계를 포함하는,
목적단백질의 생산방법.
제3항에 있어서,
(i) 프로모터, (ii) 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열, 및 (iii) 상기 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열의 개시코돈으로 전사되는 제1 서브뉴클레오티드 서열과 두 번째 코돈으로 전사되는 제2 서브뉴클레오티드 서열 사이에 추가적으로 도입된 3의 배수의 랜덤 염기서열을 포함하는 벡터를 제조하는 단계;
상기 제조된 벡터를 숙주세포에 도입하는 단계;
상기 숙주세포로부터 생산되는 목적단백질의 발현 양상을 탐색하여 원하는 발현 양상을 가진 세포를 선정하는 단계; 및
상기 선정된 세포를 배양하여 목적단백질을 생산하는 단계를 포함하는,
목적단백질의 생산방법.
제3항 또는 제4항에 있어서,
상기 숙주세포는 그람 양성 세균인 방법.
제5항에 있어서,
상기 그람 양성 세균은 바실러스 속, 락토바실러스 속, 브레비바실러스 속, 페니바실러스 속, 클로스트리디움 속, 코리네박테리움 속 또는 스트렙토마이세스 속 세균인 것인 방법.
제6항에 있어서,
상기 바실러스 속 세균은 바실러스 서틸리스, 바실러스 리케니포미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 츄린겐시스 또는 바실러스 시리우스 균으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나인 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서,
상기 목적단백질은 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인, 효소, 효소저해제, 수송단백질, 수용체 및 수용체의 단편, 항원, 항체 및 항체 단편, 구조단백질, 조절단백질, 전사인자, 독소단백질 및 생체방어 유도물질로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 목적단백질인 방법.
(i) 프로모터, (ii) 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열, 및 (iii) 상기 목적단백질-코딩 뉴클레오티드 서열의 개시코돈으로 전사되는 제1 서브뉴클레오티드 서열과 두 번째 코돈으로 전사되는 제2 서브뉴클레오티드 서열 사이에 추가적으로 도입된, 서열 길이가 3 내지 30개의 서열로 이루어진, 3의 배수의 염기서열을 포함하는 목적단백질 발현 양상 조절용 벡터.
제3항에 있어서, 상기 3의 배수의 염기서열은 제1항 또는 제2항의 방법에 의해서 정보가 제공된 3의 배수의 염기서열인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 3의 배수의 염기서열은 서열 길이가 9 내지 30개의 서열로 이루어진, 3의 배수 랜덤 염기서열 정보의 제공방법.
제3항에 있어서, 상기 3의 배수의 염기서열은 서열 길이가 9 내지 30개의 서열로 이루어진, 목적단백질의 생산방법.
제9항에 있어서, 상기 3의 배수의 염기서열은 서열 길이가 9 내지 30개의 서열로 이루어진, 목적단백질 발현 양상 조절용 벡터.