JPH07163363A - 形質転換体の製造方法、生理活性タンパク質の製造方法および形質転換体 - Google Patents
形質転換体の製造方法、生理活性タンパク質の製造方法および形質転換体Info
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- JPH07163363A JPH07163363A JP5312248A JP31224893A JPH07163363A JP H07163363 A JPH07163363 A JP H07163363A JP 5312248 A JP5312248 A JP 5312248A JP 31224893 A JP31224893 A JP 31224893A JP H07163363 A JPH07163363 A JP H07163363A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 生理活性タンパク質を効率よく簡単に製造す
る方法を提供する。 【構成】 水素細菌に、生理活性タンパク質遺伝子、シ
グナルペプチド遺伝子およびプロモーターを導入して形
質転換体を得る方法である。
る方法を提供する。 【構成】 水素細菌に、生理活性タンパク質遺伝子、シ
グナルペプチド遺伝子およびプロモーターを導入して形
質転換体を得る方法である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、形質転換体の製造方
法、生理活性タンパク質の製造方法および形質転換体に
関する。詳細には、水素細菌の形質転換体を製造する方
法、形質転換した水素細菌による生理活性タンパク質の
製造方法および水素細菌の形質転換体に関するものであ
る。
法、生理活性タンパク質の製造方法および形質転換体に
関する。詳細には、水素細菌の形質転換体を製造する方
法、形質転換した水素細菌による生理活性タンパク質の
製造方法および水素細菌の形質転換体に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】近年の遺伝子工学、細胞工学、細胞大量
培養技術などの急速な発展に伴い、ペプチド性ホルモ
ン、サイトカイン、細胞成長因子、ワクチン、酵素など
の生理活性タンパク質が次々と単離され、その構造が明
かにされている。この生理活性タンパク質の遺伝子を単
離または合成し、遺伝子組換え技術を用いて宿主細胞内
に導入し、人工的に生理活性タンパク質を製造する方法
も実用化されつつある。この遺伝子が導入される宿主と
しては、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞などが知られ
ている。また、タンパク質の分泌機構についても研究が
進み、シグナルペプチド遺伝子を生理活性タンパク質遺
伝子の上流に付与して培養することにより、培養液中に
タンパク質を分泌することが知られている。しかしなが
ら、培養液中には、糖などの炭素源や酵母エキスなどの
窒素源など、非常に多種多様な成分が含まれるために、
分泌された生理活性タンパク質を培養液中より分離精製
するには、多大な費用と時間を要するという問題があ
る。
培養技術などの急速な発展に伴い、ペプチド性ホルモ
ン、サイトカイン、細胞成長因子、ワクチン、酵素など
の生理活性タンパク質が次々と単離され、その構造が明
かにされている。この生理活性タンパク質の遺伝子を単
離または合成し、遺伝子組換え技術を用いて宿主細胞内
に導入し、人工的に生理活性タンパク質を製造する方法
も実用化されつつある。この遺伝子が導入される宿主と
しては、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞などが知られ
ている。また、タンパク質の分泌機構についても研究が
進み、シグナルペプチド遺伝子を生理活性タンパク質遺
伝子の上流に付与して培養することにより、培養液中に
タンパク質を分泌することが知られている。しかしなが
ら、培養液中には、糖などの炭素源や酵母エキスなどの
窒素源など、非常に多種多様な成分が含まれるために、
分泌された生理活性タンパク質を培養液中より分離精製
するには、多大な費用と時間を要するという問題があ
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は以上のような
問題に着目してなされたものであり、生理活性タンパク
質の分離精製の簡略化を目的として、該生理活性タンパ
ク質を効率よく簡単に製造する方法を提供することであ
る。
問題に着目してなされたものであり、生理活性タンパク
質の分離精製の簡略化を目的として、該生理活性タンパ
ク質を効率よく簡単に製造する方法を提供することであ
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明の形質転換体の製
造方法は、水素細菌に、生理活性タンパク質遺伝子、シ
グナルペプチド遺伝子およびプロモーターを導入して形
質転換体を得る点に要旨を有する。また、本発明の生理
活性タンパク質の製造方法は、上記形質転換体を無機塩
培地中、酸素、水素および炭酸ガスからなる混合ガス雰
囲気下に培養する点に要旨を有する。好適な実施態様で
は、上記生理活性タンパク質はヒト上皮細胞増殖因子
（ＥＧＦ）である。
造方法は、水素細菌に、生理活性タンパク質遺伝子、シ
グナルペプチド遺伝子およびプロモーターを導入して形
質転換体を得る点に要旨を有する。また、本発明の生理
活性タンパク質の製造方法は、上記形質転換体を無機塩
培地中、酸素、水素および炭酸ガスからなる混合ガス雰
囲気下に培養する点に要旨を有する。好適な実施態様で
は、上記生理活性タンパク質はヒト上皮細胞増殖因子
（ＥＧＦ）である。
【０００５】さらに、本発明の形質転換体は、水素細菌
を、シグナルペプチド遺伝子およびプロモーターを含む
発現ベクターで形質転換した点に要旨を有する。上記シ
グナルペプチド遺伝子は、好ましくは、配列表の配列番
号１に記載の塩基配列を有する。上記プロモーターは、
好ましくはｔａｃプロモーターを含むものであり、より
好ましくは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有
する。
を、シグナルペプチド遺伝子およびプロモーターを含む
発現ベクターで形質転換した点に要旨を有する。上記シ
グナルペプチド遺伝子は、好ましくは、配列表の配列番
号１に記載の塩基配列を有する。上記プロモーターは、
好ましくはｔａｃプロモーターを含むものであり、より
好ましくは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有
する。
【０００６】上記の配列番号１に記載のシグナルペプチ
ド遺伝子および上記の配列番号２に記載のプロモーター
を含む発現ベクターとしてはｐＫＳＥＧＦ２が挙げられ
る。上記水素細菌は、好ましくはシュードモナス・シュ
ードフラバであり、より好ましくはシュードモナス・シ
ュードフラバＡＴＣＣ３３６６８である。好適な実施態
様では、本発明の形質転換体は、上記水素細菌がシュー
ドモナス・シュードフラバＡＴＣＣ３３６６８であり、
上記発現ベクターがｐＫＳＥＧＦ２である様なシュード
モナス・シュードフラバＡＴＣＣ３３６６８（ｐＫＳＥ
ＧＦ２）である。
ド遺伝子および上記の配列番号２に記載のプロモーター
を含む発現ベクターとしてはｐＫＳＥＧＦ２が挙げられ
る。上記水素細菌は、好ましくはシュードモナス・シュ
ードフラバであり、より好ましくはシュードモナス・シ
ュードフラバＡＴＣＣ３３６６８である。好適な実施態
様では、本発明の形質転換体は、上記水素細菌がシュー
ドモナス・シュードフラバＡＴＣＣ３３６６８であり、
上記発現ベクターがｐＫＳＥＧＦ２である様なシュード
モナス・シュードフラバＡＴＣＣ３３６６８（ｐＫＳＥ
ＧＦ２）である。
【０００７】
【作用】本発明の方法は、生理活性タンパク質分泌能を
付与してなる水素細菌の形質転換体を、酸素、水素およ
び炭酸ガスからなる混合ガス雰囲気下に、実質上、無機
塩のみしか含有しない培養液中で培養することにより、
生理活性タンパク質を製造する点に特徴を有する。詳細
には、形質転換された水素細菌を上記培養液中で培養し
て生理活性タンパク質を培養液中に分泌させ、該水素細
菌を除去後、気液分離により上記混合ガスを除去する方
法である。この様な方法を用いることにより、生体に有
用な生理活性タンパク質を、簡単に効率よく製造するこ
とができる。
付与してなる水素細菌の形質転換体を、酸素、水素およ
び炭酸ガスからなる混合ガス雰囲気下に、実質上、無機
塩のみしか含有しない培養液中で培養することにより、
生理活性タンパク質を製造する点に特徴を有する。詳細
には、形質転換された水素細菌を上記培養液中で培養し
て生理活性タンパク質を培養液中に分泌させ、該水素細
菌を除去後、気液分離により上記混合ガスを除去する方
法である。この様な方法を用いることにより、生体に有
用な生理活性タンパク質を、簡単に効率よく製造するこ
とができる。
【０００８】本発明に用いられる水素細菌としては、シ
ュードモナス属に属するいくつかの細菌（例えば、シュ
ードモナス・シュードフラバ、シュードモナス・フラ
バ）、アルカリゲネス属に属するいくつかの細菌［例え
ば、アルカリゲネス・ユートロファス（A. eutrophu
s）、アルカリゲネス・パラドカス（A. paradoxu
s）］、パラコッカス属に属するいくつかの細菌（例え
ば、パラコッカス・デントリフィカンス）などが挙げら
れる。
ュードモナス属に属するいくつかの細菌（例えば、シュ
ードモナス・シュードフラバ、シュードモナス・フラ
バ）、アルカリゲネス属に属するいくつかの細菌［例え
ば、アルカリゲネス・ユートロファス（A. eutrophu
s）、アルカリゲネス・パラドカス（A. paradoxu
s）］、パラコッカス属に属するいくつかの細菌（例え
ば、パラコッカス・デントリフィカンス）などが挙げら
れる。
【０００９】本発明では、上記水素細菌を、生理活性タ
ンパク質遺伝子、シグナルペプチド遺伝子およびプロモ
ーターをプラスミドベクターに組込んで構築した組換え
プラスミドで形質転換させる。本発明に用いられる生理
活性タンパク質遺伝子としては、例えば上皮細胞増殖因
子（ＥＧＦ）遺伝子などが挙げられ、上記ＥＧＦ遺伝子
を含む組換えプラスミドとしては例えばＢＢＧ７（ＢＢ
ＰＬ社製、図５参照）などが挙げられる。また、シグナ
ルペプチド遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントとし
ては、好ましくはシュードモナス・スツッツェリの菌体
外分泌アミラーゼのシグナルペプチド遺伝子とＥＧＦの
Ｎ末端アミノ酸６個をコードする合成ＤＮＡ（図４参
照、配列表の配列番号１に対応）が挙げられる。また、
本発明に用いられるプロモーターとは、プロモーター、
オペレーターおよびＳＤ配列からなるプロモーター・オ
ペレーター領域を意味し、その様なプロモーターの例と
しては、慣用のプロモーター・オペレーター領域（ｔａ
ｃプロモーターなど）が挙げられ、好ましくはｔａｃプ
ロモーターとシュードモナス・エルギノーザのＳＤ配列
をコードする合成ＤＮＡ（図１参照、配列表の配列番号
２に対応）である。
ンパク質遺伝子、シグナルペプチド遺伝子およびプロモ
ーターをプラスミドベクターに組込んで構築した組換え
プラスミドで形質転換させる。本発明に用いられる生理
活性タンパク質遺伝子としては、例えば上皮細胞増殖因
子（ＥＧＦ）遺伝子などが挙げられ、上記ＥＧＦ遺伝子
を含む組換えプラスミドとしては例えばＢＢＧ７（ＢＢ
ＰＬ社製、図５参照）などが挙げられる。また、シグナ
ルペプチド遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントとし
ては、好ましくはシュードモナス・スツッツェリの菌体
外分泌アミラーゼのシグナルペプチド遺伝子とＥＧＦの
Ｎ末端アミノ酸６個をコードする合成ＤＮＡ（図４参
照、配列表の配列番号１に対応）が挙げられる。また、
本発明に用いられるプロモーターとは、プロモーター、
オペレーターおよびＳＤ配列からなるプロモーター・オ
ペレーター領域を意味し、その様なプロモーターの例と
しては、慣用のプロモーター・オペレーター領域（ｔａ
ｃプロモーターなど）が挙げられ、好ましくはｔａｃプ
ロモーターとシュードモナス・エルギノーザのＳＤ配列
をコードする合成ＤＮＡ（図１参照、配列表の配列番号
２に対応）である。
【００１０】これら生理活性タンパク質遺伝子、シグナ
ルペプチド遺伝子およびプロモーターをプラスミドベク
ターに組み込んで組換えプラスミドを構築する方法は特
に限定されず、当該技術分野の常法に従って行えばよ
い。この様にして構築される組換えプラスミドとして
は、好ましくは後述する実施例１で構築されるｐＫＳＥ
ＧＦ２が挙げられる。
ルペプチド遺伝子およびプロモーターをプラスミドベク
ターに組み込んで組換えプラスミドを構築する方法は特
に限定されず、当該技術分野の常法に従って行えばよ
い。この様にして構築される組換えプラスミドとして
は、好ましくは後述する実施例１で構築されるｐＫＳＥ
ＧＦ２が挙げられる。
【００１１】この様にして得られた組換えプラスミド
を、通常の形質転換法によって受容菌である上記水素細
菌に導入し、遺伝形質として安定するまで増殖すると所
望の生理活性タンパク質生産能を有する形質転換体が得
られる。この様な形質転換体の例として例えば、シュー
ドモナス・シュードフラバＡＴＣＣ３３６６８株に、Ｅ
ＧＦ遺伝子、シグナルペプチド遺伝子およびｔａｃプロ
モーターを導入して形質転換したシュードモナス・シュ
ードフラバＫ４株などが挙げられ、Ｋ４株の製造法は後
述の実施例１に詳述する。
を、通常の形質転換法によって受容菌である上記水素細
菌に導入し、遺伝形質として安定するまで増殖すると所
望の生理活性タンパク質生産能を有する形質転換体が得
られる。この様な形質転換体の例として例えば、シュー
ドモナス・シュードフラバＡＴＣＣ３３６６８株に、Ｅ
ＧＦ遺伝子、シグナルペプチド遺伝子およびｔａｃプロ
モーターを導入して形質転換したシュードモナス・シュ
ードフラバＫ４株などが挙げられ、Ｋ４株の製造法は後
述の実施例１に詳述する。
【００１２】上記水素細菌の形質転換体は、密封した容
器などを用いて、気相を酸素、水素および炭酸ガスから
なる混合ガス雰囲気で置換した無機塩培地中で培養する
ことにより、培養液中に生理活性タンパク質が分泌す
る。上記無機塩培地としては、例えば以下の組成のもの
が挙げられる。 例１：ＫＨ2 ＰＯ4 １．３３ｇ Ｋ2 ＨＰＯ4 ２．３４ｇ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２０ｇ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ５．０ ｇ ＮａＣｌ ０．５０ｇ ＣｏＣｌ2 １１９μｇ ＮｉＣｌ2 １１８μｇ ＣｒＣｌ2 ６２μｇ ＣａＳＯ4 １５６μｇ ＦｅＣｌ3 ９．７ｍｇ ＣａＣｌ2 ７．８ｍｇ 寒天 ２０ｇ 蒸留水 １Ｌ 例２：ＫＨ2 ＰＯ4 １．３３ｇ Ｋ2 ＨＰＯ4 ２．３４ｇ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２０ｇ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ５．０ ｇ ＮａＣｌ ０．５０ｇ ＣｏＣｌ2 １１９μｇ ＮｉＣｌ2 １１８μｇ ＣｒＣｌ2 ６２μｇ ＣａＳＯ4 １５６μｇ ＦｅＣｌ3 ９．７ｍｇ ＣａＣｌ2 ７．８ｍｇ 蒸留水 １Ｌ （例２は、例１において寒天を含まないもの）
器などを用いて、気相を酸素、水素および炭酸ガスから
なる混合ガス雰囲気で置換した無機塩培地中で培養する
ことにより、培養液中に生理活性タンパク質が分泌す
る。上記無機塩培地としては、例えば以下の組成のもの
が挙げられる。 例１：ＫＨ2 ＰＯ4 １．３３ｇ Ｋ2 ＨＰＯ4 ２．３４ｇ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２０ｇ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ５．０ ｇ ＮａＣｌ ０．５０ｇ ＣｏＣｌ2 １１９μｇ ＮｉＣｌ2 １１８μｇ ＣｒＣｌ2 ６２μｇ ＣａＳＯ4 １５６μｇ ＦｅＣｌ3 ９．７ｍｇ ＣａＣｌ2 ７．８ｍｇ 寒天 ２０ｇ 蒸留水 １Ｌ 例２：ＫＨ2 ＰＯ4 １．３３ｇ Ｋ2 ＨＰＯ4 ２．３４ｇ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２０ｇ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ５．０ ｇ ＮａＣｌ ０．５０ｇ ＣｏＣｌ2 １１９μｇ ＮｉＣｌ2 １１８μｇ ＣｒＣｌ2 ６２μｇ ＣａＳＯ4 １５６μｇ ＦｅＣｌ3 ９．７ｍｇ ＣａＣｌ2 ７．８ｍｇ 蒸留水 １Ｌ （例２は、例１において寒天を含まないもの）
【００１３】この様にして培地中に生理活性タンパク質
を分泌させた後、菌体を除去し、酸素ガス、水素ガスお
よび炭酸ガスを気液分離により除去することにより、培
養液から生理活性タンパク質の分離精製を容易に行うこ
とができる。以下の実施例では、ＥＧＦの製造例を詳細
に説明するが、本発明はこれに限定されるものではな
く、前・後記の主旨を逸脱しない範囲で本発明を改変す
ることはすべて本発明の範囲内である。
を分泌させた後、菌体を除去し、酸素ガス、水素ガスお
よび炭酸ガスを気液分離により除去することにより、培
養液から生理活性タンパク質の分離精製を容易に行うこ
とができる。以下の実施例では、ＥＧＦの製造例を詳細
に説明するが、本発明はこれに限定されるものではな
く、前・後記の主旨を逸脱しない範囲で本発明を改変す
ることはすべて本発明の範囲内である。
【００１４】
【実施例】ｔａｃプロモーターおよびシュードモナス・
エルギノーザＡＴＣＣ１０１４５のＳＤ配列を含む二本
鎖ＤＮＡを、Ｐ１からＰ４の４つのフラグメントに分割
し、ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ株式会
社製、３７０Ａ）を用いて合成した（図１）。
エルギノーザＡＴＣＣ１０１４５のＳＤ配列を含む二本
鎖ＤＮＡを、Ｐ１からＰ４の４つのフラグメントに分割
し、ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ株式会
社製、３７０Ａ）を用いて合成した（図１）。
【００１５】合成したＤＮＡをＯＰＣカートリッジ（ア
プライドバイオシステムズ株式会社製）を用いて精製し
た。精製したＰ２，Ｐ４フラグメントの５’末端をＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。その
後、０．２２Ａ260 単位に調製したＰ１，Ｐ２，Ｐ３，
Ｐ４フラグメントを混合し、９０℃で３分間加熱後、氷
水で急冷した。更に、７５℃で５分間加熱後、室温に戻
るまで放置して徐冷し、アニーリングを行った。アニー
リング後、ライゲーションを行い、エタノール沈澱によ
りＤＮＡフラグメントを回収した。次に、回収したフラ
グメントの５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで
リン酸化した。このフラグメントをプラスミドベクター
ｐＨＳＧ３９６（図２）のXhol,Hind III サイトに連結
した。次に、この組換えプラスミドでエシェリヒア・コ
リＪＭ１０９株を形質転換した。この組換えプラスミド
を保持する形質転換体は、クロラムフェニコール（５０
μｇ／ｍｌ）を含むＬ寒天培地（バクトトリプトン１０
ｇ，イーストエキス５ｇ，食塩５ｇ，寒天２０ｇ，蒸留
水１Ｌ）上に生育するコロニーとして選択した。この様
にして選択した形質転換体を、クロラムフェニコール
（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬ培地（バクトトリプトン１
０ｇ，イーストエキス５ｇ，食塩５ｇ，蒸留水１Ｌ）で
一晩培養後、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調
製した。この様にして調製したプラスミドを制限酵素Xh
ol,Hind III で切断すると、ｐＨＳＧ３９６のXhol,Hin
d III サイトに約７０bpのフラグメントが挿入された組
換えプラスミドｐＰＲ０１（図３）の存在が確認でき
た。
プライドバイオシステムズ株式会社製）を用いて精製し
た。精製したＰ２，Ｐ４フラグメントの５’末端をＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。その
後、０．２２Ａ260 単位に調製したＰ１，Ｐ２，Ｐ３，
Ｐ４フラグメントを混合し、９０℃で３分間加熱後、氷
水で急冷した。更に、７５℃で５分間加熱後、室温に戻
るまで放置して徐冷し、アニーリングを行った。アニー
リング後、ライゲーションを行い、エタノール沈澱によ
りＤＮＡフラグメントを回収した。次に、回収したフラ
グメントの５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで
リン酸化した。このフラグメントをプラスミドベクター
ｐＨＳＧ３９６（図２）のXhol,Hind III サイトに連結
した。次に、この組換えプラスミドでエシェリヒア・コ
リＪＭ１０９株を形質転換した。この組換えプラスミド
を保持する形質転換体は、クロラムフェニコール（５０
μｇ／ｍｌ）を含むＬ寒天培地（バクトトリプトン１０
ｇ，イーストエキス５ｇ，食塩５ｇ，寒天２０ｇ，蒸留
水１Ｌ）上に生育するコロニーとして選択した。この様
にして選択した形質転換体を、クロラムフェニコール
（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬ培地（バクトトリプトン１
０ｇ，イーストエキス５ｇ，食塩５ｇ，蒸留水１Ｌ）で
一晩培養後、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調
製した。この様にして調製したプラスミドを制限酵素Xh
ol,Hind III で切断すると、ｐＨＳＧ３９６のXhol,Hin
d III サイトに約７０bpのフラグメントが挿入された組
換えプラスミドｐＰＲ０１（図３）の存在が確認でき
た。
【００１６】次に、シュードモナス・スツッツェリＭＯ
−１９の菌体外分泌アミラーゼのシグナルペプチド遺伝
子（Fujitaら、J. Bacteriol. 171 巻, p1333-p1339 参
照）とＥＧＦのＮ末端アミノ酸６個をコードする二本鎖
ＤＮＡを、Ｓ１からＳ４の４つのフラグメントに分割し
てＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ株式会社
製、３７０Ａ）を用いて合成した（図４）。
−１９の菌体外分泌アミラーゼのシグナルペプチド遺伝
子（Fujitaら、J. Bacteriol. 171 巻, p1333-p1339 参
照）とＥＧＦのＮ末端アミノ酸６個をコードする二本鎖
ＤＮＡを、Ｓ１からＳ４の４つのフラグメントに分割し
てＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ株式会社
製、３７０Ａ）を用いて合成した（図４）。
【００１７】合成したＤＮＡを、ＯＰＣカートリッジ
（アプライドバイオシステムズ株式会社製）を用いて精
製した。精製したＳ２，Ｓ４フラグメントの５’末端を
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。
その後、０．２２Ａ260 単位に調製したＳ１，Ｓ２，Ｓ
３，Ｓ４フラグメントを混合し、９０℃で３分間加熱
後、氷水で急冷した。更に、７５℃で５分間加熱後、室
温に戻るまで放置して徐冷し、アニーリングを行った。
アニーリング後、ライゲーションを行い、エタノール沈
澱によりＤＮＡフラグメントを回収した。次に回収した
フラグメントの５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを用いてリン酸化した。このフラグメントを、ＥＧＦ
遺伝子を含む組換えプラスミドＢＢＧ７（ＢＢＰＬ社
製，図５）のHind III,BsmI サイトに連結した。次い
で、この組換えプラスミドでエシェリヒア・コリＪＭ１
０９株を形質転換した。この組換えプラスミドを保持す
る形質転換体は、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含
む上記Ｌ寒天培地上に生育するコロニーとして選択し
た。この様にして選択した形質転換体をアンピシリン
（５０μｇ／ｍｌ）を含む上記Ｌ培地で一晩培養後、ア
ルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。この様
にして調製したプラスミドを制限酵素Hind III,BsmI で
切断すると、ＢＢＧ７のHind III,BsmI サイトに約９０
bpのフラグメントが挿入された組換えプラスミドｐＳＥ
ＧＦ１（図６）の存在が確認できた。
（アプライドバイオシステムズ株式会社製）を用いて精
製した。精製したＳ２，Ｓ４フラグメントの５’末端を
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。
その後、０．２２Ａ260 単位に調製したＳ１，Ｓ２，Ｓ
３，Ｓ４フラグメントを混合し、９０℃で３分間加熱
後、氷水で急冷した。更に、７５℃で５分間加熱後、室
温に戻るまで放置して徐冷し、アニーリングを行った。
アニーリング後、ライゲーションを行い、エタノール沈
澱によりＤＮＡフラグメントを回収した。次に回収した
フラグメントの５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを用いてリン酸化した。このフラグメントを、ＥＧＦ
遺伝子を含む組換えプラスミドＢＢＧ７（ＢＢＰＬ社
製，図５）のHind III,BsmI サイトに連結した。次い
で、この組換えプラスミドでエシェリヒア・コリＪＭ１
０９株を形質転換した。この組換えプラスミドを保持す
る形質転換体は、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含
む上記Ｌ寒天培地上に生育するコロニーとして選択し
た。この様にして選択した形質転換体をアンピシリン
（５０μｇ／ｍｌ）を含む上記Ｌ培地で一晩培養後、ア
ルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。この様
にして調製したプラスミドを制限酵素Hind III,BsmI で
切断すると、ＢＢＧ７のHind III,BsmI サイトに約９０
bpのフラグメントが挿入された組換えプラスミドｐＳＥ
ＧＦ１（図６）の存在が確認できた。
【００１８】この様にしてシグナルペプチド遺伝子およ
びＥＧＦ遺伝子を導入した組換えプラスミドｐＳＥＧＦ
１のHind III,BamHIフラグメント（約２５０bp）を、広
宿主域プラスミドベクターｐＫＴ２３０（図７）のHind
III,BamHIサイトに連結した。次いで、この組換えプラ
スミドを用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質
転換した。この組換えプラスミドを保持する形質転換体
は、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む上記
Ｌ寒天培地上で生育するコロニーとして選択した。この
様にして選択した形質転換体を、ストレプトマイシン
（５０μｇ／ｍｌ）を含む上記Ｌ培地で一晩培養後、ア
ルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。この様
にして調製したプラスミドを制限酵素Hind III,BamHIで
切断すると、ｐＫＴ２３０のHind III,BamHIサイトに、
シグナルペプチド遺伝子とＥＧＦ遺伝子をコードする約
２５０bpのフラグメントが挿入した組換えプラスミドｐ
ＫＳＥＧＦ１（図８）の存在が確認できた。
びＥＧＦ遺伝子を導入した組換えプラスミドｐＳＥＧＦ
１のHind III,BamHIフラグメント（約２５０bp）を、広
宿主域プラスミドベクターｐＫＴ２３０（図７）のHind
III,BamHIサイトに連結した。次いで、この組換えプラ
スミドを用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質
転換した。この組換えプラスミドを保持する形質転換体
は、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む上記
Ｌ寒天培地上で生育するコロニーとして選択した。この
様にして選択した形質転換体を、ストレプトマイシン
（５０μｇ／ｍｌ）を含む上記Ｌ培地で一晩培養後、ア
ルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。この様
にして調製したプラスミドを制限酵素Hind III,BamHIで
切断すると、ｐＫＴ２３０のHind III,BamHIサイトに、
シグナルペプチド遺伝子とＥＧＦ遺伝子をコードする約
２５０bpのフラグメントが挿入した組換えプラスミドｐ
ＫＳＥＧＦ１（図８）の存在が確認できた。
【００１９】上記ｐＫＳＥＧＦ１（図８）のXhol,Hind
III サイトに、上述の組換えプラスミドｐＰＲ０１（図
３）より切り出した合成プロモーター（Xhol,Hind III
フラグメント）を連結した。この組換えプラスミドを用
いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換した。
この組換えプラスミドを保持する形質転換体は、ストレ
プトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む上記Ｌ寒天培地
上で生育するコロニーとして選択した。次いで、選択し
た形質転換体をストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）
を含む上記Ｌ培地で一晩培養後、アルカリ−ＳＤＳ法に
よりプラスミドを調製した。この様にして調製したプラ
スミドを制限酵素Xhol,BamHIで切断すると、ｐＫＴ２３
０（図７）のXhol,BamHIサイトに、プロモーター、シグ
ナルペプチド遺伝子およびＥＧＦ遺伝子をコードする約
３２０bpのフラグメントが挿入された組換えプラスミド
ｐＫＳＥＧＦ２（図９）の存在が確認できた。
III サイトに、上述の組換えプラスミドｐＰＲ０１（図
３）より切り出した合成プロモーター（Xhol,Hind III
フラグメント）を連結した。この組換えプラスミドを用
いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換した。
この組換えプラスミドを保持する形質転換体は、ストレ
プトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む上記Ｌ寒天培地
上で生育するコロニーとして選択した。次いで、選択し
た形質転換体をストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）
を含む上記Ｌ培地で一晩培養後、アルカリ−ＳＤＳ法に
よりプラスミドを調製した。この様にして調製したプラ
スミドを制限酵素Xhol,BamHIで切断すると、ｐＫＴ２３
０（図７）のXhol,BamHIサイトに、プロモーター、シグ
ナルペプチド遺伝子およびＥＧＦ遺伝子をコードする約
３２０bpのフラグメントが挿入された組換えプラスミド
ｐＫＳＥＧＦ２（図９）の存在が確認できた。
【００２０】一方、プロモーターおよびシグナルペプチ
ド遺伝子を含有しない組換えプラスミドは、以下の様に
して調製した。すなわち、ＥＧＦ遺伝子を含む上述の組
換えプラスミドＢＢＧ７（ＢＢＰＬ社製、図５）より、
ＥＧＦ遺伝子を含む約１８０bpのHind III,BamHIフラグ
メントを切り出し、上述の広宿主域プラスミドベクター
ｐＫＴ２３０（図７）のHind III,BamHIサイトに連結し
た。この組換えプラスミドを用いてエシェリヒア・コリ
ＪＭ１０９株を形質転換した。この組換えプラスミドを
保持する形質転換体は、ストレプトマイシン（５０μｇ
／ｍｌ）を含む上記Ｌ寒天培地上で生育するコロニーと
して選択した。次いで、選択した形質転換体をストレプ
トマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む上記Ｌ培地で一晩
培養後、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調製し
た。この様にして調製したプラスミドを制限酵素Hind I
II,BamHIで切断すると、ｐＫＴ２３０のHind III,BamHI
サイトに、ＥＧＦ遺伝子をコードする約１８０bpのHind
III,BamHIフラグメントが挿入された組換えプラスミド
ｐＫＴＥＧＦ１（図１０）の存在が確認できた。
ド遺伝子を含有しない組換えプラスミドは、以下の様に
して調製した。すなわち、ＥＧＦ遺伝子を含む上述の組
換えプラスミドＢＢＧ７（ＢＢＰＬ社製、図５）より、
ＥＧＦ遺伝子を含む約１８０bpのHind III,BamHIフラグ
メントを切り出し、上述の広宿主域プラスミドベクター
ｐＫＴ２３０（図７）のHind III,BamHIサイトに連結し
た。この組換えプラスミドを用いてエシェリヒア・コリ
ＪＭ１０９株を形質転換した。この組換えプラスミドを
保持する形質転換体は、ストレプトマイシン（５０μｇ
／ｍｌ）を含む上記Ｌ寒天培地上で生育するコロニーと
して選択した。次いで、選択した形質転換体をストレプ
トマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む上記Ｌ培地で一晩
培養後、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調製し
た。この様にして調製したプラスミドを制限酵素Hind I
II,BamHIで切断すると、ｐＫＴ２３０のHind III,BamHI
サイトに、ＥＧＦ遺伝子をコードする約１８０bpのHind
III,BamHIフラグメントが挿入された組換えプラスミド
ｐＫＴＥＧＦ１（図１０）の存在が確認できた。
【００２１】上記の様にして構築した組換えプラスミド
ｐＫＴＥＧＦ１（図１０）とｐＫＳＥＧＦ２（図９）
を、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を用いた接合伝
達法（Gary Ditta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 77, 7347(1980)）により、水素細菌シュードモナス・
シュードフラバＡＴＣＣ３３６８に導入した。すなわ
ち、ドナーとしてｐＫＴＥＧＦ１またはｐＫＳＥＧＦ２
を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を、ストレ
プトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む上記Ｌ培地で一
晩培養した。また、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３
を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０９株は、カナマ
イシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む上記Ｌ培地で一晩培養
した。受容菌であるシュードモナス・シュードフラバＡ
ＴＣＣ３３６６８は、上記Ｌ培地で一晩培養した。これ
らドナー、ヘルパー、受容菌の３種類の培養液５０μｌ
を混合し、Ｌ寒天培地上に載せたニトロセルロースメン
ブレン上で、３０℃で１６時間培養した。その後、ニト
ロセルロースメンブレンを取り出し、メンブレンに増殖
した菌を滅菌生理食塩水１ｍｌに懸濁した。この懸濁液
を、ストレプトマイシン（５００μｇ／ｍｌ）を含む無
機塩寒天培地（上述した例１の無機塩培地）上に塗布
し、混合ガス（水素ガス：炭酸ガス：酸素ガス＝８：
１：１）を充填したデシケーター中で、３０℃一週間培
養した。出現したコロニーを、ストレプトマイシン（５
００μｇ／ｍｌ）を含む上記Ｌ培地で一晩培養した後、
アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。この
様にして調製したプラスミドを制限酵素PstIで解析した
結果、ｐＫＴＥＧＦ１を保持するシュードモナス・シュ
ードフラバＫ３株（以後、Ｋ３株と略記する）と、ｐＫ
ＳＥＧＦ２を保持するシュードモナス・シュードフラバ
Ｋ４株（以後、Ｋ４株と略記する）が得られた。
ｐＫＴＥＧＦ１（図１０）とｐＫＳＥＧＦ２（図９）
を、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を用いた接合伝
達法（Gary Ditta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 77, 7347(1980)）により、水素細菌シュードモナス・
シュードフラバＡＴＣＣ３３６８に導入した。すなわ
ち、ドナーとしてｐＫＴＥＧＦ１またはｐＫＳＥＧＦ２
を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を、ストレ
プトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む上記Ｌ培地で一
晩培養した。また、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３
を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０９株は、カナマ
イシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む上記Ｌ培地で一晩培養
した。受容菌であるシュードモナス・シュードフラバＡ
ＴＣＣ３３６６８は、上記Ｌ培地で一晩培養した。これ
らドナー、ヘルパー、受容菌の３種類の培養液５０μｌ
を混合し、Ｌ寒天培地上に載せたニトロセルロースメン
ブレン上で、３０℃で１６時間培養した。その後、ニト
ロセルロースメンブレンを取り出し、メンブレンに増殖
した菌を滅菌生理食塩水１ｍｌに懸濁した。この懸濁液
を、ストレプトマイシン（５００μｇ／ｍｌ）を含む無
機塩寒天培地（上述した例１の無機塩培地）上に塗布
し、混合ガス（水素ガス：炭酸ガス：酸素ガス＝８：
１：１）を充填したデシケーター中で、３０℃一週間培
養した。出現したコロニーを、ストレプトマイシン（５
００μｇ／ｍｌ）を含む上記Ｌ培地で一晩培養した後、
アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調製した。この
様にして調製したプラスミドを制限酵素PstIで解析した
結果、ｐＫＴＥＧＦ１を保持するシュードモナス・シュ
ードフラバＫ３株（以後、Ｋ３株と略記する）と、ｐＫ
ＳＥＧＦ２を保持するシュードモナス・シュードフラバ
Ｋ４株（以後、Ｋ４株と略記する）が得られた。
【００２２】次に、上記Ｋ３株とＫ４株を用いてヒト上
皮細胞増殖因子を製造した。培養方法は、ストレプトマ
イシン（５００ｍｇ／ｍｌ）を含む２００ｍｌの無機塩
培地（上述した例２の無機塩培地）含有の１Ｌ容培養ビ
ンの気相を混合ガス（水素ガス：炭酸ガス：酸素ガス＝
８０：１０：１０）で置換し、３０℃で４日間振とう培
養を行った。その際、一日に２回気相ガスの交換を行っ
た。培養上清中のＥＧＦ濃度は、ＥＧＦ測定キット（大
塚製薬製）により測定した。図１１および図１２は、Ｋ
３株およびＫ４株の増殖量（ＯＤ600 で示す）および培
養上清中のＥＧＦ濃度（ｎｇ／ｍｌ）の経時的変化をそ
れぞれ示したグラフである。これらの図から明かな様
に、ＥＧＦ遺伝子のみを含む組換えプラスミドＰＫＴＥ
ＧＦ１を保持するＫ３株は、培地中にＥＧＦを分泌しな
かったが、プロモーター、シグナルペプチド遺伝子およ
びＥＧＦ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＫＳＥＧＦ２
を保持するＫ４株は、培養後４日目に約６ｎｇ／ｍｌの
ＥＧＦを分泌することが分かった。
皮細胞増殖因子を製造した。培養方法は、ストレプトマ
イシン（５００ｍｇ／ｍｌ）を含む２００ｍｌの無機塩
培地（上述した例２の無機塩培地）含有の１Ｌ容培養ビ
ンの気相を混合ガス（水素ガス：炭酸ガス：酸素ガス＝
８０：１０：１０）で置換し、３０℃で４日間振とう培
養を行った。その際、一日に２回気相ガスの交換を行っ
た。培養上清中のＥＧＦ濃度は、ＥＧＦ測定キット（大
塚製薬製）により測定した。図１１および図１２は、Ｋ
３株およびＫ４株の増殖量（ＯＤ600 で示す）および培
養上清中のＥＧＦ濃度（ｎｇ／ｍｌ）の経時的変化をそ
れぞれ示したグラフである。これらの図から明かな様
に、ＥＧＦ遺伝子のみを含む組換えプラスミドＰＫＴＥ
ＧＦ１を保持するＫ３株は、培地中にＥＧＦを分泌しな
かったが、プロモーター、シグナルペプチド遺伝子およ
びＥＧＦ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＫＳＥＧＦ２
を保持するＫ４株は、培養後４日目に約６ｎｇ／ｍｌの
ＥＧＦを分泌することが分かった。
【００２３】なお、上記実施例はＥＧＦの製造方法の一
例を示すものであって、用いられるプラスミドベクター
などは上記の例に限らず、他のプラスミドベクターを用
いてもよく、要するに本発明に用いられる生理活性タン
パク質、シグナルペプチド遺伝子およびプロモーターの
ＤＮＡ配列を発現するものであればよい。
例を示すものであって、用いられるプラスミドベクター
などは上記の例に限らず、他のプラスミドベクターを用
いてもよく、要するに本発明に用いられる生理活性タン
パク質、シグナルペプチド遺伝子およびプロモーターの
ＤＮＡ配列を発現するものであればよい。
【００２４】
【発明の効果】本発明の生理活性タンパク質の製造方法
は以上の様に構成されているので、生理活性タンパク質
を容易に効率よく製造することが可能である。また、本
発明の方法によれば、有機物を含まない培養液中に生理
活性タンパク質を分泌させることができるので、培養液
からの生理活性タンパク質の分離精製が容易である。
は以上の様に構成されているので、生理活性タンパク質
を容易に効率よく製造することが可能である。また、本
発明の方法によれば、有機物を含まない培養液中に生理
活性タンパク質を分泌させることができるので、培養液
からの生理活性タンパク質の分離精製が容易である。
【００２５】
配列番号：1 配列の長さ：90 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：9..71 特徴を決定した方法：ｓ 配列 AGCTTCAT ATG AGC CAC ATC CTG CGA GCC GCG GTA TTG GCG GCG ATG CTG 50 Met Ser His Ile Leu Arg Ala Ala Val Leu Ala Ala Met Leu -20 -15 -10 TTG CCG TTG CCG TCC ATG GCC AAC AGC GAC TCT GAA TGC C 90 Leu Pro Leu Pro Ser Met Ala Asn Ser Asp Ser Glu Cys -5 1 5 配列番号：2 配列の長さ：73 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：ー35 signal 存在位置：6..12 特徴を決定した方法：ｓ 特徴を表す記号：ー10 signal 存在位置：28..34 特徴を決定した方法：ｓ 配列 TCGAGTTGAC AATTAATCAT CGGCTCGTAT AATGTGTGGA ATTGTGAGCG GATAACAATT 60 TCACACAAGG AGA 73
【図１】ｔａｃプロモーターとシュードモナス・エルギ
ノーザのシャイン−ダルガノ配列をコードする合成ＤＮ
Ａの配列図である。
ノーザのシャイン−ダルガノ配列をコードする合成ＤＮ
Ａの配列図である。
【図２】プラスミドベクターｐＨＳＧ３９６の構造を示
す制限酵素地図である。
す制限酵素地図である。
【図３】組換えプラスミドｐＰＲ０１の構造を示す制限
酵素地図である。
酵素地図である。
【図４】シグナルペプチド遺伝子とＥＧＦのＮ末端アミ
ノ酸６個をコードする合成ＤＮＡの配列図である。
ノ酸６個をコードする合成ＤＮＡの配列図である。
【図５】組換えプラスミドＢＢＧ７の構造を示す制限酵
素地図である。
素地図である。
【図６】組換えプラスミドｐＳＥＧＦ１の構造を示す制
限酵素地図である。
限酵素地図である。
【図７】広宿主域プラスミドベクターｐＫＴ２３０の構
造を示す制限酵素地図である。
造を示す制限酵素地図である。
【図８】組換えプラスミドｐＫＳＥＧＦ１の構造を示す
制限酵素地図である。
制限酵素地図である。
【図９】組換えプラスミドｐＫＳＥＧＦ２の構造を示す
制限酵素地図である。
制限酵素地図である。
【図１０】組換えプラスミドｐＫＴＥＧＦ１の構造を示
す制限酵素地図である。
す制限酵素地図である。
【図１１】シュードモナス・シュードフラバＫ３株の増
殖と培養液上清中のＥＧＦ濃度の経時的変化を示すグラ
フである。
殖と培養液上清中のＥＧＦ濃度の経時的変化を示すグラ
フである。
【図１２】シュードモナス・シュードフラバＫ４株の増
殖と培養液上清中のＥＧＦ濃度の経時的変化を示すグラ
フである。
殖と培養液上清中のＥＧＦ濃度の経時的変化を示すグラ
フである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:38）
Claims (11)
- 【請求項１】 水素細菌に、生理活性タンパク質遺伝
子、シグナルペプチド遺伝子およびプロモーターを導入
して形質転換体を得ることを特徴とする形質転換体の製
造方法。 - 【請求項２】 請求項１に記載の形質転換体を無機塩培
地中、酸素、水素および炭酸ガスからなる混合ガス雰囲
気下に培養することを特徴とする生理活性タンパク質の
製造方法。 - 【請求項３】 前記生理活性タンパク質がヒト上皮細胞
増殖因子である請求項２に記載の生理活性タンパク質の
製造方法。 - 【請求項４】 水素細菌を、シグナルペプチド遺伝子お
よびプロモーターを含む発現ベクターで形質転換したも
のであることを特徴とする形質転換体。 - 【請求項５】 前記シグナルペプチド遺伝子が、配列表
の配列番号１に記載の塩基配列を有するものである請求
項４に記載の形質転換体。 - 【請求項６】 前記プロモーターがｔａｃプロモーター
を含むものである請求項４または５に記載の形質転換
体。 - 【請求項７】 前記プロモーターが、配列表の配列番号
２に記載の塩基配列を有するものである請求項４〜６の
いずれかに記載の形質転換体。 - 【請求項８】 前記発現ベクターがｐＫＳＥＧＦ２であ
る請求項４に記載の形質転換体。 - 【請求項９】 前記水素細菌がシュードモナス・シュー
ドフラバである請求項４〜８のいずれかに記載の形質転
換体。 - 【請求項１０】 前記シュードモナス・シュードフラバ
がシュードモナス・シュードフラバＡＴＣＣ３３６６８
である請求項９に記載の形質転換体。 - 【請求項１１】 生理活性タンパク質生産能を有するシ
ュードモナス・シュードフラバＡＴＣＣ３３６６８（ｐ
ＫＳＥＧＦ２）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5312248A JPH07163363A (ja) | 1993-12-13 | 1993-12-13 | 形質転換体の製造方法、生理活性タンパク質の製造方法および形質転換体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5312248A JPH07163363A (ja) | 1993-12-13 | 1993-12-13 | 形質転換体の製造方法、生理活性タンパク質の製造方法および形質転換体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07163363A true JPH07163363A (ja) | 1995-06-27 |
Family
ID=18026952
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5312248A Withdrawn JPH07163363A (ja) | 1993-12-13 | 1993-12-13 | 形質転換体の製造方法、生理活性タンパク質の製造方法および形質転換体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07163363A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007049416A1 (ja) * | 2005-10-28 | 2007-05-03 | Tosoh Corporation | カロテノイド合成微生物の作製方法およびカロテノイドの製造方法 |
| JP2015171340A (ja) * | 2014-03-12 | 2015-10-01 | 東ソー株式会社 | 組換え水素酸化細菌およびそれを用いたタンパク質製造方法 |
| JP2016185088A (ja) * | 2015-03-27 | 2016-10-27 | 東ソー株式会社 | 組換え水素酸化細菌とそれを用いたタンパク質製造方法 |
| JP2017212959A (ja) * | 2016-06-02 | 2017-12-07 | 東ソー株式会社 | 組換え水素酸化細菌を用いたタンパク質発現方法 |
| JP2018000200A (ja) * | 2010-04-27 | 2018-01-11 | キベルディ インコーポレイテッドＫｉｖｅｒｄｉ，Ｉｎｃ． | 無機炭素源および／またはｃ１炭素源から有用有機化合物への非光合成炭素の回収および変換のための酸水素微生物の使用 |
| US11203738B2 (en) | 2017-02-03 | 2021-12-21 | Kiverdi, Inc. | Microbial conversion of CO2 and other C1 substrates to protein and meat substitute products |
| US11725290B2 (en) | 2016-03-19 | 2023-08-15 | Kiverdi, Inc. | Microorganisms and artificial ecosystems for the production of protein, food, and useful co-products from C1 substrates |
-
1993
- 1993-12-13 JP JP5312248A patent/JPH07163363A/ja not_active Withdrawn
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP2018000200A (ja) * | 2010-04-27 | 2018-01-11 | キベルディ インコーポレイテッドＫｉｖｅｒｄｉ，Ｉｎｃ． | 無機炭素源および／またはｃ１炭素源から有用有機化合物への非光合成炭素の回収および変換のための酸水素微生物の使用 |
| JP2020103277A (ja) * | 2010-04-27 | 2020-07-09 | キベルディ インコーポレイテッドＫｉｖｅｒｄｉ，Ｉｎｃ． | 無機炭素源および／またはｃ１炭素源から有用有機化合物への非光合成炭素の回収および変換のための酸水素微生物の使用 |
| JP2022081470A (ja) * | 2010-04-27 | 2022-05-31 | キベルディ インコーポレイテッド | 無機炭素源および／またはｃ１炭素源から有用有機化合物への非光合成炭素の回収および変換のための酸水素微生物の使用 |
| JP2015171340A (ja) * | 2014-03-12 | 2015-10-01 | 東ソー株式会社 | 組換え水素酸化細菌およびそれを用いたタンパク質製造方法 |
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| JP2017212959A (ja) * | 2016-06-02 | 2017-12-07 | 東ソー株式会社 | 組換え水素酸化細菌を用いたタンパク質発現方法 |
| US11203738B2 (en) | 2017-02-03 | 2021-12-21 | Kiverdi, Inc. | Microbial conversion of CO2 and other C1 substrates to protein and meat substitute products |
| US11466246B2 (en) | 2017-02-03 | 2022-10-11 | Kiverdi, Inc. | Microbial conversion of CO2 and other C1 substrates to vegan nutrients, fertilizers, biostimulants, and systems for accelerated soil carbon sequestration |
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