KR101141205B1

KR101141205B1 - 목적의 단백질 발현 양상을 나타내는 발현 컨스트럭트 제조방법 및 목적단백질 발현 조절 방법

Info

Publication number: KR101141205B1
Application number: KR1020090118706A
Authority: KR
Inventors: 최수근; 반재구; 박승환; 이수진
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-10-19
Filing date: 2009-12-02
Publication date: 2012-05-04
Also published as: KR20110043386A

Abstract

본 발명은 목적의 단백질 발현 양상을 나타내는 발현 컨스트럭트의 제조방법 및 목적단백질 발현 조절 방법에 관한 것이다. 본 발명은 목적 단백질의 발현을 미세하게 조절하여 세포의 성장이나 생존에 대한 영향을 최소화 시키면서 단백질을 효율적으로 대량 생산할 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 벡터에 삽입되는 프로모터는 합성된 프로모터 또는 변형된 프로모터가 아니라, 천연프로모터가 삽입되어 있기 때문에 숙주세포의 발현 시기나 환경을 조절할 수 있다. 또한, 본 발명은 특정 물질의 대사에 관여하는 효소의 발현을 미세하게 조절함으로써 원하는 물질의 효율적 생산에 유용하게 이용될 수 있다.

천연 프로모터, 랜덤 올리고뉴클레오타이드, RSUTR, 단백질 생산

Description

목적의 단백질 발현 양상을 나타내는 발현 컨스트럭트 제조방법 및 목적단백질 발현 조절 방법{Preparation Methods for Expression Construct Having Protein Expression Pattern of Interest and Control Methods for Protein Expression}

본 발명은 목적의 단백질 발현 양상을 나타내는 발현 컨스트럭트 제조방법 및 목적단백질 발현 조절 방법에 관한 것이다.

미생물은 산업적으로 화학물질이나 효소 등 유용 물질의 대량생산이나 식품발효 산업 등에 주로 쓰이고 있다. 고전적으로 유용 효소 또는 단백질을 대량으로 생산시키기 위하여 돌연변이 유도물질 처리, 자외선 또는 방사선 조사 등을 통해 숙주균을 돌연변이 시키는 방법이 사용되어 왔으나 상기 방법들은 비선택적 돌연변이로 인해 종종 숙주균의 성장속도가 저하되거나, 배지조성 및 배양조건을 최적화시키기 까다로운 경우가 많다. 또한, 돌연변이 균주의 경우에는 균주 퇴화가 일어나며, 각각의 목적 단백질 생산을 위한 숙주균을 따로 개발해야 하므로 시간과 노력이 많이 소요되는 고전적인 방법이다. 최근에는 유전자 조작 기술을 이용하 여 재조합 미생물을 만들고 이를 이용하여 원하는 단백질이나 물질의 생산성을 높이는 방법이 시도되고 있으며 강력한 프로모터를 이용하여 목적단백질의 과발현을 유도하는 방법이 기본이 되고 있다(Jana S. and Deb JK., Appl. Microbiol. Biotechnol. 67: 289-298(2005)) (Shumann W., Adv. Appl. Microbiol. 62: 137-189(2007)). 그러나 목적단백질의 지나친 과발현은 종종 인클루젼바디를 형성하여 불활성화된 단백질이 생산되므로 목적단백질의 발현양을 최적인 상태로 조절하는 것이 필요하다(Sorensen HP and Mortensen KK., J. Biotechnol. 115: 113-128(2007)). 한편 세포 대사산물의 대량생산에는 대사과정 중의 주요 효소를 과발현시키고 불필요한 대사흐름에 관여하는 효소를 불활성화시키는 방법을 주로 사용하고 있다. 그러나 이러한 "all or nothing" 의 극단적인 접근 방법은 종종 세포의 생존환경이 불안정해져서 오히려 목적물질의 생산이 저하되는 결과를 가져온다(Snoep JL et al., Microbiology 141: 2329-2337(1995)). 따라서 최적의 대사흐름을 유지하면서 목적물질의 대량생산을 위해서는 관련된 효소의 발현을 미세하게 조절하는 것이 필요하다.

유전자의 발현은 프로모터에 의해 이루어지는데 미생물에서 프로모터는 -35부위, -10부위 및 그 사이의 스페이스로 구성되어 있다. -35 부위와 -10 부위의 염기서열은 여기에 결합하는 RNA 폴리머라제의 시그마 팩터에 따라 다양한 데 예를 들어 시그마 A에 의해 인식되는 프로모터의 -35와 -10 부위는 각각 TTGACA 및 TATAAT의 컨센서스 염기서열을 가지고 있다. 스페이스의 경우 컨센서스 서열은 없으나 길이가 일정한 데 시그마 A에 의해 인식되는 프로모터의 스페이스는 17개의 염기로 이루어져 있다. 최근 스페이스 부위가 프로모터의 세기에 영향을 준다는 보고가 있었으며(Jensen PR and Hammer K., Appl. Environ. Microbiol. 64: 82-87(1998)), 이를 이용해 프로모터의 세기를 미세하게 조정하는 기술들이 개발되었다(Solem C and Jensen PR., Appl. Environ. Microbiol. 68: 2397-2403(2002)) (Hammer K et al., Trends in Biotechnol. 24: 53-55(2006)). 이들 기술들은 대개 시그마 A에 의해 인식되는 프로모터의 컨센서스 -35와 -10 부위를 가지고 스페이스에 랜덤 염기서열을 도입한 프로모터를 제작한 후 다양한 세기의 프로모터를 스크리닝하는 방법을 사용하고 있다. 또한 프로모터를 분자진화기술을 이용하여 다양화한 후 이를 이용하여 단백질 발현을 미세조절하는 기술이 개발되어 있다(Alper H. et al. PNAS 102: 12678-12683(2005)). 대부분의 프로모터는 세포내의 대사흐름과 연계된 다양한 인자에 의해 발현이 조절되므로 적절한 환경과 시기에 단백질을 발현시킨다. 이러한 대사흐름과 연계된 조절은 세포가 최적의 상태를 유지시키는 데 도움을 준다.

그러나 상기와 같이 알려진 단백질 발현 미세조절 기술은 모두 합성된 프로모터나 변형된 프로모터를 사용하기 때문에 발현 시기나 환경을 조절할 수 없다.

따라서, 단밸질 발현 시기나 환경을 조절할 수 있는 천연 프로모터를 사용하면서 단백질 발현을 미세하게 조절할 수 있는 기술에 대한 필요성이 대두되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시 되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 발현 시기나 환경을 조절할 수 있는 천연 프로모터를 사용하면서 단백질 발현을 미세하게 조절할 수 있는 기술을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 프로모터와 목적단백질-코딩 뉴클레오타이드 사이에 랜덤 올리고뉴클레오타이드 서열을 가지는 RSUTR이 삽입된 발현 컨스트럭트를 제조하였고, 이와 같이 제조된 발현 컨스트럭트가 목적 단백질의 발현양을 미세하게 조절할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 목적의 단백질 발현 양상을 나타내는 발현 컨스트럭트 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 목적단백질 발현 조절 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 목적의 단백질 발현 양상을 나타내는 벡터를 제공한다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 목적의 단백질 발현 양상(protein expression pattern of interest)을 나타내는 발현 컨스트 럭트(expression construct)의 제조방법을 제공 한다: (a) (i) 프로모터, (ⅱ) 목적단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열, 및 (ⅲ) 상기 프로모터와 목적단백질-코딩 서열 사이에 위치한 랜덤 올리고뉴클레오타이드 서열을 가지는 RSUTR(random sequenced untranslated region)를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 벡터를 세포에 도입시키는 단계; 및 (c) 목적의 단백질 발현 양상을 나타내는 세포를 탐색하여 선정하는 단계.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 목적 단백질의 발현 조절방법을 제공 한다: (a) (i) 프로모터, (ii) 목적단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열, 및 (iii) 상기 프로모터와 목적단백질-코딩 서열 사이에 위치한 랜덤 올리고뉴클레오타이드 서열을 가지는 RSUTR를 포함하는 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 벡터를 세포에 도입시키는 단계; (c) 목적의 단백질 발현 양상을 나타내는 세포를 탐색하여 선정하는 단계; 및 (d) 상기 선정된 세포를 배양하여 목적 단백질을 생산하는 단계.

본 발명자들은 발현 시기나 환경을 조절할 수 있는 천연 프로모터를 사용하면서 단백질 발현을 미세하게 조절할 수 있는 기술을 개발하고자 예의 연구 노력하였으며, 그 결과 프로모터와 목적단백질-코딩 뉴클레오타이드 사이에 랜덤 올리고뉴클레오타이드 서열을 가지는 RSUTR(random sequenced untranslated region)이 삽입된 발현 컨스트럭트를 제조하였고, 이와 같이 제조된 발현 컨스트럭트가 목적 단백질의 발현양을 미세하게 조절할 수 있음을 확인하였다.

본 명세서에서 용어, “뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함 한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명에서 용어, “프로모터”는 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산 서열을 말한다.

본 발명에서 DNA 컨스트럭트는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 DNA 컨스트럭트는 전형적으로 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주세포로 하여 구축될 수 있으며, 바람직하게는 원핵 세포를 숙주로 하는 것이다. 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 강력한 전사활성을 갖는 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터, T7 프로모터 및 phoB 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli (예, HB101, BL21, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pL λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 프로모터로 이용될 수 있다. 숙주세포로서 바실러스 균이 이용되는 경우, 바실러스 츄린겐시스의 독소단백질 유전자의 프로모터 (Appl. Environ. Microbiol. 64:3932-3938(1998); Mol. Gen. Genet. 250:734-741(1996)) 또는 바실러스 균에서 발현 가능한 어떠한 프로모터라도 프로모터로 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용하는 프로모터는 박테리아 세포에서 작동 가능한 프로모터(예컨대, tac, lac, lacUV5, lpp, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5, amp, recA, SP6, trp, T7 프로모터, phoB, groEL, groES, dnaK, dnaJ, grpE, lon, lysU, rpoD, clpB, clpP, uspA, katG, uvrA, frdA, sodA, sodB, soi-28, narG, narK, recA, xthA, his, phoA, glnA, micF, fabA, ara, tet, trc, rac5, 바실러스 포자형성 프로모터 또는 살충 크리스탈 단백질의 프로모터)이고, 보다 바람직하게는 바실러스 속-유래 프로모터이고, 보다 더 바람직하게는 바실러스 서브틸리스에서 유래된 phoB 프로모터이며, 가장 바람직하게는 서열목록 제1서열을 포함한다.

본 발명에서 상기 벡터에 삽입되는 “랜덤 올리고뉴클레오타이드”는 A 뉴클레오타이드, T 뉴클레오타이드, G 뉴클레오타이드 및 C 뉴클레오타이드가 랜덤하게 위치하여 구성된 올리고뉴클레오타이드이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 랜덤 뉴클레오타이드 서열은 3-100개의 뉴클레오타이드를 포함하며, 보다 바람직하게는 10-75개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 보다 더 바람직하게는 30-60개의 뉴클레오타이드를 포함하며, 가장 바람직하게는 40-55개의 뉴클레오타이드를 포함한다.

본 발명에서 RSUTR (random sequenced untranslated region)는 상기 랜덤 올리고뉴클레오타이드가 포함된 올리고뉴클레오타이드이다.

본 발명은 프로모터와 목적단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열 사이에 RSUTR를 삽입하여, 상기 RSUTR를 포함하는 벡터를 세포에 도입함으로써 목적단백질을 보다 효율적 및 대량으로 생산시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 단계 (a)에서 벡터에 삽입된 프로모터와 목적단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열 사이에 위치하는 RSUTR은 서열번호 2 내지 서열번호 15 중 어느 하나이다.

본 발명에서 이용되는 벡터를 진핵세포 발현용으로 제조하는 경우, 이용 가능한 프로모터는 예를 들어 CMV 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

진핵세포 발현용 벡터는 목적단백질-코딩 뉴클레오타이드의 다운스트림에 폴 리아데닐화 서열이 결합되어 있는 것이 바람직하다. 상기 폴리아네닐화 서열은, 소성장 호르몬 터미네이터(Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998(1989)), SV40 유래 폴리 아데닐화 서열(Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393(1992)), HIV-1 polyA(Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876(1998)), β-글로빈 polyA(Gil, A., et al, Cell 49:399-406(1987)), HSV TK polyA(Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113(1985)) 또는 폴리오마바이러스 polyA(Batt, D. B and G. G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790(1995))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 하기 실시예에 따르면, 본 발명자들은 프로모터와 목적단백질 유전자 사이에 랜덤 염기서열을 가지는 RSUTR을 합성하여 삽입한 후 베타갈락토시다아제의 발현양을 조사한 결과 다양한 발현양을 보이는 프로모터-RSUTR-LacZ 조합을 다수 확보하였다 (참조: 도 3).

본 발명의 명세서에서 표현 “목적단백질-코딩 뉴클레오타이드”는 목적단백질의 CDS(coding sequence) 뉴클레오타이드를 의미한다.

본 발명의 명세서에서, 상기 DNA 컨스트럭트는 선별을 위해 선별 마커(selectable marker)를 가질 수 있다. 바람직하게는 상기 선별 마커는 항생제 내성을 나타내는 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드이다. 상기 항생제 내성을 나타내는 유전자는 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

보다 바람직하게는, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 플라스미드(예: pDG1661, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4?λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40등)를 조작하여 제작될 수 있으며, 가장 바람직하게는 플라스미드를 조작하여 제작 된다.

한편, 상술한 벡터를 세포내로 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있으며, 예를 들어 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973); 및 Chen과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752(1987)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 방법에 의해 벡터를 세포 내로 유입시킬 수 있다.

상기 숙주 세포는 상기 컨스트럭트를 안정적이면서 연속적으로 발현시킬 수 있는 공지된 어떠한 숙주세포도 사용할 수 있다. 상기 숙주세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다.

상기 숙주세포를 원핵세포를 사용하는 경우에는 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주등이 있다. 진핵 세포를 숙주세포로 사용하는 경우에는 이스트 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 명세서에서 상기 단계 (b)에서의 세포는 원핵세포가 바람직하며, 보다 바람직하게는, 본 발명에서 상기 벡터를 도입시켜 목적단백질의 발현시키는데 이용되는 숙주세포는 그람양성세균이며, 보다 더 바람직하게는 바실러스 속, 락토바실러스 속, 브레비바실러스 속, 페니바실러스 속, 클로스트리디움 속, 코리네박테리움 속 또는 스트렙토마이세스 속 균이고, 보다 더욱 더 바람직하게는 바실러스 서틸리스, 바실러스 리케니포미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 츄린겐시스 또는 바실러스 시리우스 균이며, 가장 바람직하게는 바실러스 서틸리스 균이다.

본 발명에서 발현하고자 하는 목적 단백질-코딩 뉴클레오타이드는 어떠한 뉴클레오타이드 서열도 포함한다. 바람직하게는, 상기 목적 단백질-코딩 뉴클레오타이드는 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부 분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질 또는 그 결합도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사인자, 혈액 응고 인자, 수용체 또는 그 일부분, 수송단백질, 백신 단백질 또는 스트렙토아비딘을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

상기 목적 단백질은 예를 들어 공지된 방법인 에러-프론(error-prone) PCR, 셔플링(shuffling), 올리고뉴클레오타이드-지시 돌연변이유도(oligonucleotide-directed mutagenesis), 어셈블리 PCR(assembly PCR), 성(sexual) PCR 돌연변이유도, 인 비보(in vivo) 돌연변이유도, 카세트(cassette) 돌연변이유도, 순환앙상블(recursive ensemble) 돌연변이유도, 지수(exponential) 앙상블 돌연변이유도, 사이트-특이적(site specific) 돌연변이유도, 라이게이션 리어셈블리(ligation reassembly), GSSM 및 이들 방법의 조합으로 자연 단백질(natural-occurring protein)을 변이시킨 변이 단백질일 수 있다.

본 발명에서 선정된 세포에서 생산하는 물질은 특별히 제한되지 않으나, 바직하게는 아미노산, 항생제, 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드, 비타민, 폴리감마글루타믹산, 리보오스, 에탄올, 부탄올, 폴리하이드록시부티레이트, 아세틸피롤린 및 스트렙토아비딘으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 물질이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 프로모터; (ⅱ) 목적단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열; 및 (ⅲ) 상기 프로모터와 목적단백질-코딩 서열 사이에 위치한 랜덤 올리고뉴클레오타이드 서열을 가지는 RSUTR를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명에서 제공하는 랜덤 올리고뉴클레오타이드 서열을 가지는 RSUTR를 포함하는 벡터는 상기 방법에서 이용하는 벡터와 동일한 벡터이므로, 본 발명의 명세서의 과도한 중복 기재를 피하기 위하여, 이 둘의 공통된 내용은 생략된다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 목적의 단백질 발현 양상을 나타내는 발현 컨스트럭트 제조방법 및 목적단백질 발현 조절 방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 목적 단백질의 발현을 미세하게 조절하여 세포의 성장이나 생존에 대한 영향을 최소화 시키면서 단백질을 효율적으로 대량 생산할 수 있는 장점이 있다.

(ⅲ) 본 발명에서 벡터에 삽입되는 프로모터는 합성된 프로모터 또는 변형된 프로모터가 아니라, 천연프로모터가 삽입되어 있기 때문에 숙주세포의 발현 시기나 환경을 조절할 수 있다.

(ⅳ) 또한, 본 발명은 특정 물질의 대사에 관여하는 효소의 발현을 미세하게 조절함으로써 원하는 물질의 효율적 생산에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

다른 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) 부 또는 %, 고체/액체는 (중량/부피) 부 또는 %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) 부 또는 %이다.

실시예 1: 바실러스 서틸리스 phoB 프로모터와 RSUTR을 이용한 GFP(green fluorescent protein)의 미세조절 발현

RSUTR (random sequenced untranslated region)을 포함한 phoB 프로모터는 프라이머 phoB-F (서열번호 16)와 RSL1 (서열번호 17)을 사용하여 바실러스 서틸리스 168 (Kunst F. et al. Nature. 390:249-256(1997))의 염색체로부터 PCR(중합효소연쇄반응)법을 사용하여 확보하였다.

PCR로 확보된 phoB 프로모터와 RSUTR을 포함한 DNA 뉴클레오타이드는 제한효소 EcoRI과 BamHI으로 절단하고 gfp 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 pAD123 (Dunn A.K. and Handelsman J., Gene 226: 297-305(1999))의 EcoRI과 BamHI 위치에 삽입하여 플라스미드 라이브러리를 제작하였다(도 1).

제작된 플라스미드 라이브러리는 대장균에 도입한 후 100 ㎍/㎖의 암피실린(ampicillin)이 포함된 LB (Luria-Bertani) 아가배지에 도말하였다. 이렇게 아 가배지 위에 형성된 대장균 형질전환체를 모두 모아 플라스미드를 분리하였고 분리된 플라스미드 라이브러리는 바실러스 서틸리스 168 균주에 도입하였다. 제작된 바실러스 형질전환체는 무작위로 약 190개를 선정한 후 1% 글루코스를 포함한 CLPY 배지(Choi S.K. and Saier M.H. Jr., 10:40-50(2006))에 접종하여 37℃에서 45시간 배양하였다. 배양된 균주들은 EnVision Mutilabel Plate Readers(Perkin Elmer)를 이용하여 GFP의 발현양을 측정한 결과 GFP의 발현양이 다양함을 확인하였다(도 2).

따라서 프로모터와 목적단백질 유전자 사이에 랜덤 염기서열을 가진 RSUTR을 삽입하면 목적단백질의 발현양이 다양해지므로 목적에 맞는 발현양을 가진 벡터를 선택하여 사용할 수 있다.

실시예 2: 바실러스 서틸리스 phoB 프로모터와 RSUTR을 이용한 베타갈락토시다아제의 미세조절 발현

상기 GFP의 발현양이 다양한 벡터 중 14개를 선정하여 제한효소 EcoRI과 BamHI으로 절단하고 베타갈락토시다아제 유전자(lacZ)를 포함하고 있는 플라스미드 pDG1661 (Guerout-Fleury, A. M. et. al. 1996. Gene. 180: 57-61)의 EcoRI과 BamHI 사이트에 클로닝한 후 바실러스 서틸리스 168 균주에 도입하였다.

각 플라스미드를 포함한 바실러스 서틸리스 균을 1% 글루코스를 포함한 CLPY 배지(Choi S.K. and Saier M.H. Jr. 2005. 10:40-50)에 접종한 후 1시간 간격으로 LacZ 활성을 측정하였다. 그 결과 phoB 프로모터와 lacZ 유전자 사이에 위치한 RSUTR의 종류에 따라 LacZ의 발현양이 다양하였다(도 3). 예를 들어 phoB 프로모터-RSUTR L195-lacZ 조합은 phoB 프로모터-lacZ와 발현양이 비슷한 반면, phoB 프로모터-RSUTR L225-lacZ 조합은 phoB 프로모터-lacZ에 비해 발현양이 약 4배 증가하였고, 그 외 다른 조합에서도 다양한 발현양을 나타내었다.

이러한 결과는 프로모터와 목적단백질 유전자 사이에 랜덤 염기서열을 가진 RSUTR을 삽입하면 목적단백질의 발현양이 다양해지므로 원하는 수준의 발현양을 가진 RSUTR을 선정하여 목적에 맞게 사용할 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 phoB 프로모터와 목적단백질 유전자 사이에 RSUTR이 삽입된 모식도이다.

도 2는 phoB 프로모터-RSUTR-gfp 조합을 가진 플라스미드 라이브러리가 도입된 바실러스 서틸리스 168 균주의 GFP 발현양을 ELISA READER로 분석한 이미지이다. 각 원은 각기 다른 플라스미드를 가진 세포 배양체를 포함하고 있으며 원안의 숫자는 발현된 GFP의 형광 세기 정도를 나타낸다.

도 3은 phoB 프로모터-RSUTR-lacZ 조합을 가진 플라스미드 라이브러리가 도입된 바실러스 서틸리스 168 균주의 LacZ 발현양을 분석한 이미지이다. L195부터 L225는 프로모터와 lacZ 사이에 도입된 RSUTR의 이름을 나타낸다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Methods for Control of Protein Expression <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 552 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 acacaatacc tctttccaac gtaatacttt aaattgttca agatgtaagc gggttgcttc 60 tatgcgacta tagcagattt cagtccgcct atccacggcc agtatctatt cctccaattt 120 atttctttag tactatcgct ctttccttct aaaacttctc ataaaagaat aaccattatt 180 taagggtgcc agttcattat tcttgtaaat ccaatcttta aaatcgatta atactagctt 240 aacagtttaa aaatataatt gggttgtcat tgagattcat ctatatttag gaggttatcc 300 agttgaaaaa attcccgaag aaattactgc ctatcgcggt tttatcatca attgcgttca 360 gcagcttagc cagcggcagt gtgcctgaag ccagcgccca ggaaaagaaa aaggggaacc 420 aagacgaaat taaaaatgtt attgttctga ttggtgatgg tatgggtgtg tcttatacgt 480 ctgcttatcg atacttaaag gataataaaa agacaaaagt tgtggagcct acggcttttg 540 atcagtatct tg 552 <210> 2 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSUTR 119 <400> 2 actagtgggg ggtacagccg cagccgctag atcgctctta tatttaccat ttgggaggaa 60 gaaaaatgga tcc 73 <210> 3 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSUTR 133 <400> 3 actagtcttt acaagaaact gctccctata tgtgcgaagt gcgagaccag gaggggagga 60 agaaaaatgg atcc 74 <210> 4 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSUTR 146 <400> 4 actagttggc aatcatatca gcacggtttc ccgactaact gaagacacct aagggaggaa 60 gaaaaatgga tcc 73 <210> 5 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSUTR 155 <400> 5 actagtgaca aagtggtaaa ctacaataat tcgcaaaaat catcctaaat atgggaggaa 60 gaaaaatgga tcc 73 <210> 6 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSUTR 170 <400> 6 actagtaggt tcaaaacctg tcagcgcagt atgcaaatgt tcatacccct gagggaggaa 60 gaaaaatgga tcc 73 <210> 7 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSUTR 171 <400> 7 actagtgcat agagagtcaa cgaagtgaac aagtttagat cacagtactt gtgggaggaa 60 gaaaaatgga tcc 73 <210> 8 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSUTR 181 <400> 8 actagtatat agtcttataa ctagtaggaa attagtcgtg aggttacacc aagggaggaa 60 gaaaaatgga tcc 73 <210> 9 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSUTR 183 <400> 9 actagtcccc ctgtaactac tagcaaggac gtaaaatgtt gactcatttc aagggaggaa 60 gaaaaatgga tcc 73 <210> 10 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSUTR 188 <400> 10 actagttaag ctattagctg taaaactgac taaaaataca cgacgtgaca tggggaggaa 60 gaaaaatgga tcc 73 <210> 11 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSUTR 195 <400> 11 actagttcgg gaatgatcag tcgaatgtat caagcattcc catacccgag gggggaggaa 60 agaaaaatgg atcc 74 <210> 12 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSUTR 225 <400> 12 actagtagtt tcaaaaaatc ttggagggtc gcctttcagc aatattgtga aggggaggaa 60 gaaaaaatgg atcc 74 <210> 13 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSUTR 238 <400> 13 actagttgcc tttatgatgt ggatctgacg tgactaagct aatgacagca aagggaggaa 60 gaaaaatgga tcc 73 <210> 14 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSUTR 281 <400> 14 actagtcact cctacgatgc gtgatttgtg accaagcaat tactcacacc aagggaggaa 60 gaaaaatgga tcc 73 <210> 15 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSUTR 294 <400> 15 actagtgtgg ctcatcctat gattacttga cggcgctatc tgactacatg tggggaggaa 60 gaaaaatgga tcc 73 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> phoB-F <400> 16 atagaattca cacaatacct ctttccaac 29 <210> 17 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RSL1 <400> 17 ataggatcca tttttcttcc tcccnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnnn actagtcaag atactgatca aaagccgtag 100

Claims

다음의 단계를 포함하는 목적의 단백질 발현 양상(protein expression pattern of interest)을 나타내는 발현 컨스트럭트(expression construct)의 제조방법:

(a) (i) 프로모터, (ⅱ) 목적단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열, 및 (ⅲ) 상기 프로모터와 목적단백질-코딩 서열 사이에 위치한 랜덤 올리고뉴클레오타이드 서열을 가지는 RSUTR(random sequenced untranslated region)를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;

(b) 상기 벡터를 세포에 도입시키는 단계; 및

(c) 목적의 단백질 발현 양상을 나타내는 세포를 탐색하여 선정하는 단계.
다음의 단계를 포함하는 목적 단백질의 발현 조절방법:

(a) (ⅰ) 프로모터, (ⅱ) 목적단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열, 및 (ⅲ) 상기 프로모터와 목적단백질-코딩 서열 사이에 위치한 랜덤 올리고뉴클레오타이드 서열을 가지는 RSUTR를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;

(b) 상기 벡터를 세포에 도입시키는 단계;

(c) 목적의 단백질 발현 양상을 나타내는 세포를 탐색하여 선정하는 단계; 및

(d) 상기 선정된 세포를 배양하여 목적 단백질을 생산하는 단계.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 프로모터는 박테리아-유래 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 프로모터는 바실러스 속-유래 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 프로모터는 바실러스 서틸리스에서 유래된 phoB 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 1 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 랜덤 올리고클레오타이드 서열은 3- 100개의 뉴클레오타이드로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 RSUTR은 서열번호 2 내지 서열번호 15 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 세포는 그람양성세균인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 그람양성세균은 바실러스 속, 락토바실러스 속, 브레비바실러스 속, 페니바실러스 속, 클로스트리디움 속, 코리네박테리움 속 또는 스트렙토마이세스 속 균인 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 바실러스 속 세균은 바실러스 서틸리스, 바실러스 리케니포미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 츄린겐시스 또는 바실러스 시리우스 균인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 목적단백질은 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인, 효소, 효소 저해제, 수송단백질, 리셉터 및 리셉터의 단편, 항원, 항체 및 항체 단편, 구조 단백질, 조절단백질, 전사인자, 독소 단백질 및 생체방어 유도물질로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 목적단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
(ⅰ) 프로모터; (ⅱ) 목적단백질-코딩 뉴클레오타이드 서열; 및 (ⅲ) 상기 프로모터와 목적단백질-코딩 서열 사이에 위치한 랜덤 올리고뉴클레오타이드 서열을 가지는 RSUTR를 포함하는 벡터.